细胞保护方法和组合物

相关申请的引证

本申请要求享有2018年6月20日提交的美国临时专利申请序列号 62/687,540的权益，以其全部内容通过引证结合于本文中。

联邦资助声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号GM102137和HL094463的政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本文公开的主题通常涉及细胞保护方法和组合物。更具体地，本文公开了硫酸软骨素化合物，以及使用其治疗组蛋白毒性和相关病症，包括败血症的方法。

背景技术

组蛋白是参与DNA包装而形成染色质的基本蛋白质。组蛋白有效地将DNA包装到细胞核中，并调节对DNA中所含遗传信息的访问。

组蛋白具有相对强的正电荷，并且当不与染色质结合时可以在细胞内或细胞外环境中引起有害作用。因此，组蛋白水平通过各种机制在细胞内受到严格调节。然而，许多生物学条件均可以诱导非染色质结合的组蛋白，也称为“游离”或“过量”组蛋白的积累。在细胞环境中游离的组蛋白会导致严重的细胞死亡，如在败血症、创伤、局部缺血/再灌注损伤和自身免疫性疾病中所见。组蛋白的细胞毒性作用可能与它们作用为损伤相关的分子模式蛋白、激活免疫系统和/或引起进一步的细胞毒性有关。游离组蛋白的细胞毒性作用可以导致急性器官损伤和死亡。

仍然存在对于组蛋白毒性和相关病症的治疗和治疗方法的需要。

发明内容

该发明内容列出了本公开主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和置换。该发明内容仅是众多变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征而存在；同样，那些特征可以应用于本公开主题的其他实施方式，而不管是否在本发明内容中列出。为避免过多的重复，本发明内容未列出或建议这些功能的所有可能组合。

在一些实施方式中提供了治疗受试者的组蛋白毒性的方法，该方法包括提供需要组蛋白毒性治疗的受试者，和向该受试者给予硫酸软骨素化合物，其中治疗该受试者中的组蛋白毒性。在某些方面中，该受试者可以患有败血症。该受试者可以是人类受试者。该硫酸软骨素化合物可以包含 CS骨架、CS-A、CS-E、CS-C和/或其组合。在一些方面中，该硫酸软骨素化合物包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、CS-E 19聚体、CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13聚体和/或其组合。在一些实施方式中，该硫酸软骨素化合物可以包含以下结构中的一种或多种：

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

在一些方面中，该硫酸软骨素化合物可以作为药物组合物的一部分给予。该药物组合物可以包含CS化合物和用于CS给予的药用载体或佐剂。

在一些实施方式中，本文提供了用于治疗组蛋白毒性和/或败血症的药物组合物，该组合物包含一种或多种硫酸软骨素化合物和药用载体。该硫酸软骨素化合物可以包含CS骨架、CS-A、CS-E、CS-C和/或其组合。该硫酸软骨素化合物可以包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、CS-E 19聚体、CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13聚体和/或其组合。该硫酸软骨素化合物可以包含以下结构中的一种或多种：

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

本文还提供了治疗受试者的败血症的方法，该方法包括提供需要败血症治疗的受试者，和向该受试者给予硫酸软骨素化合物，其中治疗该受试者的败血症。该受试者可以是人类受试者。该硫酸软骨素化合物可以包含 CS骨架、CS-A、CS-E、CS-C和/或其组合。在一些方面中，该硫酸软骨素化合物可以包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、CS-E 19聚体、CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13 聚体和/或其组合。在某些方面中，在这些治疗败血症的方法中，硫酸软骨素化合物可以包含以下结构中的一种或多种：

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

这些和其他目的通过本公开主题而全部或部分实现。此外，在研究了以下描述、附图和实施例之后，以上已经陈述的本公开主题的目的、本公开主题的其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

通过参考以下附图可以更好地理解本公开的主题。附图中的组件不必按比例放大，而是将重点放在示出本公开主题的原理上(通常是示意性的)。在附图中，相同的附图标记在不同的图中指示相应的部分。通过参考附图的图示中阐述的实施方式，可以获得对本公开主题的进一步理解。尽管示出的实施方式仅是用于执行本公开主题的示例性系统，但总体上，通过参考附图和以下描述，可以更容易理解本公开主题的组织和操作方法以及其进一步的目的和优点。附图无意于限制本公开主题的范围，该主题在所附或随后的权利要求书中进行具体阐述，而仅仅是为了阐明和举例说明本公开的主题。

贯穿全文，相同数字表示相同要素。在附图中，为了清楚起见，某些线、层、组件、元件或特征的厚度可以被放大。除非另有说明，否则在使用虚线处示出可选的特征或操作。

为了更全面地理解本公开的主题，现在参考以下附图。

图1A是在基于细胞的试验模型中评价合成CS寡糖在中和组蛋白细胞毒性中的有效性的研究数据的直方图。

图1B是评价合成的CS寡糖对通过组蛋白和CS寡糖处理的小鼠的存活率的影响的研究数据的图形描绘。接受CS寡糖治疗的小鼠的存活率为 100％，而暴露于组蛋白且未接受CS治疗的小鼠均无存活。

图2A是显示本文公开的CS低聚糖，包括例如CS-E低聚糖的酶促合成途径和方法的示意性图示。图2A显示了以简写符号表示的合成CS-E 7 聚体、13聚体和19聚体的方案。

图2B是根据图2A合成的并且在本文中进一步描述的四种不同CS寡糖的化学结构的示意性图示。

图3A和3B显示了CS-E 7聚体的纯度和结构分析。图3A显示了CS-E 7聚体的DEAE-HPLC色谱图，且图3B显示了CS-E 7聚体的高分辨率 MS谱。CS-E 7聚体的测量分子量为1772.227，这与所计算的1772.221相似。

图4A显示了来自采用或不采用CS-E 19聚体(50mg/kg)治疗的组蛋白(75mg/kg)中毒的小鼠的福尔马林固定的石蜡包埋的肺组织中苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像和定量。

图4B显示了来自采用或不采用CS-E 19聚体(50mg/kg)治疗的组蛋白(75mg/kg)中毒的小鼠的福尔马林固定的石蜡包埋肾脏的和肝脏组织中苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像。

图5A至5E显示了示出CS-E 19聚体保护由细菌脂多糖(LPS)引起的死亡和器官损伤的数据。图5A是用于分析在给予细菌脂多糖(6mg/kg) 后小鼠血浆中组蛋白H3的蛋白质印迹的图像。图5B是用或不用CS-E 19 聚体(0.5mg/kg)治疗的给予LPS(6mg/kg)的小鼠的存活描点图的图形描述。LPS/CS-E 19聚体队列中有10只动物，且LPS处理队列中有13 只动物。通过进行使用GraphPad Prism软件的对数秩检验(log-rank test) 获得Kaplan-Meier生存曲线，P＝0.003。图5C至5E分别显示了在用磷酸盐缓冲盐水、LPS和LPS/CS-E 19聚体处理的动物中不同生物标志物(包括BUN，肌酐和AST)的血浆浓度。

图6A至6E显示了示出CS-E 19聚体与组蛋白形成复合物而保护免受组蛋白诱导的内皮细胞损伤的数据。图6A是采用或不采用亲和素(avidin) -琼脂糖亲和柱纯化的小鼠血浆样品的蛋白质印迹分析的图像。道1是组蛋白H3。道2是未处理小鼠的血浆。道3是在亲和纯化后与生物素化的 CS-E 19聚体一起培养的未处理小鼠的血浆。道4是LPS处理小鼠的血浆。道5是亲和纯化后采用生物素化CS-E 19聚体的LPS处理小鼠的血浆。图 6B是显示组蛋白对采用或不采用CS寡糖的内皮细胞的毒性的数据曲线图。不采用或采用不同浓度的CS寡糖，在具有组蛋白H3(30μg/mL)的 EA.hy926细胞培养物中通过流式细胞术由碘化丙啶(propidium iodide) (PI)染色测量的细胞损伤。图6C至6E分别显示了在盐水、LPS或 LPS/CS-E 19聚体处理下从肺、肾和肝漏出的伊文思蓝的浓度。

具体实施方式

现在将在下文中更全面地描述本公开的主题，其中描述了本公开的主题的一些而全部实施方式。实际上，所公开的主题可以以许多不同的形式实施，并且不应该解释为仅限于本文中阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式是为了使本公开满足适用的法律要求。

定义

本文中使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而并非旨在限制本公开的主题。

尽管以下术语据信对于本领域普通技术人员可以充分理解，但提出以下定义是为了促进对本公开主题的解释说明。

除非下文另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文所用技术的引用旨在指代本领域中通常理解的技术，包括对那些技术的变型或对本领域技术人员显而易见的等效技术的替代。尽管以下术语据信是本领域普通技术人员可以充分理解，但提出以下定义是为了促进对本公开主题的解释说明。

在描述本公开的主题时，应该理解的是，公开的是许多技术和步骤。这些中的每一个都有各自的益处，并且每个也可以与一个或多个其他公开的技术，或在某些情况下，所有其他公开的技术结合使用。

因此，为了清楚起见，该描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每种可能的组合。然而，在阅读本说明书和权利要求时应该理解的是这样的组合完全处于本公开和权利要求的范围内。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过全文引用而结合于本文中，以用于与其中存在该参考文献的句子和/或段落有关的教导。

遵循长期的专利法惯例，当在本申请包括权利要求书中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”指的是“一个或多个”。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞等等。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、反应条件等的所有数字均应该理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数都是近似值，其可以根据试图通过本公开的主题获得的所需特性而变化。

如本文所用，术语“约”在指代组合物的值或量、质量、重量、温度、时间、体积、浓度、百分比等时，旨在包括所指定的量在一些实施方式中±20％，在某些实施方式中±10％，在某些实施方式中±5％，在某些实施方式中±1％，在某些实施方式中±0.5％，在某些实施方式中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于实施所公开的方法或利用所公开的组合物。

与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包含”是包括性的或开放式的，不排除其他未叙述的要素或方法步骤。“包含”是在权利要求语言中使用的技术术语，这意味着指出的要素是必不可少的，但可以添加其他要素，并仍然构成权利要求范围内的构造。

如本文中所用，短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在权利要求书的正文中出现短语“由...组成”时，而不是紧跟在前序部分之后时，其仅限制该条款中列出的要素；总体上，其他要素也不排除于该权利要求之外。

如本文中所用，短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，以及不实质上影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些。

关于术语“包含”、“由…组成”和“基本上由…组成”，在此使用这三个术语中的一个时，本公开和要求保护的主题可以包括其他两个术语中的任一个的使用。

如本文所用，术语“和/或”在实体的列表的上下文中使用时，是指实体单独或组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”分别包括A、B、 C和D，但还包括A、B、C和D的任何和所有组合以及子组合。

如本文所用，术语“基本上”在涉及组合物的值、活性或量，质量，重量，温度，时间，体积，浓度，百分比等时，意在涵盖所指定的量在一些实施方式中±40％，在一些实施方式中±30％，在一些实施方式中±20％，在一些实施方式中±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施例中±1％，在一些实施方式中±0.5％，以及在一些实施方式中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于实施所公开的方法或利用所公开的装置和设备。例如，当组合物的纯度为至少60％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少 90％，或至少95％，而在某些情况下，至少99％时，则该组合物就是“基本上纯的”。

如本文所用，“化合物”是指通常被认为是药物、治疗剂、医药、小分子或就以用途相同的候选物的任何类型的物质或试剂，以及以上的组合和混合物。

“检测”一词及其语法变体的使用是指未经量化的物质的测量，而“测定”或“测量”及其语法变体的使用则是指对具有以下特征的物种的量化测量。术语“检测”和“确定”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“抑制”涉及基于使用术语“抑制”的上下文，化合物、试剂或方法减少或阻碍所述功能、水平、活性、速率等的能力。优选的是，抑制是该功能被抑制至少10％，更优选至少25％，更加优选至少50％，而最优选至少75％。术语“抑制”与“减少”和“阻断”可互换使用。

如本文所用，术语“调控”是指改变活性、功能或过程的水平。术语“调控”涵盖抑制和刺激活性、功能或过程。术语“调控”在本文中与术语“调节”可以互换使用。

如本文所用，术语“预防”是指阻止某事发生，或针对可能或很可能发生的事采取预先措施。在医学方面中，“预防”通常是指为减少患疾病或病症的可能性而采取的措施。

术语“调节”是指刺激或抑制所关注的功能或活性。

如本文所用，“样品”是指来自受试者的生物样品，包括但不限于，正常组织样品，患病组织样品，活组织检查，血液，唾液，粪便，精液，眼泪和尿液。样品也可以是从受试者获得的包含所关注的细胞、组织或液体的任何其他材料源。

如本文所用，术语“刺激”是指诱导或增加活性或功能水平，而使其相对于对照值更高。刺激可以通过直接或间接机制进行。在一方面中，与对照值相比，活性或功能被刺激至少10％，更优选至少25％，更加优选至少 50％。如本文所用，术语“刺激剂”是指任何组合物、化合物或试剂，其应用会导致所关注的过程或功能的刺激，包括但不限于，伤口愈合，血管生成，骨愈合，成骨细胞生产和发挥功能，以及破骨细胞的生产、分化和活性。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和“治疗(to treat)”用于表示产生有益的或期望的效果，如暂时性或永久减轻症状或消除疾病或病症的因果关系，减慢症状的出现和/或障碍症的进展，或预防疾病的进展。术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指医疗治疗和预防或预防性措施，其中目的是预防或减慢疾病或症状的发展或传播。有益或期望的临床结果包括，但不限于，症状缓解，疾病程度减轻，疾病状态稳定(即不恶化)，疾病进展延迟或减慢，疾病状态改善或减轻，以及缓解(部分或全部)。“治疗”还可以是指与未接受治疗的预期生存期相比，生存期延长。

如本文所用，术语“烷基”是指C

烷基可以可选地被一个或多个相同或不同的烷基取代基取代(“取代的烷基”)。术语“烷基取代基”包括但不限于烷基，取代的烷基，卤素，芳基氨基，酰基，羟基，芳氧基，烷氧基，烷硫基，芳硫基，芳烷氧基，芳烷硫基，羧基，烷氧基羰基，氧代和环烷基。沿着烷基链可以可选地插入一个或多个氧、硫或取代或未取代氮原子，其中氮取代基是氢、低级烷基 (在本文中也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。

因此，如本文所用，术语“取代的烷基”包括如本文所定义的烷基，其中该烷基的一个或多个原子或官能团被另一原子或官能团，包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯基和巯基取代。

本文使用的术语“芳基”是指共价连接或连接至常见基团如，但不限于亚甲基或亚乙基部分的可以是单个芳环或稠合在一起的多个芳环的芳族取代基。常见的连接基团也可以是羰基，如二苯甲酮中的情况，或氧，如二苯醚中的情况，或氮，如二苯胺中的情况。术语“芳基”具体涵盖杂环芳族化合物。芳环可以包括苯基，萘基，联苯，二苯醚，二苯胺和二苯甲酮等。在具体实施方式中，术语“芳基”是指包含约5至约10个碳原子，例如，5、6、7、8、9或10个碳原子，并且包括5元和6元烃和杂环芳环。

芳基可以被一个或多个相同或不同的芳基取代基可选地取代(“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和-NR'R”，其中R'和R”各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。

因此，如本文所用，术语“取代的芳基”包括如本文所定义的芳基，其中芳基的一个或多个原子或官能团被另一原子或官能团取代，包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基。

芳基的具体实例包括，但不限于，环戊二烯基，苯基，呋喃，噻吩，吡咯，吡喃，吡啶，咪唑，苯并咪唑，异噻唑，异噁唑，吡唑，吡嗪，三嗪，嘧啶，喹啉，异喹啉，吲哚，咔唑等。

通常由如下式表示的结构：

如本文所用，是指环结构，如但不限于包括取代基R基团的3碳、4碳、 5碳、6碳等的脂族和/或芳族环状化合物，其中R基团可以存在或不存在，并且当存在时，一个或多个R基团可以各自在环结构的一个或多个可用碳原子上取代。R基团的存在与否与R基团的数目由整数n的值确定。每个 R基团，如果多于一个，在环结构的可用碳上而不是在另一个R基团上取代。例如，结构：

其中n是0至2的整数，包括化合物的组，其包括但不限于：

“环状”和“环烷基”是指具有约3至约10个碳原子，例如，3、4、5、6、 7、8、9或10个碳原子的非芳族单环或多环系统。环烷基可以可选地是部分不饱和的。环烷基还可以可选地被本文定义的烷基取代基、氧代和/或亚烷基取代。沿着环状烷基链可以可选地插入一个或多个氧、硫或取代或未取代氮原子，其中氮取代基为氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，从而提供杂环基。代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、十氢化萘、樟脑、莰烷和去甲金刚烷基(noradamantyl)。

术语“杂环”是指约3至约14个原子的非芳族或芳族的单环或多环系统，其中至少一个原子是杂原子(例如，氧，氮或硫)。术语“N-杂环”是指其中至少一个杂原子是氮原子的杂环。N-杂环的实例包括但不限于氮杂环丁烷，吡咯烷，吡咯，吡咯啉，哌啶，吡啶，哌嗪，吡嗪，嘧啶，哒嗪，吗啉和噻嗪。

“芳烷基”是指芳基-烷基-基团，其中芳基和烷基如前所述，包括取代的芳基和取代的烷基。示例性的芳烷基包括苄基、苯乙基和萘甲基。

如本文所用，术语“酰基”是指其中羧基的OH已被另一取代基取代的有机羧酸基团(即，如RC(＝O)-所示，其中R是本文所定义的烷基、取代的烷基、芳烷基、芳基或取代的芳基)。因此，术语“酰基”具体包括芳基酰基，如乙酰基呋喃和苯甲酰基。酰基的具体实例包括乙酰基和苯甲酰基。

“N-酰基”是指具有-N-C(＝O)-R结构的基团，其中R是对于酰基的定义。这些基团也可以称为酰胺。改性的N-酰基包括其中N-酰基的氧被S 或NH取代的化合物，以及其中羰基(即-C(＝O)-)连接至除氮之外的第二杂原子的化合物。例如，羰基可以连接至第二氮原子而形成脲连接基 (即，-NH-C(＝O)-NH-R)。

术语“氨基”是指-NH

术语“酯”是指包含-O-C(＝O)-R基团的部分，其中R可以是烷基、取代的烷基、芳烷基、芳基或取代的芳基。在一些实施方式中，R基团可以包括氨基取代基，并且该酯是氨基酯。

术语“酰胺”是指包含-N(R')-C(＝O)-R基团的部分，其中R选自烷基、取代的烷基、芳烷基、芳基或取代的芳基，并且R'是H、烷基、取代的烷基、芳烷基、芳基或取代的芳基。

如本文所用，术语“脲”可以是指包含-N(R')-C(＝O)-N(R')-基团的部分，其中每个R'独立地是H、烷基、取代的烷基、芳烷基、芳基或取代的芳基。

术语“羟基”是指-OH基团。

当使用术语“独立地选择”时，提及的取代基(例如，R基团，如基团 R

一般考虑

硫酸软骨素(CS或ChS)是硫酸化的多糖，并广泛存在于哺乳动物细胞表面上和细胞外基质中。已知CS与损伤后的癌转移、寄生虫感染和神经元生长抑制有关。CS中的硫酸化模式决定了与蛋白靶标的结合亲和力，以显示其在生物学功能上的选择性。含有CS的6-O-硫酸化的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc6S)有助于伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)感染而引起的莱姆病，其4-O-硫酸化的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc4S)则涉及恶性疟原虫感染而导致疟疾。在某些情况下，可能需要包含4,6二硫酸化的N- 乙酰半乳糖胺(GalNAc4S6S)残基的结构域以引导神经元信号传导并抑制轴突生长。

然而，更多关于CS，其对生物系统的影响作用，以及作为治疗性化合物的潜力的许多知识仍是未知的。这部分是因为分离具有单个硫酸化糖序列和确定长度的多糖在技术上仍是需要的。迄今为止，缺乏结构均匀或单分散的CS是阻碍CS研究及其在治疗和疗法中的应用的主要障碍。

本文公开的是CS化合物和包含CS的治疗组合物。本文还公开了使用CS化合物和组合物的治疗方法，CS化合物和组合物在制备用于治疗组蛋白毒性、败血症和相关病症的药物中的用途，以及使用此类CS治疗剂的组蛋白毒性、败血症和相关病症的治疗处理方法。

本文公开了各种形式的CS。本文公开的治疗的用途和方法包括包含硫酸化多糖的CS化合物，包括具有三糖至具有十九个糖单元(即，19聚体)的多糖的尺寸范围的那些。CS包含β1→3连接的葡萄糖醛酸(GlcA) 和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)二糖的重复二糖单元，→4)GlcA β(1→3) GalNAcβ(1→。GlcA和GalNAc残基均带有磺基，产生不同类型的CS。硫酸软骨素A(CS-A)包含4-O-硫酸化GalNAc(GalNAc4S)残基，硫酸软骨素C(CS-C)包含6-O-硫酸化GalNAc(GalNAc6S)，硫酸软骨素 D(CS-D)包含2-O-硫酸化GlcA，硫酸软骨素E(CS-E)包含4,6-O-二硫酸化GalNAc。特异性化的CS磺基转移酶，包括4-O-磺基转移酶 (CS4OST)、6-O-磺基转移酶(CS6OST)、2-O-磺基转移酶和 GalNAc4S-6-O-磺基转移酶，参与CS的生物合成。

在一些实施方式中，本文提供了治疗受试者的组蛋白毒性的方法。另外，在一些实施方式中，本文提供了治疗受试者的败血症或相关病症的方法。在一些实施方式中，这样的方法可以包括提供需要组蛋白毒性治疗或败血症治疗的受试者，和向受试者给予硫酸软骨素化合物以治疗受试者的组蛋白毒性和/或败血症。这样的受试者可能患有与组蛋白毒性、败血症、细菌性脂多糖(LPS)休克相关或由其引起的任何病症，以及任何相关病症。该受试者可以是人类受试者。

当血流中释放的化学物质与感染斗争时引发全身炎症，从而导致败血症发生。这可以导致一系列变化，从而损坏多个器官系统，导致它们衰竭，甚至导致死亡。症状包括但不限于发烧，呼吸困难，血压低，心跳加快和精神错乱。

在一些实施方式中，硫酸软骨素化合物可以包含CS骨架、CS-A、 CS-E、CS-C和/或其组合。在一些实施方式中，硫酸软骨素化合物可以包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、CS-E 19聚体、 CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13聚体、骨架7聚体、CS-A 7聚体、CS-C 7聚体、CS-E 7聚体和/或其组合，和/或可以通过本文公开的方法和合成路线合成的任何其他CS化合物。

硫酸软骨素化合物可以作为药物组合物的一部分给予。在一些方面中，该药物组合物可以包含CS化合物和用于CS化合物给予的药用载体或佐剂。

在一些方面中，本文提供了包含一种或多种硫酸软骨素化合物和药用载体的药物组合物。在这种药物组合物中，硫酸软骨素化合物可以包含 CS骨架、CS-A、CS-E、CS-C和/或其组合。硫酸软骨素化合物可以包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、CS-E 19聚体、 CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13聚体、骨架7 聚体、CS-A7聚体、CS-C 7聚体、CS-E 7聚体和/或其组合，和/或可以通过本文公开的方法和合成途径合成的任何其他CS化合物。

治疗组合物和治疗方法

本公开的主题提供了包含CS化合物的药物和/或治疗组合物，如本文公开的。在一些实施方式中，该药物组合物可以包含一种或多种本文公开的CS。

在一些实施方式中，该药物组合物还可以包含用于CS给予的药用载体或佐剂。在一些实施方式中，该载体是对用于人类是药用的。期望的是该载体或佐剂本身不应该诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，并且应该没有毒性。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。

可以使用药用盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗性组合物中的药用载体可以另外包含液体如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这种组合物中可以存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质。此类载体使该药物组合物可以配制用于给予于患者。

本公开主题的药物组合物的合适制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；和可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。这些制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶中，并可以储存于冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，在立即要使用之前仅需要添加无菌液体载体(例如，注射用水)。一些示例性成分是以在一些实施方式中范围为0.1至10mg/mL，在一些实施方式中范围为约 2.0mg/mL的SDS；和/或以在一些实施方式中范围为10至100mg/mL，在一些实施方式中范围为约30mg/mL的甘露醇或另一种糖；和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。考虑到所讨论的制剂类型，可以使用本领域常规的任何其他试剂。在一些实施方式中，该载体是药用的。在一些实施方式中，该载体是用于人类的药用载体。

本公开的主题的药物组合物可以具有5.5至8.5，优选6至8，更优选约7的pH。pH可以通过使用缓冲剂维持。该组合物可以是无菌的和/或无热原的。该组合物相对于人可以是等渗的。本公开的主题的药物组合物可以以气密性容器供给。

本文还提供了治疗用途和/或方法和/或治疗方法。根据本公开的主题的治疗方法包括向有此需要的受试者给予如本文公开的CS或相关化合物。根据本公开的主题的用途包括如本文公开的CS或相关化合物用于制备如本文公开的用于治疗适应症的药物的用途。

将有效剂量的本公开主题的药物组合物给予于对其需要的受试者。术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”、“有效量”、“有效剂量”及其变化形式在本文中可以互换使用，并是指本公开主题的治疗组合物或药物组合物足以产生可测量的反应(例如，败血症症状减轻)的量。实际剂量水平可以变化为使得给予对于特定受试者有效实现期望的治疗反应的量。

在一些实施方式中，向受试者给予的本公开主题的治疗组合物的量取决于许多因素，包括但不限于受试者体型、体重、年龄、靶组织或器官、给予途径、要治疗的病症和要治疗病症的严重程度。

治疗组合物的效力可以变化，并因此“治疗有效”的量可以变化。然而，使用本文下面描述的分析测定方法，本领域技术人员可以容易地评价本公开主题的药物组合物的效力和功效，并相应地调整治疗方案。

在一些方面中，本文提供了用于治疗组蛋白毒性和/或败血症的药物组合物，该组合物包含一种或多种硫酸软骨素化合物和药用载体。在一些实施方式中，在此类用途中的硫酸软骨素化合物可以包含CS骨架、CS-A、 CS-E、CS-C和/或其组合。在一些实施方式中，在此类用途中的硫酸软骨素化合物可以包含硫酸软骨素骨架19聚体、CS-A 19聚体、CS-C 19聚体、 CS-E 19聚体、CS骨架13聚体、CS-A 13聚体、CS-C 13聚体、CS-E 13 聚体和/或其组合。

受试者

尽管应当理解的是所公开主题的原理表明该组合物和方法对于旨在要包括于术语“受试者”中的无脊椎动物和包括哺乳动物在内的所有脊椎动物物种均有效，但本公开主题中治疗的受试者理想地是人类受试者。此外，哺乳动物应该理解为包括需要治疗组蛋白毒性病症的任何哺乳动物，特别是农业和家养哺乳动物。

本公开主题的方法在治疗温血脊椎动物中是特别有用的。因此，本公开的主题涉及哺乳动物和鸟类。

更具体地，本文提供的是对哺乳动物如人类以及由于濒危而重要的那些哺乳动物(如西伯利亚虎)、具有经济重要性(在农场上饲养供人类食用的动物)和/或对人有社会重要性(作为宠物或在动物园中饲养的动物) 的那些哺乳动物，例如除人类以外的食肉动物(如猫和狗)，猪(家猪，阉猪和野猪)，反刍动物(如家牛，牛，绵羊，长颈鹿，鹿，山羊，野牛和骆驼)和马。还提供了鸟类的治疗，包括在动物园中饲养的那些濒临灭绝的鸟类以及禽类，尤其是家禽，即肉禽，如火鸡，鸡，鸭，鹅，珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，本文提供了家畜的治疗，包括但不限于，驯养的猪(家猪和阉猪)，反刍动物，马，肉禽等。

CS化合物

在公开的CS合成方法的开发中，克服了重大挑战，包括例如改进重组CS生物合成酶的可获得性并降低UDP-GalNAc的生产成本。除了合成天然CS寡糖之外，本公开还提供了制备非天然的6-O-硫酸化的CS寡糖的可能性。合成以几毫克的量级完成，允许通过MS和NMR进行完整结构表征。除CS-A外，CS-C和CS-E也通过本文公开的方法合成。结构明确的CS寡糖的酶促合成的示范提供了研究CS生物学功能的重要工具。

如图2B和本文中所示，除了三糖至九糖即9聚体的CS化合物之外，公开的方法还提供了用于合成更大和/或更长CS化合物的方法，如图2A 和以下所示。CS合成的更多细节可以参见国际专利申请公开号WO 2019/010216，其通过引证以其全部内容结合于本文中。

实施例CS-A寡糖(11聚体至19聚体)：

n＝4，CS-A 11聚体

n＝5，CS-A 13聚体

n＝6，CS-A 15聚体

n＝7，CS-A 17聚体

n＝8，CS-A 19聚体，

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

实施例CS-C寡糖(11聚体至19聚体)：

n＝4，CS-C 11聚体

n＝5，CS-C 13聚体

n＝6，CS-C 15聚体

n＝7，CS-C 17聚体

n＝8，CS-C 19聚体，

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

实施例CS-E寡糖(5聚体至19聚体)：

n＝1，CS-E 5聚体

n＝2，CS-E 7聚体

n＝3，CS-E 9聚体

n＝4，CS-E 11聚体

n＝5，CS-E 13聚体

n＝6，CS-E 15聚体

n＝7，CS-E 17聚体

n＝8，CS-E 19聚体，

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

如本文公开的，开发了用于合成CS-E的方法。这种方法利用与CS-A 和CS-C的合成相似的方法，但是采用了额外的酶促步骤。例如，在一些实施方式中，CS-E的合成需要另外的CS磺基转移酶，包括例如 GalNAc4S-6-O-磺基转移酶。本公开都提供了这种额外的步骤所需的2-O- 磺基转移酶和GalNAc4S-6-O-磺基转移酶。

本文公开的CS化合物也可以如下所示：

CS和CS-A寡糖的化学结构：

n＝2，CS 7聚体

n＝5，CS 13聚体

n＝8，CS 19聚体

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

在一些实施方式中，R为

n＝2，CS-A 7聚体

n＝5，CS-A 13聚体

n＝8，CS-A 19聚体

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

在一些实施方式中，R为

CS-C和CS-E寡糖的化学结构：

n＝2，CS-C 7聚体

n＝5，CS-C 13聚体

n＝8，CS-C 19聚体

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

在一些实施方式中，R为

n＝2，CS-E 7聚体

n＝5，CS-E 13聚体

n＝8，CS-E 19聚体

其中R选自由-H、烷基(如但不限于-CH

在一些实施方式中，R为

实施例

本公开现在将参考以下实施例进行描述。应当理解的是，这些实施例并非旨在将权利要求的范围限制于本公开，而是旨在成为某些实施方式的示例性说明。技术人员所想到的示例性方法中的任何变化都将落入本公开的范围内。

实施例1

将人内皮细胞系EA.hy926细胞(ATCC)在补充有10％胎牛血清和 1％青霉素-链霉素(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco) 中在37℃和5％CO

实施例1的实验结果显示于图1A中。更具体地，结果表明在一些实施方式中，使用具有细胞的试验模型，合成的CS寡糖可以中和组蛋白细胞毒性。

实施例2

将雄性C57Bl6/J小鼠(Jackson Laboratories)饲养于University of NorthCarolina(Chapel Hill,North Carolina,United States of America)，12小时的明暗循环，随意进食水和食物一周。这项研究根据University of North CarolinaInstitutional Animal Care and Use Committee批准的方案进行。给小鼠静脉内注射无菌盐水(n＝8)或75mg/kg ChS E 19聚体(n＝5)，然后1分钟后注射小牛胸腺组蛋白(75mg/kg)。仅接受组蛋白(盐水处理) 的8只小鼠中有7只在输注后15分钟内死亡，可能是由于心脏骤停。接受ChS E 19聚体的所有五只小鼠均存活。ChS E 19聚体与小牛胸腺组蛋白的比例为3:1，这低于体外内皮细胞保护作用中所用的比例(其中比例为10:1)。

实施例2的实验结果显示于图1B中。更具体地，结果表明用组蛋白和CS寡糖处理的小鼠的存活率具有100％的存活率，而暴露于组蛋白而没有接受CS疗法的小鼠均没有存活。使用GraphPad Prism软件通过对数秩检验进行Kaplan-Meier生存曲线绘制而获得P＝0.001

实施例3

如实施例1和2所述，基于CS在减轻组蛋白诱导的内皮毒性和死亡率方面的有效性，进行了进一步的研究以表征CS化合物并阐明其功能。

组蛋白是DNA结合蛋白，被包裹在细胞核内。组蛋白的释放与中性粒细胞活化有关，以响应感染或炎症刺激(1、2)。细胞外组蛋白对宿主表现出细胞毒性，从而导致疾病状态，包括败血症(3)。组蛋白含有同种型，且组蛋白H3是主要的形式，归因于细胞毒性(4)。

从人体组织或海洋生物中分离得到的CS-E是具有不同大小和硫酸化模式的多糖的混合物，使得对其结构和活性关系的研究变得困难。需要的是酶促合成均质的CS-E寡糖的能力。CS-E寡糖的合成从可商购的单糖对硝基苯基葡糖醛酸苷(GlcA-pNP)开始(图2A)。该合成涉及使用细菌糖基转移酶(KfoC)将单糖延长至期望的尺寸，以形成未硫酸化的软骨素骨架。将骨架进行两轮磺基转移酶修饰。用硫酸软骨素4-O-磺基转移酶(CS 4OST)进行硫酸化以形成硫酸软骨素A(CS-A)寡糖。然后，通过4-O- 磺基GalNAc 6-O-磺基转移酶(GalNAc4S-6OST)修饰以形成4,6-二硫酸化GalNAc残基，从而获得CS-E产物。高活性GalNAc4S-6OST的获得对于CS-E寡糖的合成至关重要。使用杆状病毒表达方法，在昆虫细胞中实现了GalNAc4S-6OST的高水平表达。杆状病毒含有内源性软骨素酶，可以切割CS底物(6)。因此，出于合成目的，必须从病毒内源软骨素酶中纯化GalNAc4S-6OST。使用酶促方法，以10至100mg的量级获得了三种CS-E寡糖，即CS-E 7聚体、CS-E 13聚体和CS-E 19聚体。还合成了未硫酸化的软骨素九糖骨架CS-0S 19聚体，以用作随后的生物学研究的对照寡糖。参见图2B。

实施例4

CS-E寡糖使用高分辨率二乙氨基乙基(DEAE)-HPLC、高分辨率质谱和NMR光谱进行分析。作为代表性的实例，CS-E 7聚体洗脱为对称的单峰，表明其高纯度(图3A)。高分辨率质谱分析表明其分子量为1772.227，这非常接近1772.221的计算值(图3B)。

实施例5

长CS-E寡糖的可用性为研究CS的生物学功能开辟了新机会。通过靶向组蛋白，试图开发均质CS-E寡糖的抗炎作用。组蛋白是与DNA结合的带正电荷的蛋白质，在健康条件下被包裹于细胞核内。当组蛋白被病理刺激释放时，细胞外组蛋白显示出强大的细胞毒性。靶向细胞外组蛋白是治疗炎性疾病的可能策略。因此，假设CS寡糖会结合组蛋白并中和细胞毒性。结合亲和力(KD)测量表明CS-E 19聚体与组蛋白H3(44.7nM) 紧密结合，并且随着寡糖尺寸的缩短，结合亲和力通常会降低(表1)。

表1.H3组蛋白结合CSE寡核苷酸相互作用的动力学数据汇总*

*括号中带有(±)的数据是四次或五次注射的整体拟合的标准偏差 (SD)。

硫酸化也有助于与组蛋白H3的结合亲和力。CS-0S 19聚体，即未硫酸的软骨素骨架，并未结合组蛋白H3。还测定了不同CS-E寡糖对组蛋白同工型的混合物的结合亲和力，显示了与寡糖结合至组蛋白H3相似的趋势。参见表2。

表2.组蛋白混合物与CSE寡核苷酸相互作用的动力学数据汇总*

*括号中带有(±)的数据是四次或五次进样的总体拟合的标准偏差 (SD)。

实施例6

已知组蛋白给予对小鼠有毒(4)。如上所述，证明CS-E 19聚体防止组蛋白介导的动物死亡(图1B)。在给予组蛋白(75mg/kg)后60分钟内，六分之五(83.3％)的动物死亡，而在采用CS-E 19聚体(75mg/kg)治疗的组蛋白中毒的小鼠中，所有五只小鼠(100％)在实验过程中都存活。在使用或未使用CS-E 19聚体治疗的情况下，也检查了对肺组织的损害。来自组蛋白处理的小鼠的肺组织的H&E染色表明血管内外大量形成血栓形成(图4A)。数据表明组蛋白的给予不仅诱导血管内的血块形成，而且引起血管渗漏而导致产生血管外血块。观察到接受CS-E 19聚体的小鼠的肺部血凝块明显减少(图4A)。在用组蛋白处理的小鼠的肝脏和肾脏中也发现了血栓形成。同样，CS-E 19聚体也可以减少肝脏和肾脏中的血栓形成(图4B)。综上所述，这些数据表明CS-E 19聚体与组蛋白结合，并有效防止组蛋白对小鼠器官损伤的毒性作用。

实施例7

接着，研究了CS-E 19聚体对抗细菌脂多糖(LPS)休克的保护作用。 LPS富含于革兰氏阴性细菌的细胞壁内，也称为内毒素，在宿主中诱导过度炎性反应，导致威胁生命的败血症样症状，在美国每年导致>750,000例死亡。LPS导致死亡的一种机制是因为LPS诱导了细胞毒性胞外组蛋白的释放(7)。如预期的，对小鼠给予LPS导致了血浆中组蛋白H3的释放(图 5A)。此外，给予LPS(6mg/kg)导致72％的小鼠在72小时内死亡；而 CS-E 19聚体(0.5mg/kg)的治疗将死亡率降低至30％，这表明CS-E 19 聚体对LSP诱导的死亡具有保护作用(图5B)。还测量了生物标志物，以评价器官损伤并证实CS-E 19聚体的功能。检测到血液尿素氮(unrine nitroge)(BUN)水平显著降低，其是肾功能的标志物(图5C)。我们还观察到CS-E 19聚体治疗后肌酐水平降低，肌酐也是肾功能的标志物(图 5D)。尽管肌酐的减少趋势趋向于统计学显著，但该数据与BUN水平降低的结合使我们可以确认CS-E 19聚体对LPS诱导的肾脏损害具有保护作用。在CS-E 19聚体治疗组中，天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血浆水平也降低，这表明该化合物可以保护LPS引起的肝损伤(图5E)。总体而言， CS-E 19聚体可以保护LPS所致的器官损伤，并提高暴露于LPS后的小鼠的存活率。

三线的证据表明，CS-E 19聚体对LPS诱导的器官损伤的保护作用归因于其中和组蛋白并保护由组蛋白引起的内皮细胞损伤的能力。首先，证明了CS-E 19聚体能够从小鼠血浆中拉低组蛋白H3(图6A)。为此，将 LPS处理的小鼠血浆与生物素化的CS-E 19聚体一起温育，然后使用抗生物素蛋白-琼脂糖柱进行亲和纯化。CS-E 19聚体亲和纯化后，在血浆样品中检测到组蛋白H3(图6A，道5)。该实验的结果表明，CS-E 19聚体在体内条件下与组蛋白形成复合物，该结合中和了组蛋白的毒性。其次，评价了CS-E 19聚体对抗组蛋白引起的内皮细胞死亡的保护作用。用组蛋白 H3处理EA.hy926细胞，并使用基于PI染色的流式细胞仪测量细胞死亡 (7)。加入CS-E 19聚体以剂量响应方式降低了细胞死亡(图6B)。对于 CS-E 13聚体，观察到较小程度的保护作用，这与观察到其对组蛋白的结合亲和力比CS-E 19聚体低的观察结果一致。对于CS-0S 19聚体，未观察到保护作用。第三，CS-E 19聚体的使用可以防止LPS诱导的血管渗漏，而CS-E 19聚体在肾脏中的减少作用不太显著，并且对降低肝脏的血管渗透性没有显著影响(图6C-6E)。

实施例8

通过合成多种CS化合物，包括例如不同尺寸的CS-E寡糖，如5聚体、9聚体、11聚体、15-聚体和17聚体，证明了本文公开的CS化合物的灵活且有效的合成方法和途径。为了清楚和简单起见，本研究集中于 CS-E 7聚体、CS-E 13聚体和CS-E 19聚体，但结果和应用并不限于此。应当指出的是，二库宁(bikunin)是从天然来源分离出的最简单CS蛋白聚糖，其具有大小约27至约39个糖残基(8)。本文合成和公开的19聚体CS寡糖的尺寸是天然全长CS链的约50％至约70％。

参考文献

本文列出的所有参考文献，包括但不限于，所有专利、专利申请及其出版物、科学期刊文章和数据库条目，以其补充、解释、提供方法背景或教导本文采用的方法、技术和/或组合物的程度，通过引用以其全部内容结合于本文中。

1.Brinkmann V，Reichard U，Goosmann C，Fauler B，Uhlemann Y，Weiss DS， etal.Neutrophil extracellular traps kill bacteria.Science.2004；303:1532-5.

2.Clark SR，Ma AC，Tavener SA，McDonald B，Goodarzi Z，Kelly MM，etal.Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteriain septic blood.Nat Med.2007；13:463-9.

3.Wildhagen KC，García de Frutos P，Reutelingsperger CP，Schrijver R，Aresté C， Ortega-Gómez A，et al.Nonanticoagulant heparin prevents histone-mediated cytotoxicity in vitro and improves survival in sepsis.Blood.2014；123:1098-101.

4.Xu J，Zhang X，Pelayo R，Monestier M，Ammollo CT，Se聚体aro F，et al.Extracellular histones are major mediators of death in sepsis.Nat Med. 2009；15:1318-21.

5.Li J，Su W，and Liu J.Enzymatic synthesis of homogeneous chondroitinsulfate oligosaccharides.Angew Chem Int Ed.2017；56:11784-7.

6.Sugiura N，Setoyama y，Chiba M，Kimata K，and Watanabe H.Baculovirusenvelope protein ODV-E66 is a novel chondroitinase with distinct substratespecificity.J Biol Chem.2011；286:29026-34.

7.Xu J，Zhang X，Monestier M，Esmon NL，and Esmon CT.Extracellularhistones are mediators of death through TLR2 and TLR4 in mouse fatal liverinjury.J Immunol.2011；187:2626-31.

8.Ly M，Leach III FE，Laremore TN，Toida T，Amster IJ，and Linhardt RJ.Theproteoglycan bikunin has sequence.Nat Chem Biol.2011；7:827-33.

应该理解的是，在不脱离本公开主题范围的情况下，可以改变本公开主题的各细节。此外，前述描述仅出于举例说明的目的，而非出于限制的目的。