一种用于检测雌酮的金属有机凝胶及其应用

技术领域

本发明涉及合成材料技术领域，具体地，涉及一种用于检测雌酮的金属有机凝胶及其应用。

背景技术

雌酮(Estrone，E1)是甾体激素类化合物中的一种，属于天然内源性雌激素，在多种生理过程的调节中起关键作用。孕马尿(Pregnant mare urine，PMU)中富含雌激素，每升孕马尿中雌激素的平均含量在70～130mg，结合孕马雌激素(Conjugated mare estrogens，CEEs)，其品牌名称为Premarin，被广泛用作激素替代疗法(Hormone replacementtherapy，HRT)药物，临床上主要应用于改善绝经期女性更年期综合征的不适症状，如因体内雌激素水平下降导致的骨质疏松、肺功能下降、影响肌肉力量和骨骼肌再生等疾病。雌酮3-硫酸钠盐(Estrone 3-suLfate sodium salt，ESS)是孕马尿中含量最高的成分之一，E1作为孕马尿雌激素中的主要成分，可以将E1含量作为控制指标，对PMU进行品质鉴定。

目前，检测E1的常用方法如电化学分析法、色谱法和免疫法等。这些方法存在操作繁琐、分析时间长、成本高，特别是PMU的现场检测难以实现，这对PMU样品的收购带来很大困难。

发明内容

为了解决现有技术中缺少快速、灵敏且简便的雌酮免疫检测方法的问题，本发明提供了一种用于检测雌酮的金属有机凝胶及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测雌酮的金属有机凝胶。

本发明的第二个目的是提供所述金属有机凝胶在制备检测雌酮的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测雌酮的微流控纸芯片。

本发明的第四个目的是提供所述微流控纸芯片在检测雌酮中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测雌酮的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明采用一步法简单快速地合成得到具有类过氧化物还原酶(peroxidase,POD)活性的金属有机凝胶(Metal organic gel，MOG)，再将其和特异性结合雌酮的分子印迹聚合物固载在纸芯片上，即制得基于分子印迹的化学发光-比色法微流控纸芯片传感器，凭借MOG的高催化能力和分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)的高选择性，实现雌酮的快速、简便、高效的可视化检测。

一种用于检测雌酮的金属有机凝胶，即Ru/Hemin-MOGs，由1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、水溶性的三价钌盐和血红素充分反应得到，其中1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、Ru

优选地，所述1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、Ru

优选地，所述水溶性的三价钌盐为三氯化钌、钌酸钠、钌酸钾或钌酸铵中的任意一种。

更优选地，所述水溶性的三价钌盐为三氯化钌。

进一步优选地，所述1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的溶剂为二甲基亚砜；所述三氯化钌和血红素的溶剂为水。

优选地，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃充分静置。

更优选地，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃静置20s～40s。

进一步优选地，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃静置30s。

优选地，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置20s～40s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为5：(0.8～2.2)：(0.9～6.3)。

更优选地，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置20s～40s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为5：1.1：0.54。

进一步优选地，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置30s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为5：1.1：0.54。

具体的，所述金属有机凝胶的制备方法如包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸(13.4mg，0.2M)溶解在含有250μL DMSO的玻璃瓶中，然后加入110μL的三氯化钌水溶液(0.1M)和90μL的Hemin水溶液(6mM)，轻轻摇匀，室温(23±2℃)静置30s，即得。

本发明还要求保护由所述用于检测雌酮的金属有机凝胶经过干燥得到的干粉，即金属有机干凝胶粉。

优选地，所述金属有机干凝胶粉的制备方法如包括以下步骤：将得到的所述金属有机凝胶除杂后，干燥，即得。所述除杂包括除去未反应的原料。

更优选地，所述除杂的方法包括离心。

更优选地，所述干燥的方法包括：冷冻干燥。

具体的，所述金属有机干凝胶粉的制备方法如包括以下步骤：

将制备的金属有机凝胶进行10000rpm离心10min，共离心三次，去除游离的PDA和Ru

任一所述金属有机凝胶和/或其干粉在制备检测雌酮的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供的金属有机凝胶和/或其干粉具有强抗干扰能力，抵抗离子(Mg

优选地，所述金属有机凝胶和/或其干粉用于检测体液样本中的雌酮。

更优选地，所述金属有机凝胶和/或其干粉用于检测尿液中的雌酮。

进一步优选地，所述金属有机凝胶和/或其干粉用于检测孕马的尿液中的雌酮。

一种用于检测雌酮的微流控纸芯片，即Paper@MOG@E1-MIPs，所述微流控纸芯片负载有金属有机凝胶，所述金属有机凝胶由1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、水溶性的三价钌盐和血红素充分反应得到，其中1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、Ru

优选地，所述微流控纸芯片的制备方法包括以下步骤：

S1.将所述金属有机凝胶与氨基化的纸芯片充分结合，得到纸芯片基质，即Paper@MOG；

S2.将步骤S1所得纸芯片基质与雌酮、硅烷偶联剂、交联剂和引发剂充分反应；

S3.去除步骤S2所得产物中的雌酮。

更优选地，步骤S1中，所述1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、Ru

更优选地，步骤S1中，所述水溶性的三价钌盐为三氯化钌、钌酸钠、钌酸钾或钌酸铵中的任意一种。

进一步优选地，步骤S1中，所述水溶性的三价钌盐为三氯化钌。

进一步优选地，步骤S1中，所述1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的溶剂为二甲基亚砜；所述三氯化钌(RuCl

更优选地，步骤S1中，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃充分静置。

进一步优选地，步骤S1中，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃静置20s～40s。

更进一步优选地，步骤S1中，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃静置30s。

更优选地，步骤S1中，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置20s～40s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为(4～6)：(0.5～2.5)：(0.5～6.5)。

进一步优选地，步骤S1中，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置20s～40s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为5：1.1：0.54。

更进一步优选地，步骤S1中，所述金属有机凝胶的制备方法包括以下步骤：1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸的DMAO溶液、三氯化钌的水溶液和血红素的水溶液混合均匀，21℃～25℃静置30s，即得；1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸、三氯化钌和血红素的摩尔比为5：1.1：0.54。

更优选地，步骤S1中，所述微流控纸芯片负载有金属有机凝胶的干粉，所述干粉为所述金属有机凝胶经过干燥得到的干粉，即金属有机干凝胶粉。

进一步优选地，步骤S1中，所述金属有机干凝胶粉的制备方法如包括以下步骤：将得到的所述金属有机凝胶除杂后，干燥，即得。所述除杂包括除去未反应的原料。

更进一步优选地，步骤S1中，所述除杂的方法包括离心。

更进一步优选地，步骤S1中，所述干燥的方法包括：冷冻干燥。

更优选地，步骤S1中，所述纸芯片为纤维素纸。

进一步优选地，步骤S1中，所述纸芯片为whatman 1号纤维素纸。

更优选地，步骤S1中，所述氨基化的纸芯片由硅烷偶联剂进行氨基化得到。

进一步优选地，步骤S1中，所述硅烷偶联剂包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

更优选地，步骤S1中，所述氨基化的反应体系的溶剂包含乙醇。

进一步优选地，步骤S1中，所述氨基化的反应体系的溶剂为浓度40％v/v～60％v/v乙醇水溶液。

更进一步优选地，步骤S1中，所述氨基化的反应体系的溶剂为浓度50％v/v乙醇水溶液。

进一步优选地，步骤S1中，所述氨基化的纸芯片的制备方法包括以下步骤：将所述纸芯片与含有所述硅烷偶联剂的溶剂充分反应。

更进一步优选地，步骤S1中，将所述纸芯片于含有所述硅烷偶联剂的溶剂中充分浸泡3h～5h。

再进一步优选地，步骤S1中，将所述纸芯片于含有所述硅烷偶联剂的溶剂中充分浸泡4h。

更优选地，步骤S1中，所述纸芯片基质的制备方法包括以下步骤：将金属有机凝胶、3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和氨基化的纸芯片充分反应，即得；所述金属有机凝胶、3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(4～5)：(40～60)：(20～30)。

进一步优选地，步骤S1中，所述纸芯片基质的制备方法中，所述金属有机凝胶、3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3：50：25。

进一步优选地，步骤S1中，所述纸芯片基质的制备方法中，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃避光反应7h～9h。

更进一步优选地，步骤S1中，所述纸芯片基质的制备方法中，所述充分反应的条件包括：21℃～25℃避光反应8h。

进一步优选地，步骤S1中，所述纸芯片基质的制备方法还包括：反应结束后冲洗所得反应产物，以除去多余的反应溶液。

更优选地，步骤S2中，将雌酮与硅烷偶联剂充分反应，得到产物1；将产物1与交联剂和引发剂充分反应，得到产物2；将步骤S1所得纸芯片基质与产物2充分反应，即得。

进一步选地，步骤S2中，所述产物1的制备中，将雌酮与硅烷偶联剂在乙醇中混合均匀，充分振荡。

更进一步选地，所述振荡的条件包括：100rpm～300rpm振荡20min～40min。

再进一步选地，所述振荡的条件包括：200rpm振荡30min。

进一步选地，步骤S2中，所述产物2的制备中，将产物1与交联剂和引发剂反应20min～40min。

更进一步选地，步骤S2中，所述产物2的制备中，将产物1与交联剂和引发剂反应30min。

进一步选地，步骤S2中，将步骤S1所得纸芯片基质于产物2中浸泡100rpm～300rpm振荡10h～14h。

更进一步选地，步骤S2中，将步骤S1所得纸芯片基质于产物2中浸泡200rpm振荡12h。

更优选地，步骤S2中，所述雌酮与所述金属有机凝胶的质量比为1：(0.5～2)。

进一步选地，步骤S2中，所述雌酮与所述金属有机凝胶的质量比为1：1.5。

更优选地，步骤S2中，所述硅烷偶联剂、交联剂和所述金属有机凝胶的用量比为(40～140)μL：(40～140)μL：(5～20)mg。

进一步选地，步骤S2中，所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷，所述交联剂为四乙氧基硅烷。

更进一步选地，步骤S2中，所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷和所述金属有机凝胶的用量比为(80～140)μL：(80～140)μL：(15～20)mg。

再进一步选地，步骤S2中，所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷和所述金属有机凝胶的用量比为100μL：100μL：15mg。

更优选地，步骤S2中，所述硅烷偶联剂、交联剂和引发剂的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～2)。

进一步选地，步骤S2中，所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷，所述交联剂为四乙氧基硅烷，所述引发剂为氨水。

更进一步选地，步骤S2中，所述-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷和氨水的体积比为1：1：1。

更优选地，步骤S3中，清洗步骤S2所得产物，以去除雌酮。

进一步优选地，步骤S3中，用乙醇和乙腈清洗步骤S2所得产物5min～30min，所述乙醇和乙腈的体积比为(3～5)：1。

更进一步优选地，步骤S3中，用乙醇和乙腈清洗步骤S2所得产物10min～25min，所述乙醇和乙腈的体积比为4：1。

更进一步优选地，步骤S3中，用乙醇和乙腈清洗步骤S2所得产物20min，所述乙醇和乙腈的体积比为(3～5)：1。

再进一步优选地，步骤S3中，用乙醇-乙腈溶液清洗步骤S2所得产物20min，所述乙醇和乙腈的体积比为4：1。

任一所述微流控纸芯片在检测雌酮中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供的微流控纸芯片具有强抗干扰能力，抵抗离子(Mg

优选地，所述微流控纸芯片用于检测体液样本中的雌酮。

更优选地，所述微流控纸芯片用于检测尿液中的雌酮。

进一步优选地，所述微流控纸芯片用于检测孕马的尿液中的雌酮。

任一所述微流控纸芯片在提取孕马尿中的雌酮中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供的微流控纸芯片中的MOG催化H

一种检测雌酮的方法，包括以下步骤：用所述微流控纸芯片与待测样品进行充分的显色反应，分析微流控纸芯片的显色结果，即得；所述显色反应的方法包括化学发光法。

优选地，所述化学发光法为过氧化氢化学发光法。

更优选地，所述过氧化氢化学发光法的显色剂为TMB或鲁米诺。

进一步优选地，所述过氧化氢与TMB的摩尔比为(1～5)：(0.2～1.2)。

更进一步优选地，所述过氧化氢与TMB的摩尔比为3：0.6。

进一步优选地，所述过氧化氢与鲁米诺的摩尔比为(1～5)：(0.6～1.8)。

更进一步优选地，所述过氧化氢与鲁米诺的摩尔比为3：1.4。

进一步优选地，所述过氧化氢化学发光法的显色剂为TMB，则所述检测雌酮的方法包括以下步骤：将所述微流控纸芯片先与待测样本和过氧化氢充分反应，再与TMB充分反应。

更进一步优选地，与待测样本和过氧化氢充分反应后的所述微流控纸芯片，再与TMB反应的时间为3s～15s。

再进一步优选地，与待测样本和过氧化氢充分反应后的所述微流控纸芯片，再与TMB反应的时间为5s～15s。

最优选地，进一步优选地，与待测样本和过氧化氢充分反应后的所述微流控纸芯片，再与TMB反应的时间为5s。

更进一步优选地，在酸性缓冲溶液的存在下，将所述微流控纸芯片先与待测样本和过氧化氢充分反应，再与TMB充分反应。

再进一步优选地，所述酸性缓冲溶液的pH为4～6。

再进一步优选地，所述酸性缓冲溶液的pH为5。

再进一步优选地，所述酸性缓冲溶液为醋酸缓冲溶液。

再进一步优选地，所述酸性缓冲溶液为HAc-NaAc缓冲液。

最优选地，所述酸性缓冲溶液为pH为5的HAc-NaAc缓冲液。

进一步优选地，所述过氧化氢化学发光法的显色剂为鲁米诺，则所述检测雌酮的方法包括以下步骤：将所述微流控纸芯片先与待测样本和鲁米诺充分反应，再与过氧化氢充分反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明联合分子印迹及化学发光-比色微流控纸芯片技术，合成了以Ru/Hemin-MOGs为核心反应元件和E1为模板分子的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs，具有类过氧化物还原酶的高催化能力，能作为化学发光-比色纸基传感器用于特异性吸附E1，与化学发光反应联用能实现针对E1的定量检测。本发明提供的纸基微流控芯片具有分子印迹的高特异性，制备方法便捷，成本低，使用操作简便，灵敏度高，检测限低至0.528mg/L，能快速测定检测样品中的E1含量。同时还具有稳定性好的优势，在室温下存放长达1个月以上仍可保持有效的检测活性，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的制备流程和用法的示意图；A为Ru/Hemin-MOGs的制备流程；B为Paper@MOGs和Paper@MOG@E1-MIPs的制备流程，以及用于比色法(TMB)和化学发光法(Luminol)的检测方法。

图2为不同材料的表征结果，a～e依次为whatman 1号纤维素纸、Ru/Hemin-MOGs、Paper@MOGs、Paper@MOGs@E1-NIPs和Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的SEM图像；f为Ru/Hemin-MOGs的TEM图像。

图3为不同材料的发光-比色检测结果；(A)中的(a)为空白纸，(b)为Paper@MOGs，(c)为洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs，(d)为洗脱后的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs，(i)为自然光下拍摄的未显色的图像，(ii)为暗箱中拍摄得到的化学发光图像，(iii)为自然光下拍摄得到的比色图像；(B)为Paper@MOGs、洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs和洗脱后的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的化学发光图像(chemiluminescence)和比色图像(colorimetric)的灰度值变化情况。

图4为Ru

图5为Ru/Hemin-MOGs的类酶活性研究结果；(A)Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定；(B)不同CL体系下的动力学曲线；(C)不同比色体系下的紫外-可见光谱；(D)各种掺杂材料对类POD活性的影响。

图6为Ru/Hemin-MOGs的类POD催化活性研究结果，A和B分别为以H

图7为不同反应条件对Ru/Hemin-MOGs检测活性的影响；(A)为Luminol的浓度；(B)为TMB的浓度；(C)为H

图8为对Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs检测活性的影响因素；(A)为功能单体APTES的用量；(B)为交联剂TEOS的用量；(C)为洗脱时间；(D)为Ru/Hemin-MOGs的负载量；(E)为吸附时间。

图9为Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的灰度值与E1浓度的线性校准曲线；(A)为化学发光法的结果；(B)为比色法的结果。

图10为Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的稳定性；(A)为化学发光法的结果；(B)为比色法的结果。

图11为Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的选择性；(A)为化学发光法的结果；(B)为比色法的结果。

图12为Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的重现性；(A)为化学发光法的结果；(B)为比色法的结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中所用到的实验仪器包括：LC-2050C 3D高效液相色谱仪(日本岛津)、L5S-紫外可见分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)、Cytation3多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、一恒DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、HHJ-4A多头恒温磁力搅拌器(常州市凯航仪器有限公司)、KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、BS110型电子天平(德国赛多利斯)、SCILOGEX涡旋仪(信钰仪器有限公司)、MicroPette手动移液器(上海泰坦科技股份有限公司)、迷你离心机(长沙米淇仪器设备有限公司)烧杯、镊子、whatman 1号纤维素纸、荣智能手机、自制暗箱等。

本发明实施例中所用到的实验试剂包括：鲁米诺(Luminol)、30％过氧化氢(H

实施例1分子印迹化学发光-比色微流控纸芯片(Paper@MOGs-MIPs)的制备与表征

一、制备方法

1、金属有机干凝胶粉(Ru/Hemin-MOGs)的制备

本实施例提供一种制备金属有机干凝胶粉的方法，流程如图1中的A和B所示，具体步骤如下：

将PDA(13.4mg，0.2M)溶解在含有250μL DMSO的玻璃瓶中，然后加入110μL的RuCl

2、纸芯片基质(Paper@MOGs)的合成

将whatman 1号纤维素纸用打孔器裁剪成直径为1cm的圆片，并在0.2M的盐酸溶液中进行酸化30min，取出后将纸粘贴在载玻片上以防止其漂浮，放入培养皿中然后用去离子水清洗以去除多余的盐酸。将纸片浸入含200μL APTES的20mL乙醇-水溶液(乙醇和水的体积比为1:1)中浸泡4h进行氨基化，取出后将其固定在培养皿上以防止漂浮，加入Ru/Hemin-MOGs(15mg)、5mL NHS(50mg/mL)和5mL EDC(25mg/mL)在室温(23±2℃)、避光条件下与纸片反应8h，使MOG接枝到纸芯片上。反应完成后用去离子水冲洗纸片，以除去多余的反应溶液，得到纸芯片基质(即Paper@MOG)，4℃下冷藏保存备用。

3、纸芯片基质上分子印迹聚合物(Paper@MOG@E1-MIPs)的制备

将10mg E1和100μL APTES在20mL乙醇中混合，在200rpm下振荡30min，预聚合，然后加入交联剂TEOS100μL和引发剂氨水100μL，进行预聚合，反应20min后，将Paper@MOGs浸入溶液中，并在搅拌下(200rpm)继续振荡放置过夜(12h)；用20mL乙醇-乙腈溶液(乙醇和乙腈的体积比为4:1)清洗Paper@MOGs 20min，除去其中的模板分子E1，即得到Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs。

作为对照的纸芯片基质上分子非印迹聚合物(记为Paper@MOGs@E1-NIPs)的制备方法与Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs基本相同，区别仅在于不添加模板分子E1。

二、表征结果

本实施例对各材料和纸芯片的形貌通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行了表征。

whatman 1号纤维素纸的SEM图像如图2中的a所示，从中可以看出纤维素纸内部的纤维结构不均匀，呈现出多孔结构。

图2中的b和f分别为Ru/Hemin-MOGs的SEM和TEM图像，可见制备好的Ru/Hemin-MOGs为片状或块状。

Paper@MOGs的SEM图像如图2中的c所示，从中可以明显看出Ru/Hemin-MOGs被成功的孵育在纤维素纸的表面。

图2中的d和e分别为Paper@MOGs@E1-NIPs和Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的SEM图像，对比可见Paper@MOGs@E1-NIPs中Ru/Hemin-MOGs@NIPs的排列更为紧密，而Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs中Ru/Hemin-MOGs@MIPs的结构更为疏松，含有空隙结构，说明Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs中的E1分子被洗脱下来，形成了可特异性识别的空腔。

实施例2Paper@MOG@E1-MIPs的使用方法

一、检测及分析

将实施例1制得的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs置于定制的纸芯片大小(直径1cm)的玻璃器皿中，平行设置两组，如图1中的B所示，分别利用TMB化学发光法和鲁米诺化学发光法进行比色检测，具体操作如下：

(1)吸附及显色反应

向第一组的玻璃器皿中依次加入20μL E1(20mg/L)以及20μL Luminol(1.4mmol

(2)拍摄

第一组显色后，在暗箱中，使用手机于同一视角和高度对各玻璃器皿中的纸芯片进行拍摄，所得照片即为化学发光法的显色图像，记为化学发光图像；第二组显色后，在自然光下，使用手机于同一视角和高度对各玻璃器皿中的纸芯片进行拍摄，所得照片即为比色法的显色图像，记为比色图像。

(3)灰度值分析

运用ImageJ软件分析各组的化学发光图像和比色图像的灰度值，利用E1的浓度和对应的灰度值进行回归分析。

二、Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的有效性

按照本实施例的步骤一，分别使用whatman 1号纤维素纸(即空白纸)、Paper@MOGs、洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs和洗脱后的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPss置于定制的纸芯片大小(直径1cm)的玻璃器皿中，进行E1的比色检测。

如图3中的A所示，未固载Ru/Hemin-MOGs的空白纸化学发光和比色图像均无变化，而Paper@MOGs可观察到明显的亮蓝色的化学发光和深绿色的比色图像，说明MOGs能够明显催化纸芯片上的化学发光和比色体系；洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs化学发光和比色的显色程度相比于Paper@MOGs均受到抑制，而洗脱后的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs化学发光和比色的显色程度受到的抑制作用明显减少，原因在于洗脱后E1被除去，MOGs活性位点露出，催化活性提高，显色的受抑制程度降低。

如图3中的B所示，洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs比Paper@MOGs的化学发光图像的灰度值低，而灰度值在洗脱后升高；洗脱前的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs比Paper@MOGs的比色图像的灰度值高，而灰度值在洗脱后降低。说明E1-MIPs被成功固载于Paper@MOGs上，并在洗脱前后影响化学发光和比色图像的灰度值。

实施例3Ru/Hemin-MOGs的活性评价

一、Ru

1、不同浓度的Ru

按照实施例1中的方法制备Ru/Hemin-MOGs，区别仅在于：步骤1中，加入110μL浓度为0.08M、0.10M、0.12M、0.14M、0.16M、0.18或0.20M的RuCl

2、不同浓度的Hemin合成的Ru/Hemin-MOGs

按照实施例1中的方法制备Ru/Hemin-MOGs，区别仅在于：步骤1中，加入90μL浓度为1M、2M、3M、4M、5M、6M或7M的Hemin溶液。

3、Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定

将50μL Ru/Hemin-MOGs(0.5mg/mL)加到石英玻璃器皿(不带盖的圆柱形石英玻璃杯，底面半径×高度＝1×2厘米)，10s后依次加入50μL H

4、Ru/Hemin-MOGs的吸光度测定

在96孔板中依次加入10μL TMB(0.4mmol

5、实验结果

如图4中的A和B所示，当Ru

综上，选择110μL浓度为0.1mM的RuCl

二、Ru/Hemin-MOGs的类酶活性

1、Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照本实施例步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定”，区别仅在于：加或不加50μLRu/Hemin-MOGs(0.5mg/mL)到石英玻璃器皿中，进行测定。

2、不同CL体系下的动力学曲线

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照本实施例步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定”，区别仅在于：加或不加50μLRu/Hemin-MOGs(0.5mg/mL)和50μL H

3、不同比色体系下的紫外-可见光谱

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照本实施例步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的吸光度测定”，区别仅在于：加或不加10μL H

4、各种掺杂材料对类POD活性的影响

按照实施例1中的方法，区别仅在于：90μL的RuCl

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照本实施例步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的吸光度测定”，区别仅在于：加入10μL的Ru-MOGs(0.5mg/mL)、Ru/Cu-MOGs(0.5mg/mL)、Ru/Ag-MOGs(0.5mg/mL)、Ru/Fe-MOGs(0.5mg/mL)、Ru/Co-MOGs(0.5mg/mL)或Ru/Hemin-MOGs(0.5mg/mL)到石英玻璃器皿中，进行测定。

4、实验结果

如图5中的A所示，在化学发光体系里，Ru/Hemin-MOGs的CL发射信号以420nm为中心，这与Luminol的发射波长一致。如图5中的B所示，单独缺少Ru/Hemin-MOGs、单独缺少H

如图5中的C所示，单独缺少Ru/Hemin-MOGs、单独缺少H

以上结果表明，Ru/Hemin-MOGs具有类POD活性，能够在H

此外，本实施例还对比了掺入不同各种常见具有催化能力的过渡金属原子对Ru-MOGs的类POD活性的影响。如图5中的D所示，与Ru-MOGs相比，Ru/Cu-MOGs、Ru/Ag-MOGs、Ru/Fe-MOGs、Ru/Co-MOGs和Ru/Hemin-MOGs对H

三、Ru/Hemin-MOGs的类POD催化活性

1、稳态动力学分析

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

为了直观的评价Ru/Hemin-MOGs的类POD催化活性，本实施例进行了稳态动力学分析，以获得Ru/Hemin-MOGs的动力学参数(米氏(Michaelis-Menten)常数(K

以H

以TMB作为变化的底物：在96孔板中依次加入10μL不同浓度的TMB(0.1mmol L

通过Beer-Lambert定律将测得的吸光度反向转换为oxTMB浓度，具体公式为：A＝εbC，其中A代表oxTMB浓度，ε代表oxTMB的摩尔吸收系数(39000M

利用Origin软件对Michaelis-Menten方程中的数据进行非线性拟合，得到动力学参数，公式如下：

其中，V表示催化反应的初速度(mol·L

2、实验结果

Ru/Hemin-MOGs与TMB和H

表1Ru/Hemin-MOGs和HRP之间的K

通过比较Ru/Hemin-MOGs和HRP的K

实施例4反应条件对Ru/Hemin-MOGs检测活性的影响

一、Luminol浓度

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照实施例3步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的CL光谱测定”，区别仅在于：加100μLluminol(0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM或1.8mM)。

二、TMB浓度

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照实施例3步骤一中“Ru/Hemin-MOGs的吸光度测定”，区别仅在于：加10μL TMB(0.2mmol

三、H

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照实施例3步骤一中“Ru/Hemin-MOGs”的吸光度测定”，区别仅在于：加10μL H

四、pH值

按照实施例1中的方法，使用110μL浓度为0.1mM的RuCl

按照实施例3步骤一中“Ru/Hemin-MOGs”的吸光度测定”，区别仅在于：加170μLHAc-NaAc缓冲液(pH＝2、3、4、5、6、7或8)。

通过所测得的吸光度，选取一个吸光度为1(100％)，根据比例依次求得其他的吸光度，即计算得到Relative activity(％)。

五、实验结果

如图7中的A所示，测得的CL强度随着Luminol的浓度增大而增加。由于化学发光仪测量的最大量程(50000)的限制，为了后续方便CL测试，确定用于CL检测的Luminol的最佳浓度为1.4mmol

如图7中的B所示，测得的吸光度随着TMB的浓度增大而增加，浓度达到0.6mmol

如图7中的C所示，测得的吸光度随着H

如图7中的D所示，随着pH增大，Ru/Hemin-MOGs的催化活性呈现先增加后降低的趋势，在pH为5时达到最大。故pH值为5作为后续分析的最佳pH值。

实施例5不同因素对Paper@MOG@E1-MIPs检测活性的影响

一、功能单体APTEs的用量

1、Paper@MOG@E1-MIPs的制备

按照实施例1中的方法制备Paper@MOG@E1-MIPs，区别仅在于：步骤3中，APTES的用量为40μL、60μL、80μL、100μL、120μL或140μL。

2、灰度值测定

将制得的各Paper@MOG@E1-MIPs置于定制的纸芯片大小(直径1cm)的玻璃器皿中，依次加入20μL E1(20mg/L)以及20μL Luminol(1.4mmol

二、交联剂TEOS的用量

1、Paper@MOG@E1-MIPs的制备

按照实施例1中的方法制备Paper@MOG@E1-MIPs，区别仅在于：步骤3中，TEOS的用量为40μL、60μL、80μL、100μL、120μL或140μL。

2、灰度值测定

与本实施例步骤一中“灰度值测定”相同。

三、洗脱时间

1、洗脱液的收集

在Paper@MOG@E1-MIPs制备过程中为保证模板分子的完全洗脱对洗脱时间进行了优化，按照实施例1中的方法制备Paper@MOG@E1-MIPs，区别仅在于：步骤3中，洗脱模板分子的时间为5min、10min、15min、20min或25min，收集各洗脱时间的洗脱液。

2、吸光度测定

检测各洗脱液在280nm处的吸光度，判断其中是否含有模板分子E1。

四、Ru/Hemin-MOGs的负载量

1、Paper@MOG@E1-MIPs的制备

纸芯片上负载的Ru/Hemin-MOGs的多少，会影响其催化效率，从而影响Paper@MOG@E1-MIPs的发光强度和比色颜色深浅，因此纸芯片上的材料量是十分重要的条件。按照实施例1中的方法制备Paper@MOG@E1-MIPs，区别仅在于：步骤2中，Ru/Hemin-MOGs的用量为5mg、10mg、15mg或20mg。

2、灰度值测定

与本实施例步骤一中“灰度值测定”基本相同，区别仅在于：步骤3中，E1在乙醇中的浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L或100mg/L。

五、吸附时间

1、Paper@MOG@E1-MIPs的制备

按照实施例1中的方法制备Paper@MOG@E1-MIPs。

2、灰度值测定

与本实施例步骤一中“灰度值测定”基本相同，区别仅在于：滴加20μL H

六、实验结果

如图8中的A所示，功能单体APTES的用量为40～100μL时，Paper@MOG@E1-MIPs测得的灰度值逐渐上升，并在100μL时达到最大值，之后灰度值随APTES用量的增加而下降。所以，APTES的最佳用量为100μL。

如图8中的B所示，交联剂TEOS的用量在40～100μL时，Paper@MOG@E1-MIPs测得的灰度值逐渐上升，并在100μL时达到最大值，之后灰度值随TEOS用量的增加而下降。所以，TEOS的最佳用量为100μL。

如图8中的C所示，洗脱时间大于5min时，Paper@MOG@E1-MIPs测得的吸光度逐渐降低，洗脱时间大于10min时吸光度基本为0。为了充分洗脱E1，选择20min(吸光度为0.034)作为最佳洗脱时间。

如图8中的D所示，不同负载量的Ru/Hemin-MOGs制得的Paper@MOG@E1-MIPs对不同浓度的E1均能检测到灰度值，且灰度值与E1的浓度整体呈负相关的线性关系；其中，Ru/Hemin-MOGs的负载量为15mg和20mg时，Paper@MOG@E1-MIPs的灰度值均较高且彼此相近，结合环保节约原则，选择15mg为最佳Ru/Hemin-MOGs的负载量。

如图8中的E所示，在吸附时间为1s～5s时，Paper@MOG@E1-MIPs测得的灰度值逐渐降低，吸附时间大于5s时灰度值基本保持稳定。所以，最佳吸附时间为5s。

实施例6 Paper@MOG@E1-MIPs的性能评价

一、线性关系

1、实验方法

(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备

按照实施例1中的方法和实施例5确定的最佳条件制备得到Paper@MOG@E1-MIPs。

(2)化学发光检测

将制得的Paper@MOG@E1-MIPs置于定制的纸芯片大小(直径1cm)的玻璃器皿中，依次加入20μL不同浓度的E1(0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L或160mg/L)以及20μL Luminol(1.4mmol

(3)比色法检测

将制得的Paper@MOG@E1-MIPs置于定制的纸芯片大小(直径1cm)的玻璃器皿中，依次加入20μL不同浓度的E1(0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L或160mg/L)以及10μL H

2、实验结果

如图9中的A所示，化学发光图像的灰度值随着E1浓度增加而减小，线性回归方程为Y＝-0.2757x+105.8922(Y为灰度值，x为浓度)，相关系数R

二、稳定性

1、实验方法

(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备与保存

按照实施例1中的方法和实施例5确定的最佳条件制备得到Paper@MOG@E1-MIPs，存于密封的样品瓶中，在室温(23±2℃)条件下储存30天，每隔5天进行化学发光检测和比色法检测。

(2)化学发光检测

与本实施例步骤一的“(2)化学发光检测”相同。

(3)比色法检测

与本实施例步骤一的“(3)比色法检测”相同。

2、实验结果

如图10中的A和B所示，无论是比色法还是化学发光法，Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs在30天内的检测灰度值RSD均小于2％。表明Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs在室温下能有效保存一个月以上。

三、选择性

1、实验方法

(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备

与本实施例步骤一的“(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备”相同。

(2)化学发光检测

与本实施例步骤一的“(2)化学发光检测”基本相同，区别仅在于：加入20μL的MgCl

(3)比色法检测

与本实施例步骤一的“(3)比色法检测”基本相同，区别仅在于：加入20μL的MgCl

2、实验结果

如图11中的A和B所示，无论是比色法还是化学发光法，与E1相比，Paper@MOG@E1-MIPs对干扰离子(Mg

四、重现性

1、实验方法

(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备

按照实施例1中的方法和实施例5确定的最佳条件独立合成了5批Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs。

(2)化学发光检测

与本实施例步骤一的“(2)化学发光检测”相同。

(3)比色法检测

与本实施例步骤一的“(3)比色法检测”相同。

2、实验结果

如图12中的A和B所示，无论是比色法还是化学发光法，5批Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs的检测灰度值RSD均小于4％。表明本发明制备的Paper@Ru/Hemin-MOG@MIPs具有良好的可重复性和再现性。

五、可靠性

1、实验方法

(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备

与本实施例步骤一的“(1)Paper@MOG@E1-MIPs的制备”相同。

(2)加标回收试验

样品处理方法：孕马尿样品购自杭州梵康医药科技有限公司，孕马尿样品处理过程为量取20mL孕马尿置于离心管中6000r/min离心10min，收集上清液再经0.22μm过滤。取上清液10mL尿中加入pH＝6的磷酸盐缓冲液4mL，β2葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶100μL，于37℃水浴中保温24h，取出后离心(6000r/min，10min)，取上清液备用。将收集到的上清液按按照标准加样回收实验要求的百分比为80％、100％和120％，进行E1加样，得到待测样品。

检测方法：按照本实施例步骤一的“(2)化学发光检测”和“(3)比色法检测”检测待测样品，以高效液相色谱(HPLC)法作为对照。

2、实验结果

表2加样回收检测结果

如表2所示，三种方法的加样回收率在94.1％到101.67％之间，三次平行测试的RSD小于3.2％，表明构建的双模式传感分析方法对含有各种未定义物质的实际样品中E1的检测是准确的。此外，相比，本发明采用的比色法和化学发光法与作为“金”标准的HPLC的结果基本一致。同时，使用SPSS分析软件对检出量进行T检验分析，T检验也证实了所提出的传感系统与HPLC的检测结果在95％的置信区间内没有显著性差异(P＞0.05)。综上所述，本发明提供的利用Paper@MOG@E1-MIPs建立的检测E1的比色法和化学发光法的可靠性高。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。