一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法

技术领域

本发明涉及一种免疫学指标的检测方法，尤其涉及一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，属于医疗免疫学技术领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)仍是一大主要的公共卫生问题，全球超过四亿人感染HBV。世界卫生组织颁布的有关病毒性肝炎全球策略中提出消灭乙型肝炎病毒(HBV)是可能实现的目标。目前，大部分的临床实践指南都推荐慢性乙型肝炎(CHB)治疗最理想的终点是实现功能性治愈，这种治愈定义为乙肝表面抗原(HBsAg)的血清学清除伴或不伴有HBsAg的血清学转换，之所以提出以上目标，是因为达到HBsAg的清除可以制止疾病的进展以及减少原发性肝癌发生的风险。

HBsAg的清除在未接受抗病毒治疗或接受核苷(酸)类似物的CHB患者中发生率极低，近年来随着干扰素α联合或序贯治疗的运用，CHB患者中HBsAg的清除率大大增加。干扰素α主要通过直接抑制感染细胞中RNA和相关蛋白质的产生，以及通过阻断核衣壳蛋白的组装从而抑制病毒的复制。再者，干扰素α还有免疫调节的作用，如调节T细胞、NK细胞的免疫活化等作用。因此，经过核苷(酸)类似物长期有效抗病毒治疗后的CHB患者接受干扰素α治疗主要是通过调节机体的免疫功能来达到更好的抗病毒作用，甚至是HBsAg的清除。

干扰素α治疗主要是通过调节机体免疫功能来实现HBsAg的快速下降及清除的，目前临床上尚缺乏免疫学上相关的监测指标来综合评估患者抗病毒疗效。目前不少的研究干扰素α在CHB患者中抗病毒作用的免疫学机制，但是对于干扰素α在CHB患者中实现HBsAg清除的机制演剧较少，且尚未发现有效评估或者预测CHB患者抗病毒疗效的免疫学指标。对于联合或序贯干扰素α治疗的患者，目前临床上主要通过检测HBV相关的病毒学指标及生化指标来评估其抗病毒的疗效及预后，以上指标预测效果欠佳且较滞后。开展一项简易且实用的免疫学指标的检测项目的方法将有利于更加全面地评估患者的免疫学功能，结合临床现有的病毒和生化相关指标评估患者的抗病毒状态和疗效，从而辅助发现潜在的有望实现HBsAg清除的潜在优势人群，进一步优化抗病毒治疗方案，从而使更多的患者实现HBsAg的清除。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用下述的技术方案：

一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、分子的筛选：

a、初步筛选出评估机体T细胞功能的免疫学指标；

b、收集HBsAg阳性和清除CHB患者以及健康对照的血样；

步骤2、检测方法：

a、收集患者的血样，进行细胞重悬种植；

b、配置抗体；

c、进行流式细胞术的检测，并保存数据，利用软件Flow Jo software V10.0.7进行数据分析；

步骤3、预测效能的评估：利用ROC曲线，评估CD4和CD8 T细胞上HLA-DR表达水平在54例CHB患者48周内，进行HBsAg阴转的预测效能；

步骤4、发现可预测CHB患者48周内HBsAg阴转的T细胞免疫学指标HLA-DR。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤1的a过程中的免疫学指标包括代表细胞活化(CD69、HLA-DR、CD95、CD25、CD40L)、耗竭(PD-1、TIM-3、CTLA-4)以及效应功能(Granzyme B、CD107a)。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤2的a过程中的细胞重悬种植，包括以下步骤：

I、取新鲜的抗凝血和血样进行颠倒混悬，得到抗凝血血样，防止血样凝固达不到检测结果的准确性；

II、将上述步骤Ⅰ中得到的抗凝血血样，缓慢倒入淋巴分离管中进行分离；控制在20℃离心，800g，20min，加速与减速调整到第三档(若共有十档的话)，得到乳白色单个核细胞层；

III、将上述Ⅱ步骤中得到的乳白色单个核细胞层，用吸管吸取至离心管中，并加入3～5ml的红细胞裂解液混匀进行离心，控制在20℃离心，300g，10min，去上清，加入适量的胎牛血清，用枪头吹打重悬混匀，控制在20℃离心，250g，10min，去上清，并加入3～5ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞备用；

IV、吸取10ul台盼蓝与10ul细胞悬液混匀显微镜下计数，洗涤细胞重悬后种植1*10

本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤2的b过程中配置抗体，包括以下步骤：

Ⅴ、将抗体1.5ulCD4、1.5ulCD8、1.5ulCD3、2ulHLA-DR以及0.5ulFVD抗体及43ul鞘液混匀；

Ⅵ、将上述Ⅳ步骤中种植细胞的96孔U底板离心1500rpm，5min，甩掉上清后将配置好的抗体混合液50ul加入相应的细胞中，轻微刮底重悬后置于4°冰箱孵育30分钟；

Ⅶ、孵育30分钟后取出96孔U底板，加入150ul的鞘液洗涤，离心1500rpm，5min后，甩掉上清，加入100ul的鞘液，重悬转移至加有100ul鞘液的流式管中进行流式细胞术的检测。

本发明技术方案的进一步改进在于：根据上述步骤3的结果显示CD4或者CD8 T细胞上HLA-DR的表达对于HBsAg 48周内的HBsAg阴转具有一定的预测效能。

与现有技术相比较，本发明提供一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，成功发现了可预测CHB患者48周内HBsAg阴转的T细胞免疫学指标HLA-DR。在本发明中，首次利用CD4和CD8 T细胞的HLA-DR的表达水平预测CHB患者48周内的HBsAg阴转，且其灵敏度和特异度分别高达83.33％和72.34％，对评估CHB患者抗病毒疗效具有主要重要的临床意义，进而，辅助发现潜在的有望实现HBsAg清除的潜在优势人群，进一步优化抗病毒治疗方案，从而使更多的患者实现HBsAg的清除。

附图说明

图1为本发明实施例中，流式细胞术的检测分析画门方法示意图；

图2为本发明实施例中，CD4 T细胞上的HLA-DR的ROC曲线下面积示意图；

图3为本发明实施例中，CD8 T细胞上的HLA-DR的ROC曲线下面积示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明：

如图1～图3所示，本发明提供了一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、分子的筛选：

a、初步筛选出评估机体T细胞功能的免疫学指标；

b、收集HBsAg阳性和清除CHB患者以及健康对照的血样。

步骤2、检测方法：

a、收集患者的血样，进行细胞重悬种植；

b、配置抗体；

c、进行流式细胞术的检测，并保存数据，利用软件Flow Jo software V10.0.7进行数据分析；

步骤3、预测效能的评估：利用ROC曲线，评估CD4和CD8 T细胞上HLA-DR表达水平在54例CHB患者48周内，进行HBsAg阴转的预测效能；

步骤4、成功发现了可预测CHB患者48周内HBsAg阴转的T细胞免疫学指标HLA-DR。

实施例1

如图1～图3所示，本发明进一步提供一种经过改进的技术方案：优选的，步骤1的a过程中的免疫学指标包括代表细胞活化(CD69、HLA-DR、CD95、CD25、CD40L)、耗竭(PD-1、TIM-3、CTLA-4)以及效应功能(Granzyme B、CD107a)，收集HBsAg阳性和清除CHB患者以及健康对照的血样，在本实施例中，检测以上T细胞指标的表达差异情况，结果显示HBsAg清除患者CD4和CD8 T细胞的HLA-DR表达水平明显高于HBsAg阳性患者和健康人群，且其与HBsAg的下降幅度及HBV－特异性T细胞的反应强度成正相关，提示CD4和CD8 T细胞的HLA-DR表达水平对HBsAg的清除可能具有预测作用。

实施例2

如图1所示，在实施例1的基础上，本发明提供一种经过改进的技术方案：优选的，步骤2的a过程中的细胞重悬种植，首先，取新鲜的抗凝血和血样进行颠倒混悬，得到抗凝血血样，防止血样凝固达不到检测结果的准确性；其次，将得到的抗凝血血样，缓慢倒入淋巴分离管中进行分离；控制在20℃离心，800g，20min，加速与减速调整到第三档(若共有十档的话)，得到乳白色单个核细胞层，再次，将得到的乳白色单个核细胞层，用吸管小心吸取至离心管中，并加入3～5ml的红细胞裂解液混匀进行离心，控制在20℃离心，300g，10min，去上清，加入适量的胎牛血清，用枪头吹打重悬混匀，控制在20℃离心，250g，10min，去上清，并加入3～5ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞备用；进而，吸取10ul台盼蓝与10ul细胞悬液混匀显微镜下计数，洗涤细胞重悬后种植1*10

实施例3

如图1所示，在实施例2的基础上，本发明提供一种经过改进的技术方案：在本实施例中步骤2的b过程中配置抗体，首先，将抗体1.5ulCD4、1.5ulCD8、1.5ulCD3、2ulHLA-DR以及0.5ulFVD抗体及43ul鞘液混匀；其次，将实施例2中种植细胞的96孔U底板离心1500rpm，5min，甩掉上清后将配置好的抗体混合液50ul加入相应的细胞中，轻微刮底重悬后置于4°冰箱孵育30分钟；再次，孵育30分钟后取出96孔U底板，加入150ul的鞘液洗涤，离心1500rpm，5min后，甩掉上清，加入100ul的鞘液，重悬转移至加有100ul鞘液的流式管中进行流式细胞术的检测，并保存数据，进而利用软件Flow Jo software V10.0.7进行数据分析。

实施例4

如图2～图3所示，在实施例1、实施例2、实施例3的基础上，本发明提供一种经过改进的技术方案：根据上述步骤3的CD4和CD8 T细胞的HLA-DR预测效能的评估，结果显示CD4或者CD8 T细胞上HLA-DR的表达对于HBsAg 48周内的HBsAg阴转具有一定的预测效能，其中，CD4 T细胞上的HLA-DR的ROC曲线下面积(AUC)是0.773(P＝0.031，95％可信区间为0.607～0.939)，最佳预测临界值为7.35％(灵敏度100％，特异度55.3％)，另外，CD8 T细胞上的HLA-DR的ROC曲线下面积(AUC)是0.807(P＝0.005，95％可信区间为0.637～0.977)，最佳预测临界值为12.10％(灵敏度83.33％，特异度72.34％)。

下面，具体说明该预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法的工作原理。

如图1～图3所示，本发明成功发现了可预测CHB患者48周内HBsAg阴转的T细胞免疫学指标HLA-DR。在本发明中，首次利用CD4和CD8 T细胞的HLA-DR的表达水平预测CHB患者48周内的HBsAg阴转，且其灵敏度和特异度分别高达83.33％和72.34％，对评估CHB患者抗病毒疗效具有主要重要的临床意义，进而辅助发现潜在的有望实现HBsAg清除的潜在优势人群，进一步优化抗病毒治疗方案，从而使更多的患者实现HBsAg的清除。

上面对本发明所提供的预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法进行了详细的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明实质内容的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。