一种具有多酶活性的过渡金属基单原子纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有多酶活性的过渡金属基单原子纳米酶及其制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。

背景技术

酶作为一种高效的生物催化剂，能在温和的条件下发生特异性催化反应，具有较高的催化活性和底物特异性，已广泛应用于工业、医疗、生物等领域。作为生物体内广泛存在的生物催化剂，天然酶具有良好的生物相容性，应用于生物医疗领域时，鲜少出现免疫排斥反应，是一种潜在的疾病诊断和治疗试剂。虽然天然酶的应用前景较好，但其制备和纯化成本高、操作不稳定、催化活性容易受环境影响、储存难、回收再利用难，大大限制了其在生物医学领域的应用。

2007年，科学家发现Fe

当今，在催化领域，单原子催化剂由于具有近100％的原子分散性和最大限度的金属利用率，为显著提高催化活性和选择性提供了一条重要的潜在途径。其中，以金属原子为类酶催化活性位点的单原子纳米酶，不但具有可设计规划的几何结构和电子配位，可以在原子水平上有效地模拟天然酶的金属活性中心，还具备优异的结构稳定性，可实现底物的高效持久催化。将单原子催化剂应用于生物医疗领域，或可缩短纳米酶与天然酶活性之间的差距。在现有单原子体系中，最为典型的是通过高含量N掺杂来螯合金属的碳材料，即金属氮碳材料。然而，现有金属氮碳单原子纳米酶制备过程中多采用有机配体(2-甲基咪唑、双氰胺、三聚氰胺等)螯合金属离子作为有机前驱体，再进行进一步的热解、酸洗处理，工艺繁琐且得到的材料分散性差，不利于其医学应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种过渡金属基单原子纳米酶及其制备方法和应用。本发明中的单原子纳米酶采用一步溶剂热法制备，无需热解、酸洗处理，方便快捷；同时，该方法适用于多种金属，具有普适性。

第一方面，本发明提供了一种具有多酶活性的过渡金属基单原子纳米酶，所述过渡金属基单原子纳米酶为金属-氮碳结构，简式为M-NC；其中，M为过渡金属元素，优选选自Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、或Co；且M为氧化态，与N原子配位形成M-N键，并以单分散的形式分布于氮碳骨架中。

较佳的，N原子主要以吡啶氮、吡咯氮的形式存在；C原子主要以C＝N、C-C、C-N 的形式存在。

较佳的，所述过渡金属基单原子纳米酶的各元素的原子含量包括：M：0.01％～5％； C：60％～70％；N：15％～25％；O为10％～20％，总含量为100％。

较佳的，所述M-NC的形貌随金属原子种类的不同而发生改变；其中，Zn-NC为条带状，Fe-NC为片状，Cu-NC、Ni-NC为针状，Mn-NC为纳米花状，Co-NC为树枝状。

另一方面，本发明提供了一种具有多酶活性的过渡金属基单原子纳米酶的制备方法，包括：

(1)将过渡金属盐加入到甲酰胺或甲酰胺与其他有机溶剂的混合物中，超声溶解，得到溶液A；

(2)将所得溶液A在170～240℃下溶剂热反应后，再经冷却、洗涤和干燥，得到所述具有多酶活性的过渡金属基单原子纳米酶。

较佳的，所述其他有机溶剂包括乙醇、乙二醇、丙三醇、乙醇胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等常用有机溶剂，其中甲酰胺与有机溶剂的体积比不为0；所述甲酰胺或甲酰胺与其他有机溶剂的混合物和过渡金属盐的比为(30～50)mL：(1～200)mM；所述超声溶解的功率为40～320W，时间为5～60分钟。

较佳的，所述过渡金属盐选自锌盐、铁盐、铜盐、锰盐、镍盐、钴盐中的至少一种；所述过渡金属盐为Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、Co的氯盐、硫酸盐、硝酸盐、醋酸盐的至少一种。

较佳的，所述溶剂热的反应时间为10～48小时。

较佳的，所述冷却的方式为空冷、水冷、或炉冷；所述洗涤的方式为离心法，离心转速为3000～12000rpm，离心时间为5～30min，洗涤次数不少于4次；所述干燥的方式为在50～100℃烘干、或在-50～-5℃下冷冻干燥。

第三方面，本发明提供了一种过渡金属基单原子纳米酶的应用，所述过渡金属基单原子纳米酶M-NC同时具有多种类酶活性，包括：类氧化物酶(OXD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，且各类酶活性随着过渡金属负载量的增加而增大。

较佳的，所述过渡金属基单原子纳米酶的类酶活性具有pH和温度依赖性，生理条件下表现出CAT、SOD等天然抗氧化酶活性，且通过类酶催化反应实现对H

较佳的，所述过渡金属基单原子纳米酶的类酶活性具有优异的稳定性；与天然酶活性相比，M-NC的类酶活性在低温(-50～10℃)、高温(50～300℃)、酸性(pH＝2～6.5)、碱性(pH＝8～12)以及长时间(一年以上)保存时稳定；所述过渡金属基单原子纳米酶代替天然抗氧化酶用作抗氧化治疗。

较佳的，所述过渡金属基单原子纳米酶在细胞抗氧化模型中显示出抗氧化效果，且金属负载量越高，抗氧化效果越好，以用于细胞保护。

较佳的，所述细胞包括：巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞。

本发明的有益效果在于：

本发明利用一步溶剂热法，合成了过渡金属基单原子纳米酶M-NC。本发明所述一步溶剂热法采用低廉无毒的甲酰胺为原料，简单、成本低、条件温和，无需传统单原子纳米酶的热解、酸洗处理，解决了传统单原子纳米酶的制备过程复杂、分散性差等缺点，促进了单原子纳米酶在生物医学领域的进一步应用。该制备原理的进一步说明如下，甲酰胺同时含有氨基和醛基，在特定条件下，N原子进攻C原子，发生分子间亲核加成反应——希夫碱反应，形成不饱和C＝N键，同时，N原子外层的孤对电子与金属原子(M)螯合形成M-N配位键。该制备方法为一步溶剂热法，无需经过煅烧等脱氧处理，从而在保留大量含氧官能团的基础上制备得到金属氮碳(M-NC)单原子纳米酶。大量含氧官能团保证了该单原子纳米酶在生理环境下的稳定性，同时也可作为电子供体实现对活性氧的直接清除。

本发明所述合成的过渡金属基单原子纳米酶M-NC同时具有多种类酶活性，包括OXD、POD、CAT、SOD活性，且各类酶活性随着金属负载量的增加而增大。所制备的M- NC类酶活性具有pH和温度依赖性，生理条件下表现出CAT、SOD等天然抗氧化酶活性，可通过类酶催化反应实现对H

本发明所述合成的过渡金属基单原子纳米酶M-NC具有优异的抗氧化效果，可用于细胞保护，且金属负载量越高，细胞保护效果越好。因此，可通过简单调控金属的负载量，调控材料的抗氧化效果，应用于不同的细胞保护场景，如防晒、抗光老化、炎症治疗等。

附图说明

图1为实施例1-6及对比例中得到的单原子纳米酶Zn-NC、Fe-NC、Cu-NC、Co- NC、Mn-NC、Ni-NC、NC的TEM图像(标尺皆为1μm)；

图2为实施例1-6及对比例中得到的单原子纳米酶Zn-NC、Fe-NC、Cu-NC、Co-NC、Mn-NC、Ni-NC、NC的XRD图谱(横坐标为2θ(度)，纵坐标为强度Intensity(a.u.))；

图3为实施例1-6及对比例中得到的单原子纳米酶Zn-NC、Fe-NC、Cu-NC、Co-NC、Mn-NC、Ni-NC、NC的OXD、POD模拟活性(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))；

图4为实施例7-9及对比例中得到的单原子纳米酶Fe-NC-1、Fe-NC-2、Fe-NC-3、NC的 TEM图像；

图5为实施例7-9及对比例中得到的单原子纳米酶Fe-NC-1、Fe-NC-2、Fe-NC-3、NC的 OXD(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))、POD(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))、CAT(横坐标为时间 Time(s)，纵坐标为溶解氧Dissolved Qxygen(mg/L))、SOD模拟活性(横坐标为波长 Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))；

图6为实施例9中得到的单原子纳米酶Fe-NC-3在不同pH下的OXD(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))、POD(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))、CAT(横坐标为时间Time(s)，纵坐标为溶解氧Dissolved Qxygen(mg/L))、SOD模拟活性(横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸收度Absorbance(a.u.))；其中POD中pH＝3和pH＝4活性相近，线条重合，pH＝7和 pH＝8活性相近，线条重合；

图7为实施例7-9及对比例1中得到的单原子纳米酶Fe-NC-1、Fe-NC-2、Fe-NC-3、NC在正常环境和H

图8为对比例2中得到的Cu-MIM的XRD图谱(横坐标为2θ(度)，纵坐标为强度Intensity(a.u.))。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明中，过渡金属基单原子纳米酶具有多种类天然酶活性，生理条件下表现出抗氧化酶活性，可用于细胞保护。

其中，过渡金属基单原子纳米酶为金属-氮碳结构(M-NC)，所述过渡金属M包括但不限于Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、Co等过渡金属，其中M为氧化态，与N原子配位形成M-N 键，并以单分散的形式分布于氮碳骨架中。N原子主要以吡啶氮、吡咯氮的形式存在，C原子主要以C＝N、C-C、C-N的形式存在。

在可选的实施方式中，过渡金属基单原子纳米酶中金属M的元素百分比为0.01％～ 5％，C为60％～70％，N为15％～25％，O为10％～20％。所述M-NC的形貌随金属原子种类的不同而发生改变，如Zn-NC为条带状，Fe-NC为片状，Cu-NC、Ni-NC为针状，Mn- NC为纳米花状，Co-NC为树枝状。

以下示例性地说明过渡金属基单原子纳米酶的制备方法。

将1～200mM火毒金属盐加入到30～50mL甲酰胺中，在40～320W下超声溶解5～60min，得到溶液A。

在可选的实施方式中，所述过渡金属盐包括但不限于锌盐、铁盐、铜盐、锰盐、镍盐、钴盐等过渡金属盐。其中，金属盐包括但不限于同种金属元素的氯盐、硫酸盐、硝酸盐、醋酸盐的一种或两种混合物。

将溶液A转移至不锈钢水热反应釜中，放入烘箱，设置温度开始溶剂热反应。其中，溶剂热反应的反应温度和反应时间分别为170～240℃、10～24h。所述M-NC，金属M 含量越高，制备条件范围内温度越低、时间越短时，尺寸越小。

反应完毕，冷却至室温，打开反应釜，将反应液体转移至离心管中，将得到的反应物用超纯水和乙醇的混合溶液洗涤并干燥，最后得到过渡金属基单原子纳米酶M-NC。所述冷却方式包括但不限于空冷、水冷、炉冷；所述洗涤方式为离心法，离心转速为3000～12000rpm，离心时间为5～30min，洗涤次数不少于4次；所述干燥方式包括但不限于50～100℃烘干、或冷冻干燥。

在本发明中，过渡金属基单原子纳米酶M-NC同时具有多种类酶活性，包括类氧化物酶(OXD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，且各类酶活性随着金属负载量的增加而增大。

其中，过渡金属基单原子纳米酶的类酶活性具有pH和温度依赖性，生理条件下表现出CAT、SOD等天然抗氧化酶活性，可通过类酶催化反应实现对H

其中，过渡金属基单原子纳米酶的类酶活性具有优异的稳定性，与天然酶活性相比，M-NC的类酶活性可在低温、高温、酸性、碱性、长时间保存时稳定，可代替天然抗氧化酶用作抗氧化治疗。其中，过渡金属基单原子纳米酶在细胞抗氧化模型中显示出抗氧化效果，且金属负载量越高，抗氧化效果越好。

目前，尚未见报道采用一步溶剂热法直接合成具有多酶活性的金属氮碳单原子纳米酶材料，且本发明中该方法适用于多种金属，具有普适性，制备得到的材料均具有优异的抗氧化活性。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

将20.43mg六水合氯化锌溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Zn

实施例2

将24.33mg无水氯化铁溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Fe

实施例3

将25.57mg二水合氯化铜溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Cu

实施例4

将35.69mg六水合氯化钴溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Co

实施例5

将27.685mg四水合氯化锰溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Mn

实施例6

将43.62mg六水合硝酸镍溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Ni

实施例7

将4.866mg无水氯化铁溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Fe

实施例8

将24.33mg无水氯化铁溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Fe

实施例9

将48.66mg无水氯化铁溶解于30mL甲酰胺中，超声30min使其完全溶解，配成Fe

对比例1

将30mL甲酰胺直接转移至不锈钢水热反应釜中，在鼓风干燥箱中180℃反应12h。待反应完毕，空冷至室温，打开反应釜，将反应液体转移至离心管中，设置转速为12000rpm，离心5min；将离心得到的沉淀用超纯水和乙醇的混合溶液洗涤3遍，并于60℃烘箱干燥6h。制备得到的材料记为NC。

对比例2

将25.57mg二水合氯化铜和2-甲基咪唑(2-MIM)溶解于30mL超纯水中，超声30min使其完全溶解，配成Cu

对实施例1-6及对比例1中得到的单原子纳米酶Zn-NC、Fe-NC、Cu-NC、Co-NC、 Mn-NC、Ni-NC、NC进行TEM图像拍摄，如图1所示，M-NC的形貌随金属原子种类的不同而发生改变，其中NC、Zn-NC为条带状，Fe-NC为片状，Cu-NC、Ni-NC为针状，Mn- NC为纳米花状，Co-NC为树枝状，这与不同金属离子同高含量N配位后，甲酰胺自聚合反应的聚合方式不同有关。图2中M-NC的XRD结果显示，所有M-NC均只在27°左右存在衍射峰，与NC一致，表明过渡金属原子的掺入未影响甲酰胺自聚物的物相组成，暗示过渡金属原子是以单分散的形式分散于氮碳骨架中。

采用目前常用于制备单原子纳米酶的有机配体2-甲基咪唑作为对比例2，验证甲酰胺配体在制备单原子纳米酶上的独特性。将Cu

应用实施例1：过渡金属基单原子纳米酶的类酶活性

采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色法评价M-NC的类OXD、POD活性；

类OXD活性评价：将100μL 1mg/mL的M-NC分散液、100μL 20mM的TMB-HCl水溶液加入不同pH(pH＝3、4、5、6、7、8)的800μL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(HAc-NaAc)中，完全混匀后，37℃反应30min，取100μL使用酶标仪测定500-800nm的全谱吸收；

类POD活性评价：将100μL 1mg/mL的M-NC分散液、100μL 20mM的TMB-DMSO溶液、100μL 1mM的H2O2溶液、加入不同pH(pH＝3、4、5、6、7、8)的700μL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(HAc-NaAc)中，完全混匀后，37℃反应30min，取100μL使用酶标仪测定 500-800nm的全谱吸收；

采用溶氧仪测定M-NC催化H

类CAT活性评价：将200μL 0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μ g/mL、800μg/mL的M-NC分散液加入不同pH的1600μLPBS缓冲溶液(pH＝pH＝3、4、5、6、7、8，20mM)中，再加入200μL 100mM的H2O2溶液，完全混匀后立刻使用溶氧仪测定反应体系中的O

采用总SOD活性活性检测试剂盒(WST-8法)评价M-NC的类SOD活性；

类SOD活性评价：严格按照试剂盒使用说明书评价不同浓度M-NC的类SOD活性，反应体系37℃孵育30min后，使用酶标仪测定其410-550nm的全谱吸收，吸收峰越低，类SOD活性越高。

如图3所示，在有无H

如图4所示，不同Fe原子负载后材料的形貌逐渐从条带状向无定形转变，更偏向于片状结构，材料尺寸逐渐减小，表明Fe原子负载量显著影响甲酰胺聚合过程，进而调控材料形貌尺寸。

图5显示出Fe原子负载量对材料类酶活性的影响，结果表明，Fe-NC同时具有 OXD、POD、CAT、SOD四种天然酶模拟活性，且Fe原子负载量越多，各类酶活性越强，据此可以看出，该材料类酶活性主要来源于Fe-N配位的活性位点。

如图6所示，Fe-NC的类酶活性还具有pH依赖性，在酸性条件下主要表现出 OXD、POD模拟活性，而在中性或碱性条件下主要表现出CAT、SOD模拟活性，可实现 H

应用实施例2：过渡金属基单原子纳米酶的细胞毒性及抗氧化效果在有无H

在96孔白板中加入1×104细胞/mL细胞悬液100μL，培养24h；

吸去原培养液，加入不同浓度Fe-NC和H

吸去原培养液，加入含有10％alamarBlueTM染液的培养液110μL，避光培养2h；

每孔取100μL放入黑色96孔板，利用酶标仪测量各孔荧光强度值(激发光/发射光波长：560/590nm)。每组样品设置3个平行样，取平均值±标准差作为细胞活性结果。

如图7所示，在无H