脂肪酸合成酶、其抑制剂和修饰物及其用途

技术领域

在一个方面，本发明涉及新重组多肽，其衍生自脂肪酸合成酶蛋白复合物的新鉴定的γ-亚基(subunit)。另外，公开了包含这些新重组多肽的脂肪酸合成酶蛋白复合物以及编码这些多肽的核酸分子。进一步，描述了含有编码本发明多肽或表达本发明多肽的核酸分子的宿主细胞。另外，公开了分离的脂肪酸合成酶蛋白复合物，其含有新鉴定的γ亚基。而且，公开了用于确定能够抑制FAS蛋白复合物中存在的酮还原酶、烯酰还原酶或丙二酰/棕榈酰转移酶的候选化合物的适用性的方法以及用于设计所述酶的抑制剂的方法。最后，本发明涉及抑制剂及其在医药应用中的用途。

背景技术

脂肪酸合成酶是一种催化脂肪酸合成的多酶蛋白质。迄今为止所记载的，酵母菌中的所述酶是由两个多功能亚基组成的酶系统，其中底物通过α亚基编码的ACP结构域从一个功能域递送到下一个功能域。脂肪酸合成酶(FAS)在NADPH存在下催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成棕榈酸。

描述了两类FAS。即，FAS的I型系统利用单一或两个大的多功能多肽，其在动物和真菌中都是很常见的。I型脂肪酸合成酶系统也可以在一个细菌亚群、即棒状杆菌、分枝杆菌和诺卡氏菌中被发现。在这些细菌中，FAS I系统产生棕榈酸，并与下文所述的FAS II系统合作，以产生更多种类的脂质产品。

FAS II型存在于古细菌和细菌中，其特点是利用离散的单功能酶以用于脂肪酸的合成。FASⅡ的这种路径的抑制剂作为可能的抗生素正在研究中。酵母菌脂肪酸合成酶作为I型FAS被描述为2.6MDa桶状(barrel-shaped)复合物，应由两个独特的多功能亚基(subunits)α和β组成。描述了所述α和β单元(unit)以α

多个实验室的结构研究已经牢固确立，I型真菌脂肪酸合成酶(FAS)是D3对称的2.6MDa巨型酶复合物，其形成长

发明内容

在一个方面，本发明涉及SEQ ID No.1的氨基酸1至132的重组多肽或其功能片段、或其同系物。进一步，提供一种包含SEQ ID No.1的氨基酸的重组多肽，其进一步含有至少20个氨基酸的插入物、例如25个氨基酸的插入物或其功能片段、或其同系物。

此外，提供了一种多肽，其由以下组成：

i.)Seq ID No.2的至少6个连续氨基酸，如至少8个连续氨基酸，例如至少10个连续氨基酸或其功能片段、或其同系物；或

ii.)Seg ID No.3的至少5个连续氨基酸，如至少6个连续氨基酸，例如至少8个连续氨基酸或其功能片段、或其同系物；或

iii.)Seq ID No.4的至少6个连续氨基酸，如至少8个连续氨基酸，例如SEQ IDNo.4的至少10、12或14个连续氨基酸、或其功能片段、或其同系物。

所述多肽对酶、如FAS复合物中存在的酶具有改变活性。

进一步，公开了包含如本文所述的重组多肽的脂肪酸合成酶蛋白复合物。

另外，描述了编码本发明多肽的核酸分子以及含有所述核酸分子和/或表达本发明多肽的宿主细胞。

进一步，要求保护一种分离的脂肪酸合成酶蛋白复合物，其含有所述α-和β-亚基以及SEQ ID No.1的多肽。所述分离的脂肪酸合酶蛋白复合物可通过包含以下步骤的方法获得：

a)提供含有脂肪酸合成酶蛋白复合物的粗样品；

b)进行第一离心步骤，在25,000至35,000xg下分离细胞碎片；

c)用0％至25％(w/v)的渗透剂和任选的使半胱氨酸硫醇-烷基化的化合物补充到从该第一步离心步骤获得的上清液；

d)进行第二离心步骤，以50,000至150,000xg的速度离心，如80,000至120.000xg；

e)用水溶性聚合物、特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物、如聚亚烷基二醇、聚胺或聚羧酸盐处理从该第二离心步骤获得的上清液以进行沉淀；

f)将聚合物基沉淀物、如聚烷基二醇基沉淀物重新悬浮在不含所述聚合物、如聚烷基二醇的缓冲液中后，使用渗透剂与该聚合物基沉淀物进行密度梯度离心；

g)可选地重复一次或多次步骤e)和f)；

h)以水溶性聚合物基的沉淀物、如脂肪酸合成酶蛋白复合物的聚亚烷基二醇基沉淀物进行浓缩；

用于获得纯化的脂肪酸合成酶蛋白复合物。

进一步，还公开了用于确定能够抑制酮还原酶(KR)或烯酰还原酶(ER)或丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)的候选化合物的适用性的方法，以及所述酶的抑制剂，特别是当它们作为FAS蛋白复合物的一部分时。最后，描述了所述抑制剂在预防或治疗各种疾病、包括癌症、传染病以及结核病或肥胖症中的用途。

附图说明

图1：Tma17p构成酵母菌脂肪酸合成酶的真正γ-亚基。

α-亚基和β-亚基共同含有脂肪酸合成所需的所有酶活性。酰基载体蛋白(ACP，黄色)、酮还原酶(KR，金色)、酮合成酶(KS，橙色)和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPT，品红色)结构域位于α-亚基上，而乙酰转移酶(AT，蓝色)、烯酰还原酶(ER，蓝绿色)、脱氢酶(DH，绿色)位于β亚基上。丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT，卡其色)结构域由α-和β-亚基两者组成。

图2图2A：从野生型酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中纯化FAS的SDS-PAGE分析。描绘了等分式样的S30(泳道2)和S100(泳道3)提取物、重新悬浮的PEG切片(泳道4)、第一、第二和第三蔗糖梯度(泳道5、6和7)的池以及最终纯化的蛋白质制备品(泳道7)和分子量标记物(泳道1)。注意到表观分子量为20kDa的蛋白质的明显的共-纯化。图2B从Δtma17酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中纯化FAS的SDS-PAGE分析。加载与(D)中相同成分(fraction)的等分试样。注意到没有表观分子量为20kDa的蛋白质，表明这确实是Tma17p。

图3用ΔTma17p-FAS和重组Tma17p重构FAS全酶。左上角描绘了考马斯亮蓝染色的天然凝胶，其中表明了ΔTma17p-FAS和Tma17p的迁移位置。左下面板显示了凝胶ΔTma17p-FAS区域的荧光检测，以可视化FAS-结合的Tma17p，右面板表示荧光信号的定量分析。

图4：一旦结合γ-亚基，在FAS全酶中引起结构差异。交联质谱(XL-MS)可以解释FAS全酶(旋转)构象中可见的额外密度。γ-亚基的N-末端区域位于ER域，靠近MPT域的中心部分，而C-末端部分似乎与KR和KS域接触。

图5：γ-亚基在FAS全酶中的功能。

FAS对底物NADPH的底物浓度依赖性。左面板显示了ΔTma17p-FAS初始速度与NADPH浓度的关系图。ΔTma17p-FAS的NADPH依赖性不是双曲线的，表明了底物的激活。用于描述这种行为的动力学模型如插图显示。右面板显示了ΔTma17p-FAS(黑色)和FAS全酶(红色)初始速度与NADPH浓度的叠加。注意到在FAS全酶情况下的饱和动力学变化和对于NADPH的K

具体实施方式

在一个方面，提供了重组多肽。在本发明的实施方案中，提供了一种重组多肽，其中所述多肽由SEQ ID No.1的氨基酸1至132或其功能片段、或其同系物组成。重组多肽可进一步具有附加氨基酸，由此不存在SEQ ID No.1的133至150。

如本文所用，术语“其功能片段”分别指与所述多肽或核酸分子具有相同功能性的多肽。即，功能片段可含有至少一个氨基酸残基或至少一个核酸残基的缺失或替换，而不会显著改变本文所述多肽的功能。

根据本发明的多肽包括也称为衍生物的片段，其中单个氨基酸分子可被不同的氨基酸残基取代。例如，在位置2处的氨基酸可以是丝氨酸而不是半胱氨酸。另外，单取代包括保守氨基酸取代。本领域技术人员清楚地知道在不显著改变重组多肽活性的情况下的合适取代。

如本文所使用的，术语“包含”(“comprising”、“comprises”、“comprisedof”)与“包括”(“including”、“includes”)或“含有”(“containing”、“contains”)为同义，并且是包含的或开放式的，不排除额外的、非列举的成分(member)、元素(element)和方法步骤。应理解，本文中使用的术语“包含”(“comprising”、“comprises”、“comprised of”)以及“包括”(“including”、“includes”)或“含有”(“containing”、“contains”)包含术语“由……组成”(“consisting of”、“consist”和“consist of”，以及“composed of”)。

本说明书中引用的所有参考文献以其全部内容通过引用并入本文。特别地，本文具体引用的所有参考文献的教导通过引用并入。

除非另有说明，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员所理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则类似形式“一”(“a”)、“一”(“an”)和“该”(“the”)包括单数和复数引用。

术语“其同系物”指如本文要求保护的重组多肽，其来源于其他物种、尤其是属于其他酵母菌物种，如本文所述的从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)获得的SEQ IDNo.1的γ-单元。其同系物包括来自其他酵母属(saccharomyces)物种以及来自其他真核生物物种的相同分子，特别是来自酵母菌和细菌物种，如假丝酵母属(candida)、曲霉属(aspergillus)、耶氏酵母属(yarrowia)、青霉菌属(penicillum)、红冬孢酵母属(Rhodospiridium)、分枝杆菌属(mycobacteria)、毛壳菌属(chaetomium)。

术语“重组”指自然界中不存在的多肽或以前从未从自然界中分离出来的多肽。

术语“候选化合物”指一个分子作为小分子、化学或生物分子，尤其是由氨基酸残基组成或包含氨基酸残基的分子。

术语“晶体”是指任何给定的单分子或分子种类以空间重复方式进行的超分子组装。因此，分子或分子种类可定义为任何化学部分，无论原子通过共价键和/或非共价键连接。

如本文所用，术语“渗透剂”指影响渗透的化合物。作为示例包括但不限于甘油、蔗糖、一般糖、三甲胺-N-氧化物(TMAO)和乙二醇。

术语“具有零净电荷的聚合物”指由数百道尔顿大小范围内的重复化学单元的连续共价连接构成的聚合物。重复单元的特性满足零净电荷的定义，理想情况下，重复单元不包含电荷(既不带正电荷也不带负电荷)。如果存在电子电荷，它们应该以平衡的方式出现，即值为2的正电荷应由值为2的负电荷所平衡(counter-balanced)。这种具有平衡(counter-balanced)电荷的分子被称为两性离子物质或化学物质。

术语“非离子聚合物”是指由数百道尔顿大小范围内的重复化学单元的连续共价连接构成的分子。当化学单元不包含电子电荷时，所得聚合物称为非离子聚合物。

非共价键的示例包括但不限于氢键、静电相互作用和范德华力。晶体中一个分子与另一个分子的关系可以用严格的对称规则来描述，这些规则是基于布拉维斯(Bravais)晶格的。

如本文所用，术语“抑制剂”指化合物，包括能够降低生物活性的生物或化学实体。在本文中，抑制剂是降低酮还原酶活性、烯酰还原酶活性和/或MPT活性的生物或化学分子。具体而言，抑制剂是将所述生物实体的“正常”活性降低至少十倍的实体，例如至少二十倍，尤其是至少五十倍。

除非另有说明，术语FAS蛋白复合物或FAS指FAS I蛋白复合物。

术语“FAS蛋白复合物”是指由至少三个部分组成的蛋白复合物，即FAS I的FAS蛋白复合物的α-亚基、β-亚基和第三单元，例如候选化合物、如本文所定义的多肽，包括SEQID No.1的γ亚基或其片段、或其同系物。

SEQ ID No.1的多肽代表来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的TMA 17分子。到目前为止，所述多肽被描述为在应激时被诱导，并且应该与蛋白酶体组装相关。

本发明人认识到，当存在于FAS复合物中时，SEQ ID No.1的氨基酸1至132的重组多肽或其功能片段、或其同系物显示出比含有SEQ ID No.1的完整氨基酸序列的FAS复合物更高的酮还原酶活性。即，本发明人认识到，SEQ ID No.1的氨基酸133至150代表与FAS蛋白复合物中酮还原酶的相互作用序列。如下所示，SEQ ID No.1全长多肽的存在对FAS蛋白复合物中存在的各种酶的活性具有调节作用。

在进一步实施方案中，提供了一种重组多肽，其含有SEQ ID No.1的氨基酸的至少部分，包含SEQ ID No.1的aa1至aa112，以及位于SEQ ID No.1的C-末端至aa112的插入物。所述插入物的长度为至少25个氨基酸，任选地，所述重组多肽的所述插入物的C-端具有SEQID No.1的aa113至aa150的aa中的至少一个。

在本发明的进一步实施方案中，包含SEQ ID No.1的氨基酸的重组多肽进一步含有至少15个、如至少20个、如至少23、25、28、30个或更多个氨基酸的插入物或其功能片段或其同系物。例如，插入物是5kDa至25kDa大小的形式。

即，提供了一种包含SEQ ID No.1的氨基酸1至氨基酸112的氨基酸的重组多肽，其进一步含有至少25个氨基酸的插入物，或所述重组多肽的功能片段、或其同系物。

在重组多肽的一个实施方案中，该多肽是含有所述插入物、从N-末端到C-末端由以下组成的多肽：

-第一单元，其包含SEQ ID No.1的氨基酸1至氨基酸112；

-由Seq.ID No.1的氨基酸113至132组成的第二单元，其含有在SEQ ID No.1的氨基酸112至132的氨基酸之后插入的插入物；以及，

-任选地，第三单元，其包含SEQ ID No.1的氨基酸133至150；

或所述多肽的功能片段、或其同系物。

本发明人认识到，在SEQ ID No.1的氨基酸112中的任何一个之后和SEQ ID No.1的SEQ ID No.132之前的插入物可能特别有益于避免对剩余氨基酸的相互作用性质产生任何负面影响。在一个实施方案中，所述重组多肽包括一种多肽，其中在由含有所述插入物的氨基酸113至132组成的第二单元中，可能不存在氨基酸113至132的至少一个或全部。在一个实施方案中，缺失SEQ ID No.1的113至132的aa。

此外，一种重组多肽，其由SEQ ID No.1的aa1至aa112的从N-末端至C-末端，至少25个氨基酸、如至少50个氨基酸的插入物，和SEQ ID No.1的aa133至aa150组成。

在本发明的实施方案中，根据本发明的重组多肽中存在的插入物是酶。特别地，该酶选自去饱和酶、硫酯酶、加氧酶、羟化酶、环氧化酶、脂肪酸裂解酶。

根据本发明的多肽中存在的插入物可具有至多60kDa的大小，如至多50kDa，例如40kDa、35kDa、30kDa、至多25kDa、至多20kDa。插入物至少具有如上所述的大小，即至少15个氨基酸。例如，插入物的大小为至少2kDa，如至少2.5kDa、如至少3kDa。

在本发明的实施方案中，所述多肽由以下组成

i.)Seq ID No.2的至少6个连续氨基酸，如至少8个连续氨基酸，例如至少10个连续氨基酸或其功能片段、或其同系物；或

ii.)Seq ID No.3的至少5个连续氨基酸，如至少6个连续氨基酸，例如至少8个连续氨基酸或其功能片段、或其同系物；或

iii.)Seq ID No.4的至少6个连续氨基酸，如至少8个连续氨基酸，例如Seq IDNo.4的至少10、12或14个连续氨基酸，或其功能片段、或其同系物。

i.)至iii.)项下提到的多肽代表改变酶活性、特别是抑制酶活性的肽。所述酶活性特别是FAS复合物的酶活性。

SEQ ID No.2的氨基酸代表与FAS蛋白复合物中存在的酮还原酶的相互作用界面。SEQ ID No.2的氨基酸代表与烯酰还原酶相互作用的γ-单元中存在的氨基酸，SEQ IDNo.4的氨基酸代表与FAS蛋白复合物的MPT相互作用的γ-单元中的氨基酸。

即，如上文所定义的涉及SEQ ID No.2、3和4的多肽代表与FAS蛋白复合物的其他亚基中存在的相应酶活性相互作用并因此调节的部分。

如本发明人所证明，γ-亚基也称为TMA 17，与FAS蛋白复合物的其他亚基、即α-亚基和β-亚基具有各种相互作用位点。

在进一步的方面，本发明提供包含根据本发明的重组多肽的脂肪酸合成酶蛋白复合物。进一步，根据本发明的脂肪酸合成酶蛋白复合物含有如本领域所述的α-和β-亚基。

如下所示，本发明人意外地确定了存在于FAS蛋白复合物(FAS I)中的另一个亚基，即先前已知仅与蛋白酶体或核糖体相互作用的Tma17多肽。

在本发明的一个实施方案中，含有如本文所述的重组多肽的脂肪酸合成酶蛋白复合物用于生产脂肪酸和生物燃料，特别是用于生物生产游离脂肪酸、酮脂肪酸、脂肪酸醇、环状脂肪酸及加长脂肪酸(elongated fatty acids)。也就是说，特别是使用如所定义的含有插入物的重组多肽，可以将进一步的酶活性引入所述序列中。所述酶活性允许作用于脂肪酸，从而进一步改变FAS蛋白复合物的产物。如果根据本发明的多肽对FAS蛋白复合物上存在的至少一种酶具有抑制活性，则可抑制其中进行的脂肪酸合成步骤之一，从而改变所获得的产物。

本领域技术人员非常了解用于获得改性或改变的脂肪酸残基的合适的插入物。

在进一步的实施方案中，本发明涉及编码本发明多肽的核酸分子。核酸分子可由本领域已知的核酸组成，包括DNA、RNA或其他分子、如PNA等。进一步，提供了包含编码所述肽的本发明核酸序列的载体。本领域技术人员熟知合适的载体系统和载体，尤其是允许真核细胞的转染和转导的载体，包括转化和重组到酵母菌基因组中。

此外，本发明涉及含有本发明核酸分子和/或表达本发明多肽的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是含有I型脂肪酸合成酶(FAS I)、如酵母菌的微生物。

在进一步的实施方案中，描述了可通过包含以下步骤的方法获得的分离脂肪酸合成酶蛋白复合物：

a)提供含有脂肪酸合成酶蛋白复合物的粗样品；

b)进行第一离心步骤，在25,000至35,000xg分离细胞碎片；

c)将0％至25％(w/v)的量的渗透剂和任选的允许硫醇-烷基化和/或还原半胱氨酸的化合物补充到从该第一离心步骤获得的上清液；

d)通过以50,000至150,000xg、如80,000至120,000xg离心，进行第二离心步骤；

e)用水溶性聚合物、特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物、如聚亚烷基二醇、聚胺或聚羧酸盐处理从该第二离心步骤获得的上清液以进行沉淀；

f)将聚合物基沉淀物、如聚烷基二醇基沉淀物重新悬浮在不含所述聚合物、如聚烷基二醇的缓冲液中后，使用渗透剂与该聚合物基沉淀物进行密度梯度离心；

g)可选地重复一次或多次步骤e)和f)

h)以水溶性聚合物基的沉淀物、如脂肪酸合成酶蛋白复合物的聚亚烷基二醇基沉淀物进行浓缩；以获得纯的脂肪酸合成酶蛋白复合物。

即，如WO 2017/211775 A1(其通过引用全部包括在本文中)中详细的描述，该方法允许分离包括本文所述新鉴定的γ-亚基的FAS蛋白复合物。

虽然现有技术将FAS蛋白复合物描述为仅由两个亚基组成的复合物，但实施WO2011/211775 A1中所述方法的本发明人获得了含有第三亚基的FAS蛋白复合物。所述亚基为Tma17多肽。

在一个实施方案中，半胱氨酸的还原是通过使用膦基的还原剂、如三(2-羧乙基)膦(tricarboxyerthylphosphine)(TCEP)来实施的。进一步，密度梯度在室温下、如在18℃至22℃下实施，此外，在本发明的一个实施方案中，纯化步骤期间的盐浓度(NaCl和KCI组合)保持在150mM以下，以最小化γ-单元的解离。

此外，本发明涉及一种用于确定能够抑制酮还原酶、尤其是存在于FAS蛋白复合物中的酮还原酶的候选化合物的适用性的方法，包括以下步骤：

-酮还原酶、特别是含有候选化合物的FAS蛋白在含有水溶性聚合物、特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物如聚亚烷基乙二醇、聚胺或聚羧酸盐(特别是聚乙二醇)的池液(reservoir solution)中的结晶化，或提供结晶的酮还原酶，特别是含有候选化合物的FAS蛋白复合物；

-通过

-基于所述分析，确定候选化合物作为酮还原酶、特别是FAS蛋白复合物的酮还原酶的抑制剂的适用性，或者，替代地或相结合，

-制备酮还原酶、特别是FAS蛋白复合物，其含有能够抑制酮还原酶、特别是存在于FAS蛋白复合物中的酮还原酶的候选化合物，用于冷冻电子显微术分析(cryo-electronmicroscopy analysis)；

-用所述酮还原酶、特别是FAS蛋白复合物进行冷冻电子显微术；

-确定候选化合物作为酮还原酶、特别是FAS蛋白复合物的酮还原酶抑制剂的适用性。

进一步，本发明涉及一种用于确定能够抑制烯酰还原酶、特别是FAS蛋白复合物中存在的烯酰还原酶的候选化合物的适用性的方法，包括以下步骤：

-烯酰还原酶、特别是含有候选化合物的FAS蛋白在含有水溶性聚合物、特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物如聚亚烷基乙二醇、聚胺或聚羧酸盐(特别是聚乙二醇)的池液中的结晶化，或提供结晶的含有候选化合物的烯酰还原酶、特别是含有候选化合物的FAS蛋白复合物；

-通过

-基于所述分析，确定候选化合物作为烯酰还原酶、特别是FAS蛋白复合物的烯酰还原酶的抑制剂的适用性，或者，替代地或相结合，

-制备烯酰还原酶、特别是FAS蛋白复合物，其含有能够抑制烯酰还原酶、特别是存在于FAS蛋白复合物中的烯酰还原酶，以用于冷冻电子显微术分析；

-用所述烯酰还原酶、特别是FAS蛋白复合物进行冷冻电子显微术；

-确定作为烯酰还原酶、特别是FAS蛋白复合物的烯酰还原酶的抑制剂的候选化合物的适用性。

此外，本发明提供一种用于确定能够抑制丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)、特别是FAS蛋白复合物中存在的MPT的候选化合物的适用性的方法，其包括以下步骤：

-MPT、特别是含有候选化合物的FAS蛋白在含有水溶性聚合物、特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物如聚亚烷基乙二醇、聚胺或聚羧酸盐(特别是聚乙二醇)的池液中的结晶化，或提供结晶的MPT、特别是含有候选化合物的FAS蛋白复合物；

-通过

-基于所述分析，确定作为MPT、特别是FAS蛋白复合物的MPT的抑制剂候选化合物的适用性，或者，替代地或相结合，

-制备MPT、特别是FAS蛋白复合物，其含有的候选化合物能够抑制MPT、特别是存在于FAS蛋白复合物中的MPT，以用于冷冻电子显微术分析；

-用所述MPT、特别是FAS蛋白复合物进行冷冻电子显微术；

-确定作为MPT、特别是FAS蛋白复合物的MPT抑制剂的候选化合物的适用性。

即，所述用于鉴定能够抑制相应酶(酮还原酶、烯酰还原酶和MPT)、特别是抑制存在于FAS蛋白复合物中的所述酶的候选化合物的方法，包括所述酶或含有所述酶的蛋白复合物的结晶化，或者替代地或相结合地通过冷冻电子显微术检查与相应酶相互作用的所述候选化合物。

在一个实施方案中，候选化合物可以是抑制上述酶中的至少两种、例如抑制酮还原酶和烯醇还原酶的化合物。

例如，候选化合物可从含有如本文所述的上述抑制性肽序列的肽库中获得，其中这些序列通过随机突变或定点突变随机化。应考虑到候选化合物结合酶、特别是选择酮还原酶、烯醇还原酶或MPT中的一种，并引入到γ-亚基，并因此进行确定对相应酶的抑制活性。当然，候选化合物还包括稳定γ-亚基的天然抑制单元的抑制干扰的化合物。本领域人员非常了解确定候选化合物有效性的库和方法。

在另一方面，确定了一种用于设计FAS蛋白复合物中存在的酶活性的抑制剂的方法。即，提供了一种设计酮还原酶活性、特别是FAS蛋白复合物中酮还原酶活性的抑制剂的方法，包含步骤：

-突变Seq ID No.2的至少6个连续氨基酸、如至少8个连续氨基酸、例如至少10个连续氨基酸的多肽，或其功能片段，或其同系物，通过随机或定点突变所述多肽的至少一个氨基酸。

-确定抑制酮还原酶活性、特别是FAS蛋白复合物的酮还原酶活性的适用性。

在另一方面，提供了一种用于设计烯酰还原酶活性、特别是FAS蛋白复合物中的烯酰还原酶活性的抑制剂的方法，包含步骤：

-突变Seq ID No.3的至少5个连续氨基酸、如至少6个连续氨基酸、例如至少8个连续氨基酸的多肽、或其功能片段，通过随机或定点突变所述多肽的至少一个氨基酸；

-确定抑制烯酰还原酶活性、特别是FAS蛋白复合物的烯酰还原酶活性的适用性。

最后，一种设计MPT活性、特别是FAS蛋白复合物中的MPT活性的抑制剂的方法，包含步骤：

-突变Seq ID No.4的至少6个连续氨基酸、如至少8个连续氨基酸、例如Seq IDNo.4的至少10、12或14个连续氨基酸的多肽、或其功能片段或其同系物；通过随机或定点突变所述多肽的至少一种氨基酸。

-确定抑制MPT活性、特别是FAS蛋白复合物的MPT活性的适用性。

设计包括本文所定义的多肽的改变或修饰。也就是说，氨基酸残基本身可以被不同的氨基酸残基取代，或者，替代地，核酸残基可以被修饰。进一步修饰包括对至少一个氨基酸残基进行化学修饰，其允许点击化学，从而与酶中存在的相互作用对应物建立共价键。因此，可以实现瞬时或永久抑制。进一步，抑制剂可经修饰以包括迈克尔反应或迈克尔加成反应中的受体。此外，抑制剂可含有可与相应酶的相互作用对应物中存在的Lys或His反应的希夫碱构建部分。

此外，本发明提供了酮还原酶、烯酰还原酶和/或MPT的抑制剂。所述抑制剂可为含有抑制所提到的酶活性、即抑制KR、ER和MPT活性的所有三个抑制基团的抑制剂。所述抑制剂的设计是这样的，各自的部分可以与酶的对应物相互作用。特别是对于FAS蛋白复合物中存在的至少两种酶活性的抑制剂，例如MPT和ER或MPT和KR以及ER和KR的组合、或所有三种酶活性。

进一步，可以设想到FAS蛋白复合物含有相结合的本文所定义的多肽或抑制剂。即，所述FAS蛋白复合物可能是具有含有插入物的重组多肽的γ-亚基的FAS蛋白复合物，同时存在上述酶活性的至少一种的抑制剂。此外，本发明进一步的多肽包括在其Seq ID No.1的多肽中缺失Seq.ID No.2、3和4的至少一个序列或其片段的多肽。所述多肽可能含有额外的片段来维持潜在的γ-亚基结构。技术人员充分了解必需氨基酸的存在，以确保具有所需抑制特性的各自多肽的适用性。例如，MPT抑制位点被中性、碱性和/或极性氨基酸残基取代。

最后，本发明提供了根据本发明用于预防或治疗癌症、传染病、结核病或肥胖的抑制剂，针对细菌感染、特别是结核病或酵母菌感染的抗生素。

本技术还讨论了FAS蛋白复合物抑制剂(FAS I或FAS II)的适用性。因此，本发明的抑制剂代表了治疗疾病适合的抑制剂，其中FAS蛋白复合物是预防或治疗所述疾病或紊乱的目标分子。

酵母菌脂肪酸合成酶γ-亚基的探索

为了从机制上探寻控制酵母FAS迭代穿梭的结构决定因素，本发明人最初着手建立生化纯化程序，该程序将从酿酒酵母(S.cerevisiae)中产生高活性、生化和结构均一的FAS。为此，发明人将其先前发表的用于20S和26S蛋白酶体的无色谱纯化程序(J.Schrader等，Science.353,594-8(2016))应用于FAS。这种方法依赖于分级的PEG沉淀和密度梯度离心作为正交纯化步骤，例如，参见WO2017/211775A1。这允许在恒定(低)离子强度下进行非常温和的纯化，从233g湿重的酿酒酵母菌细胞中产生15-20mg电泳纯FAS。令人意外的是，在这些纯化条件下，发明人发现表观分子量为20kDa的蛋白质可重复地与FAS共纯化(图2a)。胰蛋白酶消化物的串联质谱法将该蛋白质鉴定为Tma17p。

在近五十年的FAS生化研究中，酵母菌FAS的额外的蛋白质亚基尚未被描述。Tma17p此前曾被描述参与细胞翻译或蛋白酶体组装(T.C.Fleischer等，Genes Dev.20,1294-1307(2006))。然而Tma17p与FAS在梯度40S区域的共纯化和共沉淀表明两者存在直接的生化相互作用。因此，发明人进行了一系列的控制实验，以确定Tma17p确实是FAS的真正的相互作用物。首先，发明人交叉验证了与FAS共纯化的20kDa蛋白鉴定为Tma17p。为此，发明人生产了Δtmal7敲除酵母菌株，并使用上述相同的方法从该菌株中纯化FAS，获得了相当数量的FAS。然而，如图2b所示，当从Δtma17菌株中纯化FAS时，纯化的FAS部分中没有20kDa的条带，证实了串联-MS的结果。其次，发明人研究了Tma17p与FAS相互作用的生化稳定性。为此，从野生型菌株中纯化的FAS被装载到含有50mM KCl、150mM KCl或250mM KCl的密度梯度上。以与重组Tma17p相同的方式，Tma17p在250mM KCl时从FAS中定量解离，导致Tma17p在蔗糖密度梯度的顶部部分中沉积。在150mM KCl时，与FAS共同纯化的Tma17p约有一半被解离，而在50mM KCl时，与FAS共同纯化的Tma17p仍然与FAS紧密联系，并在40S区域与FAS共同沉积。第三，发明人研究了将重组Tma17p加入ΔTma17p-FAS中是否可以重构FAS-Tma17p复合物。为此，将ΔTma17p-FAS与更多的重组荧光标记Tma17p孵育，并在琼脂糖凝胶上进行天然凝胶电泳分析，然后对FAS结合的Tma17p进行荧光定量分析。在本程序中，标记的Tma17p向前迁移，而FAS由于其固有分子量为2.6MDa而显著延迟迁移。Tma17p与FAS的结合导致其迁移到与FAS共同迁移的位置的转变。实验结果显示，Tma17p与FAS具有正协同结合，K

γ-亚基稳定旋转的FAS构象

已经确定Tma17p构成了FAS的确信的γ-亚基，发明人探究γ-亚基的结合是否会影响FAS的结构。因此，发明人产生ΔTma17p-FAS晶体,其属于原始单斜空间群P2

γ-亚基引起的动态ACP结构域的运动

ΔTma17p-FAS与FAS全酶的冷冻-EM和晶体结构的结构比较显示了几个差异：1)FAS全酶结构的β亚基相对于中心3重对称轴旋转约15°，其位于邻近的β-亚基所在的穹顶的顶部。这导致AT结构域向内移动，MPT结构域向外移动，FAS全酶结构整体压缩

γ-亚基的功能和构象影响

那么FAS全酶中γ-亚基的生物学功能是什么？酶活性本身并不需要这种蛋白质，因为迄今为止对酵母FAS的大多数酶研究都是在缺乏γ-亚基的情况下进行的。FAS全酶内γ-亚基结合的结构模式表明，通过受损的底物结合，FAS全酶内的酶活性受到部分抑制，因此预计对还原酶活性有最显著的影响。为了测试这一点，发明人分析了稳态动力学，并测量了ΔTma17p-FAS相对于所有底物(特别是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和NADPH)不同浓度下的底物转化率(the rates of substrate turnover)。该分析揭示了乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的饱和动力学，其结合通过添加饱和量的γ-亚基而被部分抑制。γ-亚基结合导致乙酰辅酶A亲和力降低2倍，丙二酰辅酶A亲和力降低4倍。相比之下，不同浓度NADPH下的比率分析更为复杂，并且显示了出底物依赖性激活模型是在ΔTma17p-FAS(图5)带有E(酶)、S(底物)、ES(同源酶底物复合物)、SE(非同源或弱亲和酶底物复合物)、SES(同时非同源/弱亲和力和同源酶-底物复合物)的情况下。然而，FAS全酶对NADPH表现出典型的双曲线米氏依赖性。在γ-亚基饱和浓度下，NADPH的K

此外，本文描述的结构数据表明γ-亚基的结合影响FAS巨型酶的构象图景(landscape)。在γ-亚基存在时，具有轴向定位的ACP结构域的旋转紧致构象是有利的，而在没有γ-亚基时，采用的是具有等位ACP结构域的非旋转构象。为了解决这一假设，发明人首先通过EM测试将γ-亚基滴定到ΔTma17p-FAS中是否会导致采用旋转紧实构象的单个粒子分数增加。为此，发明人收集了几个用不同数量的γ-亚基重构的FAS全酶的冷冻-EM数据集。然后，发明人从每个单独的数据集中细化了3D结构，并分析了与非旋转构象或旋转构象的总体相对应的粒子的相对丰度。定量分析表明，旋转构象与用于重构的γ-亚基的数量有明显的相关性。而在ΔTma17p-FAS样品中，2％的选定粒子对应于旋转状态，当γ-亚基的摩尔过量为6倍时，这一比例增加到88％，当γ-亚基的摩尔过量为12倍时，这一比例增加到95％。

为了以定量方式评估γ-亚基结合引起的构象变化，发明人接下来应用了他们先前建立的3D分类冷冻-EM方法，并结合能量图景(landscapes)计算(D.Haselbach等，Cell.172，454-458.ell(2018))。为此，发明人最初使用与中心轮相对应的遮盖(mask)细化了单个数据集的3D结构，该遮盖在非旋转结构和旋转结构中的构象不可区分。为了深入了解每个单独数据集中穹顶所占据的构象空间，发明人随后在不对齐的情况下进行了3D分类，每批6500个粒子，完全依赖于先前获得的中心轮的对齐参数。由此获得的单个3D类别被单独细化以确保其有效性，并随后进行3D主成分分析(PCA)。此3D PCA的第一特征向量描述穹顶的压缩(compaction)，而第二特征向量表示穹顶的显著旋转。由于发明人对每个3D类别中的粒子数量有确切的了解，因此发明人能够通过在由PCA的第一和第二特征向量定义的坐标系内执行玻尔兹曼插值来映射能量图景。每个单独数据集的能量图景概括了γ-亚基结合和随后形成的FAS全酶导致采用旋转构象的观察结果。此外，能量图景表明γ-亚基的结合导致形成能量屏障，限制进入非旋转构象。

已经进行了初步的原理验证实验，这清楚地表明γ-亚基确实可以用作将蛋白质引入FAS室的支架。本实验的基本原理如下：γ-亚基的卷曲螺旋(coiled-coil)和KR结合片段(残基114-132)之间的柔性连接片段已被单个(15kDa大小)拷贝或两个(30kDa大小)的小荧光蛋白UnaG拷贝所取代。然后将所得的UnaG-γ-亚基融合蛋白与Δγ-FAS重构，并在蔗糖密度梯度上分离混合物。梯度在UV照射下成像、分级(fractionated)，单独部分进行SDS-PAGE，以显示在40秒范围内与FAS共沉积的相应UnaG-γ亚基融合蛋白的比例。对照组中没有蛋白质与FAS一起沉积。相比之下，在单个UnaG-γ亚基融合构建体的情况下，可见绿色荧光显著增加，以及在SDS-PAGE中发现相当大比例的UnaG-γ亚基融合蛋白与FAS共沉积。在双UnaG-γ亚基融合构建体的情况下，可以看到荧光的一些增加，其与FAS对照相比增加，但小于单UnaG-γ亚基融合构建的情况。SDS-PAGE分析双UnaG-γ亚基融合蛋白Δγ-FAS重构实验表明，与单UnaG-γ亚基融合蛋白相比，用FAS重构的双UnaG-γ亚基融合蛋白的数量减少。

综上所述，该原理验证实验表明，使用γ亚基作为支架将酶模块引入FAS穹顶的策略原则上适用于蛋白质。

进一步进行了该原理验证实验：通过用大肠杆菌硫酯酶A(TesA)的编码序列替换γ-亚基的残基114-132，产生了TesA-γ-亚基融合。硫酯酶的功能在于识别脂链与酰基载体蛋白共价，并在催化水解为游离脂肪酸(FFA)后释放。FFA在工业上是精细化学品的重要合成前体。在大肠杆菌中重组产生TesA-γ-亚基融合蛋白构建体，并纯化至接近均一性。TesA-γ-亚基融合蛋白可以与Δγ-FAS以与上述单个UnaG-γ-亚基融合蛋白类似的效率重构。活性分析确定上述与Δγ-FAS重构的TesA-γ-亚基融合蛋白中TesA的活性。

结论

本文中，酵母FAS巨型酶复合物的新型γ-亚基的鉴定已被证明，由于纯化FAS所采用的相对较高的盐条件，该复合物很可能迄今未被检测到。γ-亚基以前被认为是核糖体相关(如Tma17p)或参与蛋白酶体(如Adc17p)组装，现在可以与酵母中的细胞脂肪酸生物合成紧密联系在一起。观察到的γ-亚基与FAS的弱相互作用可能提示是非特异性结合。然而，以下实验证据可以有力地排除这一点：1)冷冻-EM和X射线结晶学的结构解析表明γ-亚基直接影响FAS所采用的构象图景，非旋转态在其不存在时优先占据，旋转态通过其结合而稳定。γ-亚基的结合似乎为FAS引入了一个能量屏障，以获得非旋转构象。2)对非旋转和旋转状态的仔细检查表明，前者与占据与本领域先前描述的KS结构域相邻的位置的ACP结构域相关联，而与AT结构域相邻的ACP位置是后者状态的特征。3)通过对旋转状态结构的彻底检查，在位于AT结构域的ACP结构域附近发现了额外的密度。通过使用XL-MS和模型构建，发明人能够明确地将这种卷曲螺旋形密度分配给γ-亚基。发明人进一步能够确定γ-亚基的N-末端24残基在空间上封闭ER活性位点，并且能够追踪γ-亚基的C-末端18残基占据KR活性位点并在空间上竞争NADPH结合。4)这些发现暗示了FAS全酶还原酶活性的调节，发明人能够通过图5中的稳态酶动力学证实这一点。对于FAS全酶，发明人发现在γ-亚基存在的情况下NADPH的结合亲和力降低了15倍，并且表现出饱和、经典的米氏动力学。在缺乏NADPH的情况下，动力学机制更为复杂，对NADPH的亲和力更强。这些结果表明，γ-亚基的另一个功能可能是将脂肪酸合成与NADPH的细胞丰度结合起来。

综上所述，除了鉴定FAS全酶的γ-亚基所产生的机理意义外，还产生了一些明确的重要生物技术意义。1)考虑到γ-亚基对FAS还原酶活性的抑制作用，γ-亚基基因缺失的酵母菌株将有利于酵母通过生物技术生产脂肪酸和生物燃料。2)可以预见，天然γ-亚基结构支架的开发将用于将野生型脂肪酸合成酶(如去饱和酶)中缺失的已知和设计的酶模块引入FAS反应室。特别是，卷曲螺旋的C-末端和KR结合片段之间的连接片段的替换似乎是出于此目的而预设的。3)基因工程、分裂(segmentation)和亲和力成熟可能允许操纵和利用γ-亚基的ER-和KR-结合片段，将其转化为广义脂肪酸合成酶抑制剂。这些化合物将有利于治疗各种疾病，包括肺结核、肥胖症和癌症。

方法

γ-亚基与FAS的结合亲和力

为了确定γ-亚基与FAS的结合亲和力，根据制造商的推荐，用NHS-罗丹明(ThermoFisher Scientific)标记γ-亚基，然后通过脱盐柱去除多余的未反应染料。将不同浓度的NHS-罗丹明标记的γ-亚基滴定至15.38pmol的ΔTma17p-FAS在分析缓冲液中，总反应体积为40μL的。混合物在30℃下孵育30分钟。然后将每个反应物的10μL加载到1.5％(w/v)琼脂糖凝胶(在0.5X TBE，2mM MgCl

γ-亚基的盐浓度依赖性解离

将FAS全酶(0.52mg)加载在含有10mM DTT的纯化缓冲液中的线性10-45％(w/v)蔗糖梯度上，并添加0、100或200mM KCl。梯度在4℃下以120,000x g离心16h，并以200μL部分进行收集。然后通过SDS-PAGE分析三种盐浓度下梯度的所有部分。

FAS全酶的制备重构

为了重构FAS全酶，向4μMΔTma17p-FAS中添加100倍过量的γ-亚基，并在30℃下培养30min。然后将蛋白质加载到含有10mM DTT的纯化缓冲液中的10-45％(w/v)蔗糖梯度上，然后在4℃下以64,000x g离心16h。以400μL部分收集梯度。然后，发明人使用SDS-PAGE鉴定含有FAS全酶的部分。通过添加40％(v/v)PEG400，将选定的部分汇集并沉淀。离心(30,000x g，30分钟)后，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮在含有10％(w/v)蔗糖、10mM DTT和0.01％(w/v)LMNG至10mg/ml的最终浓度。

EM样品制备

使用蛋白质浓度为0.5mg/ml的ΔTma17p-FAS和FAS全酶复合物制备EM载网(grid)。在4℃下，将粒子吸附到附接到Quantifoil(3,5/1)(Quantifoil，耶拿市，德国)载网上的连续碳膜上2min。然后将载网转移到Vitrobot Mark IV(Thermofisher，德国)浸入式-冷冻柜中，其中该载网在吸干后在4℃和100％湿度下玻璃化(vitrified)持续8s。对于γ-亚基滴定实验，使用1.5mg/mlΔTma17p-FAS溶液，并以0、2、6、24和96倍过量滴定重组纯化的γ-亚基。将蛋白质混合物在30℃下孵育30分钟，然后在4℃下保存。将每个样品的4μL施加到新型辉光放电Quantifoil R1.2/1.3多孔碳网(Quantifoil Micro Tools,耶拿市，德国)，然后进行上述浸入式-冷冻。

冷冻EM数据采集与图像处理

使用Falcon 3(集成模式)摄像机或K2 summit(计数模式)摄像机(Gatan，Inc.)在300kV下运行的Titan Krios(Thermo Fisher Scientific)上获取数据。表S3汇总了数据收集和处理统计数据。使用Motioncor2(S.Q.Zheng等，Nat.Methods.14，331-332(2017))对采集的影像进行运动校正和加权，所有画面分为5×5块。对齐的画面用于使用GCTF(K.Zhang，JStruct.Biol.193，1-12(2016))来进行每个显微图CTF估计。使用Gautomatch(https://www.mrc lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/)进行粒子选择。除非另有规定，所有后续图像处理步骤均使用Relion 3.0执行(J.Zivanov等，Elife.7(2018)，doi:10.7554/Elife.42166)。对提取的粒子进行3轮无参考2D分类，以去除不良/空白图像。使用D3对称性，在中心轮周围使用遮盖对剩余粒子进行细化。EMDB-1623经过低通滤波至

能量图景

按照上述方法处理数据，直到第一个分类步骤。对于该分析，将约100,000个粒子的批次分为15类。在不应用任何遮盖的情况下，再次选择并细化属于每个类别的粒子。如前所述(D.Haselbach等，Nat.Commun.8，1-8(2017))，将每个数据集(总共165个)的细化3D体积用于构象图景分析。3D体积首先在USCF chimera(E.F.Pettersen等，J Comput.Chem.25，1605-1612(2004))中以分子的中心轮作为参考点对齐。在COW软件套件(www.cow-em.de)中进行进一步的步骤。将3D体积归一化并过滤至

其中，每个体积X

其中，T是绝对温度，K

结晶与稳定化

含有10％蔗糖(w/v)、10mM DTT和0.01(w/v)LMNG的纯化缓冲液中的ΔTma17p-FAS通过在750μL结晶缓冲液A储液上方的Crystalgen悬滴扩散板(Jena Bioscience，德国)中混合1μL蛋白质+1μL结晶缓冲液A，以7mg/ml的浓度结晶。对于FAS全酶，7倍摩尔过量的γ-亚基(在用于ΔTma17p FAS的缓冲液中)添加到7mg/ml的ΔTma17p-FAS蛋白质溶液中，并在30℃下孵育30分钟。然后重构复合物通过在500μL结晶缓冲液B储液上方的Chryschem坐滴蒸汽扩散板(Hampton Research，亚里索维耶荷市，USA)中混合1μL蛋白质+1μL结晶缓冲液B进行结晶。晶体在18℃下生长需要3-7天，通常大小约为150x200x200μm。

通过使用

X射线衍射数据采集

这些晶体在安装在磁性销(magnetic pins)上的Spine Litholoops(MolecularDimensions,Suffolk,UK or Jena Bioscience,耶拿市，德国)中收集，并在液氮中浸入冷却进行玻璃化。使用MD3垂直轴衍射仪(EMBL and Arinax，Moirans，法国)和EIGER 16M探测器(Dectris，巴登，瑞士)在PETRA III储存环(DESY,汉堡市，德国)的EMBL光束线P14上收集数据。使用白束折射透镜变换器和狭缝获得与晶体尺寸匹配的均匀X射线束(J.Schrader等,Science.353,594-8(2016))。衍射数据被缩放并与XDS程序包(W.Kabsch，IUCr，XDS.Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66，125-132(2010))整合。

X射线结构测定

ΔTma17p-FAS的初始阶段通过使用酿酒酵母菌FAS结构(PDB ID:2UV8)、利用MOLREP(A.Vagin，A.Teplyakov，Acta Crystallogr.Sect.DBiol.Crystallogr.66，22-25(2010))进行分子置换来确定。该模型通过在Coot(P.Emsley，K.Cowtan ActaCrystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.60，2126-2132(2004))进行的几轮交互式手动建模和Refmac5(G.N.Murshudov等，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.67，355-67(2011))中的细化而建立和优化。最后，进行TLS细化，每个TLS结构域由单独的酶结构域定义。得到的结构显示出良好的立体化学性质，为19.4％/21.4％(R/R

利用改进的ΔTma17p-FAS晶体结构，通过用MOLREP分子替换FAS全酶衍射数据确定初始相。发现获得的密度图与FAS全酶模型(由冷冻-EM确定)比ΔTma17p-FAS结构的相关性更好。因此，发明人使用了来自FAS全酶冷冻-EM模型的α-亚基和β-亚基模型对X射线数据进行了初步细化。值得注意的是，在细化之前，ACP结构域和γ-亚基被从结构中移除，以避免引入相偏倚。在Refmac5中经过几轮刚体细化后，分别对应于AT和ER结构域旁边的ACP结构域和γ-亚基的差异密度可以很容易识别。然后将缺失的区域放入各自的密度中，然后使用Coot和Refmac5进行额外的细化。由于FAS全酶结构的分辨率，发明人选择仅将该结构沉积为聚Ala-迹线。

EM建模

晶体ΔTma17p-FAS模型用作冷冻-EM确定的ΔTma17p-FAS和FAS全酶结构的初始模型。使用UCSF chimera将其作为刚体(rigid body)固定在EM密度中，见上文。然后在Refmac5中执行了另一轮刚体细化。然后，模型在Coot中进行了几轮手动建模，并在Refmac5中进行了细化。使用Robetta(D.E.Kim,等,Nucleic Acids Res.32,W526-31(2004))预测服务器基于序列同源性生成了几个γ-亚基模型。使用UCSF chimera，将所有这些细胞都固定在FAS全酶图谱中的“额外密度”中。然后，根据交联数据以及可见的侧链密度，将具有最佳拟合的模型手动建模为密度。该蛋白有两个非结构化区域(60-76，114-132)无法可靠建模。

对于模型的最终完善和验证，发明人使用了使用D3对称重建的图谱，因为它们具有最佳分辨率。计算(FSC

材料

标准化学品来自Sigma-Aldrich(Taufkirchen，德国)。表面活性剂来自Anatrace(莫米市，USA)，结晶板来自Hampton Research(亚里索维耶荷市,USA)和Jena Bioscience(耶拿市，德国)，Litholoops来自Molecular Dimensions(Suffolk,UK)和Jena Bioscience(耶拿市，德国)。使用来自Rubarth Apparate GmbH(汉诺威市，德国)的

方法

酵母菌培养

所有酵母操作均按照标准方案(27)进行。本研究使用酿酒酵母菌株BJ2168(MATaprc1-407 prb1-1122 pep4-3 leu2 trp1 ura3-52 gal2)和tma17ΔBJ2168(MATa prc1-407 prb1-1122 pep4-3 leu2 trp1 ura3-52 gal2tma17::kanMX)。细胞在Infors 250升发酵罐、在YPD培养基中生长，并在对数后期(OD

酵母FAS的纯化

纯化方案改编自早期开发的用于纯化人类20S和26S蛋白酶体的方案(D.Haselbach等,Nat.Commun.8,1-8(2017))。我们从700g冷冻细胞珠(相当于233g湿细胞重量的酵母菌)开始，使用Retsch ZM200研磨机将其在液氮中研磨成细粉。研磨粉末在37℃水浴中解冻，从10×储备液中补充纯化缓冲液至0.33x浓度，然后将蔗糖粉末添加至20％(w/v)，将苯甲脒氯化物添加至10mM，将PMSF添加至1mM(从100mM丙醇储备液)。提取物在25℃下、在磁力搅拌器上培养30分钟，然后在4℃下以30,000xg离心30分钟。离心后，上清液通过干酪包布和神奇滤布(miracloth)各3层过滤，以获得S30酵母菌细胞提取物。为此，添加辛基葡萄糖新戊二醇(OGNG)(从10％(w/v)储备液)至最终浓度0.2％(v/v)，提取物在30℃下培养30分钟，然后在4℃下以100,000xg离心1小时。再次通过干酪包布和神奇滤布(miracloth)各3层过滤上清液。由此澄清的S100提取物用聚乙二醇400(PEG；数字表示PEG聚合物的平均分子量)进行差异沉淀。将PEG400添加至酵母菌S100提取物至浓度为20％(v/v)，同时在18℃下搅拌并培养30分钟。通过在4℃下以30,000xg离心30分钟来去除沉淀的蛋白质。然后通过如上所述将PEG400浓度提高至30％(v/v)来沉淀上清液。该步骤的沉淀物含有FAS，通过在4℃下以30,000x g离心30分钟回收，并重新悬浮在含有2％(w/v)蔗糖、10mMDTT和0.01％(w/v)月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)中，在18℃下置于轨道摇床中。将重新悬浮的材料装载在含有10mM DTT的纯化缓冲液中的10-45％(w/v)线性蔗糖梯度上，在4℃下以100,000xg离心16h。梯度以1ml部分收集。SDS-PAGE用于鉴定含有FAS的部分。通过添加40％(v/v)PEG400，将选定的部分汇集并沉淀。离心(30,000xg，30分钟)后，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮在含有2％(w/v)蔗糖、10mM DTT和0.01％(w/v)LMNG的纯化缓冲液中。将重新悬浮材料装载在含有10mM DTT的纯化缓冲液中的线性10-45％(w/v)蔗糖梯度上，并在4℃下以79,000xg离心16h。通过SDS-PAGE鉴定含有FAS的部分，在50μM丙二酰辅酶A和100μMNADPH存在下，在18℃下汇集并循环30min。通过添加40％(v/v)PEG400沉淀并浓缩蛋白质，并在含有2％(w/v)蔗糖、10mM DTT和0.01％(w/v)LMNG的纯化缓冲液中重新悬浮。需要另一轮在含有10mM DTT的纯化缓冲液中的10-45％(w/v)的线性蔗糖梯度，在4℃下以60,000x g离心16h，随后用40％(v/v)PEG400重新沉淀FAS部分，以在含有10％蔗糖(w/v)、10mM DTT和0.01％(w/v)LMNG的纯化缓冲液中以约15mg/ml的速度产生最终纯化蛋白制品。使用BSA标准通过Bradford分析(BioRad，慕尼黑市，德国)测定蛋白质浓度。该程序可重复产生15-20mg纯化酵母菌FAS。

γ-亚基的表达与纯化

将γ-亚基作为合成基因克隆到

对于纯化，将7克细胞重新悬浮在42ml的重悬浮缓冲液(20mM Tris-HCI pH 8.0，500mM NaCl，10mM咪唑、0.2mM PMSF，10mM苯甲脒)中。添加2U/ml DNA酶和0.33mg/ml溶菌酶后，悬浮液在4℃下培养30min。细胞在15000PSI下通过Avestin Emulsiflex C3均质机(Avestin，曼海姆市，德国)两次进行裂解。将获得的裂解物离心(30min，50,000g，4℃)并通过带有0.45μm孔径的Minisart NML Plus醋酸纤维素注射器式过滤器(Sartorius)进行过滤。将澄清的裂解物装载到Ni-NTA重力柱(5ml床体积)上，该重力柱用20柱体积(CV)的重悬浮缓冲液预平衡。用20CV重悬浮缓冲液洗涤柱，然后用20CV洗涤缓冲液(20mM Tris-HCI pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，0.2mM PMSF，10mM苯甲脒)洗涤柱。对于结合的γ-亚基的洗脱，使用5CV的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCI pH 8.0，500mM NaCl，500mM咪唑，0.2mM PMSF，10mM苯甲脒)并以2ml部分收集。用SDS-PAGE分析洗脱部分，合并含有γ-亚基的部分，并用光度法测定蛋白质浓度(MW＝17.4kDa，ε

为了进一步的动力学和结构研究，将纯化的γ-亚基解冻并在4℃下使用6-8kDaMWCO Dialyzer Mini D-Tubes(Millipore)透析到动力学分析缓冲液中。

稳态动力学

使用V-750紫外-可见分光光度计(Jasco Instruments)通过监测底物转化期间NADPH消耗进行动力学测量。我们分析了所有三种FAS底物的底物浓度依赖性：NADPH、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。使用制备柱(MN

我们通过光度法测定底物储备液浓度(NADPH:ε

通过测量λ＝340nm处NADPH吸收的时间依赖性变化，测定不同乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A浓度下脂肪酸合成的初始速度。为了研究乙酰辅酶A的浓度依赖性，丙二酰辅酶A(120μM)和NADPH(360μM)保持恒定，而乙酰辅酶A浓度在0-180μM之间变化。在丙二酰辅酶A的情况下，乙酰辅酶A(180μM)和NADPH(360μM)保持恒定，而丙二酰辅酶A的浓度在0-180μM之间变化。对于NADPH的相应研究，我们必须在λ＝371nm的波长下进行测量，因为由于高吸光度，无法在340nm处分析NADPH饱和度。所有动力学测量均通过孵育含0.254μM FAS、有或没有254μM的γ-亚基的蛋白质储备液，在30℃条件下进行30分钟。单个酶反应包含12.7nM FAS、有或没有12.7μMγ-亚基，0.2mg/ml溶菌酶作为非特异性缓冲蛋白，动力学分析缓冲液，各自所需的底物浓度和10％(w/v)蔗糖。单个反应预先混合并孵育(1min，30℃)。通过添加丙二酰辅酶A开始酶促反应，并在30℃下测量。获得的数据用不同的动力学模型、包括米氏方程、希尔方程或通过实施底物活化的改良米氏方程进行拟合。

交联质谱

我们通过交联质谱分析纯化的FAS全酶。蛋白复合物在30℃下与1mM BS3交联剂(来自100mM的DMSO储备液)孵育30min。反应用100mM Tris-HCl pH 8.0(来自1M储备液)进行猝灭。蛋白质分别用10mM二硫苏糖醇和40mM碘乙酰胺还原和烷基化。在存在1M尿素的情况下，蛋白质以1:50的酶-蛋白比用胰蛋白酶在37℃下消化过夜。用添加至最终浓度为0.5％(v/v)的三氟乙酸(TFA)将肽酸化，按照制造商的说明在MicroSpin Colums(HarvardApparatus)上脱盐，并真空干燥。在通过肽尺寸排阻(Superdexpetide 3.2/300柱，GEHealthcare)富集交联物前，肽在50μL 50％乙腈/0.1％(v/v)TFA中重新悬浮。收集50μL部分，通过LC-MS/MS分析首先洗脱并含有交联肽对的部分。

在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪上以技术重复的方式测量第一次重复的交联肽，该质谱仪与配备内部填充C

ProteomeDiscoverer 1.4(Thermo Fisher Scientific)用于将.raw文件转换为.mgf格式(信噪比1.5，前体质量为1000-10000Da)。生成的.mgf文件用pLink v.1.23(B.Yang等,Nat.Methods.9,904-906(2012))处理以识别交联肽。此处，应用默认设置，其中半胱氨酸的碳氮甲基化作为固定值，甲硫氨酸的氧化作为可变修改，FDR设置为0.01。人工评估第一次重复中FAS和TMA17之间的相互交联光谱。对于第二次重复，得分截止值为3(原始pLink得分的-log

序列表

<110> 马克斯·普朗克科学促进学会

<120> 脂肪酸合成酶、其抑制剂和修饰物及其用途

<130> LAF210731P

<150> EP19163958.2

<151> 2019-03-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

Met Cys Ser Ala Gly Gly Ile Arg Arg Pro Ile Gln Ile Glu Glu Phe

1 5 10 15

Lys Thr Ala Ile Ser Gly Met Ser Asp Met Glu Leu Ala Gln Ile Lys

20 25 30

Thr Glu Ile Glu Asn Ser Ile Asn His Leu Gln Arg Ser Asn Ala Arg

35 40 45

Leu Gly Lys Tyr Ile Ala Lys Leu Glu Gly Ala Asp Asp Arg Leu Glu

50 55 60

Ala Asp Asp Ser Asp Asp Leu Glu Asn Ile Asp Ser Gly Asp Leu Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Lys Asp Ser Val Arg Glu Asn Glu Ile Val Leu Asn Asn Tyr

85 90 95

Asn Glu Arg Val Asp Ala Leu Glu Gln Glu Thr Val Tyr Arg Lys Thr

100 105 110

Gly His Gly Lys Ser Lys His Glu Val Glu Ala Lys Asp Asn Thr Asn

115 120 125

Lys Gly Pro Asp Val Asp Met Asp Asn Ser Asn Val Asp Val Val Thr

130 135 140

Pro Asn Ser Ile Phe Ile

145 150

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial)

<400> 2

Val Asp Met Asp Asn Ser Asn Val Asp Val Val Thr Pro Asn Ser Ile

1 5 10 15

Phe Ile

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial)

<400> 3

Ser Ala Gly Gly Ile Arg Arg Pro Ile

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial)

<400> 4

Asp Asp Arg Leu Glu Ala Asp Asp Ser Asp Asp Leu Glu Asn Ile Asp

1 5 10 15

Ser