高增生活性的3D结构细胞球体、其制造方法与用途

技术领域

本发明涉及一种细胞球体、其制造方法与用途，特别涉及一种高增生活性的3D结构细胞球体、其制造方法与用途。

背景技术

传统细胞治疗法为利用酵素自培养盘分离出单颗细胞，再将单颗细胞填充至针筒内后通过针头注射至生物体内。然而，酵素会破坏胞外基质，因此细胞注射至生物体内后会影响其增生活性与生物因子表现量。

因此，如何改善传统细胞治疗法确实为本领域技术人员积极解决的课题之一。

发明内容

本发明基于一项不可预料的发现所完成，其中多个细胞聚集成的细胞团聚体通过特定内径尺寸的针头后会提升细胞增生活性与特定生物因子表现量，且无癌化疑虑。

因此，本发明之一目的在于提出一种3D结构细胞球体，其为将细胞团聚体通过编号30G以下的针头后所取得的。

较佳地，细胞团聚体的细胞数为30至3,000个。

较佳地，细胞团聚体为规则三维立体结构、不规则三维立体结构、规则细胞球体、或不规则细胞球体。

较佳地，细胞团聚体为培养真皮细胞或血管内皮细胞或纤维母细胞或脂肪细胞或表皮细胞或上皮细胞或乳腺细胞或肌肉细胞或胰岛细胞或角膜细胞或毛囊细胞或软骨细胞或硬骨细胞或神经细胞或肺细胞或牙周间韧带细胞或T细胞或B细胞或单核细胞或巨噬细胞或粒细胞或肥大细胞或辅佐细胞或周边血干细胞或脂肪干细胞或骨髓间质干细胞所取得的。

较佳地，针头编号为27G以下。

较佳地，针头编号为27G至21G。

依本发明，3D结构细胞球体具高增生活性与特定生物因子的高表现量且无癌化疑虑，故可植入至生物体内并迅速生长且具备生物活性。另外，细胞团聚体通过针头的过程相当于医疗或美容的注射行为，故3D结构细胞球体至生物体内的植入可于细胞团聚体通过针头时一并实施，或者于试管内(in vitro)取得3D结构细胞球体后再移植至生物体内。

基于上述特性，本发明另提出一种上述3D结构细胞球体的用途，其为用于制备疾病治疗或医学美容的生物制剂。

较佳地，疾病治疗为实体癌、血液恶性肿瘤、下肢周边动脉阻塞(lower extremityperipheral arterial disease)、皮肤创伤、皮下组织或软组织缺陷、退化性关节炎、膝关节软骨缺损、中风、或脊髓损伤的治疗。

较佳地，医学美容为皱纹的填补、表皮凹洞的填补、疤痕的填补、软组织的填充、糖尿病伤口的愈合、烧烫伤口的愈合、割伤伤口的愈合、或手术伤口的愈合。

本发明再提出一种上述3D结构细胞球体的制备方法，其包括：培养多个细胞以形成细胞团聚体；以及将细胞团聚体通过编号30G以下的针头。

附图说明

图1为一流程示意图，说明本发明一实施方式的细胞团聚体的形成。

图2为一直方图，说明实验例与对照例中通过不同内径尺寸的针头后所取得的3D结构细胞球体增生活性。

图3为一直方图，说明着实验例与对照例中通过编号27G的针头后所取得的3D结构细胞球体生物因子表现量。

图4为一直方图，说明着实验例与对照例中通过编号27G的针头后所取得的3D结构细胞球体干性(stemness)因子表现量。

具体实施方式

为让本发明上述及/或其他目的、功效、特征更明显易懂，下文特举较佳实施方式，作详细说明于下：

本发明的一实施方式提出一种3D结构细胞球体的制备方法，所得到的细胞球体具备高增生活性与特定生物因子的高表现量且无癌化疑虑，故可植入至生物体内以达疾病治疗或医学美容目的。此方法包含：培养多个细胞以形成细胞团聚体；以及将细胞团聚体通过编号30G以下的针头。

请参照图1，示例说明上述细胞团聚体的形成，但不以此为限。首先，种植此等细胞(1)于凹槽(2)内，细胞(1)的实例可为但不限于真皮细胞或血管内皮细胞或纤维母细胞或脂肪细胞或表皮细胞或上皮细胞或乳腺细胞或肌肉细胞或胰岛细胞或角膜细胞或毛囊细胞或软骨细胞或硬骨细胞或神经细胞或肺细胞或牙周间韧带细胞或T细胞或B细胞或单核细胞或巨噬细胞或粒细胞或肥大细胞或辅佐细胞或周边血干细胞或脂肪干细胞或骨髓间质干细胞。。其次，培养此等细胞(1)以形成细胞团聚体(3)。须说明的是，于细胞(1)为贴附型细胞时，此等细胞(1)培养后会自然聚集成细胞团聚体(3)；于细胞(1)为悬浮型细胞时，此等细胞(1)培养后须借由离心方式而聚集成细胞团聚体(3)。此外，细胞团聚体(3)可为但不限于规则三维立体结构、不规则三维立体结构、规则细胞球体、或不规则细胞球体，其细胞数可为但不限于30至3,000个。须说明的是，于细胞团聚体(3)为规则细胞球体或不规则细胞球体时，凹槽(2)表面可涂布反贴附层(4)，其材料实例可为但不限于2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholinepolymer)，以协助细胞(1)堆栈成细胞团聚体(3)；于细胞团聚体(3)为规则三维立体结构或不规则三维立体结构时，凹槽(2)表面可涂布外部刺激响应层(4)，其材料实例可为但不限于光响应材料、pH响应材料、电响应材料、磁场响应材料、或化学响应材料。透过外部刺激响应材料受外部环境刺激会改变亲疏水性的特征，可使细胞团聚体(3)与凹槽(2)表面分离。换言之，反贴附材料或外部刺激响应材料均可避免细胞(1)间的连接蛋白受破坏，以维持后续所得的细胞球体整体的结构与生物活性。此外，凹槽(2)尺度可控制细胞团聚体(3)尺寸或细胞数，其深度(d)可为但不限于100μm至400μm，直径(D)可为但不限于200μm至1000μm。

上述针头编号为参照伯明翰标准(Birmingham gauge)制定的皮下注射针头规则。举例而言，“30G”意指针头外径直径为0.3112mm、内径直径为0.159mm；“27G”意指针头外径直径为0.4128mm、内径直径为0.21mm；“21G”意指针头外径直径为0.8192mm、内径直径为0.514mm。所用的针头编号较佳地为27G以下，更佳地为27G至21G。

本发明的另一实施方式为依上述3D结构细胞球体可于生物体内迅速生长且具备生物活性之功能所得到的。具体地提出一种上述细胞球体的用途，其为用于制备疾病治疗或医学美容的生物制剂。所述生物制剂可于细胞团聚体通过针头时一并注射至生物体内或于试管内取得后再移植至生物体内，如此均可达到疾病治疗或医学美容的用途。所谓“疾病治疗”意指但不限于实体癌、血液恶性肿瘤、下肢周边动脉阻塞、皮肤创伤、皮下组织或软组织缺陷、退化性关节炎、膝关节软骨缺损、中风、或脊髓损伤的治疗；所谓“医学美容”意指但不限于皱纹的填补、表皮凹洞的填补、疤痕的填补、软组织的填充、糖尿病伤口的愈合、烧烫伤口的愈合、割伤伤口的愈合、或手术伤口的愈合。

＜实验例＞

种植人类纤维母细胞(human fibroblast)在具外部刺激响应层的培养盘。在一般环境(37℃与5％二氧化碳)下于培养盘内的培养液(Fibroblast Growth Medium(116-500))培养细胞直到细胞培养团聚成30至3,000个细胞组成的细胞团聚体后，置换新的培养液并将培养盘置于对应的外部环境刺激下，使形成的细胞团聚体浮起。接着，将细胞团聚体填充至具不同编号的针头的注射器内。最后，推动注射器的活塞使细胞团聚体通过针头而种植于另一培养盘，并于一般环境(37℃与5％二氧化碳)下于培养盘内的培养液(Fibroblast Growth Medium(116-500))继续培养所得的3D结构细胞球体。

＜对照例＞

种植人类纤维母细胞(human fibroblast)于培养盘。于一般环境(37℃与5％二氧化碳)下于培养盘内的培养液(Fibroblast Growth Medium(116-500))培养细胞直到细胞密度达特定程度后，移除培养液并以PBS清洗细胞。之后，加入0.25％胰蛋白酶至培养盘内并于37℃下作用3分钟使细胞浮起。接着，加入新的培养液至培养盘内终止酵素反应并将细胞均匀打散成多个单颗细胞。最后，将此等单颗细胞填充至具不同编号的针头的注射器内。最后，推动注射器的活塞使此等单颗细胞通过针头而种植于另一培养盘(单颗细胞总细胞数与前述细胞团聚体总细胞数相同)，并于一般环境(37℃与5％二氧化碳)下于培养盘内的培养液(Fibroblast Growth Medium(116-500))继续培养所得的3D结构细胞球体。

＜分析例1＞

依文献J Pharm Pharmacol.2015May；67(5):640-50所述，纤维母细胞通过针头后需要3天回复期，故利用上述细胞球体培养后第3天的生长速率为基准。如图2所示，对照例的细胞球体为通过内径直径越大的针头所取得时，其相对生长率越低；然而，实验例的细胞球体为通过编号30G的针头所取得时，其相对生长率最低，通过编号21G的针头所取得时次低，通过编号27G的针头所取得时最高。

＜分析例2＞

在上述细胞球体培养3天后，先以PBS清洗，再加入不含血清的培养液继续培养24小时，最后收集上清液进行细胞激素数组分析，以比较实验例与对照例的细胞球体的生长因子表现。如图3所示，在同样为通过编号27G的针头所取得时，实验例的细胞球体的CXCL 1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1)、CCL 17(chemokine(C-C motif)ligand 17)、SDF-1(基质细胞衍生因子-1，stromal cell-derived factor-1)、血管生成素(angiogenin)、VEGF-A(血管内皮生长因子-A，vascular endothelial growth factor-A)、与PDGF-BB(血小板衍生生长因子-BB，platelet-derivedgrowth factor-BB)表现量均大于对照例，其中CCL17可促进纤维母细胞迁移，SDF-1可促进角质细胞生长，血管生成素与VEGF-A可促进血管新生，PDGF-BB可促进细胞生长，此等因子均与伤口修复有关。又如图3所示，实验例的细胞球体的IL-6(介白素-6，interleukin-6)表现量小于对照例，这表示对照例的细胞球体可能受到伤害而释放出较多的促炎性因子。

＜分析例3＞

在上述细胞球体培养3天后，收集细胞进行qPCR(定量PCR，quantitative PCR)，以比较实验例与对照例的细胞球体的干性因子表现。如图4所示，在同样为通过编号27G的针头所取得时，实验例的细胞球体的Sox2(Sex-determining Region Y(SRY)-related Box2)、Oct4(octamer-binding transcription factor 4)、Nanog、c-Myc表现量均大于对照例，但仍低于人类肝癌细胞HepG2，这表示实验例的细胞球体无癌化的疑虑。

惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；故，凡依本发明申请权利要求保护范围及说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍落入本发明专利权利要求保护范围内。