流动池

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月6日提交中国专利局、申请号为62/715,177的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

背景技术

生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支撑表面上或预定的反应室内进行大量受控反应。然后可以观察或检测指定的反应，随后的分析可以帮助鉴定或揭示反应中涉及的化学物质的性质。在一些实例中，受控反应产生荧光，因此光学系统可用于检测。在其它实例中，受控反应改变电荷、电导率或某些其它电性质，因此电子系统可以用于检测。

发明内容

本文公开的第一方面是一种流动池。流动池包括基板；在基板上的可选择性移除的多孔分子网状结构，所述多孔分子网状结构限定暴露的基板区域；并包括在至少一些暴露区域上的测序表面化学物质(sequencing surface chemistry)，表面化学物质选自：i)活化垫，附接于活化垫的聚合物层和附接于聚合物层的引物；ii)纳米结构和附接在该纳米结构上的酶。

在流动池的一个实例中，可选择性移除的多孔分子网状结构是胺和二酰亚胺的平面超分子(supermolecular)网状结构。在一个实例中，胺是三聚氰胺或其类似物，并且其中二酰亚胺是苝四甲酰二亚胺(perylene tetracarboxylic di-imide)或其类似物。

在流动池的一个实例中，表面化学物质是ii)纳米结构和附接于纳米结构的酶；在ii)中：纳米结构是导电通道，其包括选自导体和半导体的材料并且具有选自管、线和带的几何形状；所述酶是聚合酶。在一个实例中，一种聚合酶附接于一个纳米结构。在一个实例中，纳米结构电附接至两个电极。在一个实例中，该流动池还包括将聚合酶附接至纳米结构的系链(tether)。在一个实例中，纳米结构选自硅纳米线和碳纳米管。

在流动池的一个实例中，表面化学物质是：i)活化层，聚合物层和引物；在i)中，聚合物层为：

其中：R

应该理解的是，本文公开的流动池的任何特征可以以任何期望的方式和/或形态组合在一起。

本文公开的第二方面是测序系统。该测序系统包括可移除的流动池，其包括：基板；在基板上的可选择性移除的多孔分子网状结构，所述多孔分子网状结构限定暴露的基板区域；附接于每个暴露的基板区域的纳米结构；附接于至少一些纳米结构的酶；输入和输出流体端口；容器，其i)永久容纳可移除的流动池或ii)接收可移除的流动池；以及流体系统，其将去图案化试剂(de-patterning reagent)选择性地递送至可移除的流动池以从基板上移除可选择性移除的多孔分子网状结构，并且将图案化试剂(patterning reagent)选择性地递送至可移除的流动池以施加新的可选择性移除的多孔分子网状结构到基板上。

在测序系统的一个实例中，每个纳米结构是导电通道，其包括选自导体和半导体的材料，并且具有选自管，线和带的几何形状；并且每个纳米结构是可单独电可寻址的。

在测序系统的实例中，流体系统包括筒状容器(cartridge receptacle)，以容纳至少包括去图案化试剂和图案化试剂的试剂筒。在一些实例中，测序系统还包括试剂筒，其中试剂筒包括：流体储存系统，包括：去图案化试剂容器；包含在去图案化试剂容器内的去图案化试剂；图案化试剂容器，其包括两个单独的隔室；图案化试剂的第一组分容纳在两个单独的隔室的第一隔室中；所述图案化试剂的第二组分容纳在两个单独的隔室的第二隔室内。在一个实例中，去图案化试剂包括氧化剂。图案化试剂的第一组分是苝四甲酰二亚胺或其类似物；图案化试剂的第二组分是三聚氰胺或其类似物。在一个实例中，氧化剂选自高锰酸盐、过硼酸盐、卤素、高氯酸盐和过氧化物。

应当理解，测序系统的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，测序系统和/或流动池的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第三方面是一种方法。该方法包括通过将多孔分子网状结构施加到基板的表面上来形成掩蔽的基板，所述基板的表面上具有置于其上的纳米结构，从而每个纳米结构的至少一部分保持暴露；将掩蔽的基板暴露于对多孔分子网状结构呈惰性的酶溶液，从而将相应的酶选择性地附接于纳米结构的至少一些暴露部分。

在该方法的一个实例中，多孔分子网状结构的施加包括：加热苝四甲酰二亚胺或其类似物与三聚氰胺或其类似物的饱和混合物；将饱和混合物沉积在附接有纳米线的基板上；并冷却沉积的饱和混合物。

应当理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。而且，应当理解，该方法和/或测序系统和/或流动池的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第四方面是另一种方法。该方法包括将多孔分子网状结构施加到基板上以限定暴露的基板区域的图案；活化暴露的基板区域以形成活化垫；移除多孔分子网状结构，从而使活化垫保持完整并被间隙基板区域分开；将相应的聚合物层施加到每个活化垫上；然后将引物接枝到每个相应的聚合物层上。

在该方法的一个实例中，移除多孔分子网状结构涉及使多孔分子网状结构暴露于氧化剂。

在这种方法的一个实例中，施加多孔分子网状结构包括：加热苝四甲酰二亚胺或其类似物与三聚氰胺或其类似物的饱和混合物；将饱和混合物沉积在附接有纳米线的基板上；并冷却沉积的饱和混合物。

应当理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。而且，应当理解，该方法和/或测序系统和/或流动池的特征的任何组合可以一起使用，和/或与本文公开的任何实例组合。

更进一步，应理解，任何方法和/或任何测序系统和/或任何流动池的任何特征可以以任何期望的方式结合在一起，和/或与本文公开的任何实例组合。

附图说明

通过参考下面的详细描述和附图，本公开的实例的特征将变得清楚，在附图中，相同的附图标记对应于相似但可能不相同的组件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以结合或可以不结合出现它们的其它附图来描述。

图1A和图1B是示出形成本文所公开的流动池的实例的方法的实例的俯视示意图。

图2是沿着图1B的2-2线的流动池的剖视图。

图3A是示出本文公开的方法的另一实例的流程图；

图3B是通过图3A所示的方法形成的流动池的一个实例的剖视图。

图4是示出本文公开的方法的另一实例的流程图；

图5A至图5C是示出图4的方法的实例的俯视示意图。

图6是沿着图5C的6-6线的剖视图，除了图6所示的多孔分子网状结构是与图5C所示的实例不同的实例以外；和

图7是本文公开的示例性测序系统的一部分的透视图。

发明详述

在本文公开的实例中，通过使用多孔分子网状结构能够在纳米尺度上进行图案化。多孔分子网状结构在基板表面上自组装并产生图案，其中i)下面的基板的一部分或ii)预先沉积在基板上的纳米结构被暴露。高度疏水的多孔分子网状结构至少基本上覆盖基板表面的其余部分，并因此在基板表面上形成掩模(mask)。该掩模可以最小化，并且在某些情况下甚至完全防止随后沉积的表面化学物质附接到所述掩模上，但是不防止随后沉积的表面化学物质附接到i)下面的基板的暴露部分或ii)暴露的纳米结构上。这样，多孔分子的网状结构仅对所需区域进行功能化。

多孔分子网状结构也可使用不会对施加的表面化学物质产生有害影响的温和条件容易地从基板表面移除。

在本文公开的一些实例中，在测序操作期间，多孔分子网状结构也可以保留在基板表面上。在这些实例中，高度疏水的多孔分子网状结构可以帮助增加引入的试剂和表面化学物质之间的相互作用。

应当理解，除非另外说明，否则本文中使用的术语将具有相关领域中的普通含义。下面列出本文中使用的几个术语及其含义。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包括复数对象。

术语包括(comprising)、包含(including)、含有(containing)以及这些术语的各种形式彼此同义，并且含义的广度相同。

术语顶部(top)、底部(bottom)、下部(lower)、上部(upper)、上(on)等在本文中用于描述流动池和/或流动池的各种组件。应当理解，这些方向性术语并不意味着暗指特定的取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向性术语的使用不应解释为将此处公开的实例限定为任何特定方向。

如本文所使用的，术语“附接(attached)”是指两个东西彼此结合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价或非共价键连接至聚合物涂层。共价键的特征是原子之间共享电子对。非共价键是不涉及电子对共享的物理键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

如本文所用，术语“流动池(flow cell)”意指具有可进行反应的腔室(即，流动通道)，用于将试剂递送至腔室的入口和用于移除试剂的出口的容器。在一些实例中，腔室能够检测在腔室中发生的反应。例如，腔室/流动通道可包括一个或多个透明表面，以允许在凹陷处光学检测阵列、光学标记的分子等。对于另一个实例，腔室/流动通道可以包括允许检测电信号的电子电路。

如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动化的，并且导致表面性质的改变。通常，可以使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等来进行沉积。一些具体实例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如超声喷涂)、旋涂、浸涂(dunk/dipcoating)、刮刀涂布、凹坑配液(puddle dispensing)、流穿涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。

如本文所用，“核苷酸”包括含氮的杂环碱基，糖和一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，在DNA中，糖是脱氧核糖，即，缺少在核糖的2’位置存在的羟基的糖。含氮杂环碱基(即核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可以具有任何磷酸主链，糖或核碱基的改变。核酸类似物的实例包括例如通用碱基或磷酸糖主链类似物，例如肽核酸(PNA)。

如本文所用，“引物”定义为单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)。一些引物，可以称为扩增引物，用作模板扩增和簇产生的起点。其它引物，可以称为测序引物，用作DNA或RNA合成的起点。例如，扩增引物的5′末端可以被修饰以允许与聚合物涂层的官能团的偶联反应。引物长度可以是任意数量的碱基长，并且可以包括多种非天然核苷酸。在一个实例中，测序引物是短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。

术语“基板(substrate)”是指可以在其上添加流动池的各种组分的支撑物。支撑物可以是晶片、面板、矩形片、模具或任何其它合适的形态。支撑物通常是刚性的，并且不溶于水性液体。支撑物对用于修饰凹陷的化学反应可以是惰性的。例如，支撑物可以对用于形成嵌段共聚物、附接引物的化学反应呈惰性。合适的支撑物的实例将在下面进一步描述。

在某些方面，如本文所用，术语“表面化学物质”是指活化垫，附接于活化垫的聚合物层，以及附接于聚合物层的至少一部分的引物。在其它方面，术语“表面化学物质”是指纳米结构和附接于纳米结构的酶。

多孔分子网状结构

在本文公开的实例中，多孔分子网状结构是胺和二酰亚胺的平面超分子网状结构。所选择的胺和二酰亚胺相对于同分子氢键合优先进行异分子氢键合。以下是三聚氰胺与苝四甲酰二亚胺(PTCDI)之间的异分子氢键合的实例：

如上所述，在这些分子之间形成三个氢键。三聚氰胺包括三个可参与氢键合网状结构的功能单元(H

多个氢键供体和/或受体的存在提供了遍及基板表面的二维网状结构的形成。因此，虽然三聚氰胺和PTCDI是可以形成多孔分子网状结构的两个分子的实例，但是应当理解，其它胺和二酰亚胺的组合可以用于形成其它图案几何形状。例如，具有四个功能性三聚氰胺单元(H

合适的胺的实例包括三聚氰胺：

或其类似物。三聚氰胺类似物至少包括参与与二酰亚胺氢键合网状结构的功能单元(H

及其变体。在一个实例变体中，中心苯环被不同的芳族或其它环状系统取代，该芳族或其它环状系统允许连接不同数量(大于3)，例如2或4个2,6-二氨基吡啶基(或其它包含H

其中包括四个H

合适的二酰亚胺的实例包括苝四甲酰二亚胺(PTCDI)：

或其类似物。PTCDI类似物包括至少两个参与与胺的氢键合网状结构的二酰亚胺官能团(O＝CR-NR-CR＝O)。

PTCDI类似物的实例包括：

据信，以下任何芳香族基团在转化成二酰亚胺后都可用作PTCDI类似物：

多孔分子网状结构可以在溶液中预组装，然后沉积在所需的基板表面上。因为分子能够超分子自组装，所以溶液不包含除了溶剂和将要形成的基质/网状结构的两种成分之外的试剂(例如催化剂)。溶剂的实例包括二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。可以选择其它溶剂，并且可以部分地取决于要形成的基质/网状结构的两种成分。

可以通过达到热力学平衡而在溶液中形成多孔分子网状结构组件。达到热力学平衡的一种方法是加热苝四甲酰二亚胺或其类似物与三聚氰胺或其类似物的饱和混合物。饱和混合物包括合适的化学计量(摩尔比)的苝四甲酰二亚胺或其类似物和三聚氰胺或其类似物。在一个实例中，二酰亚胺和胺以1：1的摩尔比存在。但是，化学计量取决于所选择的分子及其对特定基板表面的亲和力。如果一个分子对基板表面具有更高的亲和力，则溶液中该分子的量可能低于溶液中另一分子的量。

溶液加热到的温度部分取决于溶液中的两种成分。在一个实例中，加热在约51℃(至325K)至约127℃(至400K)的温度范围内发生。

然后可以将加热的饱和混合物沉积在基板上(例如，通过本文公开的任何方法)，并冷却。冷却可以缓慢完成，例如以高达约10℃每分钟的速度完成。在一个实例中，冷却速率在约0.1℃/分钟至约10℃/分钟的范围内。在另一个实例中，冷却速率在约0.5℃/分钟至约5℃/分钟的范围内。在又一个实例中，冷却速率为约1℃/分钟。

在基板表面上形成的多孔分子网状结构是非反应性pi(π)系统。在一个实例中，这种类型的系统基本上是化学惰性的，因此不会与用于通过表面化学物质功能化基板表面的多种试剂和/或活化方法反应。因此，这种类型的系统很容易钝化涂覆这种系统的基板表面。部分由于这种钝化性质，多孔分子网状结构可以用作图案以通过表面化学物质选择性地官能化基板表面。下面将更详细地描述如何将多孔分子网状结构用于图案化不同的流动池的实例。

此外，多孔分子网状结构的非反应性pi(π)系统是指多孔分子网状结构未共价附接至下面的基板表面。因此，当需要时，可以容易地将多孔分子网状结构从基板表面移除。为了移除多孔分子网状结构，可以使用对二酰亚胺部分的亲和力高于对基板表面本身的亲和力的试剂。该试剂将改变热力学平衡，并且多孔分子的网状结构将从基板表面解吸。移除试剂的实例包括可以氧化二酰亚胺部分(moiety)的环的氧化剂。氧化的二酰亚胺不是平面的，并且容易从基板表面解吸。合适的氧化剂选自高锰酸盐、过硼酸盐、卤素、高氯酸盐和过氧化物。下面将进一步详细描述何时可以移除多孔分子网状结构的实例。

用于光学检测的流动池

在本文公开的一个实例中，流动池包括基板；在基板上的可选择性移除的多孔分子网状结构，所述多孔分子网状结构限定暴露的基板区域；以及在至少一些暴露区域上的测序表面化学物质，其中所述表面化学物质包括活化层，附接于所述活化层的聚合物层和附接于所述聚合物层的引物。

在图1A和图1B中示意性地示出了用于制造该流动池的方法的实例。该方法包括将多孔分子网状结构14施加到基板12上以限定暴露的基板区域18的图案(图1A)；在至少一些暴露的基板区域18上施加表面化学物质20(图1B)。如图2所示，在该示例性方法中，表面化学物质20的施加包括活化暴露的基板区域18以形成活化垫22。将相应的聚合物层24施加到每个活化垫上；并将引物26接枝到每个相应的聚合物层24上。

图1A示出了其上具有自组装的多孔分子网状结构14的基板12的俯视示意图。

合适的基板12的实例包括环氧硅氧烷、玻璃和改性或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(例如Chemours的

在一个实例中，基板12的直径可以在约2mm至约300mm的范围内，或者为具有最大尺寸可达约10英尺(约3米)的矩形片或面板。在一个实例中，基板是直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个实例中，支撑物是具有约0.1mm至约10mm的宽度的模具。尽管已经提供了示例性尺寸，但是应当理解，可以使用具有任何合适尺寸的支撑物。对于另一个实例，可以使用为矩形支撑物的面板，其具有比300mm的圆形晶片更大的表面积。

多孔分子网状结构14包括由自组装的胺和二酰亚胺分子限定的图案16以及由图案16限定的孔。图案16覆盖部分的基板12，并且孔对应于暴露的基板区域18。多孔分子网状结构14可以如本文所述被预组装并沉积在基板12上。冲洗和干燥可以在施加表面化学物质20之前进行。

如上所述，在该实例方法中表面化学物质20的施加首先涉及活化暴露的基板区域18。在一些实例中，活化包括用硅烷或硅烷衍生物硅烷化暴露的基板区域。用于硅烷化的硅烷或硅烷衍生物对多孔分子网状结构14的延伸的π系统没有亲和力，因此，多孔分子网状结构14有效地在基板12上定义了硅烷或硅烷衍生物将要反应的隔离的锚点(例如，暴露的基板区域18)。

当通过硅烷化活化暴露的基板区域18时，可以使用任何硅烷或硅烷衍生物来实现硅烷化。硅烷或硅烷衍生物的选择可部分取决于要形成的聚合物层24，因为可能期望在硅烷或硅烷衍生物与聚合物层24之间形成共价键。用于将硅烷或硅烷衍生物附接到暴露的基板区域18的方法可以根据所使用的硅烷或硅烷衍生物而变化。本文阐述了几个实例。

合适的硅烷化方法的实例包括气相沉积(例如，YES方法)、旋涂或其它沉积方法。

在使用YES CVD烘箱的实例中，将其上具有多孔分子网状结构14的基板12放置在CVD烘箱中。该腔室可以被排气，然后开始硅烷化循环。在循环期间，可以将硅烷或硅烷衍生物容器保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷为约120℃)，将硅烷或硅烷衍生物蒸气管线保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷为约125℃)，并将真空管线保持在合适的温度(例如约145℃)。

在另一个实例中，可以将硅烷或硅烷衍生物(例如，液态降冰片烯硅烷)沉积在玻璃小瓶内，并放置在玻璃真空干燥器内，其中基板12上具有多孔分子网状结构14。然后可以将干燥器抽空至约15毫托至约30毫托的压力，并将其放置在温度范围为约60℃至约125℃的烘箱内。进行硅烷化，然后将干燥器从烘箱中取出，冷却并在空气中排气。

气相沉积，YES方法和/或真空干燥器可与多种硅烷或硅烷衍生物一起使用，例如那些含有环烯不饱和部分的硅烷或硅烷衍生物，例如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，(杂)降冰片烯，其中包括氧或氮代替碳原子之一)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯，双环[4.3.1]癸-1(9)-烯，双环[4.2.1]壬-1(8)-烯和双环[4.2.1]壬-1-烯。这些环烯中的任何一个可以被例如R基团取代，例如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。降冰片烯衍生物的实例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。作为其它实例，当硅烷或硅烷衍生物包括环炔烃不饱和部分，例如环辛炔，环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物，双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)时，可以使用这些方法。这些环炔烃可以被本文所述的任何R基团取代。

在至少一些暴露的基板区域18上，硅烷或硅烷衍生物的附接形成活化垫22。因为硅烷或硅烷衍生物与基板12反应而不与图案16反应，所以在暴露的基板区域18上形成了对应的活化垫22。在该实例中，活化垫22通过图案16彼此隔离。

然后可以将聚合物层24施加到活化垫22上。聚合物层24可以是可渗透液体和气体的半刚性聚合物材料。可以选择用于形成聚合物层24的分子优先与活化垫22反应而不是与多孔分子网状结构14反应。在某些情况下，该分子可能对活化垫22具有很高的反应性，并且对多孔分子网状结构的亲和力很小或没有。这增强了分子反应性的特异性，并使分子能够在活化垫22上而不在多孔分子网状结构14上形成相应的聚合物层24。

聚合物层24的实例包括丙烯酰胺共聚物，例如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。PAZAM和一些其它形式的丙烯酰胺共聚物由以下结构(I)表示：

其中：

R

RA选自：叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；

R

每一个-(CH

p为1至50范围内的整数；

n为1至50,000范围内的整数；和

m是1至100,000范围内的整数。

本领域普通技术人员将认识到，结构(I)中重复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚基可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、块、图案或它们的组合)。

PAZAM的分子量可以在约10kDa至约1500kDa的范围内，或者在特定实例中可以为约312kDa。

在一些实例中，PAZAM是线性聚合物。在一些其它实例中，PAZAM是轻度交联的聚合物。

在其它示例中，聚合物层24可以是结构(I)的变体。在一个实例中，丙烯酰胺单元可以被N,N-二甲基丙烯酰胺代替

应当理解，可以使用其它分子来形成聚合物层24，只要它们被官能化以与活化垫22和随后施加的引物26相互作用即可。用于形成聚合物层24的合适分子的其它实例包括具有胶体结构的分子，例如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的分子，例如明胶；或具有交联的聚合物结构的分子，例如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物，无硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化形式。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。用于形成聚合物层24的合适分子的其它实例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。

如本文中提到的，用于形成聚合物层24的分子对多孔分子网状结构14的延伸的π系统没有(或具有非常小的)亲和力，因此聚合物层24将形成在活化垫22上而不是形成在多孔分子网状结构14上。可以使用旋涂，或浸渍或浸涂，或官能化分子在正压或负压下的流动或其它合适的技术来沉积分子(例如，PAZAM)。官能化的分子可以混合物存在。在一个实例中，混合物包括在水中或在乙醇和水的混合物中的PAZAM。分子将进行反应以在活化垫22上而不在多孔分子网状结构14上形成聚合物层24。

在被涂布之后，分子还可以被暴露于固化过程以在每个活化垫22上形成聚合物层24。在一个实例中，固化所述官能化分子可以在室温(例如约25℃)至约95℃的温度下进行约1毫秒至约几天的时间。在另一个实例中，时间可以在从10秒到至少24小时的范围内。在又一个实例中，时间可以在从大约5分钟到大约2小时的范围内。

聚合物层24可以通过共价键合附接至活化垫22。聚合物层24与活化垫22的共价连接有助于在各种用途中在最终形成的流动池的整个寿命中将表面化学物质20保持在各个隔离的区域。以下是可在活化垫22和聚合物层24之间发生的反应的一些实例。

当硅烷或硅烷衍生物包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基进行1,3-偶极环加成反应；ii)与连接PAZAM的四嗪基进行偶联反应；与连接PAZAM的腙基进行环加成反应；与连接PAZAM的四唑基进行光点击反应；或与连接PAZAM的腈氧化物基团进行环加成反应。

当硅烷或硅烷衍生物包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基进行应变促进的(strain promoted)叠氮-炔1,3-环加成(SPAAC)反应，或ii)与连接PAZAM的腈氧化物基团进行应变促进的炔烃-腈氧化物环加成反应。

当硅烷或硅烷衍生物包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于双环体系中的应变，双环壬炔可能会与连接PAZAM的叠氮化物或腈氧化物发生类似的SPAAC炔烃环加成反应。

进行接枝过程以便将引物26接枝到聚合物层24上。引物26可以是包括炔官能团的任何正向扩增引物或反向扩增引物，或另一种封端的引物。可以使用的封端的引物的其它实例包括四嗪封端的引物、叠氮基封端的引物、氨基封端的引物、环氧或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端(thiophosphate terminated)的引物、硫醇封端的引物、醛封端的引物、肼封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。也可以使用引物的混合物。合适的引物的具体实例包括P5和/或P7引物，这些引物用于Illumina公司出售的商业流动池的表面以在HiSeqX

在一个实例中，可以通过流经沉积(例如，使用临时结合的盖子)、浸涂、喷涂、凹坑配液或通过将引物26附接到聚合物层24上的另一种合适的方法来完成接枝。这些实例技术中的每一个都可以利用引物溶液或混合物，其可以包括引物、水、缓冲剂和催化剂。

浸涂可涉及将基板12(其上具有活化垫22和聚合物层24)浸入一系列温度控制浴中。浴也可以是控制流量的和/或被氮气覆盖。浴可包括引物溶液或混合物。在各种浴中，引物26将附接在聚合物层24的官能团上。在一个实例中，将基板12引入包括引物溶液或混合物的第一浴中，在该第一浴中发生反应以附接引物26，然后移至另外的浴中进行洗涤。从一个浴到另一个浴的移除可能涉及机械臂或可以手动执行。干燥系统也可用于浸涂中。

可以通过将引物溶液或混合物直接喷涂到基板12上(其上具有活化垫22和聚合物层24)来完成喷涂。可以将经过喷涂的晶片在约0℃至约70℃的温度下温育约4分钟至约60分钟的时间。温育后，可以稀释并使用例如旋涂机移除引物溶液或混合物。

可以根据富集和旋抛方法(pool and spin off method)来进行凹坑配液，因此可以利用旋涂机来实现。可以将引物溶液或混合物(手动或通过自动过程)施加到基板12(其上具有活化垫22和聚合物层24)。所施加的引物溶液或混合物可以被施加到或铺展在包括图案16在内的整个表面上。涂有引物的基板12可以在约0℃至约80℃的温度下温育约2分钟至约60分钟的时间。温育后，可以稀释并使用例如旋涂机移除引物溶液或混合物。

引物26与聚合物层24的官能团反应，并且对多孔分子网状结构14的延伸的π系统没有亲和力。这样，引物26接枝到聚合物层24而不是接枝到多孔分子网状结构14上。

在该方法的另一个实例中，表面化学物质20的施加可以在施加多孔分子网状结构之前和之后进行。在这些其它实例中，在施加多孔分子网状结构14之前进行基板表面活化，并且在施加多孔分子网状结构之后进行聚合物层24的形成和引物26的接枝。

在该实例中，(裸)基板12的表面暴露于等离子体灰化，其在基板12的表面上产生表面活化剂(例如，-OH基团)。应注意，-OH基团的添加可以降低基板12对多孔分子网状结构(其为疏水性)的亲和力，因此可以控制等离子体灰化的条件和时间，以使表面不会过于亲水。

在该实例中，将多孔分子网状结构14添加到活化的基板表面上，其暴露了活化的基板表面的离散区域。当将多孔分子网状结构14施加在活化基板上时，形成活化垫22。

同样在该实例中，然后可以如本文所述将聚合物层24选择性地施加至活化垫22，并且可以如本文所述将引物26接枝至聚合物层24。

现在参考图2，其示出了通过图1A和图1B中所示的方法(例如，图案化，然后添加表面化学物质20)形成的流动池10的实例。尽管示出了单一类型的引物24，但是应当理解，可以连接两个或更多个不同的引物24。

在该实例中，表面化学物质20的每个离散部分的X和Y尺寸基本上对应于多孔分子网状结构14的每个孔的X和Y尺寸。多孔分子网状结构14的孔使得能够以纳米精度对表面化学物质20进行排序。

在图2所示的实例中，在整个所述方法中，可选择性移除的多孔分子网状结构14保留在基板12上，然后在随后的测序操作期间作为流动池10的一部分。可能期望的是，多孔分子网状结构14的分子结构将不与在测序操作期间使用的荧光团相互作用。在这个实例中，分子网状结构14的架构可以在测序操作期间帮助钝化表面，使其对生物分子非特异性吸收。

在其它实例中，可选择性移除的多孔分子网状结构14可在该方法期间从基板12移除，然后在随后的测序操作期间不作为流动池的一部分存在。该方法100的一个实例在图3A中示出，而所得的流动池10’的一个实例在图3B中示出。该方法100包括将多孔分子网状结构14施加到基板12上以限定暴露的基板区域18的图案(附图标记102)；活化暴露的基板区域18以形成活化垫22(附图标记104)；移除多孔分子网状结构14，由此活化垫22保持完整并被间隙基板区域28(附图标记104)分开；将相应的聚合物层24施加到每个活化垫22上(附图标记106)；并将引物26接枝到各个聚合物层24上(附图标记108)。当多孔分子网状结构14的分子结构能够与要在测序操作期间使用的荧光团相互作用时，该方法100可能是期望的。一些荧光团可能会粘附在多孔分子网状结构14的某些实例上。这种相互作用将破坏测序，或者以其它方式有害地影响测序，因为粘附在多孔分子网状结构14上的荧光团标记的分析物不能与测序模板相互作用。在这些实例中，可以使用方法100，其有效地利用多孔分子网状结构14来创建活化垫22(用于保留表面化学物质20的锚点)，然后移除多孔分子网状结构14，因此它不会干扰后续的测序操作。在这些实例中，移除了多孔分子网状结构14的指纹和潜在的干扰。

在方法100中，可以如本文所述形成多孔分子网状结构14，并且可以使用硅烷或硅烷衍生物如本文所述进行活化。在该实例中，每个离散的活化垫22(以及表面化学物质20的每个部分)的X和Y尺寸与多孔分子网状结构14的每个孔的X和Y尺寸相对应，因为硅烷或硅烷衍生物在孔处活化暴露的基板区域18。

在形成活化垫22之后，方法100随后包括移除多孔分子网状结构14。多孔分子网状结构14的化学性质使其易受本文公开的任何氧化剂的影响。可以使用任何合适的沉积技术将氧化剂沉积在多孔分子网状结构14上(以及在基板12的其余部分上)。由于二酰亚胺的氧化，暴露于氧化剂使多孔分子网状结构14从基板12上抬起(例如，通过解吸)。氧化剂不会与活化垫22反应，因此基板12的这些活化部分保持完整以用于随后的反应。在移除多孔分子网状结构14之后，可以清洗基板12和其上的活化垫22(例如，用水)。

多孔分子网状结构14的移除暴露的基板12的部分，其在本文中称为间隙区域28。间隙区域18可以是连续的(并且具有与多孔分子网状结构14相同的图案)，而硅烷化区域22是离散的。

在方法100中，可以如本文所述形成聚合物层24。在这些实例中，用于形成聚合物层24的分子对基板12没有亲和力，因此聚合物层24将选择性地在活化垫22上形成而不是基板12的间隙区域28上形成。在方法100中，引物接枝26也可以如本文所述发生。

本文公开的流动池10、10’可用于多种测序方法或技术，包括通常称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。利用这些技术中的任何一种，由于引物26作为表面化学物质20的一部分而不是在图案16或间隙区域28上存在，因此测序将限于表面化学物质20。

作为一个实例，合成测序(SBS)反应可以在诸如HiSeq

在特定的基于聚合酶的SBS方法中，将核酸文库模板引入流动池10、10’，从而使核酸文库模板与引物26杂交。多个核酸文库模板与例如固定在流动池10、10′上的两种类型的引物26之一杂交。然后可以执行簇生成。在簇产生的一个实例中，使用高保真DNA聚合酶通过3′延伸从杂交引物26复制核酸文库模板。原始核酸文库模板被变性，使拷贝固定在引物26所在的位置。等温桥扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板成环(loop over)以与相邻的互补引物26杂交，并且聚合酶对复制的模板进行复制以形成双链桥，所述双链桥被变性以形成两条单链。这两条链成环并与相邻的互补引物26杂交，并再次延伸形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增的循环在每个模板拷贝上重复该过程，以创建密集的克隆簇。每个双链桥簇均被变性。在一个实例中，反向链通过特异性碱基切割移除，从而留下正向模板链。

模板的3’端和任何引物26可以被封闭，以防止不必要的引发。可以将测序引物引入到流动池10、10’中。因为测序引物与核酸模板链的衔接子互补，所以它将与衔接子杂交(例如，模板的读段(read)1测序引物)。

以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加至模板(从而延伸测序引物)，使得可以使用对添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测来确定模板的序列。例如，为了启动第一个SBS循环，可以将一个或多个标记的核苷酸，DNA聚合酶等递送至/通过流动通道等，所述流动通道等容纳附接有模板链的引物26的阵列。测序引物延伸导致标记的核苷酸被掺入，并且这种掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向表面化学物质20提供激发光。

在一些实例中，核苷酸可以进一步包括可逆的终止性质，一旦添加核苷酸，该可逆的终止性质终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物沿着模板链添加到测序引物中，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以移除该部分才发生。因此，例如对于使用可逆终止的实施例，可以在检测之前或之后将解封闭剂递送至流动通道等。

在各种流体递送步骤之间可能会发生清洗。然后可以将SBS循环重复n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

尽管已经详细描述了SBS，但是应当理解，本文描述的流动池10、10’可以与其它测序方案一起用于基因分型或在其它化学和/或生物学应用中使用。在又一个实例中，本文公开的流动池10、10’可以用于池上文库(on-cell library)的生成。

用于电子检测的流动池

在本文公开的另一个实例中，流动池包括基板；在基板上的可选择性移除的多孔分子网状结构，所述多孔分子网状结构还限定暴露的基板区域；以及在至少一些暴露区域上的测序表面化学物质，其中所述表面化学物质包括纳米结构和附接于所述纳米结构的酶。

在图4以及图5A至图5C中示出了用于制造该流动池的方法的实例。

如图4所示，方法200包括通过将多孔分子网状结构14施加到其上组装有纳米结构的基板12的表面上来形成掩蔽的基板，由此每个纳米结构的至少一部分保持暴露(附图标记202)；将掩蔽的基板暴露于对多孔分子网状结构14呈惰性的酶溶液，从而将相应的酶选择性地附接于纳米结构的至少一些暴露部分(附图标记204)。

图5A示出了其上组装有纳米结构的基板12的俯视示意图。基板12可以是本文描述的任何实例。

纳米结构在图5A中以附图标记30示出。纳米结构30是电荷传感器32的导电通道，该电荷传感器还包括电极34、34’。如本文所用，术语“电荷传感器”旨在表示将其表面或周围电场中的扰动转换为电信号的检测装置。例如，电荷传感器32可以将反应成分的到达或离开转换成电信号。在一些实例中，电荷传感器32还可以将两个反应成分(例如，模板核酸和核苷酸)之间的相互作用转化为电信号。示例电荷传感器32是场效应晶体管(FET)，例如基于碳纳米管(CNT)的FET，基于单壁碳纳米管(SWNT)的FET，硅纳米线(SiNW)FET，聚合物纳米线FET和石墨烯纳米带FET(以及由2D材料(例如MoS

可以使用任何类型的纳米结构30，只要它可以用作电荷传感器32的导电通道即可。适用于导电通道的示例材料包括导体(例如，金属、碳基材料、某些金属氧化物、导电聚合物等)或半导体(例如，硅，其它金属氧化物等)。纳米结构30可以具有任何合适的几何形状，例如管、线、带等，并且纳米结构30的至少一个尺寸(例如，长度、宽度、直径等)可为纳米尺度。作为实例，纳米结构30是导电通道，其包括选自导体和半导体的材料，并且具有选自管、线和带的几何形状。纳米结构30的一些具体示例包括碳纳米管(CNT)、单壁碳纳米管(SWCN)、硅纳米线(SiNW)、聚合物纳米线、纳米带(例如，石墨烯纳米带，由2D材料(例如MoS

如图5A所示，纳米结构30的相对端与相应的电极34、34’电连通。可以使用可以化学和电方式附接到纳米结构30的任何合适的电极材料。合适的电极材料的实例包括金、铂、碳、铟锡氧化物等。

在一些实例中，在基板12上组装一个或多个电荷传感器32可以包括使用任何合适的技术(例如直接生长，溶液滴加或各种印刷技术)，制造电极34、34’以及在电极34、34’之间制造纳米结构30。作为一个实例，可以使用电弧放电、激光烧蚀、高压一氧化碳歧化或化学气相沉积(CVD)来生产碳纳米管。作为另一个实例，硅纳米线(SiNW)可以通过蚀刻固体或通过从气相或液相催化生长而由硅酮前体制成。

每个电荷传感器32可以被单独地布线(并且因此被单独地监测)。换句话说，任何单独的电荷传感器32的电极34、34’可以连接到使它们能够进行操作(例如，一旦连接到检测器和电源上)的电子电路。电子电路可以电连接到检测器和电源。

电荷传感器32在基板12上的布置可以部分地基于要形成在基板12上的多孔分子网状结构14的图案16的几何形状，尤其是基于孔的几何形状。这部分地是由于以下事实：多孔分子网状结构14将自组装在基板12和电荷传感器32上，并且期望至少一部分纳米结构30被定位在多孔分子网状结构14的孔中。多孔分子网状结构14可以部分地沉积在纳米结构30的表面的顶部上，以限制发生在纳米结构30上的官能化的量和/或隔开附接于纳米结构30的生物分子和/或钝化部分的电荷传感器32,以防止试剂(例如溶液盐等)与钝化部分相互作用。

如图4的附图标记202所示，方法200包括通过将多孔分子网状结构14施加到其上组装有纳米结构30的基板12的表面上来形成掩蔽的基板，由此使每个纳米结构30的至少一部分保持暴露。多孔分子网状结构14可以在溶液中预组装，然后如本文所述沉积在基板12上。

多孔分子网状结构14在基板12的表面上自组装，并且在某些情况下，于电荷传感器32的组件(30、34、34’)上自组装，至少部分地取决于孔的尺寸以及电荷传感器32的尺寸和位置。当沉积时，多孔分子网状结构将自组装，使得基板12的部分和/或基板12上的电荷传感器32的部分将在孔处暴露。如图5B所示，这形成了掩蔽的基板。为了简单和清楚地示出多孔分子网状结构14和电荷传感器32，图5B中的每个电荷传感器32被示为暴露在多孔分子网状结构14的相应孔中。然而，应当理解，多孔分子网状结构14的各个孔小于电荷传感器32，并且在某些情况下小于纳米结构30。这样，除了暴露的基板12之外，多孔分子网状结构14还可以覆盖电极34、34’和/或电荷传感器32的一些或全部纳米结构30。在图6中示出了在电极34、34′和一些纳米结构30上延伸的多孔分子网状结构14的实例。应当理解，由多孔分子网状结构14覆盖的和在多孔分子网状结构14的孔处暴露的将部分取决于电荷传感器32的尺寸和位置以及多孔分子网状结构14的自组装。在本文公开的实例中，多孔分子网状结构14的至少一些孔将暴露出至少一些纳米结构30的部分，尽管应当理解，一些纳米结构30可以被多孔分子网状结构14完全覆盖和/或基板12的一部分也可以在一些孔处暴露。

然后，方法200包括将被掩蔽的基板暴露于对多孔分子网状结构14呈惰性的酶溶液。所谓“惰性”是指酶溶液将不粘附于或不与多孔分子网状结构反应，因此溶液中的酶将选择性地附接于纳米结构30的至少一些暴露部分。酶溶液的惰性可能是由于溶液的亲水性和多孔分子网状结构14的疏水性。多孔分子网状结构14是共轭的，因此非常疏水。酶溶液是亲水的(与多孔分子网状结构14相比)，因此不会粘附于多孔分子网状结构14或与多孔分子网状结构14反应。这样，当掩蔽的基板暴露于酶溶液时，溶液中的酶可被吸引至纳米结构30的任何暴露部分，而不是多孔分子网状结构14。由于多孔分子网状结构14可以覆盖一些或所有纳米结构30的一些表面，所以仅这些纳米结构30的一小部分可以在孔处暴露。小的暴露部分限制了可以在任何一个纳米结构30处发生的功能化，这可以改善生物分子附接的特异性。在一些实例中，小的暴露的纳米结构部分可以附着单一酶，这可以改善电荷传感器32的感测功能。

酶溶液可以包括酶36(单独或与连接到其上的系链38组合)和酶的液体载体。液体载体将是水基溶液。在一个实例中，生理盐溶液可以用作液体载体。

在本文公开的实施例中，期望单个酶36附接到单个纳米结构30(如图5C和图6所示)。为了帮助该过程，可以选择所使用的酶36以使其在溶液中的流体力学半径类似于纳米结构30的可以暴露于图案16的孔的部分的尺寸。所谓“相似”是指流体力学半径可以比多孔分子网状结构的孔的尺寸最多大50％或最多小50％。合适的酶36的一个实例是聚合酶。合适的DNA聚合酶的实例包括那些通过结构同源性鉴定为A、B、C、D、X、Y和RT的家族。家族A中的DNA聚合酶包括，例如T7 DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、大肠杆菌DNAPol I、水生栖热菌Pol I和嗜热脂肪芽孢杆菌Pol I。B族的DNA聚合酶包括，例如，真核DNA聚合酶α、δ和ε；DNA聚合酶ζ；T4 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶和RB69噬菌体DNA聚合酶。家族C的实例包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基。家族D的实例包括，例如，衍生自古细菌的广古菌门(Euryarchaeota)亚结构域的聚合酶。家族X的DNA聚合酶包括，例如，真核聚合酶Polβ、Polσ、Polλ和Polμ，以及酿酒酵母Pol4。家族Y的DNA聚合酶包括，例如，Polη、Polι、Polκ、大肠杆菌PolIV(DINB)和大肠杆菌PolV(UmuD’2C)。DNA聚合酶的RT(逆转录酶)家族包括例如逆转录病毒逆转录酶和真核端粒酶。

酶36可直接附接到纳米结构30的暴露部分或可例如通过系链38(图6所示)间接附接到纳米结构30的暴露部分。酶36和纳米结构30的暴露部分之间，或酶36和系链38之间以及系链38和纳米结构30的暴露部分之间的附接可以是共价的或非共价的，并且可以取决于纳米结构30的材料，酶36以及所使用的任何系链38。在一个实例中，使用镍NTA/His标签化学物质来完成附接。

系链38可用作酶36(例如，聚合酶)的锚定物。合适的系链38的实例包括聚乙二醇(PEG)、DNA链、肽核酸(PNA)链、脂族烃链等。在一些实例中，系链38的长度足以将酶36保持与纳米结构30相距至少10nm。这可能是合乎需要的，例如使得聚合酶(或其它酶36)的构象变化，聚合酶(或其它酶36)的电荷和/或聚合酶(或其它酶36)所保持(hold)的靶标/模板多核苷酸链的电荷不会干扰纳米结构30的感测操作。

当被掩蔽的基板暴露于酶溶液时，可进行加热以将酶36或系链38偶联至任何纳米结构30的暴露部分。然而，应理解，一些偶联反应(例如，酰胺偶联)可在室温下(例如，在约18℃至约25℃的范围内)发生，因此额外加热的使用可取决于酶36或系链38，纳米结构30，以及在组分36和30或38和30之间发生的偶联反应的类型。

作为方法200的结果，形成了图6所示的流动池10”的一个实例。尽管阵列中的每个纳米结构30可用酶36官能化，但是应理解，在一些实例中，偶联反应可能不会在所有的纳米结构30上发生，因此一些(但不是全部)阵列中的纳米结构30可以用酶36功能化。在该实例流动池10”中，在随后的测序操作期间，多孔分子网状结构14可以保留在基板12上和电荷传感器32的被覆盖部分上。由于检测是电子的并且不涉及荧光团，因此疏水性多孔分子网状结构14可以帮助将引入的试剂(亲水的)引导至酶功能化的纳米结构30。

尽管未在图6中显示，但应理解，每个电荷传感器32也可以包括可以检测单个传感器32的电响应的检测器。在一个实例中，每个检测器是电流表。

本文公开的流动池10”可用于聚合酶掺入事件(即哪个核苷酸已掺入新生链)的单分子检测。更特别地，电荷传感器32可以监测单分子反应的动力学。

对于单分子检测，可以将模板多核苷酸链引入流动池10”。模板多核苷酸链可以是待测序的任何样品，并且可以由DNA，RNA或其类似物(例如，肽核酸)组成。模板(或靶标)多核苷酸链的来源可以是基因组DNA，信使RNA或其它来自天然来源的核酸。

模板多核苷酸链可以通过聚合酶(酶36的一个实例)保持在适当位置，该聚合酶直接或间接地附接于纳米结构30。可以将模板多核苷酸链与试剂(例如核苷酸)一起引入生物学稳定溶液中，所述试剂例如将被掺入沿着模板多核苷酸链形成的新生链中。生物学稳定溶液可以是适合于聚合酶碱基掺入反应，例如聚合酶链反应(PCR)或线性扩增的任何缓冲液。例如，生物学稳定溶液可包括pH值接近7，盐浓度高于数毫摩尔，以及Mg

引入的至少一些核苷酸可以包括与模板多核苷酸链的靶核酸互补的碱基。核苷酸将部分地通过聚合酶保持在适当的位置，所述聚合酶也与模板多核苷酸链结合。结合的核苷酸改变在电荷传感器32处的信号，该信号在检测器处是可检测的。

在一个或多个电荷传感器32检测到单个分子(核苷酸)之后，应当理解，流动池10”可以暴露于去图案化试剂，例如本文公开的氧化剂。在该实例中，去图案化试剂将从聚合酶中移除结合的核苷酸，并且还将氧化多孔分子网状结构14的二酰亚胺，这将使多孔分子网状结构14与基板12分离。

可以通过引入图案化试剂(包括在溶液中预组装的多孔分子网状结构)再次使用流动池10”，该图案化试剂在电荷传感器32周围的基板12上形成新的多孔分子网状结构14，然后引入样品，该样品包括要引入模板多核苷酸链的下一个靶核酸的核苷酸。对于整个模板多核苷酸链，可以继续进行单分子检测，去图案化和重新图案化。

该流动池10”也可以与不同的模板多核苷酸链一起再次用于其它测序操作中。

流动池的盖

图2、图3B和图6所示的实例是没有结合了盖子的流动池10、10’、10”的实例。尽管未示出，但是流动池10、10’、10”可以具有结合到基板12的至少一部分上的盖。盖可以定位在基板12上，使得其限定单个流动通道或多个流体分离的流动通道。应当理解，表面化学物质20、20’(单独地或作为阵列)存在于流动通道中。

对于流动池10、10’(利用光学感测)，盖子可以是对于导向表面化学物质20的激发光透明的任何材料。例如，盖子可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融石英等)，塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购实例是可从Schott North America，Inc.购得的

感测系统

图7中示出了本文公开的感测系统40的一个实例。该系统40包括流动池10”，并且是电子感测系统40。在该实例中，流动池10”是指可移除的流动池10”，但是应当理解，该流动池10”可以永久地封闭在系统40中或者可以从系统40中移除。在可移除的实例中，可移除的流动池10”可以被移除并替换为新的可移除的流动池10”，例如，用于不同的测序操作。感测系统40是一个实例，并且应当理解，可以使用系统的其它配置。

示例性感测系统40是电子感测系统，其包括壳体42，壳体42包含各种固定部件，包括例如电部件、计算部件、电源、风扇等。屏幕44可以例如存在于壳体42的前表面上，并且可以用作图形用户界面，其可以提供各种类型的信息，例如操作状态，正在进行的分析过程的状态(例如，测序运行)，向设备40传输数据或从设备40传输数据的状态，使用说明，警告等。容器46也存在于壳体42的前表面上。容器46可包括两个部分：流动池容器部分和试剂筒容器部分。容器46的流动池部分可以永久地容纳可移除的流动池10”，或者可以接收(并释放)可移除的流动池10”。当容器46的流动池部分永久地容纳可移除的流动池10”时，容器46可以包括单个狭槽50，以在试剂筒容器部分中容纳试剂筒。当容器46的流动池部分接收可替换的流动池10”时，容器46可包括两个狭槽48、50，其中一个用于容纳可移除的流动池10”，另一个用于容纳试剂筒。狭槽48、50可以具有防护门。

感测系统40可以包括状态指示器52，在该实例中，该状态指示器52呈容器46的框架上的指示器灯的形式。状态指示器52可以指示是否存在试剂筒和/或可替换的流动池10”。

如图所示，流动池10”包括基板12和盖54。不论是永久性的还是可替换的，可移除的流动池10”还可以包括输入和输出流体端口56、58，其能够将大量试剂递送到可移除的流动池10”的电荷传感器32(图5A)。

测序系统40还可以包括试剂递送系统，以选择性地将试剂引入到可移除的流动池10”的输入流体端口56上，穿过传感器32，然后从可移除的流动池10”的流体输出端口58引出。试剂递送系统可包括永久或可移除地连接到端口56、58的管道或其它流体元件(fluidics)。试剂递送系统还可包括可操作地连接到试剂筒60的管道或其它流体元件。试剂递送系统还可以包括泵或其它合适的设备，从试剂筒60中取出试剂并根据测序和去图案化/图案化方案(例如，根据本文所述的使用可移除的流动池10”的方法)将其递送到输入流体端口56。

试剂筒60可以向可移除的流动池10”提供各种试剂。试剂筒60包括壳体，该壳体保护各种流体部件，例如储液器、流体连接件、泵、阀等。在一个实例中，试剂筒60包括流体储存系统，该流体储存系统包括去图案化试剂容器62和容纳在去图案化试剂容器62内的去图案化试剂(例如，氧化剂)；图案化试剂容器包括两个单独的隔室64、66，其中图案化试剂的第一成分(例如三聚氰胺或其类似物)包含在两个单独的隔室64中的第一个隔室中，并且图案化试剂的第二成分(例如PTCDI或其类似物)包含在两个单独的隔室66中的第二个隔室中。试剂筒60还可以包括样品隔室68，样品隔室68可以包括用于模板多核苷酸链(将被测序)和用于包括核苷酸的样品(被引入到沿模板多核苷酸链形成的新生链中)的子隔室。可以对试剂筒60进行程序化以在测序过程中释放模板多核苷酸链和样品，释放去图案化试剂以移除结合的核苷酸和多孔分子网状结构14，并释放图案化试剂以形成新的多孔分子网状结构14。试剂筒60还可以包括混合腔室，在该混合腔室中将图案化试剂引入并在将其引入到可移除的流动池10”的基板12上之前进行预组装。

其它注释

应当理解，前述概念和下面更详细讨论的额外概念的所有组合(假设这样的概念并不相互矛盾)被认为是本文公开的发明主题的一部分。特别地，出现在本公开中的要求保护的主题的所有组合预期为本文公开的发明主题的一部分。还应理解，本文明确采用的术语也可能出现在通过引用并入的任何公开中，应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。

整个说明书中对“一个实例(one example)”，“另一个实例(another example)”，“一个实例(an example)”等的引用意味着结合该实例描述的特定元素(例如，特征，结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个实例中，并且可能存在也可能不存在于其他实例中。另外，应该理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在各种实例中，可以以任何合适的方式将用于任何实例的所述元素组合起来。

在本公开(包括权利要求书)中所使用的术语“基本上(substantially)”和“约(about)”用于描述和解释小的波动，例如由于处理的变化。例如，它们可以指小于或等于±5％，例如小于或等于±2％，例如小于或等于±1％，例如小于或等于±0.5％，例如小于或等于±0.2％，例如小于或等于±0.1％，例如小于或等于±0.05％。

此外，应理解，本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围，如同其被明确列举一样。例如，以1至50表示的范围应解释为不仅包括明确列举的1到50的限制，还包括单个值，例如约15、22.5、45等，以及子范围，例如约20至约48等。

尽管已经详细描述了几个实例，但是应当理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。