一种高效脱氮好氧反硝化菌株及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物及水处理技术领域，具体而言，涉及一株高效脱氮好氧反硝化细菌及其应用。

背景技术

氮素是导致水体污染的重要污染物之一，会引起水质恶化，水体富营养化，进而导致水生动物中毒死亡。因此，氮素的治理工作日益受到重视，生物脱氮技术受到广大研究者的关注。生物脱氮法以其安全、高效、经济的特点被认为是最具有发展前景的污水脱氮方法。传统的生化脱氮要经过好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，首先通过好氧硝化菌作用把氨氮转变为硝氮，继而在厌氧环境下通过反硝化菌作用把硝氮转变为氮气从而达到氮素的去除。其中，反硝化细菌为兼性厌氧菌，而硝化细菌为好氧菌，因此硝化过程和反硝化过程通常在两个反应池中进行，导致污水处理难度和成本显著增加。好氧反硝化是利用好氧反硝化菌在有氧的条件下，利用硝氮作为电子受体，还原脱氮，具有生长速度快、活性高、容易控制等优点，在污水脱氮处理方面有着广阔的应用前景。此外，随着污水厂尾水量的增多，水环境负担的加重，越来越多的污水厂尾水随着河流排放到江河湖泊中。由于尾水内存在总氮浓度高且以硝态氮为总氮的主要存在形式，致使部分湖泊水体中氮含量急剧增加，导致湖泊水体污染、水体富营养化和水生动物中毒死亡。因此，通过好氧反硝化菌对污水处理厂尾水联合人工湿地进行处理，进一步提高尾水利用率，使其发挥潜在作用，能保证城镇居民用水和饮水安全。

但是，我们发现目前大多数好氧反硝化菌的脱氮过程受温度、碳源等环境因素限制，导致反硝化过程不稳定且效率不高，硝氮去除效率多数仅能达到1—10 mg/L。因此有必要筛选出更高效的好氧反硝化菌以提高其对硝酸盐废水的脱氮能力。

另外，研究表明，大多数反硝化菌的生存温度在27—37℃，需要大量的碳源，挂膜效率差等问题。目前污水厂尾水实际水体的温度仅为10—20℃，秋冬季节会更低，COD仅为100 mg/L甚至更低，大部分微生物难以生存下来。因此，为开拓好氧反硝化细菌在实际废水处理中的应用，筛选出能够适应实际废水的高效好氧反硝化菌是一项极为迫切的任务，同时对景观废水处理具有重要的理论价值和工程实践意义。

发明内容

本发明目的在于提供一株应用于硝酸盐废水的好氧反硝化菌株。为实现上述目的，本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株应用于实际水体的好氧反硝化细菌，所述的应用于实际水体的好氧反硝化菌通过16S rDNA鉴定为气单胞菌属(

本发明公开的

本发明公开的

本发明公开的

本发明公开的

本发明公开的

本发明公开的好氧反硝化细菌在硝酸盐废水处理中具有良好应用前景。

进一步的，所述好氧反硝化细菌在好氧条件下对硝酸盐废水进行反硝化，在好氧条件下耐受温度为15 ℃；耐受COD为60-100mg/L。

进一步的，所述好氧反硝化细菌在对硝酸盐废水进行反硝化时采用河沙作为载体。

本发明所述的好氧反硝化细菌在人工湿地系统中的应用。

本发明所述的好氧反硝化细菌在污水厂尾水处理中的应用。

本发明的有益效果：

本发明从植物根际土壤中筛选分离得到了一株气单胞菌，命名为

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为菌株

图2为菌株

图3为菌株

图4为菌株Aeromonas sp.RC-15菌株在15℃和COD为98mg/L的模拟废水条件下培养48 h后生长量（OD600）、硝态氮、总氮去除率的变化。

图5为模拟人工湿地系统的装置图。

图6为菌株

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下所列举的具体实施方式。

实施例中通过分光光度计测定菌液600 nm（OD600）的吸光度来确定细胞密度（Lambda 25，分光光度计，美国）；硝氮和总氮通过水和废水监测分析方法测定；COD和pH分别用哈希COD检测仪（DRB200）和pH计测定（PHS-3C 上海仪电科学仪器股份有限公司）。

实施例1

好氧反硝化菌株的筛选

具体步骤如下:

配制培养基：1）筛选分离培养基：醋酸钠2 g，胰蛋白胨15 g，酵母浸膏3 g，葡萄糖1 g，NaCl 6 g，KNO

取1 mL根际土壤上清液，加入DM液体培养基中，于30 °C，160 r/min条件进行5-6次富集培养，直到观察到培养液表面有气体快速产生。之后取100 μL菌液接种到筛选分离固体培养基上，于30 °C下倒置孵育36 h，之后进行多次平板划线培养，分离出的单菌落于-80 °C储藏备用。

将分离出的单个菌株再次接种至DM液体培养基中，于30 °C、160 r/min条件下振荡培养72 h，每12 h取样并测定硝氮和亚硝氮含量，保留脱氮能力强的菌株。

用平板划线法和扫描电镜（Scanning electron microscope， SEM）观察菌株的形态结构，用稀释涂布记录菌株生物量。SEM观察：将菌株在LB培养基中扩大培养36 h，取1.5mL菌液，于6000 r/min离心5 min，倒掉上清液。加入2 mL在4 °C下预冷的2.5%戊二醛溶液，固定24 h，之后通过扫描电镜（日立SU 8010，日本）拍摄观察菌株细胞形态，由此观察到菌株RC-15的形态特征为圆形、黄色、菌落较小，表面光滑湿润，边缘整齐，紧贴在培养基表面，易挑取[图1（a）]。且该菌株为杆状细菌，其长度约为0.5 μm，宽度约为0.1 μm，无鞭毛和芽孢[图1（b）]。

将菌株接种于LB液体培养基，30 °C振荡培养36 h，用DNA试剂盒SK 8255（上海生工生物工程有限公司）提取50 μL菌株悬液DNA。以基因组DNA为模板，扩增16S rDNA，PCR引物见表1。其反应体系为：模板DNA 2 μL，10 × buffer 5 μL，dNTP混合物2 μL，正向引物（10 μM）2 μL，反向引物（10 μM）2 μL，Taq酶0.5 μL。

如图2所示，将测得的菌株RC-15的16S rDNA序列在NCBI nucleotide数据库中进行比对，发现菌株RC-15与豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）的同源性为99.93%。采用MEGA4.1软件进行多重序列比对后，基于K－2－P（Kimura－2－parameter）模型构建邻接法（N－J 法）系统发育树，Bootstrap自展检测1000，构建出的系统发育树如图2所示，菌株RC-15与豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）的亲缘关系最为相近，推测菌株RC-15属于气单胞菌属（

实施例2

菌株在最适条件下（温度30℃、pH为8和C/N为7）的脱氮实验

具体实施步骤如下:

预先将菌株接种至筛选分离液体培养基上活化，于30 ℃，160 r/min条件下振荡培养36 h。培养完成后取50 mL菌液在8000 × g，4 ℃下离心5 min，舍弃上清液，用无菌水清洗3次后重悬菌液，其600nm下该菌株的OD值为1.0 ± 0.05，之后按培养液体积比的5%分别接种菌液在含不同成分的200 mL的DM液体培养基中，探究最适环境因子优化下（温度30℃、pH为8和C/N为7）的菌株反硝化能力。

硝氮和总氮的去除率计算方法为：

由图3所示，RC-15菌株的反硝化能力超过了以往的大多数菌株，培养环境的硝氮和总氮去除率较高，发现24 h时培养环境中硝氮的去除率达到95.57%，对应的去除速率达到14.62 mg/L/h，48 h时菌株的硝氮和总氮的去除率分别达到96.31%和82.84%。

实施例3

菌株在15℃和COD为98mg/L的条件下脱氮实验

具体实施步骤如下:

结合实际废水的水质指标来配置模拟废水，实际废水和模拟废水的水质指标如表1所示，在模拟废水条件下，由图4所示，菌株RC-15经过48 h总氮和硝态氮的去除率分别为83.37%和73.89%，COD的浓度从98.14mg/L下降到22.70mg/L。可以看出，该菌株在低温和低COD下也能进行良好的反硝化能力，具备应用于实际废水的前景。

表1 废水指标

实施例4

菌株RC-15在河沙为载体的条件下挂膜效果

具体实施步骤如下：将河沙冲洗干净，用灭菌锅在121℃、101kpa条件下灭菌30分钟，在55℃烘箱内烘干放入模拟废水中培养24-72h，之后取出河沙放入烧杯中，在55℃烘箱内烘干后称重记为W

结果为，W

实施例5

模拟人工湿地装置的搭建

具体实施步骤如下：如图5所示，在实验室设置两台模拟人工湿地系统VFCWs（室温：20℃±1.0），位于昆明理工大学呈贡校区。VFCWs由亚克力板组成的一个内径为30cm、高50cm的圆柱形反应器，反应器底层（0-20cm）由粒径为0.1-0.2cm的干净海沙构成；中间层（20-30cm）由粒径为0.5-1cm的干净河沙构成；上层由（30-40cm）由粒径为1-2cm的干净河沙构成；不同的河沙粒径构成了人工湿地不同的溶解氧环境。且在每个实验装置内放置两株高为70cm的湿地植物（香蒲），在距离反应器顶部10cm，25cm，40cm出设置不同的取样口，底部设置出水口。

根据昆明市昆明理工大学璟苑污水处理厂水体的水质配制合成废水，之后在反应器能进行活性污泥的接种，接种的污泥浓度（MLSS）为8780mg/L，两个反应器在相同的条件下运行模拟废水一段时间，之后待水质稳定后转换为污水厂实际废水运行36 d，其对总氮和硝氮的去除率分别为40%和60%左右。反应器的进水为间歇式进水，每2 h进水12min；进水流量为14.4L/d，水力停留时间为0.083 d。

实施例6

菌株在模拟人工湿地下处理污水厂尾水的实验

具体实施步骤如下:

将菌株RC-15接种至LB培养基中，在30℃、160r/min条件下培养24h，培养结束后在4℃、8000r/min的条件下离心5 min，用无菌水重悬菌液，使其600 nm下的吸光度为1.0-1.4，作为微生物强化人工湿地的接种剂，在模拟人工湿地（CWs）系统的出水水质稳定后，接种1 L该菌株，离心后的质量为5g，加入到CW1系统中，以未接种菌株的CW2系统作为试验对照，所有的模拟人工湿地系统均在相同条件下稳定运行，期间测定其出水水质的NO

具体结果如图6所示。

投加菌株后，菌株需要一定的适应性，第一周无明显的变化，但是第7天后，总氮和硝态氮去除率相比于对照组CW1分别有25%-35%和10%-20%的提高，此外基本能将COD去除至50mg/L一下，达到污水厂尾水排放的一级A标，由此可见，RC-15菌株具有很好的应用潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 一种高效脱氮好氧反硝化菌株及其应用

<130> 2021

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> RC-15

<400> 1

ctcagcttga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggcag cgggaaagta 60

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