磁性纳米颗粒上的二氧化硅包封的DNA

背景技术

数字信息的体量正以指数速率增长。数字信息量的这一巨大增长可能会超过常规存储技术的能力。一种用于存储大量数字信息的有前途的技术是脱氧核糖核酸(DNA)。DNA是众所周知的可以存储遗传信息的分子。然而，DNA也可以用作数字信息的存储介质。多个不同的小组已成功地将计算机文件转换为核苷酸碱基的串，创建了编码该串的合成DNA，对合成DNA进行了测序，然后以100％的精度恢复了原始数字信息。

作为存储介质，DNA在信息密度和稳定性方面相对于常规光学和磁性介质具有潜在优势。使用DNA进行存储可以实现每克超过200拍字节(即2亿吉字节)的数据密度，这比利用常规介质所可能达到的密度要高得多。使用DNA，世界上所有的数字信息都可以存储在单个房间中。DNA还可以提供更好的长期存储。磁性和光学介质可在5到10年内损坏。然而，可读性DNA已从数十万年前的化石中恢复。

然而，DNA的寿命取决于存储条件。DNA容易因热、酶、诱变化学物质和电离辐射而降解。当存储在溶液中时，DNA可以稳定大约10年，这与其他存储介质的时间尺度相同。提供长期稳定性和高数据密度的存储技术改善了DNA作为数字信息存储介质的可用性。

发明内容

本公开提供了通过包封在二氧化硅中来稳定地存储DNA的结构和方法。DNA被吸附到基材上，该基材提供了可以与DNA一起包入二氧化硅中的结构。基材可以具有任何形状，包括但不限于球形或平坦表面。在一种实施方式中，基材是纳米颗粒。将DNA包入二氧化硅中可涉及多个步骤，并且可以通过使用磁力从溶液或上清液中分离DNA来辅助物理处理。因此，基材可以被磁化。基材可具有强的饱和磁化强度，例如，每克大于50个电磁单位(EMU)。金属可具有强的饱和磁化强度。在一个实施方式中，基材可以是例如铁(Fe)、钴(Co)或镍(Ni)的金属。可以例如通过添加碳和/或带电的有机基团来使基材的表面层官能化。在一个实施方式中，基材的官能化可以将负电荷赋予其表面，从而产生带负电荷的磁性基材。

二氧化硅包封可以通过将DNA暴露于四烷氧基硅烷如正硅酸四乙酯(TEOS)来执行。将DNA暴露于含二氧化硅的化合物可以持续延长的时间段，例如数小时或数天。在二氧化硅中包封可保护DNA免受DNA降解剂(例如活性氧物种(ROS))。在二氧化硅中包封可以将DNA密封在玻璃下，从而保护其免受化学侵蚀、高温和潮湿。这增加了DNA的耐用性，并且使其成为长期存储数字信息的可行介质。

通过在基材上产生多层DNA来增加DNA密度。DNA是带负电荷的分子，并且可以与多阳离子分子(例如多阳离子聚合物)一起层叠。如本文所用，“多阳离子分子”是指具有三个或更多个可潜在地带正电荷的分开的位点的分子。在一个实施方式中，多阳离子分子是聚乙烯亚胺(PEI)。DNA和多阳离子分子的多个交替层可以被吸附到基材的表面。与仅具有单层DNA的基材相比，多层DNA增加了每单位体积或重量可以存储的DNA量。在使用涂覆有四层DNA的纳米颗粒的实施方式中，密度可以超过按重量计7％DNA。在平坦表面(例如2D结构)上的多层DNA可以达到约400-500ng/cm

存储后，可通过与溶解二氧化硅而不损害DNA的蚀刻溶液接触来从二氧化硅包封中释放DNA。在一个实施方式中，蚀刻溶液是缓冲氟化氢溶液。一旦从包封中释放，就将pH调整为中性(例如6-8)，并添加多阴离子分子以从多阳离子分子中置换DNA。然后可以对DNA测序或以其他方式处理。DNA中核苷酸碱基的序列可以被解码以获得存储的数字信息。

在本公开中描述的这些结构和技术可应用于存储编码数字信息的合成DNA，但是同样适于存储天然存在的DNA。

提供本发明内容以简化形式介绍一些概念，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容既不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。例如，术语“技术”可以指上述上下文和整个文件中所允许的一个或多个系统和/或方法。

附图说明

参照附图阐述具体实施方式。在附图中，附图标记的最左边的数字标识该附图标记首次出现的附图。在不同附图中使用相同的附图标记指示相似或相同的条项。

图1是示出了使用磁性纳米颗粒将多层DNA稳定包封在二氧化硅中的结构和过程的图。

图2是流程图，示出了用于将DNA包封在二氧化硅中并在存储后恢复DNA的说明性过程。

图3是流程图，示出了用于将包含多层DNA的颗粒包封在二氧化硅中的说明性过程。

图4是电泳凝胶的图像，其显示包封在二氧化硅中保护DNA免受通过活性氧物种(ROS)的降解。

图5是显示增加的二氧化硅包封对DNA稳定性的影响的柱形图。随着为二氧化硅包封过程提供更多的时间，稳定性增加。较高的柱指示高的降解速率，而较低的柱指示较大的稳定性。

图6是柱形图，其显示了以DNA的重量百分比测量的存储密度如何随DNA层数变化。存储密度增加至多达总共四层，然后再次下降。

具体实施方式

多核苷酸——例如DNA和核糖核酸(RNA)——包括具有非天然碱基的多核苷酸，可以用于通过设计编码数字信息的零和一的核苷酸碱基序列而存储数字信息。本领域技术人员已知存在多种使用核苷酸碱基表示数字信息的技术和编码方案。使用DNA而不是用于存储数字信息的另一存储介质的优点包括信息密度和寿命。相对于用于存储DNA的其他技术，本公开中描述的DNA存储结构和方法可以提高信息密度和寿命这两者。本公开内容可用于任何类型的多核苷酸，因此对“DNA”的提及是说明性的，并不旨在将本申请仅限于DNA。

在一种实施方式中，金属纳米颗粒可以用作芯，在其上层叠有DNA，然后将整个颗粒包封在二氧化硅中。一种合适的纳米颗粒是可从TurboBeads LLC(瑞士苏黎世)获得的“涡轮珠(TurboBeads)”。涡轮珠在Grass等人的Covalently Functionalized CobaltNanoparticles as a Platform for Magnetic Separations in Organic Synthesis,46Angew.Chem.Int.Ed.4909(2007)中进行了描述。如本文所用，“纳米颗粒”是具有约100nm或更小的直径的颗粒。一些纳米颗粒(例如涡轮珠)可具有约为50nm的直径。如本文所用，“金属的”或“金属”是指元素周期表中通常归类为金属的任何元素或元素的合金。然而，金属氧化物不包括在“金属的”或“金属”的定义中。可以使用除了涡轮珠以外的颗粒(包括直径大于100nm的颗粒)来实施本公开的技术。

除纳米颗粒以外的基材也可用于存储DNA。例如，较大的颗粒、容器的内壁、平坦的表面(例如，材料的片材、柔性带、玻璃、塑料等)可以涂覆有DNA和多阳离子分子的交替层，以形成用于稳定地存储DNA的多层结构。无论是颗粒还是另一形状的基材都可以是磁性的或非磁性的。

纳米颗粒的磁性性质可以帮助将纳米颗粒从上清液或其他溶液中分离，上清液或其他溶液是在将DNA层叠到纳米颗粒的表面上和/或将纳米颗粒包封在二氧化硅中的过程期间使用的。从溶液中物理分离非常小的颗粒可能是麻烦的并且在技术上具有挑战性。磁性分离允许收集纳米颗粒并去除上清液或其他溶液而无需干燥。此外，与干燥相比，可以容易地使用更大的体积，从而增加了可收集的包封物和可恢复的DNA的量。术语“分离”是指纳米颗粒和溶液的部分或完全分离。在分离不完全/不足的情况下，可以添加一个或多个其他分离步骤。

一种磁性性质是“饱和磁化强度”。铁磁材料的饱和磁化强度是表示当固体块中的所有磁偶极与外部磁场相互对准时产生的磁化强度的量。饱和磁化强度是铁磁体的易磁化轴与外部磁场方向匹配时的铁磁体的磁化强度值。饱和磁化强度等于每个原子的净磁矩与存在的原子数的乘积。术语磁矩通常是指系统的磁偶极矩——磁矩的分量，其可以用等效的磁偶极子来表示：磁北极和南极间隔的距离很小。物体的磁偶极矩容易根据物体在给定磁场中所经历的扭矩来定义。

饱和磁化强度可以通过电磁单元(EMU)进行测量，其中电流通过承载其的两条细的、平行的、无限长的导线之间存在的力来定义，然后将电荷定义为电流乘以时间。相对于较小的饱和磁化强度，较大的饱和磁化强度可以提高分离速度，但是较小的饱和磁化强度将只会减慢而不停止分离。在一个实施方式中，纳米颗粒的饱和磁化强度可以大于每克50EMU。

基材例如纳米颗粒还可以表现出“软”磁行为并且具有零或接近零的磁滞。软磁性材料是易于磁化和消磁的那些材料。磁滞是当施加外部磁场时铁磁体的磁化强度变化的延迟。磁滞低或为零的材料将响应于外部磁场而快速变化。

金属芯可以被官能化以使得DNA能够吸附到其表面。吸附是指来自气体、液体或溶解固体的原子、离子或分子与表面的附着。该过程在吸附剂的表面上产生了被吸附物的膜。如本文所用，“官能化”是指将官能团引至表面。例如，涡轮珠是用氯基、硝基、氨基、磺酸根或其他官能团官能化的碳涂覆纳米颗粒。可以部分地基于它们的电荷来选择官能团。因此，纳米颗粒可以涂覆有官能团，该官能团向其表面赋予负电荷。负电荷提供了如下表面，带正电荷的分子(如多阳离子聚合物)可静电吸引到该表面。带正电荷的分子进而提供了带负电荷的DNA可吸附到的表面。DNA中带正电荷的分子与纳米颗粒的重复接触可以添加围绕金属芯的连续的层。术语“接触”是指在纳米颗粒上构建层的背景下如本文所述的使一种物质与另一种物质接触的任何合适方式。因此，“接触”包括简单的添加以及强烈的混合。

术语“稳定地存储”是指如下存储条件，其将以不变或基本不变的条件保存所存储的物品达比在没有特定存储条件的情况下物品会不改变的更长的时间。在DNA存储的背景下，“稳定地存储”可指在室温和大约50％的相对湿度下将DNA存储达10年以上而降解小于1％。“稳定地存储”还可以指用于存储的技术或结构，该技术或结构将存储的物品的降解降低到小于所存储的物品在类似条件而不使用该特定存储技术或结构的情况下的一半的速率。

图1示出了用于将DNA稳定地存储在包封于二氧化硅中的纳米颗粒上的技术的示意性表示，以及通过该技术产生的包封物。在官能化或产品吸附到其表面之前，纳米颗粒100具有约100nm或更小的直径。在一个实施方式中，直径可以是大约50nm。纳米颗粒100可以具有芯102。芯102可以是金属的或非金属的。金属芯的例子包括铁、钴、镍及其合金。非金属芯的例子包括氧化铁、氧化钴、氧化镍和二氧化硅。由这些材料产生纳米颗粒的技术是本领域普通技术人员已知的。

在一个实施方式中，芯102可以是磁性的。芯102可以具有对每克的纳米颗粒100而言大于50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150EMU的饱和磁化强度。在一种实施方式中，给定1特斯拉磁场，芯102的饱和磁化强度可在80–140EMU/g之间。可以选择用于芯102的材料以实现给定的饱和磁化强度。

纳米颗粒100可具有碳涂层。碳涂层可具有大约1nm的平均厚度。不受理论的束缚，据信碳涂层在化学上与石墨层或多壁碳纳米管的结构相关联，因此适用类似的官能化化学。因此，可以应用于石墨层或碳纳米管的官能化也可以应用于碳涂覆的纳米颗粒。涡轮珠是具有碳涂覆芯的纳米颗粒的一个例子。然而，其他类型的纳米颗粒也是合适的。

纳米颗粒100可以被官能化以产生官能化的表面层106。官能化可以向纳米颗粒100添加能够附着到芯102或碳涂层(如果存在)的表面的任何类型的官能团。可以通过使用重氮化学将纳米颗粒100官能化，从而产生氯基、硝基和氨基官能化的纳米颗粒。纳米颗粒100也可以通过使用N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N,N,N-三甲基-氯化铵而被铵基官能化。图1示出了磺酸盐官能化。磺酸盐是磺酸的盐或酯。它包含官能团R-SO

多阳离子分子108——例如多阳离子聚合物——可以通过静电力结合至带负电荷的官能团。多阳离子分子108可以是多阳离子线性大分子，例如聚乙烯亚胺(PEI)、聚-l-赖氨酸(PLL)、二乙基氨基乙基-右旋糖酐(DEAE-右旋糖酐)，或支链聚合物，例如聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状大分子。PEI或聚氮丙啶是具有重复单元的聚合物，该重复单元由胺基和二碳脂肪族CH

多阳离子分子108的添加可以通过用多阳离子分子108使纳米颗粒100涡旋、然后超声处理来执行。这导致纳米颗粒100具有带正电荷的多阳离子分子108的外层。带正电荷的表面适于吸附带负电荷的多核苷酸110，例如DNA。

然后可以使纳米颗粒100与多核苷酸110接触，以形成多核苷酸涂覆的纳米颗粒112。多核苷酸110存在于例如退火缓冲液的溶液中。如上所述，多核苷酸110可以是DNA、RNA、单链(ss)、双链(ds)、混合，和/或包括非天然碱基。多核苷酸110的长度可以是大约80-300个碱基对(bp)，大约100-200个bp，大约120-180个bp或大约150个bp。多核苷酸110可以编码数字信息。在添加多核苷酸110之后，可以进行涡旋和超声处理。尽管超声处理可以使基因组DNA片段化，但超声处理不会破坏长度为数百个bp的多核苷酸。此时，多核苷酸涂覆的纳米颗粒112在最外表面上具有单层多核苷酸110。

重复向多核苷酸中添加多阳离子分子以在层状颗粒114上产生交替的层。在该说明性实例中，层状颗粒114中存在四个多核苷酸110层。不受理论的束缚，据信层的交替的正负电荷可通过静电力产生稳定的结构。重复这些步骤多次涉及从上清液中重复地分离颗粒。因此，如果芯102是磁性的，则可以使用磁性分离器来促进分离。如果芯102不是磁性的，则可以使用例如过滤和干燥的其他技术来将颗粒与上清液分离。

在添加多层多阳离子分子108和多核苷酸110之后，通过将层状颗粒114包封在二氧化硅118中来产生“包封物”116。在一种实施方式中，并且为了进一步保护多核苷酸110，在二氧化硅118的添加之前最终的外层可以是多阳离子分子108。多阳离子分子108的单层和多核苷酸110的相邻单层可以被称为多阴离子/多阳离子双层120或简称为“双层”。可通过使层状颗粒114与一种或多种四烷氧基硅烷接触来添加二氧化硅118。在一个实施方式中，一种或多种四烷氧基硅烷可具有含有一个至五个碳原子的烷氧基链。例如，四烷氧基硅烷可以是正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四丙基酯、正硅酸四丁基酯、正硅酸四戊酯或它们的混合物。

在一个实施方式中，四烷氧基硅烷是TEOS。TEOS是化学式为Si(OC

含二氧化硅的化合物可以是水溶液，并且与层状颗粒114混合达延长的时间段，例如几小时或几天。可以通过使用振摇器来促进混合。在一个实施方式中，混合可以被执行24小时、48小时、72小时或96小时。更长的混合时间可以导致在层状颗粒114周围形成更厚的二氧化硅118壳。

在一种实施方式中，包封物116的重量的大约60％可以是二氧化硅118。因此，二氧化硅层118可以在颗粒周围形成非常致密的壳。例如，二氧化硅壳的厚度可能约为5-15nm。添加包括二氧化硅118的多层可导致包封物116的直径增长到大约200nm。纳米颗粒100周围的二氧化硅118和其他层可能会降低磁性能。例如，如果在1特斯拉的磁场中，纳米颗粒100具有大约50EMU/g的饱和磁化强度，则包封物116可具有大约19EMU/g的饱和磁化强度。多核苷酸110的多层使得包封物116能够加载有比不采用层叠的其他构型更多的多核苷酸110。例如，包封物116可以加载有多核苷酸110，使得该结构包括按重量计大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、或9％的多核苷酸110。在一种实施方式中，包封物116可具有约6-8％(重量/重量)的多核苷酸110。

示例性过程

为了易于理解，在本公开中讨论的过程被描绘为以独立块表示的单独的操作。但是，这些单独描绘的操作不应解释为在其执行时必定是依赖于顺序的。描述过程的顺序不旨在被解释为限制，而是可以以任何顺序组合任意数量的所描述的过程块，以实施该过程或替代过程。此外，还可以修改或省略所提供的一个或多个操作。

图2显示了将DNA包封在二氧化硅中、然后在存储后恢复DNA的过程200。DNA可以用于存储数字信息，而包封在二氧化硅中可以提供稳定的长期存储，其保护DNA免受降解。

在202处，纳米颗粒可以被官能化。纳米颗粒可以由纯金属、金属合金、金属氧化物或其他化合物制成。在一个实施方式中，纳米颗粒可以是磁性的。可以通过将带电的官能团连接至纳米颗粒的表面来实现官能化。官能团可以带正电荷或带负电荷。官能团可以是磺酸根、铵基、氯基、硝基或氨基。基于纳米颗粒的组成和待添加的官能团，可以通过已知的化学过程实现官能化。可通过在25℃处的超声浴(Elmasonic“P”系列)中将纳米颗粒与强酸(例如HCl)在水溶液中混合30分钟来执行官能化。官能化的结果可以是具有带负电荷的表面的(磁性)纳米颗粒。备选地，过程200可以开始于已经被官能化的可商购的纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以是磺酸盐官能化的涡轮珠(50mg/ml)。

在204处，将DNA加载到纳米颗粒上。DNA可以在退火缓冲液的溶液中(例如，以50μg/ml的浓度)。退火缓冲液可以是用于DNA的任何标准缓冲溶液，例如400mM三羟甲基氨基甲烷–盐酸(Tris-HCl)，500mM NaCl和100mM MgCl

如果纳米颗粒上的官能团带正电荷，则DNA可以通过静电力吸附到纳米颗粒的表面。如果官能团带负电荷，则可通过首先使纳米颗粒与带正电荷的分子接触来将DNA加载到带负电荷的纳米颗粒上。可以使用多阳离子分子，例如PEI。多阳离子分子可在超纯水中稀释(例如至2.6mg/mL的浓度)。如本文所用，“超纯水”是指具有在25℃处电阻率为18.2MΩ·cm的纯度的水或ISO(国际标准组织)3696中规定的“1类”水。超纯水的一种来源是可从密理博公司(Millipore Corporation)获得的Milli-Q

可通过在超纯水中短暂涡旋然后在超声浴中进行超声处理来悬浮纳米颗粒。在一个实施方式中，可以在2mL微量离心管中将2μL纳米颗粒与50μL超纯水混合，并置于超声浴中一分钟。在超声浴后，可以使用磁性分离器(Ocean Nano Tech，SuperMag多管分离器)从上清液中分离磁性纳米颗粒。可以将PEI溶液(300μL)或另外的阳离子聚合物添加到微量离心管中，涡旋，然后超声处理大约30秒。可以使用块状磁体，例如钕磁体，将纳米颗粒拉至微量离心管的一侧，同时丢弃上清液。然后可以通过添加200μL超纯水、短暂涡旋和超声处理10秒钟来洗涤纳米颗粒。在该洗涤后，可将200μL DNA溶液添加到微量离心管中，涡旋，然后在超声浴中放置30秒。在这段时间内，一些或所有的DNA分子已经被吸附到多阳离子分子上。潜在地包含DNA的上清液可以被收集并重新使用。

可以通过添加100μL超纯水、短暂涡旋并超声处理10秒钟来再次洗涤纳米颗粒。块状磁体可用于从溶液中分离颗粒，并丢弃上清液。根据上述程序，使纳米颗粒与PEI、然后与DNA的接触可以重复多次，以在纳米颗粒上产生多个双层。在纳米颗粒上产生多层DNA可提供更大的DNA密度(即每个纳米颗粒更多的DNA)，然后仅用单层涂覆纳米颗粒即可。DNA加载的最后步骤可以是使纳米颗粒与PEI溶液接触，使得最后一层是多阳离子分子。

在206处，可以将覆盖有多层多阳离子分子和DNA的纳米颗粒包封在二氧化硅中。块状磁体用于将纳米颗粒与任何剩余的上清液分离。在一个实施方式中，将1000μL超纯水添加到微量离心管中的纳米颗粒中，并置于超声浴中30秒。随后添加四烷氧基硅烷，例如TEOS。例如，在超声浴中时，可将5μL TEOS添加到微量离心管中。包含纳米颗粒、超纯水和TEOS的微量离心管可以放置在大约500-2000转/分钟(RPM)的振摇器上。振摇可以维持较长的时间，例如一天、两天、三天、四天、五天或更长。

在208处，可以存储二氧化硅涂覆的纳米颗粒或“包封物”。可以通过施加磁场梯度——例如通过使用块状磁体——将包封物与上清液分离。可以将包封物存储在微量离心管中或转移到另一个容器中进行存储。可以选择存储条件以进一步提高样品的寿命。例如，可以将包封物中的DNA存储在低湿度的凉爽温度下，例如9℃和20％的相对湿度。当包入二氧化硅中并在有利条件下存储时，DNA可以保存数百年、数千年或可能数百万年而不会发生显著降解。例如，在二氧化硅中包封可以达到dsDNA稳定性水平，使得在70℃和50％相对湿度(RT)下存储时，每天有<0.2、<0.3、<0.5、<1.0或<2.0ΔCq。ΔCq是将样品中的DNA量增加到检测阈值以上所需的定量PCR循环数变化的量度，并且对于具有最佳PCR效率(100％)的序列，ΔCq为1相当于为最初存在的DNA的50％的检测损失。较大值的Cq指示较小的DNA起始量，需要更大数量的PCR扩增循环。

在二氧化硅中的存储还可以使DNA对例如通过DNA降解剂的化学攻击更具抗性。活性氧物种(ROS)是DNA降解剂中的一种类型。ROS是包含氧的化学反应性化学物质。实例包括过氧化物、超氧化物、羟基和单线态氧。高百分比的包封在二氧化硅中的DNA可以在暴露于ROS后保持活性，例如超过30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。因此，如果可以例如通过本文讨论的技术使用纳米颗粒或其他基材在DNA之上形成二氧化硅层，则该结构将有助于至少部分地防止强化学物质降解DNA。显示改善的DNA稳定性的ROS测试结果证明该技术是在DNA周围形成非多孔玻璃层的二氧化硅包封。如果二氧化硅层未完全形成或它是多孔的，则可以预期更高水平的DNA降解。

在210处，DNA从二氧化硅包封中释放并纯化。在某些时刻，可以访问DNA以通过寡核苷酸测序仪测序或用于其他处理。由于二氧化硅包封保护DNA免受降解，因此其还可防止大多数分子生物学技术作用于DNA上。因此，DNA可能需要从二氧化硅壳中去除，以便测序或以其他方式使用。纯化可从溶液中除去二氧化硅、盐和其他化合物的残留物，从而留下准备好用于进一步处理的“干净的”DNA。

二氧化硅在含氟化物的溶液中迅速溶解(形成SiF

可通过使用加热的纯化柱来去除二氧化硅。可以例如通过设置为95℃的热混合器来提供热量。可以使用的一种纯化柱是QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28104)中提供的那些。

可以在将纳米颗粒加载到纯化柱上之前对其进行处理。在一个实施方式中，可以将纳米颗粒浸入20μL超纯水和10μL蚀刻缓冲液中达大约5分钟。随后通过添加10μL磷酸钾缓冲液(0.5M，pH 7)来中和pH值，涡旋，并且添加100μL释放溶液。该释放溶液可以通过在50mL超纯水中将40mg聚丙烯酸钠(PAS)稀释至0.8mg/mL的浓度、然后将其与在超纯水中稀释的氯化钠混合直至在室温下饱和而制得，PAS：NaCl的比例＝20:80。PAS是一种多阴离子分子，其可从PEI中置换DNA。在添加释放溶液之后，可以进行涡旋和超声处理30秒。可以将包含纳米颗粒的微量离心管放入预热的热混合器中，并以900RPM振摇2分钟。

在振摇后，可以将650μL缓冲液PB(Qiagen，目录号28104)添加到微量离心管中，并将内容物转移到纯化柱。缓冲液PB用于DNA清理程序，并且使得能够将单链或双链多核苷酸有效结合到纯化柱的膜上。缓冲液PB包含高浓度的盐酸胍和异丙醇。

纯化柱可以放置在离心机(Eppendorf离心机5424R)上，并以17,900cfg旋转一分钟。丢弃流过液，并添加700μL洗涤缓冲液，例如缓冲液PE(Qiagen，目录号19065)。以17,900cfg离心1分钟，并丢弃流过液。可以重复用缓冲液PE洗涤。

然后将纯化柱置于微量离心管中，并将200μL预热的蚀刻缓冲液添加至微量离心管中。将包含纯化柱的微量离心管以900RPM振摇2分钟。接下来，将微量离心管以17,900cfg离心一分钟。这产生了没有二氧化硅壳的纯化的DNA。尽管上述说明性纯化程序使用了特定的商业试剂盒，但可以使用任何与缓冲氟化氢溶液相容的纯化DNA的技术。

在212处，DNA被扩增。DNA可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其增加可用于测序或其他处理的DNA量。

图3示出了用于将包含多层DNA的颗粒包封在二氧化硅中的过程300。

在302处，具有磁芯的颗粒与多阳离子分子接触。在一个实施方式中，多阳离子分子可以是多阳离子聚合物，例如PEI。多阳离子分子可以是聚乙烯亚胺(PEI)、聚-l-赖氨酸(PLL)、二乙氨基乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状大分子，或它们的混合物。

磁性颗粒可以是纳米颗粒，并且在一种实施方式中，它们可以是碳涂覆的金属纳米颗粒。纳米颗粒的磁芯可以从金属例如铁、钴、镍及其合金形成。磁芯也可以从金属氧化物形成。磁芯的饱和磁化强度可以大于50EMU/g，大于80EMU/g，或大于100EMU/g。

多阳离子分子与颗粒的接触可以通过使颗粒在包含多阳离子分子的溶液中涡旋来执行。接触可以进一步包括在存在多阳离子分子溶液的情况下使用超声来搅动颗粒。

在304处，可将多核苷酸如dsDNA的溶液添加至磁性颗粒。多核苷酸的长度可以为大约80-300个bp，大约100-200个bp，大约120-180个bp或大约150个bp。多核苷酸可以编码数字信息，例如计算机文件的全部或一部分。可以在水溶液例如退火缓冲液中以例如约20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/mL的浓度提供多核苷酸。

在306处，将磁性颗粒与溶液分离。从溶液中分离磁性颗粒可以通过施加磁场梯度来执行。磁场梯度可以由例如商业钕磁体的永磁体(例如，1.4特斯拉的磁感应强度)产生。然而，磁场梯度的其他来源例如电磁体同样是合适的。磁体可以是块磁体，或例如磁性分离器等设备的一部分。备选地，可通过物理分离例如过滤和/或干燥将颗粒与溶液分离。

从溶液中分离后，磁性颗粒可以与多阳离子分子和DNA重复接触。因此，步骤302、304和306可以重复至少两次，至少三次，至少四次或更多。通过这些步骤进行的每次迭代都会添加另外的包括DNA和多阳离子分子的多阴离子/多阳离子双层。向磁性颗粒上添加另外的DNA层可以增加DNA密度。

在308处，将颗粒包封在二氧化硅中。将颗粒包封在二氧化硅中将产生二氧化硅包封的颗粒，其也可以称为“包封物”。可以通过使颗粒与四烷氧基硅烷接触，将颗粒包封在二氧化硅中。四烷氧基硅烷可以是正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四丙基酯、正硅酸四丁基酯、正硅酸四戊酯或它们的混合物。颗粒与四烷氧基硅烷的接触可以被执行延长的时间段，例如3小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或更长。更长的混合时间可以导致在磁性颗粒周围形成更厚的二氧化硅外壳。可以在超声浴中将颗粒与四烷氧基硅烷接触，并且可以在二氧化硅壳形成时的时间段期间连续或间歇地振摇颗粒和四烷氧基硅烷的混合物。

在310处，可通过使颗粒与蚀刻缓冲液以及多阴离子分子例如PAS接触来使多核苷酸从二氧化硅包封的颗粒中释放。从二氧化硅包封中释放DNA可以在将DNA存储一段时间后被执行。该段时间可能是几天、几周、几个月、几年、几个世纪或更长时间。缓冲的氟化氢溶液可用于溶解二氧化硅。一种合适的含氟化物溶液是NH

示例

在以下示例中，纳米颗粒是具有铁芯和磺酸盐表面官能化的碳涂覆的涡轮珠。吸附到纳米颗粒上的多核苷酸是150个bp链的dsDNA。使用PEI(分支的，Mw 1200，Polysciences，目录号06088)作为多阳离子分子。

图4是电泳凝胶的图像400，显示了在二氧化硅中的包封可以保护DNA免受DNA降解剂例如活性氧物种(ROS)的降解。四层DNA吸附在纳米颗粒的表面上。通过将L-抗坏血酸(20mM)，H

当暴露于ROS时，“裸露的”DNA导致凝胶中信号的完全失去。对于未暴露于ROS的对照，凝胶中存在强信号。通过Qubit测试法进行的DNA定量分析表明，暴露于ROS后保留了裸露的DNA起始量的14.29％。因此，没有保护层的情况下暴露于ROS可有效降解DNA。

经包封的DNA对ROS降解的抵抗力要强得多。暴露于ROS后，凝胶对包封在二氧化硅中的DNA显示出强的条带。然而，与包封的DNA对照相比，条带强度有所降低。ROS暴露使包封在二氧化硅中的DNA的量减少到起始量的52.34％。因此，二氧化硅包封导致在ROS处理后剩余的DNA多了超过三倍。

图5是条形图500，显示了增加的二氧化硅包封对DNA稳定性的影响。二氧化硅涂层可以在数小时内形成，但是额外的时间允许形成更具保护性的涂层。将样品置于70℃和50％RH下7天，以模拟DNA在9℃存储2000年会经历的热应力的量。将相同制备的参考样品在9℃和50％RH存储相同的7天。所有样品均起始于相同量的DNA。

将样品在振摇器(ThermoMixer温度控制装置)中以1100RPM振摇而暴露于TEOS(≥99.0％，Aldrich，目录号86578)达在x轴中指示的时间长度。“纯DNA”表示未包封在二氧化硅中或未以其他形式保护的“裸露的”DNA。

通过比较在7天后存储在70℃的样品与参考样品之间的定量PCR(qPCR)循环差异、并除以7以获得每日变化，来计算条形的高度。qPCR使用DNA扩增的线性来确定样品中DNA的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报道基因，可以在PCR反应实时进行时在qPCR分析中测量DNA生成。荧光超过检测阈值并变得可测量的PCR循环数称为定量循环(Cq)。包括较大量DNA的起始样品比具有较小量DNA的样品以更少的PCR循环达到此阈值。因此，Cq值与样品中的目标DNA的量成反比。存储在70℃的样品的Cq值与存储在9℃的参考样品的Cq值之差(ΔCq)指示在高温下存储的样品多降解了多少。如果差异为零，则表明升高的温度不会增加DNA降解的量。

如随着包封时间增加，条形的高度减小所证明的，为二氧化硅包封过程提供的时间越多，稳定性越高。PCR的单个循环导致DNA的量增加一倍，因此Cq值减少1指示起始DNA的量增加一倍。没有二氧化硅保护的DNA纯样品降解得最多，每天的ΔCq值超过2.64，这表明每天在70℃的存储期间，DNA的量增加了超过2.5倍。条形图500中显示的结果以表格形式再现于下表1中。

表1.稳定性对包封时间的依赖性。

因此，如果允许二氧化硅包封继续一天(24小时)，则包封的DNA在70℃存储时每天减少约一半。但是，如果将包封时间延长至四天(96小时)，则每天的ΔCq约为0.3，这相当于七天后略少于四分之一的原始DNA保留下来。因此，当将DNA涂覆的微珠与TEOS振摇四天时，dsDNA稳定性＜0.4ΔCq/天。

图6是条形图600，显示了以DNA的重量百分比(重量％)测量的存储密度如何随DNA的层数而变化。如上所述制备涡轮珠纳米颗粒，并且将添加另外的多阳离子聚合物(PEI)和DNA层的步骤重复可变次数。添加另外的层可对应于图3的重复步骤302、304和306。有趣的是，存储密度增加直至总共四层，然后降低。不受理论的束缚，第四层之后DNA加载减少的原因可能是粘附到离心管壁上。加载密度以重量％测量，代表DNA占的颗粒总重量的百分比。在一层的情况下，大约只有2％(重量/重量)是DNA，在四层的情况下增加到超过7％(重量/重量)是DNA，而在六层的情况下少于5％(重量/重量)是DNA。

示例性实施例

以下条项描述了用于实现本公开中描述的特征的多个可能的实施例。本文描述的各个实施例不是限制性的，来自任何给定实施例的每个特征也不要求存在于另一实施例中。除非上下文另外明确指出，否则可以将任何两个或更多个实施例组合在一起。如在本文的文件中所使用，“或”是指和/或。例如，“A或B”是指A没有B，B没有A，或A和B。如本文所用，“包括”是指包括所有列出的特征并且可能包括添加未列出的其他特征。“基本上由……组成”是指包括所列出的特征和不会实质性影响所列出特征的基本和新颖特征的那些附加特征。“由...组成”仅指列出的功能，不包括未列出的任何功能。

条项1.一种用于稳定地存储DNA的多层结构，包括：带负电荷的磁芯；DNA和多阳离子分子的多个交替层；以及二氧化硅涂层，其中所述多层结构包含按重量计至少1％的DNA，并且保护所述DNA，使得至少50％的所述DNA在暴露于DNA降解剂时保持活性。

条项2.根据条项1的多层结构，其中所述带负电荷的磁芯包括金属的Fe、Co或Ni；Fe、Co或Ni的金属合金；或其组合物。

条项3.根据条项1-2中任一项的多层结构，其中所述带负电荷的磁芯具有赋予负电荷的官能化表面层。

条项4.根据条项1-3中任一项的多层结构，其中在吸附所述DNA或所述多阳离子分子之前，所述带负电荷的磁芯具有至少50EMU/g的饱和磁化强度。

条项5.根据条项1-4中任一项的多层结构，其中所述多个交替层由四层组成。

条项6.根据条项1-5中任一项的多层结构，其中所述二氧化硅涂层从一种或多种四烷氧基硅烷形成。

条项7.根据条项1-6中任一项的多层结构，其中所述多阳离子分子包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚-l-赖氨酸(PLL)、二乙基氨基乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、或聚(酰氨基胺)(PAMAM)。

条项8.根据条项1-7中任一项的多层结构，其中所述多层结构包含按重量计至少7％的DNA。

条项9.根据条项1-8中任一项的多层结构，其中所述DNA降解剂产生活性氧物种(ROS)。

条项10.一种用于稳定地存储多核苷酸的方法，包括：

a.使具有磁芯的颗粒与多阳离子分子接触；

b.添加多核苷酸的溶液；

c.从所述溶液分离所述颗粒；

d.将步骤a至步骤c重复至少一次；以及

e.将所述颗粒包封在二氧化硅中，以产生二氧化硅包封的颗粒。

条项11.根据条项10的方法，其中所述具有磁芯的颗粒包括碳涂覆的金属纳米颗粒。

条项12.根据条项10-11中任一项的方法，其中所述多阳离子分子包括聚乙烯亚胺(PEI)。

条项13.根据条项10-12中任一项的方法，其中从所述溶液分离所述颗粒至少部分地通过施加磁场梯度来执行。

条项14.根据条项10-13中任一项的方法，其中将所述颗粒包封在二氧化硅中包括使所述颗粒与一种或多种四烷氧基硅烷接触。

条项15.根据条项14的方法，其中使所述颗粒与所述四烷氧基硅烷接触被执行至少48小时。

条项16.根据条项10-15中的任一项的方法，所述方法还包括将步骤a至步骤c重复至少三次。

条项17.根据条项10-16中任一项的方法，其还包括通过使所述二氧化硅包封的颗粒与蚀刻缓冲液以及多阴离子分子接触来释放所述多核苷酸。

条项18.一种制品，包括包封在二氧化硅中的多个多阴离子/多阳离子双层，其中所述多阴离子包括多核苷酸，并且所述多阳离子包括多阳离子分子。

条项19.根据条项18的制品，其中所述多个多阴离子/多阳离子双层覆盖在带负电荷的磁性基材上。

条项20.根据条项18-19中任一项的制品，其中多核苷酸含量为按重量计至少1％。

尽管已经以特定的结构特征和/或方法行为的语言描述了主题，但是应该理解，所附权利要求书中定义的主题不必限于上述特定特征或行为。相反，公开的特定的特征和行为作为实现权利要求的示例形式。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一种”、“一个”、“该”和类似指代物(特别是在所附权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“基于(based on)”、“基于(based upon)”和类似指示物应解释为“至少部分基于”，包括“部分基于”和“整体基于”，除非另有说明或与上下文明显矛盾。

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