α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用

文献发布时间：2024-01-17 01:27:33

本申请为申请日为2021年09月30日，申请号为202111159897.9，发明创造名称为“α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

α-1,2-岩藻糖基转移酶属于岩藻糖基转移酶家族，催化鸟苷二磷酸活化的岩藻糖基转移到半乳糖基连接的受体底物上，形成α-1,2-糖苷键。例如，GDP-L-岩藻糖和乳糖在α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化下可以生成2’-岩藻糖基乳糖，其在促进健康肠道菌群构建、免疫系统发育、过敏性疾病预防和大脑功能发展等方面发挥着极其重要的作用。

目前用于合成岩藻糖基化产物的方法包括化学法和生物法。化学法包括分离提取和从头合成。分离提取是指从样品中(如母乳)对岩藻糖基化寡糖进行分离和提纯，这种方法受制于样品的多少，且损失极大。从头合成法是通过合成化学基团实现每个基团组装，但这常常伴随着反应步骤多、条件复杂不好控制、存在有毒有害试剂参与等问题。生物法包括全细胞发酵和酶法合成，因其条件温和、专一性强等优势，是目前主要采用的方法。

目前岩藻糖基化产物合成主要是通过全细胞发酵，即通过在基因工程菌株中构建所需代谢途径并转入α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来实现产物合成。国外已有公司以该法实现了岩藻糖基化寡糖的商业化。而在我国，该法由于转基因工程菌参与，尚未获得行业应用批准。除此之外，全细胞发酵生产工艺的缺陷还表现在其最终产物的产量还处于较低水平，存在较大提升空间。这是由于现已发现的α-1,2-岩藻糖基转移酶表现出的活性并不能满足工业需求，极大程度限制了其大规模应用。

随着人们对于岩藻糖基化产物的需求日益增加，运用基因工程技术改良、创制酶分子及其基因工程菌株以期获得功能强化的α-1,2-岩藻糖基转移酶成为了生物催化领域的发展趋势。目前针对α-1,2-岩藻糖基转移酶催化活性的改造还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用，以期提高岩藻糖基转移酶的活性，并扩大其底物识别范围。

本发明提供的α-1,2-岩藻糖基转移酶的突变体，其野生型的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述突变体包括如下突变位点中的至少一个：

N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F或V291L。

一些实施例中，所述突变体的突变位点的数量为1～11。

一些具体实施例中，所述突变体中的突变位点为N14M、Q15C、M16T、F17Y、F21A、Q71S、L73K、V88N、S89A、F94D、E95I、Y96S、L100F、F109I、G111N、Y112I、F113R、Q114V、D115F、P116N、R117K、Y118T、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C、S250T、W251N、W252I、A254F、Y255F、I264V、G266C、P267Y、H269W、L271 S、G273C、H274G、N276Y、V283N、K284F或V291L中的任意一个；

或为H269W和 G172Y；

或为H269W、G172Y和 C175F；

或为H269W、G172Y、C175F和I179E；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E和K206W；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W和Y249C；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C和Y255F；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C、Y255F和G266C；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C、Y255F、G266C和H274G；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C、Y255F、G266C、H274G和D115F；

或为H269W、G172Y、C175F、I179E、K206W、Y249C、Y255F、G266C,H274G、D115F和P116N。

本发明还提供了编码本发明所述的突变体的核酸。

本发明还提供了一种表达载体，其包括编码本发明所述的突变体的核酸。

一些实施例中，所述表达载体的骨架载体选自pET系列载体。一些具体实施例中，所述表达载体的骨架载体为pET22b。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21(DE3)。

所述宿主细胞的构建方法包括：将构建获得的表达载体转化入宿主细胞。所述转化的方法为热激转化。

本发明所述突变体的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞、诱导所述突变体的表达。

本发明所述的突变体，核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物，在岩藻糖基化产物合成中的应用。

本发明还提供了一种促进岩藻糖基化产物的合成的生物制剂，其包括：所述的突变体，核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物。

一些实施例中，所述生物制剂的制备原料包含所述突变体的发酵液。

本发明还提供了岩藻糖基化产物的合成方法，其以乳糖为底物，以本发明所述生物制剂促进岩藻糖基化产物的合成。一些实施例中，所述合成的反应条件包括：在pH＝6.0～8.0，20～40℃条件下反应10～120min。

传统认为乳糖并不是α-1，2-岩藻糖基转移酶的天然底物，而本发明提供的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，通过定点突变改造α-1,2-岩藻糖基转移酶获得α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，构建其基因工程菌并应用在高效催化岩藻糖基化寡糖生产中。α-1,2-岩藻糖基转移酶经替换多个氨基酸残基能够以乳糖为底物。

具体实施方式

本发明提供了岩藻糖基转移酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列长度为298，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：

MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHLNTPVLLDITSFDWSNRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDTLKCMGFDRVSQEIVFEYEPGLLKPSRLTYFYGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPENGNNKKKEEEYHRKLALILAAKNSVFVHVRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYIAKRVPNMELFVFCEDLKFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCKHGIIANSTYSWWAAYLINNPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSKKYNA

编码野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶的核酸经密码子优化，共计897bp，序列如SEQID NO:2所示，具体为：

atggcgttcaaggtggttcagatttgcggtggcctgggtaaccagatgttccaatatgcgtttgcgaaaagcctgcaaaagcacctgaacaccccggttctgctggacattaccagcttcgattggagcaaccgtaaaatgcagctggagctgtttccgatcgacctgccgtacgcgagcgcgaaagaaattgcgatcgcgaagatgcagcacctgccgaaactggtgcgtgacaccctgaagtgcatgggtttcgatcgtgttagccaagagatcgtgtttgagtatgaaccgggtctgctgaaaccgagccgtctgacctacttctatggctactttcaggacccgcgttacttcgatgcgattagcccgctgatcaagcaaacctttaccctgccgccgccggaaaacggcaacaacaagaagaaggaagaggagtatcaccgtaagctggcgctgattctggcggcgaaaaacagcgtgtttgttcacgtgcgtcgtggtgactacgttggtattggctgccagctgggcatcgattatcagaagaaggcgctggagtacatcgcgaagcgtgttccgaacatggagctgttcgtgttttgcgaagacctgaaattcacccagaacctggatctgggttatccgtttatggacatgaccacccgtgataaggaagaggaagcgtactgggatatgctgctgatgcaaagctgcaaacacggcatcattgcgaacagcacctattcctggtgggcggcgtacctgatcaacaacccggaaaagatcattatcggtccgaaacactggctgttcggccacgagaacattctgtgcaaagaatgggttaagatcgagagccactttgaagtgaaaagcaaaaagtacaacgcg tga

本发明中，所述突变体相对于野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列(SEQID NO:1)中的一个或多个氨基酸残基的改变。研究表明，野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列中发生如果下突变中的任意一种，都可以使其能够以乳糖作为底物。所述突变位点包括N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F或V291L。而当突变位点数量增加，酶活性随之提高。

一些实施例中，所述突变体包括如下突变位点中的至少一个：

例如，一些实施例中，所述突变体包括如下突变位点：

或者，所述突变体包括N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F或V291L中任意2种。

本发明实施例中，针对不同突变位点数量的突变体分别进行了验证，例如：

突变位点数量为1的突变体中突变位点为H269W；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码第269位氨基酸的密码子为tgg。

突变位点数量为2的突变体中突变位点为H269W和G172Y；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述2个突变位点的密码子依次为tgg、tac。

突变位点数量为3的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述3个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg。

突变位点数量为4的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述4个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa。

突变位点数量为5的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述5个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg。

突变位点数量为6的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述6个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc。

突变位点数量为7的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述7个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc，ttc。

突变位点数量为8的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述8个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc，ttc，tgc。

突变位点数量为9的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，H274G；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述9个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc，ttc，tgc，gac。

突变位点数量为10的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，H274G，D115F；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述10个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc，ttc，tgc，gac，ttc。

突变位点数量为11的突变体中突变位点为H269W，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，H274G，D115F，P116N。编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ IDNO:2一致，但编码上述11个突变位点的密码子依次为tgg，tac，gcg，ctg，aaa，tgg，tgc，ttc，tgc，gac，ttc，aac。

突变位点数量为12的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，H269W，L271 S，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述12个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，ttt，tgc，tac，agc，tgc，tac。

突变位点数量为13的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述13个突变位点的密码子依次为，但编码上述突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，ttt，tgc，tac，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为14的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述14个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，ttt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为15的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述15个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为16的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述16个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为17的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述17个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为18的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述18个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为19的突变体中突变位点为D115F，P116N，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述19个突变位点的密码子依次为ttc，aac，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为20的突变体中突变位点为D115F，P116N，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述20个突变位点的密码子依次为ttc，aac，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为21的突变体中突变位点为D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述21个突变位点的密码子依次为ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为22的突变体中突变位点为Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述22个突变位点的密码子依次为gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为23的突变体中突变位点为F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ IDNO:2一致，但编码上述23个突变位点的密码子依次为cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为24的突变体中突变位点为Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述24个突变位点的密码子依次为att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为25的突变体中突变位点为G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述25个突变位点的密码子依次为aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为26的突变体中突变位点为F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述26个突变位点的密码子依次为att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为27的突变体中突变位点为L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271 S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述27个突变位点的密码子依次为ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为28的突变体中突变位点为Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述28个突变位点的密码子依次为agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为29的突变体中突变位点为E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述29个突变位点的密码子依次为att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为30的突变体中突变位点为F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述30个突变位点的密码子依次为gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为31的突变体中突变位点为S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述31个突变位点的密码子依次为gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为32的突变体中突变位点为V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述32个突变位点的密码子依次为aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为33的突变体中突变位点为L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述33个突变位点的密码子依次为aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为34的突变体中突变位点为Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述34个突变位点的密码子依次为cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为35的突变体中突变位点为F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述35个突变位点的密码子依次为gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为36的突变体中突变位点为F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述36个突变位点的密码子依次为tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac。

突变位点数量为37的突变体中突变位点为M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ IDNO:2一致，但编码上述37个突变位点的密码子依次为acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac

突变位点数量为38的突变体中突变位点为Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述38个突变位点的密码子依次为tgc，acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac

突变位点数量为39的突变体中突变位点为N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述39个突变位点的密码子依次为atg，tgc，acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac

突变位点数量为40的突变体中突变位点为N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述40个突变位点的密码子依次为atg，tgc，acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac，aac

突变位点数量为41的突变体中突变位点为N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述41个突变位点的密码子依次为atg，tgc，acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac，aac，ttt

突变位点数量为42的突变体中突变位点为N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F，编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码上述42个突变位点的密码子依次为atg，tgc，acc，tat，gcg，cac，aaa，aac，gcg，gac，att，agc，ttc，att，aac，att，cgt，gtg，ttc，aac，aag，acc，tac，ttt，gag，tgg，tgc，acc，aac，att，ttt，ttt，gtt，tgc，tac，tgg，agc，tgc，ggt，tac，aac，ttt，ctg

突变位点数量为43的突变体中突变位点为N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，G172Y，C175F，I179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F和V291L；编码该突变体的核酸其他位置的核酸与SEQ ID NO:2一致，但编码第14位Met的密码子为atg，编码第15位Cys的密码子为tgc，

编码第16位Thr的密码子为acc，编码第17位Tyr的密码子为tat，

编码第21位Ala的密码子为gcg，编码第71位Ser的密码子为cac，

编码第73位Lys的密码子为aaa，编码第88位Asn的密码子为aac，

编码第89位Ala的密码子为gcg，编码第94位Asp的密码子为gac，

编码第95位Ile的密码子为att，编码第96位Ser的密码子为agc，

编码第100位Phe的密码子为ttc，编码第109位Ile的密码子为att，

编码第111位Asn的密码子为aac，编码第112位Ile的密码子为att，

编码第113位Arg的密码子为cgt，编码第114位Val的密码子为gtg，

编码第115位Phe的密码子为ttc，编码第116位Asn的密码子为aac，

编码第117位Lys的密码子为aag，编码第118位Thr的密码子为acc，

编码第172位Tyr的密码子为tac，编码第175位Phe的密码子为ttt，

编码第179位Glu的密码子为gag，编码第206位Trp的密码子为tgg，

编码第249位Cys的密码子为tgc，编码第250位Tyr的密码子为acc，

编码第251位Asn的密码子为aac，编码第252位Ile的密码子为att，

编码第254位Phe的密码子为ttt，编码第255位Phe的密码子为ttt，

编码第264位Val的密码子为gtt，编码第266位Cys的密码子为tgc，

编码第267位Tyr的密码子为tac，编码第269位Trp的密码子为tgg，

编码第271位Ser的密码子为agc，编码第273位Cys的密码子为tgc，

编码第274位Gly的密码子为ggt，编码第276位Tyr的密码子为tac，

编码第283位Asn的密码子为aac，编码第284位Phe的密码子为ttt，

编码第291位Leu的密码子为ctg。

本发明通过一步定点突变，将α-1,2-岩藻糖基转移酶的多位点氨基酸突变，改变了α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化活性，从而加强了该酶催化岩藻糖基化产物合成的能力。本发明所述相同突变位点个数下得到的最高酶活力，是指在所有相同数量突变位点的突变体(例如，含有3个突变位点的所有突变体，含有5个突变位点的所有突变体)中，经检测获得的最高酶活力。换而言之，一定数量的突变位点下，该突变体具有最高的酶活力，而其他突变体的酶活力相对较低。说明该具有最高酶活力的突变体中突变位点的设置更有利于酶活力的发挥。

本发明还提供了一种含有α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的重组表达载体；所述重组表达载体优选的以pET22b作为原始表达载体；所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因优选的插入在质粒pET22b上；本发明对构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

本发明具体实施过程中，所述重组载体的采用以下方法构建：以编码核苷酸序列为模板，进行PCR即得到重组表达载体pET22b-futC。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组表达载体的重组菌；所述重组菌优选的以大肠杆菌作为宿主菌；所述大肠杆菌优选的包括E.coli BL21(DE3)，NovaBlue，Origami，PlySs，T7 shuffle等DE3系列菌株。本发明对所述重组菌的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，所述重组菌采用以下方法制备得到：所述重组表达载体pET22b-futC转化E.coli BL21，获得重组菌，命名为pET22b-futC-E.coliBL21。

本发明中所述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体优选的采用以下方法制备得到：培养所述重组菌，诱导获得α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体；所述培养所述重组菌的培养基优选为TB培养基；所述TB培养基含有1.2％(W/V)蛋白胨，2.4％(W/V)酵母提取物，0.4％(V/V)甘油，17mM KH

取上述诱导后的发酵液经离心取菌体破碎后取上清液，用于促进岩藻糖基化产物的合成。本发明的具体实施过程中，以GDP-L-岩藻糖和乳糖、乙酰基乳糖等为底物，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或其重组菌，无辅酶，在20-40℃，与pH值为6.0-8.0的缓冲液构成的体外催化反应体系中反应0.1-2h,得到包括α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的混合酶促反应体系。

一些实施例中，所述岩藻糖基化产物为2’-岩藻糖基乳糖。一些具体实施例中，所述2’-岩藻糖基乳糖的制备方法包括：将发酵菌体裂解后的上清液加入含有GDP-岩藻糖和乳糖的TRIS-HCl缓冲发酵液中，于20-40℃下孵育10-120min，获得含有2’-岩藻糖基乳糖的反应液。

本领域此前认为，大部分的酶都不能以乳糖作为岩藻糖基受体完成酶催化。本方案中选用的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶本身也不具备以乳糖为岩藻糖基受体的能力，这也是野生酶活性极低的原因之一。经过突变后，仍以乳糖为底物时，其酶活力显著提高，即其利用乳糖为底物的能力增强。而乳糖作为食品工业常见的原料，具有易得、安全、价廉等多重优势，因此更需要开发出具有能够以乳糖为底物进行高效转化的酶种。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

根据突变体的氨基酸序列，通过密码子优化获得对应的编码核酸序列(见表1)。

将合成的核酸片段插入pET22b载体，构建获得重组载体pET22b-futC。将该重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-16h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认包含编码突变体的核酸的重组工程菌构建完成。

实施例2：重组菌pET22b-futC-E.coli BL21表达及纯化α-1,2-岩藻糖基转移酶

将实施例1构建的重组菌pET22b-futC-E.coliBL21与表达未突变的原始酶α-1,2-岩藻糖基转移酶的对照菌株分别接种与含0.1％氨苄霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜制备种子液，次日按1％的接种量转接于200mL含氨苄霉素的TB培养基中，37℃培养适当时间后加入适量IPTG于16℃过夜诱导。诱导完成后，于4℃，8000rpm离心收集细胞，经过超声波破碎，收集细胞破碎上清液(粗酶液)用于后续纯化。

α-1,2-岩藻糖基转移酶或α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的纯化是利用pET22b载体上所带的组氨酸标签，利用Ni

缓冲液1，优选Tris-HCl缓冲液，1，5，10，20，50mM咪唑，pH＝7.0-8.0。

缓冲液2，优选Tris-HCl缓冲液，10，20，50，100，200，300，400，500mM咪唑，pH＝7.0-8.0。

酶活检测：

首先各组分别取20mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集菌体，重悬后经超声波破碎，低温高速离心得到细胞破碎上清液。经组氨酸标签纯化得到较纯的酶液，并通过透析除去咪唑、调整缓冲液盐浓度。最终得到的酶液保存备用。

加入100μM GDP-L-岩藻糖100μL和5mM乳糖100μL，而后加入1μg酶参与反应，在20-40℃下孵育10-120min，实现催化生成2'-FL。催化完成后立即置于冰上停止反应。随后在低温下高速离心并通过除盐柱进行超滤除杂后，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定催化体系中的2'-FL产量以及底物的剩余量。

将催化得到的反应液，通过0.22μm的滤膜，备用。准备液相色谱检测所需的流动相，流动相A：乙腈，流动相B＝0.5％醋酸三乙胺的水溶液。选用amide色谱柱(150mm×2.1μm)，检测条件为：流动相比例80：20，流速0.2m/L，柱温35℃，检测器使用蒸发光散射检测器，蒸发温度70℃,载气流量为2.0SLM。通过外标法定量产物。

定义在37℃条件下，1分钟内转化生成1微摩尔2’-FL所需的酶量为一个活力单位(U)。将重组酶依据上述条件进行体外酶催化验证，此时得到的各组纯化后酶蛋白的比活力如下表：

表1

注：表中所示为相同突变位点个数下得到的最高酶活力。

结果表明，对α-1,2-岩藻糖基转移酶中的特定位点进行突变，所获得的突变体的酶活力得到了不同程度的提高。其中，突变体G266C的酶活力最高。包含两个或多个突变位点的突变体具有更强的酶活力，并且，在一定数量范围内，突变位点个数的越多，该突变位点数量下得到的最高酶活力越强。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：汪家琦;周洪波;潘丽娜;朱玉玲;刘雯娴;王玉光;陈祝;程海娜;颜卫彬;
专利申请人：中南大学;澳优乳业（中国）有限公司;长沙运康生物科技有限公司;

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