一株降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的假黄单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于有机污染物降解技术领域，具体涉及一株降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的假黄单胞菌及其应用。

背景技术

氯代苯、氯代苯酚和氯代苯胺是广泛应用于工农业生产、化学性质稳定的一大类化合物，如对二氯苯、对氯苯酚、对氯苯胺等，这些物质是基本的有机化工原料，在工业中的使用量越来越大，特别是在偶氮染料、农药、医药等的生产中。通常来说这些化合物是一大类具有“三致”效应(致突变、致癌、致畸效应)与遗传毒性的典型持久性污染物，可在环境中长期滞留，对生态环境和人类健康构成极大威胁。环境中氯代苯、氯代苯酚和氯代苯胺类化合物主要通过工业、农业等人为的生产和生活活动进入环境当中，这些物质进入水环境、土壤环境中可通过迁移、扩散作用造成大范围的环境污染，由于具有物理化学性质相对稳定、不易分解等特点，可长期影响生态环境，造成严重的环境污染，并危害人类的生命安全。吸附、光解、电解、氧化和臭氧化等不同的物理化学方法是用于去除工业废水或土壤中氯代苯、氯代苯酚和氯代苯胺的传统方法，但是这些方法通常具有较高的运营成本，并且还会形成需要在卫生填埋场中处理的污泥。生物处理方案为修复污染土壤提供了一种生态友好的选择，可以使污染物安全矿化和解毒。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的假黄单胞菌及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株假黄单胞菌，所述假黄单胞菌为假黄单胞菌DCB-2(Pseudoxanthomonasindica DCB-2)保藏编号为CCTCC NO:M 2022524。

上述假黄单胞菌在制备降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的制剂中的应用，其中，所述氯代苯为对二氯苯，所述的氯代苯酚为对氯苯酚，所述的氯代苯胺为对氯苯胺。

一种降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的生物制剂，包含保藏编号为CCTCCNO:M2022524的假黄单胞菌。

在上述方案的基础上，所述生物制剂中保藏编号为CCTCC NO:M 2022524的假黄单胞菌的含量≥1.2×10

上述假黄单胞菌在降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺中的应用。

一种降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的方法，向待降解样品中添加保藏编号为CCTCC NO:M 2022524的假黄单胞菌。

本发明技术方案的优点：

本方法从受氯代苯胺污染的土壤中筛选得到一株高效降解有机污染物的菌株。通过分子鉴定，基于16S rRNA编码基因序列比对，鉴定为假黄单胞菌(Pseudoxanthomonasindica)，并命名为Pseudoxanthomonas indica DCB-2。该菌可有效降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺等物质，在有机污染物降解领域有较好的应用前景。

附图说明

图1菌株DCB-2在LB平板培养基的培养形态；

图2菌株DCB-2的系统发育树；

图3菌株DCB-2对浓度为30mg/L的对氯苯胺的降解效果；

图4菌株DCB-2对浓度为50mg/L的对氯苯胺的降解效果；

图5菌株DCB-2对浓度为100mg/L的对氯苯胺的降解效果；

图6菌株DCB-2对浓度为30mg/L的对氯苯酚的降解效果；

图7菌株DCB-2对浓度为50mg/L的对氯苯酚的降解效果；

图8菌株DCB-2对浓度为100mg/L的对氯苯酚的降解效果；

图9菌株DCB-2对浓度为30mg/L的对二氯苯的降解效果；

图10菌株DCB-2对浓度为50mg/L的对二氯苯的降解效果；

图11菌株DCB-2对浓度为100mg/L的对二氯苯的降解效果。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所采用的的培养基及溶液配制方法如下：

液体LB培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，1000mL去离子水，调节pH至7.0。

固体LB培养基：在液体LB培养基配方的基础上加入20g/L的琼脂粉。

基础无机盐培养基(BSM1)：NaCl 0.5g，K

基础无机盐培养基(BSM2)：NaCl 0.5g，K

金属溶液:CaCl

对氯苯胺-甲醇溶液(1g/L)：对氯苯胺1g，1000ml甲醇，通过0.22微米微孔滤膜过滤。

对氯苯酚-甲醇溶液(1g/L)：对氯苯酚1g，1000ml甲醇，通过0.22微米微孔滤膜过滤。

对二氯苯-甲醇溶液(1g/L)：对二氯苯1g，1000ml甲醇，通过0.22微米微孔滤膜过滤。

实施例1菌株的分离、纯化及鉴定

样品的获得：于2021年5月24日从江苏南京采集红太阳地块的3,3-二氯联苯胺(DCB)污染土壤。

菌株的分离、纯化：

①取上述采集的10g DCB污染土壤样品加入到含90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡后静置10min，取2mL上层清液转移至含50mL液体LB培养基的锥形瓶中，于30℃，160rpm转速条件下培养2d；

②取1mL上述步骤①获得的培养液通过稀释涂布的方法涂布到固体LB培养基中，于30℃生化培养箱中培养3d；

③从上述固体LB培养基中挑取单菌落并接种于含50mL液体LB培养基的锥形瓶中，于30℃，160rpm转速条件下培养2d；之后取2mL培养液转移至含50mL BSM1培养基的锥形瓶中，并加入2mL对氯苯胺-甲醇溶液，于30℃，160rpm转速条件下培养7d。

④取2mL上述步骤③获得的培养液转移至含50mL液体LB培养基的锥形瓶中，于30℃，160rpm转速条件下培养2d；之后取2mL培养液转移至含50mL BSM1培养基的锥形瓶中，并加入4mL对氯苯胺-甲醇溶液，于30℃，160rpm转速条件下培养7d。重复该步骤，每次比上次多加2mL对氯苯胺-甲醇溶液，直至对氯苯胺-甲醇溶液加入量为10mL。

⑤通过液相色谱法测定上述培养液中剩余对氯苯胺浓度，取降解效果好的菌株，最终获得菌株DCB-2，将其接种于液体LB培养基中，于30℃，160rpm转速条件下培养2d，取5mL菌液转移至含有5mL甘油的离心管中(经高温高压灭菌后)，用漩涡仪充分震荡后于-80℃冰箱保藏。

菌株DCB-2的鉴定

①形态学鉴定

菌株DCB-2在固体LB平板培养基培养2d的生长特征为：菌株菌落呈圆形，表面微微凸起，不透明，边缘整齐、光滑，菌落呈淡黄色(图1)。

②生理生化鉴定

对菌株DCB-2进行生理生化实验结果如表1所示。DCB-2为好氧菌，革兰氏染色为阴性，无芽孢，氧化酶阴性，接触酶阳性，脲酶阳性，葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阳性，V.P.实验阳性，淀粉水解阳性，明胶液化阳性。

表1菌株DCB-2生理生化实验结果

③分子生物学鉴定

提取菌株DCB-2的总DNA作为基因扩增模板，采用16S rDNA通用引物，扩增菌株DCB-2的16S rRNA编码基因序列。反应完成后，取3μL PCR产物加1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，PCR产物通过Sanger法进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1

所采用的16S rDNA通用引物如下：

primer1-27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:2)；

primer2-1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:3)。

使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BLAST程序“blastn”对菌株DCB-2的16SrRNA编码基因序列进行一致性检索，结果以E值(E value)升序排序，如表2所示。序列的BLAST分析显示菌株DCB-2的16S rRNA编码基因与多株假黄单胞菌(Pseudoxanthomonasindica)的16S rRNA编码基因具有99％的一致性(Identity)，因此初步将菌株DCB-2鉴定为假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas indica)。

表2 16S rRNA编码基因序列比对分析结果

系统发育分析：

为了确定菌株DCB-2的系统发育位置，基于菌株DCB-2的16S rRNA编码基因序列、NCBI数据库BLAST结果，使用邻接法构建系统发育树，如图2所示。系统发育分析显示，菌株DCB-2与其余假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas indica)细菌聚为一簇，同属一个大分支。结合菌株DCB-2的基因序列比对分析结果、形态学和生理生化特性，最终确定该菌属于假黄单胞菌，命名为Pseudoxanthomonas indica DCB-2。

将菌株DCB-2送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏名称为假黄单胞菌DCB-2(Pseudoxanthomonas indica DCB-2)，保藏日期为2022.4.29，保藏编号为CCTCC NO:M2022524，保藏地址为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学。

实施例2菌株DCB-2对对氯苯酚、对氯苯胺、对二氯苯的生物降解

①DCB-2菌液：使用液体LB培养基培养用于接种的细菌Pseudoxanthomonasindica DCB-2，培养至菌密度为1.2×10

②菌株DCB-2对对氯苯胺的生物降解

每50mL BSM1培养基中分别加入一定量的对氯苯胺-甲醇溶液(加入量分别为1.5mL、2.5mL、5mL)，使体系中的对氯苯胺浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L，并按5％(V/V)添加量加入上述步骤①的DCB-2菌液，以不添加DCB-2菌液的组作为空白组，于30℃，160rpm转速条件下培养10d。分别测定空白组与实验组培养液中的对氯苯胺浓度，结果如图3～图5所示。

③菌株DCB-2对对氯苯酚的生物降解

每50mL BSM2培养基中分别加入一定量的对氯苯酚-甲醇溶液(加入量分别为1.5mL、2.5mL、5mL)，使体系中的对氯苯酚浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L，并按5％(V/V)添加量加入上述步骤①的DCB-2菌液，以不添加DCB-2菌液的组作为空白组，于30℃，160rpm转速条件下培养10d。分别测定空白组与实验组培养液中的对氯苯酚浓度，结果如图6～图8所示。

④菌株DCB-2对对二氯苯的生物降解

每50mL BSM2培养基中分别加入一定量的对二氯苯-甲醇溶液(加入量分别为1.5mL、2.5mL、5mL)，使体系中的对二氯苯浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L，并按5％(V/V)添加量加入上述步骤①的DCB-2菌液，以不添加DCB-2菌液的组作为空白组，于30℃，160rpm转速条件下培养10d。分别测定空白组与实验组培养液中的对二氯苯浓度，结果如图9～图11所示。

对氯苯胺、对氯苯酚、对二氯苯测定方法：通过高效液相色谱测定，流动相为甲醇：水＝45/55，流速：0.5mL/min，检测器为SPD-20，其中，对氯苯胺检测波长为240nm，对氯苯酚检测波长为225nm，对二氯苯检测波长为220nm，进样体积为10μL。

由图2-10所示，Pseudoxanthomonas indica DCB-2对对氯苯胺、对氯苯酚和对二氯苯均具有较好的降解效果，经过10d的降解，可将初始浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L的对氯苯胺降解至12.35mg/L、24.15mg/L及50.89mg/L，降解率分别为58.83％、51.70％和49.11％；可将初始浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L的对氯苯酚降解至5.57mg/L、8.24mg/L及23.68mg/L，降解率分别为81.43％、83.52％和76.32％；可将初始浓度分别为30mg/L、50mg/L、100mg/L的对二氯苯降解至6.18mg/L、14.11mg/L和33.62mg/L，降解率分别为79.40％、71.78％、66.38％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 山东科技大学

<120> 一株降解氯代苯、氯代苯酚和/或氯代苯胺的假黄单胞菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1423

<212> DNA

<213> 假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas indica)

<400> 1

ctacacatgc agtcgaacgg cagcacagga gagcttgctc tctgggtggc gagtggcgga 60

cgggtgagga atacatcgga atctaccttg tcgtggggga taacgtaggg aaacttacgc 120

taataccgca tacgaccttc gggtgaaagt gggggaccgc aaggcctcac gcgattagat 180

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ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt ccttagttgc 1080

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caccagaagc aggtagctta accttcggga gggcgctgcc acg 1423

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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