瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用

技术领域

本发明涉及水稻病害防治技术领域，具体而言，涉及瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用。

背景技术

目前水稻主要细菌性病害有以下：

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌属水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)侵染引起的一种细菌病害，也是国内检疫对象。播种后由叶片水孔和伤口侵入，借风雨、露水、灌溉水和管理人员的走动等传播蔓延。成株期常见的典型症状有叶缘型，还有急性型、凋萎型、中脉型和黄化型。其中，深水灌溉、洪涝淹水、串灌、漫灌、氮肥过多、生长过旺均有利于病害发生。特别是，感病时期以孕穗期最易感病，分蘖期次之。

水稻细菌性条斑病又称细条病、条斑病，由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)引起。主要为害叶片。病斑初为暗绿色水浸状小斑，很快在叶脉间扩展为暗绿至黄褐色的细条斑，病斑两端呈浸润型绿色。病斑上常溢出大量串珠状黄色菌脓，干后呈胶状小粒。白叶枯病斑上菌溢不多不常见，而细菌性条斑上则常布满小珠状细菌液。发病严重时条斑融合成不规则黄褐至枯白大斑，与白叶枯类似，但对光看可见许多半透明条斑。病情严重时叶片卷曲，田间呈现一片黄白色。

水稻细菌性基腐病病原菌为菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwiniachrysanthemipv.zeae,Ecz)。水稻分蘖期发病常在近土表茎基部叶鞘上产生水浸状椭圆形斑，渐扩展为边缘褐色、中间枯白的不规则形大斑，剥去叶鞘可见根节部变黑褐，有时可见深褐色纵条，根节腐烂，伴有恶臭，植株心叶青枯变黄。拔节期发病叶片自下而上变黄，近水面叶鞘边缘褐色，中间灰色长条形斑，根节变色伴有恶臭，该病主要通过水稻根部和茎基部的伤口侵入。

水稻细菌性穗枯病是近年来新上升一种种/土传穗部病害。据研究报道，植物伯克氏菌(Burkholderiaplantarii，Bp)、颍壳伯克氏菌(Burkholderiaglumae，Bge)、唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli,Bgi)为病害的主要病原菌。病原菌在秧苗期可为危害幼苗，表现为立枯病症状。穗期染病谷粒大多表现为萎缩且畸形，其中部分或全部变为灰白色、黄褐色或深褐色，但穗轴仍为绿色。症状可用“秆青、叶绿、穗腐、谷枯”来描述。该病害在包括亚洲、非洲、美洲17个国家均有发生甚至爆发流行的报道。

目前，市场上防治细菌性病害的农药主要有无机铜类、有机铜类和噻唑类，但尚无防控水稻细菌性病害的广谱生防菌剂。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供瓜类鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasmelonis，Sm)及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用，以改善上述技术问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用。

第二方面，本发明还提供了瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在制备防治水稻细菌性病害的生物防治药剂上的应用。

第三方面，本发明还提供了一种防治水稻细菌性病害的生物防治药剂，其包括瓜类鞘氨醇单胞菌类物质和助剂，所述瓜类鞘氨醇单胞菌类物质为瓜类鞘氨醇单胞菌或所述瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物，所述助剂包括溶剂、助溶剂、乳化剂、润湿剂、分散剂、粘着剂和稳定剂中的至少一种。

第三方面，本发明还提供了瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在制备抑菌剂中的应用。

本发明的技术方案具有以下有益效果：通过将瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在水稻种植中进行施用，可有效抑制各病原细菌侵染水稻的病症发展，且不同处理方式均达到较理想的防治效果。同时，瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物还能对未染病水稻还能起到生长促进作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Sm菌及其发酵产物喷施法对Xoc引起水稻细菌性条斑病的防效结果；

图2为Sm菌及其发酵产物喷施法对Xoo引起水稻白叶枯病的防效结果；

图3为Sm菌及其发酵产物喷施法对Ecz引起水稻细菌性基腐病的防效结果；

图4为Sm菌及其发酵产物喷施法对Bp引起水稻细菌性穗枯病的防效结果；

图5为Sm菌及其发酵产物喷施法对Bge引起水稻细菌性穗枯病的防效结果；

图6为Sm菌及其发酵产物喷施法对Bgi引起水稻细菌性穗枯病的防效结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明提供的瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用进行具体说明。

本发明的一些实施方式提供了瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在防治水稻细菌性病害中的应用。

需要说明的是，瓜类鞘氨醇单胞菌是现有的一种核酸序列确定的菌种，本申请并不限该菌种的来源，其来源可以是保藏编号为CGMCC 1.15791的菌种。也可以通过实验从水稻等植物或土壤、水体中分离得到。

瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物可以通过以下步骤得到：

将瓜类鞘氨醇单胞菌的单菌落在LB培养基中进行预培养，再将预培养得到的菌液在MA液体培养基中培养；MA培养基包括无机盐溶液200X，葡萄糖8～12g和水1L。

其中，无机盐溶液组成为：NH

具体地，用接种针垂直挑取Sm的单菌落，将其置于50ml的LB培养基中进行预培养，培养24小时后，吸取10mL菌液，5000rpm离心5min后弃去上清液，再加入等量清水清洗，震荡混匀后再用5000rpm离心5min，再一次加入等量清水并震荡混匀，吸取混匀后的菌液100μL加入至60mL MA液体培养基中培养，MA液体培养基的配方比例为无机盐溶液(NH

再对发酵液进行萃取，以得到瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物。一些实施方式中，萃取方式采用萃取剂或大孔树脂吸附法(MR)进行萃取；更优选地，萃取剂选自二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EtOAc)和石油醚(PE)中的至少一种。这三种有机溶剂极性依次增大，极性范围广，能够确保将Sphingomonasmelonis发酵液中有活性的次生代谢产物萃取出来。同时，也通过大孔树脂吸附法(MR)高通量快速提取Sphingomonasmelonis次生代谢产物。基于DCM、EtOAc、PE、MR不同萃取方法获得四类Sphingomonasmelonis发酵产物。

具体地，瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物防治的水稻细菌性病害包括但不限于水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、水稻细菌性基腐病和水稻细菌性穗枯病穗枯病中的一种或多种。

进一步地，一些实施方式中，上述防治水稻细菌性病害的应用为：将瓜类鞘氨醇单胞菌或瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物对水稻种子进行浸种处理。

一些实施方式中，浸种时间至少为10小时。例如，12小时、13小时或14小时等。

为了达到较佳的防治效果，一些实施方式中，水稻种子为催芽完成的种子。

一些实施方式中，上述防治水稻细菌性病害的应用还可以为：对水稻植株不同生育期喷施瓜类鞘氨醇单胞菌或瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物。

一些实施方式中，分别在分蘖期和抽穗期进行喷施瓜类鞘氨醇单胞菌或瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物。

为了使得瓜类鞘氨醇单胞菌或瓜类鞘氨醇单胞菌的发酵产物能够对水稻起到较佳的防治效果，控制其使用成本等，一些实施方式中，对水稻植株进行喷施的瓜类鞘氨醇单胞菌的菌剂浓度为10

本发明的一些实施方式还提供了瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在制备防治水稻细菌性病害的生物防治药剂上的应用。其应用中所用的瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物如前述，在此不再赘述。

需要说明的是，生物防治药剂包括但不限于粉剂、粒剂、悬浮剂、油剂、熏蒸剂、缓释剂、种衣剂、微胶囊剂、泡腾片剂和喷洒剂中的任意一种。但是该生物防治药剂中的有效成分是Sm或其发酵产物，以上生物防治剂含有Sm制剂，可以是Sm菌体、Sm发酵产物、Sm菌体和发酵产物的混合物中的任意一种。也可以是它们与其他化合物组合共同防治水稻细菌性病害的制剂组成复方。

一些实施方式中，生物防治药剂为防治水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、水稻细菌性基腐病或水稻细菌性穗枯病的防治剂。

进一步地，本发明的一些实施方式还提供了一种防治水稻细菌性病害的生物防治药剂，其包括瓜类鞘氨醇单胞菌类物质和助剂，瓜类鞘氨醇单胞菌类物质为Sm或其发酵产物，助剂包括但不限于溶剂、助溶剂、乳化剂、润湿剂、分散剂、粘着剂和稳定剂中的至少一种。

本发明的一些实施方式还提供了一种瓜类鞘氨醇单胞菌及其发酵产物在制备抑菌剂中的应用。

具体地，抑菌剂为抑制水稻病源菌的抑菌剂。一些实施方式中，水稻病源菌包括Xoo、Xoc、Ecz、Bp、Bge、Bg中的一种或多种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了Sphingomonasmelonis发酵产物对水稻病原细菌的抑制作用。具体操作为：

1.Sphingomonasmelonis培养：将Sphingomonasmelonis(Sm)菌株日常培养在25℃恒温培养箱中，选用的培养基为LB培养基。

2.制备Sm发酵产物：用接种针垂直挑取Sm的单菌落，将其置于50mL的LB培养基中进行预培养，培养24小时后，吸取10ml菌液，5000rpm离心5min后弃去上清液，再加入等量清水清洗，震荡混匀后再用5000rpm离心5min，再一次加入等量清水并震荡混匀，吸取混匀后的菌液100μL加入至60mL MA液体培养基中培养，MA培养基的配方比例为无机盐溶液(NH

分别通过DCM、EtOAc、PE、MR四种萃取方法获得四类Sphingomonasmelonis发酵产物。

3.抑菌作用测定：抑菌活性测定参考肉汤微量稀释法。从日常培养固体培养基中挑取病原菌菌落(Xoo、Xoc、Ecz、Bp、Bge、Bgi)，接入灭菌的Mueller-Hinton培养基中，于25℃培养至部分浑浊，然后用新置的MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，此时细菌含量为1～2×10

观察结果如表1-表6所示。

表1Sm发酵产物对Xoo的MIC值

表2Sm发酵产物对Xoc的MIC值

表3Sm发酵产物对Ecz的MIC值

表4Sm发酵产物对Bp的MIC值

表5Sm发酵产物对Bge的MIC值

表6Sm发酵产物对Bgi的MIC值

由表1-表6的结果可知，通过Sm发酵产物对水稻常见病原细菌表现出不同程度的生长抑制作用。其中，EtOAc和MR萃取的Sm发酵产物的抑制作用强于其他萃取方法获得的发酵产物。此外，Sm发酵产物总体抑制效果对Xoc表现最佳，依次为Xoo、Ecz、Bgi、Bge、Bp。

实施例2

本实施例提供了Sm菌及其发酵产物在水稻生长基质中的防治应用。具体操作为：

1.水稻催芽与病原菌接种处理：将水稻种子置于玻璃培养皿中，再加入少量清水(以不没过种子表面为准)，之后放在25℃恒温培养箱中培养，每隔一天需要更换一次清水，2-3天后，种子出现露白现象，此时催芽完成。催芽完成后的种子，选取可引起苗期病害的Bp和Bge分别做接种处理(10

2.Sm菌及其发酵产物对病原菌感染秧苗的防治效果：在MS植物培养基，分别添加Sm菌(10

表7Sm菌及其发酵产物基质补充法对感染Bp秧苗的防治效果

其中，

表7Sm菌及其发酵产物基质补充法对感染Bge秧苗的防治效果

其中，

由表7-8可知，水稻生长基质补充Sm菌及其发酵产物，对Bp和Bge感染秧苗均具有显著的防治效果。接种Bp或Bge秧苗表现出明显的病症(黄化和矮缩)，地上部和根系生长均受到显著抑制(+Bp组对比空白对照)；而补充Sm菌及其发酵产物的秧苗的生长显著优于感染病原菌秧苗，苗和根症状得到显著缓解(Sm菌及其发酵产物处理组对比+Bp组)；此外，对比空白对照，添加Sm菌及其发酵产物还能对水稻生长起一定的生长促进作用。

实施例3

本实施例提供了Sm菌及其发酵产物处理水稻种子的防效。具体操作为：

水稻催芽参照实施例2，催芽完成后的种子，分别用Sm菌(10

表9Sm菌及其发酵产物浸种对感染Bp秧苗的防治效果

其中，

表10Sm菌及其发酵产物浸种对感染Bge秧苗的防治效果

其中，

由表9-10的结果可知，利用Sm菌及其发酵产物水稻种子进行浸种处理，对Bp和Bge感染秧苗均具有显著的防治效果。接种Bp或Bge秧苗表现出明显的病症(黄化和矮缩)，地上部和根系生长均受到显著抑制(+Bp组对比空白对照)；而补充Sm菌及其发酵产物的秧苗的生长显著优于感染病原菌秧苗，苗和根症状得到显著缓解(Sm菌及其发酵产物处理组对比+Bp组)；此外，对比空白对照，添加Sm菌及其发酵产物还能对水稻生长起一定的生长促进作用。

实施例4

本实施例提供了水稻喷施法喷施Sm菌及其发酵产物的防效。具体操作为：

水稻催芽参照实施例2，催芽后的种子分别MS植物培养基培养2周，移栽水稻种植桶(直径35cm，高)置于温室培养(光照周期为黑暗12h)。分别培养至分蘖期进行Xoc、Xoo、Ecz进行防效试验，接种病原菌Xoc、Xoo、Ecz后，喷施Sm菌(10

从图1～图6的结果可知，Sm菌及其发酵产物在水稻不同生育期喷施植株，对Xoc引起水稻细菌性条斑病具有45％-74％的防效(图1)，对Xoo引起水稻白叶枯病具有36％～75％防效(图2)，对Ecz引起水稻细菌性基腐病具有42％-75％的防效(图3)，对Bp、Bgi、Bge引起的穗枯病具有34％～78％(图4～6)。因此，Sm菌及其发酵产物在制备水稻细菌性病害中具有应用前景。

需要说明的是图1～6中横坐标中的“103CFU/mL、105CFU/mL、107CFU/mL”实际依次表示的是“10

综上所述，Sm菌及其发酵产物能够用于防治水稻细菌性病害，主要可用于制备水稻细菌性病害生防制剂。本发明实施方式的生防制剂应用于水稻种植中，能够促进水稻健康生长，减少水稻立枯病、白叶枯病、细菌性条斑病、穗枯病、穗腐病等具有良好防治效果，能够减轻水稻穗部病害的危害。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。