豆梨果实醇提物在制备美白药物中的应用及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及豆梨果实醇提物在制备美白药物中的应用及其制备方法。

背景技术

酪氨酸酶又称单酚氧化酶，常见于动植物、微生物及人体中，其可以催化酪氨酸等含酚基化合物反应形成黑色素，是黑色素合成的关键酶(Fine Chemicals,2020,37(5):1002-1009)。黑色素快速累积并分布不均匀时，就会导致皮肤的局部色素沉着，从而产生雀斑、褐斑等皮肤问题(Gene,2001,277(1/2):49-62；Pigment Cell&Melanoma Research,2019,32(6):753-765)。因此，降低酪氨酸酶活性并进而抑制黑色素产生是皮肤美白的主要方式。目前，已研究出的酪氨酸酶抑制剂分为天然来源类(植物来源和真菌来源)和人工合成类。常见的酪氨酸酶抑制剂如真菌来源的曲酸、人工合成的氢醌等细胞毒性大，副作用较强(精细化工,2019,1-10)。因此，筛选研究具备安全、高效特性的酪氨酸酶抑制活性的天然产物已成为热点。

豆梨(Pyrus calleryana Decne)为蔷薇科梨属，落叶乔木，是我国原生树种。我国梨属植物资源丰富，共有14个种，豆梨是最为广泛分布的梨属植物之一。豆梨的根、叶具有润肺止咳、清热解毒的功效，主治肺燥咳嗽、急性眼结膜炎等；果实具有健胃消食、涩肠止痢、清热生津的功效；枝能止泻、行气和胃；叶和花能解闹羊花、黎芦毒(江苏农业科学,2015,43(03):162-165)。豆梨的根、茎、叶和果实都可以被用作治疗咳嗽、急性结膜炎、胃痛、消化不良、痢疾等传统疾病(安徽农业科学,2020,48(21):6-9)。豆梨果实发酵酒中富含有益人体健康的营养物质，长期适量饮用有助于血管软化、消化、降血脂、防治心血管疾病等(中国酿造,2012,31(08):162-165)。豆梨叶子的乙醇提取物显示出强的抗氧化活性(Phytochemistry,1968,7(10):1781-1801；Carbohydrate Research,2011,346(1):64-67)。然而，目前还没有关于豆梨果实在美白方面的相关报道，这可能会阻碍其开发和利用。

发明内容

本发明的目的：提供豆梨果实醇提物在制备美白药物中的应用及其制备方法，开拓了豆梨果实的新用途，为制备美白药物提供了新选择。

本发明还发现了豆梨果实醇提物抑制了体外酪氨酸酶的活性；在无毒剂量下，豆梨果实醇提物抑制了α-MSH诱导的B-16黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性和黑色素的生成水平。

本发明采取的技术方案如下：豆梨果实醇提物在制备美白药物中的应用。

所述的豆梨果实醇提物在制备抑制酪氨酸酶活性药物中的应用。

所述的豆梨果实醇提物在制备抑制α-黑色素细胞刺激素诱导的黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性和黑色素生成的药物中的应用。

将豆梨果实醇提物和药学上可接受的载体膜剂、滴丸或软膏剂剂型的药物。

豆梨果实醇提物的制备方法，取豆梨果实鲜品洗净、切块，并进行粉碎；将粉碎的原料与质量百分比浓度为70％的乙醇按1:3～1:8的料液比混合，单位g/mL，加热回流提取2次，每次2～4h，合并2次提取液冷却至室温，进行抽滤，滤液经过减压浓缩和真空冷冻干燥得到豆梨果醇提取物干燥粉末。

本发明通过试验研究发现了豆梨果实醇提物显著抑制了酪氨酸酶的活性且效果强于阳性药熊果苷；在无细胞毒剂量下，抑制了α-MSH诱导的B-16黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性和黑色素的生成水平。

通过采用上述技术方案，本发明首次发现了豆梨果实醇提物在美白方面的新用途，为制备美白药物提供了新选择，在制药和美妆行业具有重要的应用价值。

附图说明

图1为豆梨果实提取物对体外酪氨酸酶活性的影响。

图2为豆梨果实醇提物对B-16小鼠黑色素瘤细胞存活率的影响；

图3为豆梨果实醇提物(EE)对α-MSH刺激的B-16小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响。

图4为豆梨果实醇提物(EE)对α-MSH刺激的B-16小鼠黑色素瘤细胞内黑色素生成含量的影响。

具体实施方式

本发明的实施例：将豆梨果实鲜品(采收地：江西省赣州市于都县山森水库；由贵州大学胡国雄教授鉴定)粉碎。称取已粉碎的药材，加入溶剂(去离子水或70％乙醇)加热回流提取2次(每次2h)，合并2次提取液冷却至室温，进行抽滤。滤液经过减压浓缩和真空冷冻干燥得到豆梨果实水提物和醇提物，提取率分别为8.3％和11％(w/w，基于果实的鲜重)。

药理实例1：豆梨果实水提物和醇提物对酪氨酸酶的抑制活性

酪氨酸酶的活性检测在96孔板上进行，以L-酪氨酸为底物：

在96孔板中添加待测样品溶液(70μL)，然后添加酪氨酸酶(100μL、100U/mL)，恒温孵化(37℃、5min)，然后再加入底物L-酪氨酸(80μL、5.5mmoL/L)，恒温孵化(37℃、15min)，随即用酶标仪测得波长492nm的吸光值A

酪氨酸酶抑制率(％)＝(1－)×100 (1)

如表1和图1所示，对于酪氨酸酶，EE(IC

表1豆梨提取物对酪氨酸酶的抑制活性

注：IC

药理实例2：豆梨果实醇提物对B-16小鼠黑色素瘤细胞存活率的影响

为了评估豆梨果实醇提物在α-MSH刺激的B-16细胞中的作用，为随后的分析确定适当的豆梨果实醇提物浓度，采用MTT法测定豆梨果实醇提物对B-16细胞活力的影响。将B16细胞以5×10

结果如图2所示，豆梨果实醇提物在测试浓度(2.5、5、10、20和40μg/mL)下，对α-MSH刺激的B16细胞的活力无影响，表明豆梨果实醇提物在0～40μg/mL剂量下，无细胞毒性。

药理实例3：豆梨果实醇提物对α-MSH刺激的B-16小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响

采用多巴氧化法测定细胞内酪氨酸酶的抑制活性(European Journal ofMedicinal Chemistry,2010,45:2010–2017)。将B-16细胞以5×10

结果如图3所示，与未受刺激的对照组相比，α-MSH刺激的细胞的酪氨酸酶活性增加(p<0.05)，而在豆梨果实醇提物的作用下，酪氨酸酶活性被显著抑制，且呈现剂量依赖性。以上结果表明，豆梨果实醇提物能够在无毒剂量下显著地抑制α-MSH诱导的B-16细胞内酪氨酸酶的活性。

药理实例4：豆梨果实醇提物对α-MSH刺激的B-16小鼠黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响

采用NaOH裂解法测定胞内相对黑色素含量(河北医药,2018,40(17):5-6)。将B-16细胞以5×10

结果如图4所示，在α-MSH的刺激下，细胞内的黑色素含量显著增加(p<0.05)，而在豆梨果实醇提物的作用下，黑色素水平显著下调，且呈现浓度依赖性，给药浓度越高，对黑色素形成的抑制作用越强。该结果与细胞内酪氨酸酶活性抑制结果一致。

综合以上药理实例，豆梨果实醇提物在体外能够显著抑制酪氨酸酶的活性，在无细胞毒剂量下，对B-16小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素生成有显著的抑制效果。