制备个性化血管的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月3日提交的美国临时申请号62/714,200的权益。

技术领域

本公开文本涉及个性化血管和制备个性化血管的方法。在各种实施方案中，由本文所考虑的方法产生的个性化血管可用于以改善的宿主相容性、组织整合和降低的血栓形成易感性进行移植。

背景技术

血管疾病在全球范围内构成了严重且不断增长的健康问题。如今，替换受损血管的选择是有限的。自体移植需要患者体内合适的血管，并导致供体部位的发病。合成血管替换件是可行的，但是这些缺乏在宿主组织中的生物整合和长期通畅性。需要完全生物学的患者个体化接枝物。

国际公开号WO/2013/136184公开了“用于使血管再细胞化的方法”；例如“用于产生同种异体静脉，其中使供体静脉脱细胞化，然后使用全血或骨髓干细胞再细胞化”。

国际公开号WO/2015/181245公开了“用于在带瓣膜的静脉中使瓣膜再细胞化的方法”；例如“用于产生同种异体静脉瓣膜，其中使带瓣膜的供体静脉脱细胞化，然后使用全血或骨髓干细胞再细胞化”。

发明内容

本公开文本的一个方面涉及一种制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与来自需要所述个性化血管的受试者的未稀释全血样品接触，其中所述接触进行多于2天。

本公开文本的另一个方面涉及一种制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与包含来自需要所述个性化血管的受试者的全血样品的悬浮液接触，其中将所述全血样品在生理溶液中稀释。在一些实施方案中，所述生理溶液维持细胞外环境的胶体膨胀压，以不依赖CO

在一些实施方案中，存在于所述全血样品中的细胞群填充所述支架。

在一些实施方案中，所述全血样品包含一种或多种非细胞因子，其中全血的一种或多种非细胞因子填充所述支架，并且其中所述一种或多种非细胞因子促进所述无细胞管状支架的细胞化和所述血管在接枝时的宿主相容性。

在一些实施方案中，所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液还包含抗血栓因子。

在一些实施方案中，所述抗血栓因子包括抗凝血剂。

在一些实施方案中，所述抗凝血剂包括肝素或葡聚糖。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述肝素以约0.5IU/mL至约150IU/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述肝素以约6.7IU/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述葡聚糖是葡聚糖-40。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述葡聚糖以约1g/L至约55g/L的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述抗血栓剂包括抗坏血酸。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述抗坏血酸以约0.2μg/mL至约200μg/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，抗坏血酸的浓度以约5μg/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述抗血栓因子包括乙酰水杨酸。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述乙酰水杨酸以约0.2μg/mL至约200μg/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述乙酰水杨酸以约5μg/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述全血样品或包含所述全血样品的悬浮液还包含等于或大于群体平均生理水平的生长因子，所述生长因子选自：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、神经营养因子(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、中期因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5、趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGF、成纤维细胞生长因子(FGF)-l、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-1及其任何一种或多种组合。

在一些实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)-2。

在一些实施方案中，所述FGF-2是人FGF-2。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述FGF-2以约0.5ng/mL至约200ng/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述FGF-2的浓度以约10ng/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。

在一些实施方案中，所述VEGF是人VEGF。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述VEGF以约4ng/mL至约800ng/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，所述VEGF以约80ng/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述全血样品或包含所述全血样品的悬浮液还包含人血清白蛋白，其中在开始接触所述无细胞管状支架的表面时人血清白蛋白的浓度是约55g/L至约105g/L。

在一些实施方案中，所述生理溶液包含无机盐和缓冲液系统。

在一些实施方案中，所述缓冲液系统包括不依赖CO2的缓冲液系统

在一些实施方案中，所述不依赖CO2的缓冲液系统包括磷酸盐缓冲液系统。

在一些实施方案中，所述生理溶液表现出基本上类似于全血的渗透压，其优选为约270mOsm/kg H

在一些实施方案中，所述生理溶液还包含膨胀因子和/或营养素。

在一些实施方案中，所述膨胀因子包括血清白蛋白。

在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，人血清白蛋白VEGF的浓度以约55g/L至约105g/L的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。

在一些实施方案中，所述营养素包括糖、氨基酸或维生素中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述糖是D-葡萄糖。

在一些实施方案中，所述生理溶液包含生长因子、和抗血栓因子、营养素和膨胀因子；其中所述生长因子包括人FGF-2和人VEGF；其中所述抗血栓因子包括乙酰水杨酸、肝素或葡聚糖中的一种或多种；并且其中所述营养素包括D-葡萄糖。

在一些实施方案中，所述方法不需要在与用于制备所述个性化血管的全血接触之后使所述无细胞管状支架与细胞培养基接触。

在一些实施方案中，接触所述无细胞管状支架的表面持续多于3天、多于4天、多于5天、多于6天、多于7天、持续2至21天、持续3至21天、持续4至21天、持续5至21天、持续6至21天、持续7至21天或持续7-9天。

在一些实施方案中，其中使所述无细胞管状支架与包含所述全血样品的悬浮液接触，并且所述方法还包括在制备所述个性化血管期间监测多个环境参数和/或营养素的浓度。

在一些实施方案中，本公开文本的方法还包括调节所述多个环境参数。

在一些实施方案中，所述多个环境参数包括温度、pH、氧和/或CO

在一些实施方案中，使所述无细胞管状支架与包含所述全血样品的悬浮液接触，并且所述方法还包括监测所述悬浮液中营养素的浓度。

在一些实施方案中，本公开文本的方法还包括连续或定期地调节所述营养素的浓度。

在一些实施方案中，所述营养素是D-葡萄糖，并且其中连续或定期地调节D-葡萄糖浓度以将D-葡萄糖浓度维持在约3至约11mmol/L。

在一些实施方案中，通过测量从所述悬浮液收集的样品中的D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。

在一些实施方案中，每天测量一次所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。

在一些实施方案中，通过使用与所述悬浮液接触的传感器测量D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。

在一些实施方案中，使所述传感器在所述接触期间连续地与所述悬浮液接触。

在一些实施方案中，当所述悬浮液中D-葡萄糖的测量浓度低于4mmol/L时添加D-葡萄糖。

在一些实施方案中，添加D-葡萄糖以达到所述悬浮液中D-葡萄糖的最终浓度为10mmol/L。

在一些实施方案中，所述无细胞管状支架的表面是所述无细胞管状支架的内表面。

在一些实施方案中，全血包括外周血或脐带血。

在一些实施方案中，所述方法还包括监测人血清白蛋白的浓度，其中在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，人血清白蛋白的浓度是约55g/L至约105g/L。

在一些实施方案中，其中接触所述无细胞管状支架导致多个祖细胞增殖和/或分化为多个内皮细胞。

在一些实施方案中，所述多个内皮细胞表达VE-钙粘素、AcLDL、vWF和/或CD31。

在一些实施方案中，所述无细胞管状支架是脱细胞化血管。

在一些实施方案中，用所述悬浮液或全血连续地灌注所述无细胞管状支架。

在一些实施方案中，以每分钟约0.1mL至约50mL的速度灌注所述无细胞管状支架。

在一些实施方案中，以每分钟约2mL的速度灌注所述无细胞管状支架。

在一些实施方案中，用所述悬浮液或全血的闭合再循环灌注所述支架。

在一些实施方案中，所述连续接触是使用生物反应器进行的灌注。

在一些实施方案中，所述接触在体外进行。

在一些实施方案中，所述接触在约8℃至约40℃下进行。

在一些实施方案中，其中所述接触在约20℃至约25℃下进行。

在一些实施方案中，所述个性化血管是静脉。

在一些实施方案中，所述静脉是股静脉。

在一些实施方案中，本公开文本的方法还包括使用瓣膜能力测试来评估所述个性化血管的静脉瓣膜功能。

本公开文本的另一个方面涉及一种通过本文公开的制备个性化血管的任一种方法的方法制备的个性化血管。

在一些实施方案中，所述个性化血管已经通过手术植入受试者体内。

本公开文本的另一个方面涉及一种手术方法，所述方法包括将本文公开的个性化血管植入有需要的受试者体内。

本公开文本的另一个方面涉及一种用于在手术方法中使用的个性化血管，其中所述方法包括将本文公开的个性化血管植入有需要的受试者体内。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

本公开文本的另一个方面涉及一种用于制备个性化血管的生物反应器，所述生物反应器包括蠕动泵、包括采样端口的容器、第一连接器和第二连接器，其中所述第一连接器和所述第二连接器直接或间接地连接到所述容器，其中每个连接器连接到用于制备通过本文公开的方法制备的个性化血管的管状支架的端部，其中当所述第一连接器和所述第二连接器连接到管状支架的两端时，所述蠕动泵介导悬浮液或溶液在闭合回路中的循环。

在一些实施方案中，所述第一连接器和所述第二连接器是鲁尔连接器。

在一些实施方案中，所述采样端口是注射端口。

在一些实施方案中，所述生物反应器还包括注射端口。

在一些实施方案中，所述注射端口连接到D-葡萄糖的贮存器。

在一些实施方案中，所述第一容器通过管直接连接到所述容器，和/或所述第二容器通过管直接连接到所述容器。

在一些实施方案中，所述生物反应器包括一个或多个样品端口。

在一些实施方案中，所述生物反应器还包括一个或多个用于测量葡萄糖水平的传感器。

在一些实施方案中，所述生物反应器还包括pH调节模块。

在一些实施方案中，所述生物反应器还包括CO

本公开文本的另一个方面涉及一种制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与包含在全血中的组分接触，所述组分在用于接触所述表面之前被富集或选择。

在一些实施方案中，所述组分选自血小板、有核细胞、蛋白质、生长因子、信号传导因子、免疫球蛋白及其任何组合。

在一些实施方案中，所述组分通过离心、梯度离心来富集；或者通过选择性粘附、过滤或分选来选择。

在一些实施方案中，所述表面是所述无细胞管状支架的内表面。

附图说明

图1A-1B是假手术腔静脉(图1A)和移植的P-TEV(图1B)的血管造影片。金属夹由箭头指示，以定位吻合口。

图2A-2B是一系列图像，其示出了手术后3天、2周、17天和4-5周来自相邻切片的天然腔静脉(“天然”，图2A)和P-TEV移植物(“P-TEV”，图2B)的苏木精和伊红(H&E)染色和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。

图3A-3D描绘了示出手术后两周腔静脉细胞化的图像。图3A-3D是一系列免疫直方图，其示出了手术后两周腔静脉的DAPI染色和CD31免疫染色。图3A示出了吻合口近端的天然腔静脉。图3B-3D示出了P-TEV的近端(图3B)、中心(图3C)和远端(图3D)部分。箭头指示CD31阳性细胞。

图4A-4D描绘了示出手术后四周腔静脉细胞化的图像。图4A-4D是一系列免疫直方图，其示出了手术后4-5周腔静脉的DAPI染色和CD31免疫染色。图4A示出了吻合口近端的天然腔静脉。图4B-4D示出了P-TEV的近端(图4B)、中心(图4C)和远端(图4D)部分。箭头指示CD31阳性细胞。

图5A-5B描绘了示出手术后四周腔细胞形态的图像。图5A-5B是一系列40倍放大的图像，其示出了手术后4-5周天然腔静脉(图5A)和P-TEV移植物(图5B)的H&E染色。箭头指示天然组织中的内皮细胞以及P-TEV移植物中具有板状内皮细胞样形态的细胞。

具体实施方式

本公开文本尤其基于以下发现，即血液中的细胞和非细胞因子能够调节无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)以产生个性化血管。本公开文本尤其进一步提供了在体外过程中使无细胞管状支架与未稀释全血样品或包含在生理溶液中稀释的全血样品的悬浮液接触，产生具有改善的宿主相容性和降低的血栓形成易感性的个性化血管。

因此，本公开文本的一个方面涉及制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与来自需要个性化血管的受试者的未稀释全血样品接触，其中所述接触进行多于2天。

本公开文本的另一个方面涉及制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与包含来自需要个性化血管的受试者的全血样品的悬浮液接触，其中将所述全血样品在生理溶液中稀释。在一些实施方案中，所述无细胞管状支架的表面是所述无细胞管状支架的内表面。

如本文所用，术语“个性化血管”是指不是天然血管的能够携带血液通过组织或器官的管状结构。管状结构可以通过以下方式来制备：使来自供体的天然血管脱细胞化，从而获得无细胞支架，并使用来自另一个个体的细胞对支架进行修复/再细胞化。还可以通过在体外组装生物相容性材料(例如，生物打印或聚合物自组装)来获得无细胞支架。如本文所用，术语“修复(recondition、reconditioning和reconditioned)”用于描述由含有全血的再细胞化/修复(RC)溶液的组分对无细胞支架进行的修饰。如本文所用，术语“再细胞化(recellularize、recellularizing和recellularization)”在任一上下文中使用，并且不要求初始起始材料具有附着的细胞。个性化血管可以是个性化静脉、动脉或毛细血管。在某些实施方案中，个性化血管可用于替换天然血管。

如本文所公开的制备个性化血管的方法采用无细胞管状支架。如本文所用，术语“无细胞管状支架”是指基本上不含细胞的管状支架。可以通过使来自供体的天然血管脱细胞化来制备无细胞管状支架。供体可以是人或来自合适物种的动物。还可以通过在体外组装生物相容性材料(例如，生物打印或聚合物自组装)来获得无细胞支架。

可以通过本领域已知的任何方法(例如，天然血管的脱细胞化)来制备无细胞管状支架。天然血管可以是人类起源的，或者可以从合适的动物物种获得。管状结构可以通过组织培养方法在体外从生物相容性支架和细胞制备，并且可以作为制备无细胞支架的起始材料。在某些实施方案中，通过本文公开的脱细胞化方法获得无细胞管状支架。在某些实施方案中，本文公开的制备个性化血管的方法还包括使天然血管脱细胞化，从而获得无细胞管状支架。

如本文所用，术语“脱细胞化(decellularize、decellularized、decellularizing或decellularization)”是指从血管(包括血管中的任何静脉瓣膜)去除细胞的过程。有效的脱细胞化取决于诸如组织密度和组构、最终产品所需的几何和生物学特性以及目标临床应用等因素。本领域技术人员可以优化血管的脱细胞化同时保持ECM完整性和生物活性，例如通过在处理期间选择特定的药剂和技术。

成功的脱细胞化被定义为使用标准的组织学染色程序而在组织学切片中不存在细胞，如内皮细胞、平滑肌细胞和细胞核。虽然大多数细胞去除剂和方法可能改变ECM组成并导致某种程度的超微结构破坏，但希望将这些不良效果最小化。脱细胞化方法是本领域已知的，例如在美国专利公开号2017/0071738中。

因此，在某些实施方案中，脱细胞化过程去除所有细胞核，如通过本领域已知的方法(例如，DAPI染色、DNA定量)所检测。在某些实施方案中，脱细胞化过程减少或去除HLA I类抗原和HLA II类抗原，如通过本领域已知的方法(例如，用于HLA I类和II类抗原的免疫组织化学测定)所检测。

在某些实施方案中，ECM组分基本上保留在脱细胞化过程中。在脱细胞化过程期间和之后，可以目视和/或组织学检查ECM的形态和构造，以验证脱细胞化过程没有影响ECM支架的三维结构和生物活性。通过染色(例如，H&E染色、Masson三色染色或Verhoeff-VanGieson染色)进行组织学分析可用于可视化脱细胞化的血管构造和ECM组分(如胶原I、胶原IV、层粘连蛋白和纤连蛋白)的保存。本领域已知的其他方法可以用于确定ECM组分(如糖胺聚糖和胶原)的保存。

一种或多种细胞破坏溶液可以用于使血管脱细胞化。细胞破坏溶液通常包括至少一种洗涤剂，如SDS、PEG或Triton X。特别优选的洗涤剂是Triton X(例如，Triton X-100)。细胞破坏溶液可以包含有机溶剂，例如磷酸三正丁酯(TNBP)。细胞破坏溶液还可以具有比血液低得多的渗透压，从而促进细胞裂解。可替代地，细胞破坏溶液可以是等张的。细胞破坏溶液还可以包括酶，如但不限于一种或多种核酸酶(例如，DNA酶或RNA酶)和蛋白酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶)。包含DNA酶I的细胞破坏溶液还可以包括氯化钙和氯化镁(A12858，Life Technologies)以激活酶。在某些实施方案中，细胞破坏溶液还包含一种或多种蛋白酶抑制剂(例如，苯甲基磺酰氟(PMSF)、胶原酶抑制剂)。在某些实施方案中，细胞破坏溶液还可以包括抗生素(例如，青霉素、链霉素或两性霉素)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

在某些实施方案中，灌注方法可以用于用细胞破坏溶液处理血管(例如，带瓣膜的静脉)，以使血管脱细胞化。交替灌注方向(例如，顺行和逆行)可以帮助有效地使带瓣膜的静脉脱细胞化。如本文所述的脱细胞化基本上从内向外去除带瓣膜的静脉内衬的细胞，导致对ECM的损伤非常小。根据血管的大小和重量以及细胞破坏溶液中的一种或多种具体洗涤剂和一种或多种洗涤剂的浓度，通常在4与48小时之间或者在8与24小时之间用细胞破坏培养基灌注带瓣膜的静脉。包括洗涤，可以将血管灌注对于Triton X至多约48小时或24小时，对于TNBP约8小时，对于DNA酶约16小时，总洗涤约1小时，并且最终洗涤约48小时。在一些实施方案中，将前述灌注程序重复1-14个循环；1-5个循环；2-4个循环；1-3个循环；或2个循环；或3个循环；或4个循环；或5个循环；或6个循环。在某些实施方案中，通过用前述试剂连续灌注100小时、110小时、120小时、130小时、140小时、150小时、160小时、170小时、180小时、190小时、200小时、210小时、220小时、230小时、240小时、250小时、260小时、270小时、280小时、290小时、300小时、310小时、320小时、330小时、340小时、350小时或更久来进行脱细胞化。灌注通常根据生理条件(包括脉动流、速率和压力)进行调节。在一些实施方案中，如本文所述的灌注脱细胞化可以与例如美国专利号6,753,181和6,376,244中所述的浸没脱细胞化相比较。在某些实施方案中，根据如下文实施例1中提供的使血管脱细胞化的方法进行脱细胞化。

在某些实施方案中，所述无细胞管状支架是合成的和/或组装的支架，例如通过在体外组装生物相容性材料获得的支架。制备这种支架的方法(例如，生物打印或聚合物自组装)是本领域已知的，并且非限制性例子在美国专利公开号2017/0304503和2016/0354194中提供。

因此，在某些实施方案中，本文公开的方法还包括使用生物打印聚合物支架制备生物打印管状血管支架的步骤。在聚合物(天然或合成)上制备生物打印血管支架，所述聚合物可以呈凝胶形式、海绵形式、泡沫形式、贴片形式或半液体/流体形式。在某些实施方案中，用全血或在溶液中稀释的全血(例如，包括全血的悬浮液)灌注生物打印支架。

在某些实施方案中，ECM组分可以以粉末形式添加到聚合物中。在本公开文本中，用于制备本公开文本的组合物的粉末通过以下方式来制备：用化学品处理组织，冷冻干燥经化学品处理的组织，并使冷冻干燥的组织均质化。在某些实施方案中，所述粉末是丝状的。

在某些实施方案中，生物打印聚合物支架可以包括明胶和纤维蛋白。明胶和纤维蛋白可以形成模拟天然ECM的互穿的聚合物网络，并且可以优化用于细胞附着、生物打印、透明度和生物相容性。

在某些实施方案中，ECM的组分从或可以从哺乳动物(例如，猪、奶牛、羔羊、山羊、绵羊、黑猩猩、猴子、人或其他灵长类动物)的组织中分离和/或纯化，或者使用涉及哺乳动物(例如，猪、奶牛、羔羊、山羊、绵羊、黑猩猩、猴子、人或其他灵长类动物)的编码相应的ECM组分(例如，胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、抗微生物剂、化学引诱剂、细胞因子和生长因子)的基因或基因片段的重组DNA技术产生，并在合适的表达系统(原核或真核(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞))中表达，并且随后通过本领域合适的方法分离和/或纯化。在某些实施方案中，可以将ECM组分中的一种或多种添加到聚合物支架中以制备生物打印聚合物支架，然后用全血或在溶液中稀释的全血(例如，包括全血的悬浮液)灌注所述支架，用于制备个性化血管。

在一些实施方案中，所述管状支架可以通过诸如不同材料的3D打印、自组装、化学或生化制造等方法来制备。在一些实施方案中，所述管状支架由生物和非生物起始材料制造。

在一些实施方案中，存在于所述全血样品中的细胞群填充所述支架。患者全血可以未稀释或用生理灌注液(如实施例4-5所述)或其他器官防腐液(例如像Perfadex

在某些实施方案中，全血包括外周血(例如，外周静脉血)。在某些实施方案中，全血是外周血(例如，外周静脉血)。在某些实施方案中，全血包括脐带血。在某些实施方案中，全血是脐带血。

术语“患者”和“受试者”在本公开文本中可互换使用，并且是指人或非人动物(例如，哺乳动物)。非限制性例子包括人、牛、大鼠、小鼠、狗、猫、猴子、山羊、绵羊、奶牛和鹿。在一些实施方案中，所述受试者是人。

未稀释的患者全血

本公开文本的一个方面涉及制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与来自需要个性化血管的受试者的未稀释全血样品接触，其中所述接触进行多于2天。

在某些实施方案中，存在于血液中的细胞和/或祖细胞填充所述支架。在一些实施方案中，存在于所述全血样品中的细胞群填充所述支架。术语“全血”是指从身体、器官或组织中抽取的血液，从其中没有去除任何组分。

技术人员将理解，在全血采集期间，可以在从受试者抽取血液样品期间或之后立即添加少量抗血栓剂。在抗血栓剂的体积不超过与抗血栓剂混合的血液体积的约5％或至少不超过10％的情况下，由此制备的全血被认为是未稀释的。类似地，在某些实施方案中，全血可以补充有一种或多种其他试剂(例如，抗血栓剂、营养素、稀释剂、防腐剂和不依赖CO

在某些实施方案中，所述方法不需要使所述无细胞管状支架与细胞培养基接触以用于制备个性化血管。在某些实施方案中，在采集全血后约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约12小时、约24小时、约36小时、约2天、约3天或约1周内，将全血用于本文公开的方法。在某些实施方案中，在用于所述方法之前，将全血储存在约2℃至约8℃下。

稀释的患者全血

在另一个方面，本发明涉及使所述无细胞管状支架与稀释的患者全血接触。

如果用任何类型的溶液、缓冲液或含水液体将从患者抽取的全血稀释至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％，则患者全血被认为是稀释的。在一些实施方案中，将所述全血样品1:1稀释，即将1体积的全血与1体积的稀释剂混合。在一些实施方案中，可以将所述全血样品1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10稀释。

在某些实施方案中，将全血在生理溶液中稀释。在某些实施方案中，所述稀释剂是含有如实施例x-y中所述的另外的膨胀和其他因子的生理溶液或者其他器官防腐液，例如像Perfadex

在一些实施方案中，考虑用于调节所述生理溶液的渗透压的膨胀因子包括血清白蛋白、球蛋白或纤维蛋白原。在一些实施方案中，所述膨胀因子包括血清白蛋白。在一些实施方案中，明胶可以用于调节所述溶液的膨胀压。

生理溶液还可以包含一种或多种营养素(例如，氨基酸、单糖(例如，D-葡萄糖)、维生素、无机离子、微量元素和/或盐)和/或生长因子(例如，以生理浓度)，以支持细胞的存活、增殖和/或分化。在一些实施方案中，所述营养素包括糖、氨基酸或维生素中的一种或多种。在一些实施方案中，所述糖是D-葡萄糖。

在一些实施方案中，所述生理溶液包含无机盐和缓冲液系统。在一些实施方案中，所述缓冲液系统包括不依赖CO

添加到全血或稀释全血样品中的其他试剂

在一些实施方案中，在使所述无细胞管状支架与全血接触之前或期间，将本文所述的其他试剂添加到全血样品或全血的悬浮液或稀释全血样品中。如上所解释，只要本文所述因子的添加没有将全血稀释多于5％或至少不多于10％，则所述全血样品仍被认为是未稀释的。如果用本文所述的因子将全血样品稀释多于15％，则所述全血样品是稀释的。

在某些实施方案中，具有全血或稀释全血或未稀释全血的悬浮液还包含抗血栓剂。在某些实施方案中，抗血栓剂在接触所述无细胞管状支架之前被引入或已经被引入全血中。在某些实施方案中，所述抗血栓剂包括抗凝血剂。在某些实施方案中，所述抗凝血剂包括肝素、葡聚糖。在某些实施方案中，所述抗血栓剂包括血小板抑制剂，如抗坏血酸。

在某些实施方案中，所述抗凝血剂包括肝素。肝素用于防止凝血的有效浓度是本领域已知的。在一些实施方案中，在开始接触所述无细胞管状支架的表面时，肝素以约0.5IU/mL至约150IU/mL的浓度存在于所述未稀释全血样品或包含所述全血样品的悬浮液中。在某些实施方案中，在所述接触开始时肝素的浓度是约5至约50IU/ml。在某些实施方案中，在所述接触开始时肝素的浓度是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15或约20IU/mL。在某些实施方案中，在所述接触开始时肝素的浓度是约6.7IU/ml。在一些实施方案中，用在PBS溶液中的50IU/ml肝素预冲洗具有管道和静脉的生物反应器(例如1小时)，然后清空并填充血液溶液；并且在各种实施方案中，通过溶液的交换获得1:10稀释度，从而在血液溶液中产生约5IU/ml肝素。在某些实施方案中，使用含有17IU肝素/mL全血的真空采血管(vacutainer)，从而在血液溶液中产生约8.5IU肝素。

在某些实施方案中，所述抗凝血剂包括葡聚糖。可以使用任何平均分子量的葡聚糖。在某些实施方案中，葡聚糖具有约40kD的平均分子量，即葡聚糖是葡聚糖-40。在某些实施方案中，葡聚糖具有约60kD的平均分子量，即葡聚糖是葡聚糖-60。在某些实施方案中，葡聚糖具有约70kD的平均分子量，即葡聚糖是葡聚糖-70。在某些实施方案中，在所述接触开始时葡聚糖的浓度是约1至约55g/L。在某些实施方案中，在所述接触开始时葡聚糖的浓度是约1、约2、约3、约4、约4.5、约5、约10或约20g/L。在某些实施方案中，在所述接触开始时葡聚糖的浓度是约5g/L。

在某些实施方案中，所述抗血栓剂包括抗坏血酸。在某些实施方案中，在所述接触开始时抗坏血酸的浓度是约0.2至约200μg/ml。在某些实施方案中，在所述接触开始时抗坏血酸的浓度是约1、约5、约10、约20、约50或约100μg/mL。在某些实施方案中，在所述接触开始时抗坏血酸的浓度是约5μg/mL。

两种或更多种抗血栓剂(例如，抗凝血剂)可以在本发明中组合。在某些实施方案中，所述悬浮液包含选自肝素、葡聚糖(例如，葡聚糖-40)和抗坏血酸的试剂中的两种或更多种。在某些实施方案中，所述悬浮液包含肝素、葡聚糖(例如，葡聚糖-40)和抗坏血酸。技术人员将理解，当两种或更多种抗血栓剂组合时，它们中的至少一种可以以比其单独使用时的浓度更低的浓度使用。在某些实施方案中，所述悬浮液包含约6.7IU/mL肝素、约6.7mg/mL葡聚糖-40和约4.5μg/mL抗坏血酸。在某些实施方案中，所述悬浮液包含至少约6.7IU/mL肝素、约6.7mg/mL葡聚糖-40和约4.5μg/mL抗坏血酸。

在某些实施方案中，具有全血或稀释全血或未稀释全血的悬浮液还包含选自以下的生长因子：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、神经营养因子(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、中期因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5、趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGF、成纤维细胞生长因子(FGF)-l、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-1及其任何一种或多种组合。在某些实施方案中，所述生长因子是人生长因子。在某些实施方案中，所述生长因子的浓度等于所述生长因子的群体平均生理水平。在某些实施方案中，所述生长因子的浓度大于所述生长因子的群体平均生理水平。在某些实施方案中，所述生长因子作为重组蛋白补充。

在某些实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)-2。在某些实施方案中，所述FGF-2是人FGF-2。在某些实施方案中，在所述接触开始时FGF-2的浓度是约0.5至约200ng/ml。在某些实施方案中，在所述接触开始时FGF-2的浓度是约10ng/ml。在某些实施方案中，在所述接触之前以约0.5至约200ng/ml(例如，约10ng/ml)的浓度补充FGF-2。在某些实施方案中，所述FGF-2是重组人FGF-2(rhFGF-2)。在某些实施方案中，在所述接触开始时rhFGF-2的浓度是约0.5至约200ng/ml(例如，约10ng/ml)。

在某些实施方案中，所述生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。在某些实施方案中，所述VEGF是人VEGF。在某些实施方案中，在所述接触开始时VEGF的浓度是约4至约800ng/mL。在某些实施方案中，在所述接触开始时VEGF的浓度是约80ng/ml。在某些实施方案中，在所述接触之前以约4至约800ng/mL(例如，约80ng/mL)的浓度补充VEGF。在某些实施方案中，所述VEGF是重组人VEGF(rhVEGF)。在某些实施方案中，在所述接触开始时rhVEGF的浓度是约4至约800ng/mL(例如，约80ng/mL)。

在某些实施方案中，具有全血或稀释全血或未稀释全血的悬浮液还包含乙酰水杨酸。在某些实施方案中，在所述接触开始时乙酰水杨酸的浓度在0.2μg/mL与200μg/mL；或0.5μg/mL与100μg/mL；或0.1μg/mL与50μg/mL；或1μg/mL与25μg/mL；或1μg/mL与10μg/mL；或2μg/mL与10μg/mL；或3μg/mL与8μg/mL；或4μg/mL与6μg/mL之间。在某些实施方案中，在所述接触开始时乙酰水杨酸的浓度是约0.5μg/mL；或约1μg/mL；或约2μg/mL；或约3μg/mL；或约4μg/mL；或约5μg/mL；或约6μg/mL；或约7μg/mL；或约8μg/mL；或约8μg/mL；或约8μg/mL；或约9μg/mL；或约10μg/mL；或约25μg/mL或约50μg/mL；或约100μg/mL；或约200μg/mL。在某些实施方案中，在所述接触开始时乙酰水杨酸的浓度是约5μg/mL。在某些实施方案中，在所述接触之前以在4ng/mL与800ng/mL之间；或在10ng/mL与400ng/mL之间；或在20ng/mL与200ng/mL之间；或在40ng/mL与200ng/mL之间；或在60ng/mL与100ng/mL之间；或在70ng/mL与90ng/mL之间的浓度补充VEGF。

在某些实施方案中，在所述接触开始时人血清白蛋白(HSA)的浓度在50mg/mL与150mg/mL之间；或在50mg/mL与125mg/mL之间；或在50mg/mL与100mg/mL之间；或在60mg/mL与90mg/mL之间；或在60mg/mL与80mg/mL之间；或在65mg/mL与75mg/mL之间。在某些实施方案中，在所述接触开始时人血清白蛋白的浓度是约55至约105mg/m，其是全血在溶液中稀释2倍时的量。在某些实施方案中，在所述接触开始时人血清白蛋白的浓度是约45至约69mg/mL。在某些实施方案中，溶液中的HSA浓度是约70mg/ml，并且人血液中的HSA浓度是约45mg/mL，并且将全血在所述溶液中稀释，包含全血的悬浮液中的HSA是55-60mg/mL(即，全血在所述溶液中稀释2倍)。在某些实施方案中，在将全血稀释在包含2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍稀释的HSA的溶液中之后，人血清白蛋白浓度。

在某些实施方案中，具有全血或稀释全血或未稀释全血的悬浮液包含一种或多种营养素和/或生长因子(例如，以生理浓度)，以支持细胞的存活、增殖和/或分化。在某些实施方案中，所述营养素选自单糖(例如，D-葡萄糖)、氨基酸(天然氨基酸)、维生素、无机离子、微量元素、盐及其任何组合。在某些实施方案中，作为营养素包含的氨基酸可以是以下中的一种或多种：L-精氨酸HCl、L-胱氨酸2HCl、L-胱氨酸HCl H

在一些实施方案中，具有全血或稀释全血或未稀释全血的悬浮液包含约0.7％至约1.5％的盐。在一些实施方案中，所述生理溶液包含约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1.0％的盐。

在某些实施方案中，所述悬浮液包含不依赖CO

在一些实施方案中，所述不依赖CO

在某些实施方案中，所述全血悬浮液的非细胞因子促进所述无细胞管状支架的细胞化，例如通过促进细胞存活、增殖和/或分化。在某些实施方案中，所述非细胞因子是存在于全血中的非细胞组分。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是在接触期间从全血(例如，从全血中的细胞)产生的因子。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进接枝时血管的宿主相容性、细胞化或整合。本发明的非细胞因子的非限制性例子在下表中提供：

以上公开的任一种试剂(例如，抗血栓剂、营养素、稀释剂和不依赖CO

在某些实施方案中，连续或定期地监测和调节所述悬浮液中营养素的浓度。在某些实施方案中，所述营养素选自单糖(例如，D-葡萄糖)、氨基酸(例如，天然氨基酸)、维生素、无机离子、微量元素和盐。在具体的实施方案中，在接触期间监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度，并且将D-葡萄糖添加到所述悬浮液中以将D-葡萄糖浓度维持在约3至约11mmol/L。

在某些实施方案中，通过测量从所述悬浮液收集的样品中的D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在某些实施方案中，定期地(如每天两次、每天一次或每两天一次)测量所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在某些实施方案中，通过使用与所述悬浮液接触的传感器测量D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在某些实施方案中，使所述传感器在接触期间连续地与所述悬浮液接触。在某些实施方案中，当所述悬浮液中D-葡萄糖的测量浓度低于4mmol/L时添加D-葡萄糖。在某些实施方案中，添加D-葡萄糖以达到所述悬浮液中D-葡萄糖的最终浓度为约7mmol/L；约8mmol/L；约9mmol/l；或约10mmol/L。在一些实施方案中，通过添加1.1M D-葡萄糖储备溶液来调节葡萄糖水平。在某些实施方案中，每mL血液溶液添加0.91μL储备溶液(以1.1M)导致葡萄糖水平增加1mmol/L。通过传感器进行连续监测(任选地与在悬浮液中自动添加D-葡萄糖组合)允许将D-葡萄糖浓度维持在较窄范围内。因此，在某些实施方案中，将D-葡萄糖浓度维持在约5至约8mmol/L。

非细胞血液因子

在一些实施方案中，所述全血样品包含一种或多种非细胞因子，其中全血的一种或多种非细胞因子填充所述支架，并且其中所述一种或多种非细胞因子促进所述无细胞管状支架的细胞化和所述血管在接枝时的宿主相容性。如本文所用，术语“非细胞因子”是指全血悬浮液中不包含完整真核细胞的组分。非细胞因子可以是任何类型的分子，包括但不限于蛋白质、核酸、糖、脂类、小分子、金属离子、或其缀合物或组合。

例如，所述非细胞因子可以是生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子选自：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、神经营养因子(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、中期因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5、趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGF、成纤维细胞生长因子(FGF)-l、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-1及其任何一种或多种组合。

在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是细胞片段(例如血小板、细胞部分)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是蛋白质(例如，细胞因子、趋化因子、生长因子、抗体、抗体片段、补体系统的蛋白质或酶)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是核酸(例如，循环DNA、循环RNA或循环miRNA)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是糖(例如，单糖或双糖)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是脂质(例如，脂肪酸、甘油三酯或胆固醇)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是小分子。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是金属离子。

在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是以上任一种分子的修饰形式或代谢物。例如，在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是蛋白质的区段(例如，肽或多肽)。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是具有一个或多个修饰(例如，甲基化、5’加帽)的核酸。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是糖的醛糖酸或糖醇。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是甾醇。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子是本文公开的任一种分子的缀合物，其中所述分子是共价或非共价缀合的。

在某些实施方案中，所述生长因子的浓度等于所述生长因子的群体平均生理水平。在某些实施方案中，所述生长因子的浓度大于所述生长因子的群体平均生理水平。在某些实施方案中，所述生长因子作为分离的、纯化的和/或合成的分子补充。

所述非细胞血液因子可以在体外或植入后以各种方式促成所述无细胞管状支架的修复/再细胞化。例如，在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进细胞与所述支架的附着或粘附。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进祖细胞的增殖。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进祖细胞分化为能够填充所述支架的细胞。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子抑制所述细胞和/或祖细胞的凋亡和/或坏死。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进所述支架上存在的一种或多种同种异体蛋白的去除或掩蔽。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进一种或多种自体蛋白沉积在所述支架上。在某些实施方案中，所述非细胞血液因子促进所述支架的调节以抑制宿主排斥反应。

本公开文本提供了制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)的表面(例如，内表面)与包含全血的悬浮液接触多于48小时，从而允许血液中存在的细胞填充所述支架。在一些实施方案中，所述无细胞管状支架的表面是所述无细胞管状支架的内表面。

如本文所用，术语“接触(contact、contacting或contacted)”意指静态孵育、灌注、引入、注射或培养。灌注可以是脉冲灌注、间隔灌注、交替方向和不灌注。在一些实施方案中，用所述悬浮液或全血连续地灌注所述无细胞管状支架。

在某些实施方案中，所述接触持续多于2天。如本文所用，术语“多于2天”是指长于48小时和长于约48小时的持续时间。术语“天(day和days)”是指一个或多个24小时周期。在某些实施方案中，所述接触持续至少3、至少4、至少5、至少6或至少7天。在某些实施方案中，所述接触持续长达9天、长达10天、长达11天、长达12天、长达13天、长达14天、长达21天或长达31天。在某些实施方案中，所述接触持续长达1个月。在一些实施方案中，所述接触持续约1至31天、持续2至21天、持续2至14天、持续2至9天、持续2至7天、持续2至5天、持续5至7天或持续7至9天。在某些实施方案中，所述接触持续约7至约9天。在一些实施方案中，接触所述无细胞管状支架的表面持续2至21天、持续3至21天、持续4至21天、持续5至21天、持续6至21天或持续7至21天。在某些实施方案中，所述接触持续约2天、持续约3天、持续约4天、持续约5天、持续约6天、持续约7天、持续约8天、持续约9天、持续约10天、持续约11天、持续约12天、持续约13天、持续约14天、持续约15天、持续约16天、持续约17天、持续约18天、持续约19天、持续约20天或持续约21天。

可以使所述无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)以本领域已知的任何方式与未稀释全血样品或含有稀释全血的悬浮液接触。例如，在某些实施方案中，所述支架是松散的并悬浮在所述悬浮液中，任选地其中振荡(例如，旋转)所述悬浮液，以定期或连续地再混合组分。在灌注期间所述管状支架的旋转可以是连续的/间歇的、交替的或间隔的。

在某些实施方案中，使所述支架的内表面与所述悬浮液接触。在某些实施方案中，用所述悬浮液灌注所述支架。在某些实施方案中，用所述悬浮液的闭合再循环灌注所述支架。在某些实施方案中，所述连续接触是使用生物反应器进行的灌注。在某些实施方案中，使所述支架的外表面也与所述悬浮液接触。在其他实施方案中，不使所述支架的外表面与所述悬浮液接触。在某些实施方案中，所述接触在体外进行。

所述灌注可以以任何模式进行。例如，在某些实施方案中，用所述悬浮液连续地灌注所述支架。在某些实施方案中，用所述悬浮液间歇地灌注所述支架(例如，每隔4分钟灌注1分钟)。在某些实施方案中，所述灌注在单个方向上进行。在某些实施方案中，所述单个方向是顺行流动的方向，例如所述支架中一种或多种瓣膜结构所允许的方向。在某些实施方案中，所述灌注在交替方向上进行(例如，每5分钟改变方向)。所述灌注的速度可以由技术人员根据许多因素来确定，所述因素是如管状支架的直径、支架的机械强度、细胞沉淀所用的时间以及悬浮液的粘度。在某些实施方案中，以每分钟约0.1至约50mL的速度灌注所述支架。在某些实施方案中，以每分钟约2ml的速度灌注所述支架。取决于所述支架的取向，在所述灌注期间的旋转(包括间隔)可能是有利的，使得所述支架的内表面被均匀地填充。在某些实施方案中，使所述支架连续地旋转。在某些实施方案中，使所述支架间歇地旋转(例如，每5分钟旋转30°)。旋转的方向可以是恒定的或交替的。旋转的优点可能基本上不是在所述支架垂直固定的地方。因此，在某些实施方案中，所述支架不旋转。

在具体的实施方案中，用所述悬浮液连续地灌注所述支架(例如，所述支架的腔)。在某些实施方案中，以每分钟约0.1至约50mL(例如，每分钟约2mL)的速度灌注所述支架。在某些实施方案中，用所述悬浮液的闭合再循环灌注所述支架。在某些实施方案中，所述连续接触是使用生物反应器进行的灌注。

在另一个方面，本公开文本提供了制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)的表面与包含全血的悬浮液接触，其中连续或定期地监测和调节多个环境参数(例如，温度、pH、氧含量和/或CO

在某些实施方案中，所述接触在约8℃至约40℃下进行。在某些实施方案中，所述接触在约20℃至约25℃下进行。在某些实施方案中，所述接触在约37℃下进行。在某些实施方案中，所述接触在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃下进行。

在某些实施方案中，所述接触在约pH 7.2至约pH 7.5下进行。在某些实施方案中，所述接触在约pH 7.4下进行。

在某些实施方案中，所述接触在约30mmHg至约100mmHg的氧分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约30mmHg至约40mmHg的氧分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约80mmHg至100mmHg的氧分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约160mmHg的氧分压下进行。

在某些实施方案中，所述接触在约38mmHg至约76mmHg的二氧化碳分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约38mmHg的二氧化碳分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约76mmHg的二氧化碳分压下进行。在某些实施方案中，所述接触在约40mmHg至约50mmHg的二氧化碳分压下进行。

在某些实施方案中，在接触期间连续或定期地监测和调节所述环境参数(例如，温度、pH、氧含量和/或CO

在另一个方面，本公开文本提供了制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)的表面与包含全血的悬浮液接触，其中连续或定期地监测和调节所述悬浮液中营养素的浓度。

在另一个方面，本公开文本提供了制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)的表面与包含全血的悬浮液接触，其中在接触期间监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度，并且将D-葡萄糖添加到所述悬浮液中以将D-葡萄糖浓度维持在约3至约11mmol/L。

在一些实施方案中，通过测量从所述悬浮液收集的样品中的D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在一些实施方案中，每天测量一次所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在一些实施方案中，通过使用与所述悬浮液接触的传感器测量D-葡萄糖浓度来监测所述悬浮液中的D-葡萄糖浓度。在一些实施方案中，使所述传感器在所述接触期间连续地与所述悬浮液接触。

在一些实施方案中，当所述悬浮液中D-葡萄糖的测量浓度低于4mmol/L时添加D-葡萄糖。在一些实施方案中，添加D-葡萄糖以达到所述悬浮液中D-葡萄糖的最终浓度为10mmol/L。

在某些实施方案中，本公开文本提供了制备个性化血管的方法，其中富集和选择全血的一种或多种组分，然后将其添加到无细胞管状支架的表面以与所述支架的内表面接触。例如，可以将选自血小板、有核细胞、蛋白质、生长因子、信号传导因子、免疫球蛋白及其任何一种或多种组合的组分添加到无细胞管状支架的内表面。可以通过例如离心、梯度离心、通过选择性粘附分离、过滤或分选(例如，FACS、MACS)来富集或选择所述组分。

术语“富集和选择”是指物质和/或实体已经从最初产生时(无论是在自然界中还是在实验环境中)与其混合的至少一种组分中分离出来。在某些实施方案中，经分离的物质和/或实体从最初产生时与其混合的组分的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％中分离出来。在某些实施方案中，纯化经富集和选择的物质和/或实体。在某些实施方案中，经富集、经选择和/或经纯化的物质和/或实体基本上不含其他组分。如本文所用，分离或纯度百分比的计算不包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。

本文公开的方法允许细胞和/或祖细胞填充所述无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架)的表面(例如，内表面)，从而产生个性化血管。在某些实施方案中，所述细胞包括内皮细胞。在某些实施方案中，所述细胞包括平滑肌细胞。在某些实施方案中，所述祖细胞包括内皮祖细胞。在某些实施方案中，所述祖细胞包括平滑肌祖细胞。技术人员将理解，所述细胞和/或祖细胞可以以一种或多种方式填充所述支架。所述支架的填充可以在植入之前在体外发生，或者在植入之后在体内发生。在某些实施方案中，所述细胞附着到所述支架。在某些实施方案中，所述祖细胞增殖和/或分化以产生子代细胞，并且所述子代细胞附着到所述支架。

在某些实施方案中，所述接触导致所述祖细胞增殖和/或分化为内皮细胞。在某些实施方案中，所述内皮细胞表达VE-钙粘素、AcLDL、vWF和/或CD31。经修复/经再细胞化的支架的特征可以在于内皮细胞和平滑肌细胞的存在。将普通技术人员熟知的免疫组织化学和免疫荧光技术用于检测内皮细胞和平滑肌细胞的存在或不存在。为了可视化内皮细胞的存在，可以将CD31的抗体(1:200)(Abcam，德国)和vWF的抗体(1:100)(Santa Cruz，德国)用于染色经修复/经再细胞化的支架。为了可视化平滑肌细胞，可以将针对平滑肌肌动蛋白的抗体(1:50)(Abcam，德国)用于染色经修复/经再细胞化的瓣膜。通过免疫组织化学或免疫荧光检测经再细胞化的支架中这些标记物阳性细胞的存在。还可以通过经修复/经再细胞化的支架内衬的梭形肌细胞的形态来鉴定平滑肌细胞。

通过本文公开的方法制备的个性化血管可用于植入受试者(例如，人)体内。在某些实施方案中，所述个性化血管可用作静脉。在某些实施方案中，所述方法还包括评估所述个性化血管的静脉瓣膜功能(例如，使用体外瓣膜能力测试)的步骤。示例性体外瓣膜能力测试在美国专利公开号2017/0071738中提供。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之前测试静脉瓣膜功能。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之后测试静脉瓣膜功能。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之前和之后都测试静脉瓣膜功能。

功能性个性化血管没有渗漏。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括评估渗漏的步骤。本领域已知用于测试渗漏的各种方法。例如，在某些实施方案中，用溶液(例如，生理缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS))冲洗所述个性化血管，优选以稳定的速率冲洗，并且观察所述个性化血管的表面由渗漏或孔导致的溶液积聚。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之前测试渗漏。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之后测试渗漏。在某些实施方案中，在修复/再细胞化之前和之后都测试渗漏。

在另一个方面，本公开文本提供了通过本文公开的任一种方法制备的个性化血管。在某些实施方案中，所述个性化血管包括无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管、任选经MMP处理的，或生物打印管状支架)，所述无细胞管状支架包括用人细胞(例如，内皮细胞和/或平滑肌细胞)细胞化的非细胞因子，如哺乳动物血管或其功能部分的ECM组分/组合物。

本公开文本的个性化血管还包含细胞，如但不限于全血来源的干细胞或祖细胞，如内皮干细胞、内皮祖细胞、平滑肌祖细胞、全血、外周血以及可以从全血分离的任何细胞群。祖细胞被定义为致力于分化为一种类型细胞的细胞。例如，内皮祖细胞意指被编程分化为内皮细胞的细胞；平滑肌祖细胞意指被编程分化为平滑肌细胞的细胞。全血或外周血中的祖细胞包括未定型和/或定型细胞群，如多能细胞或全能细胞。

在某些实施方案中，所述个性化血管的表面基本上被细胞覆盖。在某些实施方案中，所述个性化血管的内表面基本上被内皮细胞覆盖。在某些实施方案中，所述内皮细胞表达VE-钙粘素、AcLDL、vWF和/或CD31。

技术人员将理解，血液中的细胞和/或祖细胞不需要填充所述支架的内表面到经修复/经再细胞化的支架与天然血管不可区分的程度。如本文所公开的，再细胞化可以在体外以及植入后在体内发生，并且在体外部分再细胞化的支架可以在体内进一步再细胞化以重新获得天然血管的形态和/或功能。尽管如此，密度低于天然血管的内皮细胞也可以通过采用更分散的形态来基本上覆盖所述支架的内表面，从而附着到每个细胞的更大表面积。

通过本文公开的方法制备的个性化血管可用于植入受试者(例如，人)体内。在某些实施方案中，所述个性化血管可用作静脉。

在某些实施方案中，所述无细胞管状支架源自静脉(例如，通过使天然静脉脱细胞化而制备)。在某些实施方案中，所述静脉在下肢中。下肢静脉系统包括深静脉，其位于肌筋膜下方并引流下肢肌肉；浅静脉，其在深筋膜上方并引流皮肤微循环；以及穿静脉，其穿透肌筋膜并连接浅静脉和深静脉。交通静脉连接同一隔室内的静脉。

在某些实施方案中，所述静脉是深静脉。可用于本发明方法的深静脉包括但不限于连接腘静脉至股总静脉的股浅静脉以及小腿的深静脉(例如，胫骨前静脉、胫骨后静脉和腓骨静脉)。在某些实施方案中，所述静脉是浅静脉。可用于本发明方法的深静脉包括但不限于大隐静脉、前和后副大隐静脉、小隐静脉(SSV)和间隐静脉(又称为Giacomini静脉)。

大多数静脉都具有静脉瓣膜以保证血液的单向流动。例如，下肢的浅静脉、深静脉和大多数穿静脉都含有二尖瓣。因此，在某些实施方案中，所述无细胞管状支架包含瓣膜结构，并且所述瓣膜结构被修复/再细胞化以在所述个性化血管中提供功能性静脉瓣膜。瓣膜结构可以源自天然静脉瓣膜或者源自支架合成和/或组装。评估静脉瓣膜功能的方法是本领域已知的，包括但不限于体外瓣膜能力测试。在某些实施方案中，所述方法还包括评估所述无细胞管状支架的静脉瓣膜功能(例如，使用体外瓣膜能力测试)。

在某些实施方案中，在所述支架内表面的其余部分的修复/再细胞化期间，所述无细胞管状支架中的瓣膜结构被修复/再细胞化，即不采取另外的步骤来特别地修复/再细胞化瓣膜结构。在某些实施方案中，经修复/经再细胞化的瓣膜是CD31阳性的。经修复/经再细胞化的瓣膜也可以是平滑肌肌动蛋白阳性的、vWF阳性的，和/或以存在梭形平滑肌细胞为特征。

在某些实施方案中，所述个性化血管具有天然血管的一个或多个特征。在某些实施方案中，通过本文公开的方法制备的个性化静脉包含在第一峰值处具有高于0.8N的力的机械特性的经修复/经再细胞化的瓣膜。在某些实施方案中，通过本文公开的方法制备的个性化血管在测试时显示没有渗漏。

在另一个方面，本公开本文提供了本文公开的用于在疗法中使用的个性化血管。在某些实施方案中，本公开文本提供了用于在受试者的移植中使用的个性化血管。在某些实施方案中，本公开文本提供了用于在治疗有需要的受试者的血管疾病或障碍中使用的个性化血管。

如本公开文本所用的术语“治疗(treat、treating或treatment)”和其他语法等同形式包括减轻、缓和、改善或预防疾病、病症或症状，预防另外的症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，使疾病或病症消退，缓解由疾病或病症引起的病症，或阻止疾病或病症的症状，并且旨在包括预防。所述术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处意指根除或改善正在治疗的潜在障碍。另外，通过根除或改善与潜在障碍相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，使得在患者中观察到改善，尽管患者可能仍患有潜在障碍。

本文公开的方法特别适合于产生自体样工程化血管。它们具有以下优点：(1)无免疫原性，并且因此具有最小的接枝排斥或不良免疫反应风险；(2)避免了免疫抑制的需要，并且因此对手术后的患者及其一生的风险更小；(3)没有长度限制；(4)与匹配的供体静脉或自体静脉相比，更容易获得；(5)由天然组分(即ECM、内皮细胞和平滑肌细胞)构成，并且因此具有优于主要是合成的和人工静脉的品质，包括保留残余的血管生成生长因子和生物力学完整性；6)与收获用于移植的自体静脉相比，需要侵入性地产生静脉；(7)允许通过使用全血对受试者进行快速和最小侵入性操作；(8)变得细胞化并生物学整合到受试者的身体及其功能(修复、生长、免疫防御)中。

因此，在一个方面，本公开文本提供了手术方法，所述方法包括将本文公开的个性化血管植入有需要的受试者(例如，人)体内。在另一个方面，本公开文本提供了本文公开的用于在植入到有需要的受试者(例如，人)体内中使用的个性化血管。在另一个方面，本公开文本提供了通过本文公开的任一种方法制备的个性化血管，其中所述个性化血管已经通过手术被植入受试者(例如，人)体内。

在某些实施方案中，所述个性化血管是自体的。如本文所用，术语“自体”意指在制备个性化血管的方法中使用的血液来自接受植入或手术的受试者。在某些实施方案中，其中所述个性化血管是通过使天然血管脱细胞化而产生的，天然血管的供体与所述个性化血管的受体不是同一个体。在某些实施方案中，其中所述个性化血管是通过使天然血管脱细胞化而产生的，天然血管是从合适的动物物种(例如，猪、羊、奶牛)获得的。

本文公开的手术方法可用于治疗各种血管疾病或障碍。因此，在某些实施方案中，所述受试者患有血管疾病或障碍，例如静脉疾病或障碍。在某些实施方案中，所述静脉疾病或障碍选自深静脉血栓形成(DVT)、慢性静脉功能不全(CVI)(又称为静脉炎后综合征)、静脉曲张、静脉性溃疡(例如，静脉性腿部溃疡)以及复发性腿部癌症(例如，由深静脉返流和/或静脉高压引起)。在某些实施方案中，所述个性化血管被植入、移植或接枝以替换受任一种血管疾病或病症折磨的天然血管的区段。在某些实施方案中，所述个性化血管是静脉并且包含至少一个静脉瓣膜。

在某些实施方案中，所述手术方法治疗、改善和/或减轻一种或多种症状，包括腿部的钝痛、沉重或抽筋，瘙痒和刺痛，站立时变得更糟的疼痛，腿部抬起时变得更好的疼痛，腿部的肿胀，腿部和脚踝的发红，脚踝周围的皮肤颜色变化，表面(浅表)上的静脉曲张，腿部和脚踝上的皮肤增厚和硬化(脂性硬皮病)，腿部和脚踝上的溃疡以及腿部或脚踝上的愈合缓慢的伤口。

在某些实施方案中，本文公开的手术方法治疗和/或改善CVI。CVI定义了由动态静脉高压引起的静脉疾病的那些表现，动态静脉高压被定义为通过运动不能降低静脉压。在正常情况下，下肢的静脉瓣膜和肌肉泵限制了下肢静脉中的血液积聚。因流出阻塞、肌筋膜无力、关节活动丧失或瓣膜功能衰竭导致的下肢肌肉泵的衰竭与周围静脉功能不全相关。

在某些实施方案中，本文公开的手术方法治疗和/或改善静脉性溃疡。静脉性溃疡是由于(通常是腿部的)静脉瓣膜功能不正常造成的伤口(即，静脉性腿部溃疡)。当瓣膜功能减退且血液回流导致静脉内血液聚集以及静脉和毛细血管内压力增加时，就会发生静脉性溃疡。这导致其他相关的并发症，如水肿、炎症、组织硬化、皮肤营养不良和静脉湿疹。静脉性溃疡大、浅、因红细胞中含铁色素渗漏到组织内而变色，并且可能具有分泌物。溃疡最常位于内踝或外踝周围。

在某些实施方案中，本文公开的手术方法恢复正常的下肢静脉压。例如，行走时，下肢静脉压在7至12步内从大约100mm Hg(取决于高度)降低至18mm Hg至约25mm Hg的平均值。在脚踝跖屈站立或脚跟提起从而将重量转移到前足(踮脚尖动作)时观察到类似的压力变化。动态静脉压(AVP)可以使用21号针测量足背静脉对10次踮脚尖运动(通常以每秒1次的速率)的反应来确定。当恢复规定的站立姿势时，静水压力在平均31秒后恢复。溃疡的发生率与AVP增加到30mm Hg以上呈线性关系。AVP增加还与90％的静脉再充盈时间少于20秒相关。与AVP相比，容积变化可以使用体积描记法非侵入性地测量。快速返流(即，静脉充盈大于7ml/sec)和小腿泵功能障碍与溃疡的高发生率相关。接枝后，静脉中的经修复/经再细胞化的瓣膜恢复正常的AVP、正常的快速返流和/或正常的小腿泵功能障碍。优选地，接枝后，所述个性化血管中的静脉瓣膜恢复约100mm Hg的正常返流压耐受，并且在行走7至12步期间降低至约18mm Hg至约25mm Hg的平均值。

在某些实施方案中，本文公开的手术方法治疗和/或改善大腿中瓣膜不全的症状。在某些实施方案中，通过恢复肌肉泵与静脉瓣膜之间的正常工作关系来实现症状的治疗和/或改善。下肢的肌肉泵包括脚、小腿和大腿的那些肌肉泵。其中，小腿泵是最重要的，因为它效率最高，具有最大的电容，并且产生最高的压力(肌肉收缩期间为200mm汞柱)。正常肢体的小腿容积范围为1500至3000cc，静脉容积为100至150cc，并且单次收缩时喷出超过40％至60％的静脉容积。

在收缩期间，腓肠肌和比目鱼肌将血液驱动到大容量的腘静脉和股静脉中。本公开文本的经修复/经再细胞化的瓣膜在随后的松弛期间防止逆行流动(返流)，从而产生负压并通过有能力的穿静脉将血液从浅表系统抽吸到深层系统。经修复/经再细胞化的瓣膜逐渐降低静脉压，直至动脉流入等于静脉流出。本公开文本提供，当受试者的运动停止时，具有经修复/经再细胞化的瓣膜的静脉缓慢地填充毛细血管床，从而导致缓慢恢复到静息静脉压。

虽然肌肉环绕大腿静脉，但大腿肌肉收缩对静脉回流的贡献与小腿肌肉泵相比微乎其微。在步行期间，由于足底静脉丛受压而产生的泵压作用会启动小腿泵。各种腿泵与有能力的瓣膜功能一起工作，以将静脉血从远端返回到近端。本公开文本的个性化血管用于在恢复功能性腿泵中使用，以将静脉血从远端返回到近端。

在另一个方面，本公开文本提供了用于制备个性化血管的生物反应器，所述生物反应器包括泵(例如蠕动泵、重力泵、柱塞泵或其他合适的泵)、容器、第一连接器和第二连接器，其中所述第一连接器和所述第二连接器直接或间接地连接到所述容器，其中每个连接器连接到用于制备通过本文公开的制备个性化血管的任一种方法制备的个性化血管的管状支架的端部，其中当所述第一连接器和所述第二连接器连接到所述管状支架的两端时，所述泵介导悬浮液、全血或溶液在闭合回路中的循环。在许多实施方案中，有利的是本文使用的泵(例如蠕动泵、重力泵、柱塞泵或其他合适的泵)足够柔和，从而最小化对血细胞的损伤。

在某些实施方案中，所述生物反应器还包括管状支架(例如，无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架))。在某些实施方案中，所述生物反应器还包括如本文所公开的用于制备个性化血管的悬浮液或全血。

在某些实施方案中，所述生物反应器的至少两个部分分别提供，具有以规定顺序连接它们的指令。因此，在一个方面，本公开文本提供了用于组装制备个性化血管用的生物反应器的套件，所述生物反应器包括蠕动泵、容器、第一连接器和第二连接器，其中所述第一连接器和所述第二连接器可以直接或间接地连接到所述容器，其中每个连接器可以连接到用于制备通过本文公开的制备个性化血管的任一种方法制备的个性化血管的管状支架的端部，其中当所述第一连接器和所述第二连接器连接到所述管状支架的两端时，所述蠕动泵介导悬浮液、全血或溶液在闭合回路中的循环。在某些实施方案中，所述套件还包括管状支架(例如，无细胞管状支架(例如，脱细胞化血管或生物打印管状支架))。

在某些实施方案中，所述第一连接器和所述第二连接器是鲁尔连接器。在某些实施方案中，所述第一容器通过管直接连接到所述容器，和/或所述第二容器通过管直接连接到所述容器。

在某些实施方案中，所述生物反应器包括采样端口。在某些实施方案中，所述采样端口是所述容器的一部分。在某些实施方案中，所述采样端口允许从所述闭合回路中收回所述悬浮液、全血或溶液的样品。在某些实施方案中，所述采样端口包括用于测量所述悬浮液、全血或溶液中的温度、pH和/或氧、CO

在某些实施方案中，所述采样端口还可用作注射端口。在某些实施方案中，所述生物反应器还包括注射端口。在某些实施方案中，所述注射端口连接到或可以连接到氧、CO

在某些实施方案中，使所述管状支架的外表面与所述容器中的悬浮液、全血或溶液接触。此生物反应器允许同时对所述管状支架的内表面和外表面进行修复/再细胞化。

在某些实施方案中，所述生物反应器还包括封闭所述管状支架的腔室，从而允许所述管状支架的外表面与所述腔室中的液体接触。所述腔室还可以被灭菌，从而使所述管状支架保持在无菌条件下。

技术人员将理解，相同的生物反应器可以用于使天然血管脱细胞化或者用于调节管状支架。适当的悬浮液、全血或溶液可以由技术人员根据用途选择。

可以使用各种泵，其即使在长时间的灌注期间也不会破坏血液溶液中的细胞和无细胞组分。这些泵可以是蠕动泵、重力泵、活塞泵或类似的。在生物反应器设置中包括样品端口允许对灌注介质进行无菌采样以及无菌注射另外的组分，而无需打开闭环，并且在一些情况下甚至无需停止灌注。在生物反应器设置的改进版本中，传感器多种相关参数(如葡萄糖、pH、氧含量、CO2含量、代谢物等)可以内嵌式耦合到灌注管中。这允许在RC期间或DC期间连续监测个性化过程，监测细胞和DNA破坏和去除的进展和成功。

本公开文本的另一个方面涉及用于制备个性化血管的生物反应器，所述生物反应器包括蠕动泵、包括采样端口的容器、第一连接器和第二连接器，其中所述第一连接器和所述第二连接器直接或间接地连接到所述容器，其中每个连接器连接到用于制备通过本文公开的方法制备的个性化血管的管状支架的端部，其中当所述第一连接器和所述第二连接器连接到管状支架的两端时，所述蠕动泵介导悬浮液或溶液在闭合回路中的循环。

在一些实施方案中，所述第一连接器和所述第二连接器是鲁尔连接器。在一些实施方案中，所述采样端口是注射端口。在一些实施方案中，所述生物反应器还包括注射端口。在一些实施方案中，所述注射端口连接到D-葡萄糖的贮存器。在一些实施方案中，所述第一容器通过管直接连接到所述容器，和/或所述第二容器通过管直接连接到所述容器。在一些实施方案中，所述生物反应器包括一个或多个样品端口。在一些实施方案中，所述生物反应器还包括一个或多个用于测量葡萄糖水平的传感器。在一些实施方案中，所述生物反应器还包括pH调节模块。在一些实施方案中，所述生物反应器还包括CO

本公开文本的另一个方面涉及制备个性化血管的方法，所述方法包括使无细胞管状支架的表面与包含在全血中的组分接触，所述组分在用于接触所述表面之前被富集或选择。

在一些实施方案中，所述组分选自血小板、有核细胞、蛋白质、生长因子、信号传导因子、免疫球蛋白及其任何组合。

在一些实施方案中，所述组分通过离心、梯度离心、通过选择性粘附分离、过滤或分选来富集。用于富集或分选组分的许多方法是本领域熟知的。用于分选的方法的一些例子包括荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)。

应理解的是，方法并不限于所描述的具体实施方案，因为这些可以改变。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。本发明技术的范围将仅由所附权利要求来限制。

如本文所用，某些术语可以具有以下定义的含义。除非上下文另有明确指示，否则如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”以及“所述(the)”包括单数和复数指示物。例如，术语“一个细胞”包括单个细胞以及多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，术语“包含”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但是不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应当意指排除对组合物或方法具有任何重要意义的其他要素。“由……组成”应当意指对于要求保护的组合物和实质方法步骤排除其他成分的多于微量的要素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开文本的范围内。因此，意图是方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含)或者可替代地包括不重要的步骤和组合物(基本上由……组成)或者可替代地仅包括所述方法步骤或组合物(由……组成)。

术语“约”是指所述绝对值(例如，药剂的浓度或量)的任何最小改变，其不改变所述功效、活性、作用、结果等。在实施方案中，术语“约”可以包括指定数值或数据点的±10％。术语“约”包括所述值(例如，“约1％”包括1％及其最小改变)。

在本公开文本中范围可以表示为从“约”第一具体值和/或至“约”第二具体值。当表示这样的范围时，还考虑了包括从第一具体值和/或至第二具体值的另一个方面。类似地，当通过使用“约”将值表示为近似值时，应理解的是所述具体值形成另一个方面。应进一步理解的是，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。还应理解的是，在本公开文本中公开了多个值，并且除了值本身之外，每个值也被公开为“约”所述具体值。还应理解的是，在整个申请中，数据以多种不同格式来提供，并且此数据代表数据点的任何组合的端点和起始点以及范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”，应理解的是认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10与15之间。还应理解的是，还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

如本文所用，术语“包含”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但是不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应当意指排除对组合物或方法具有任何重要意义的其他要素。“由……组成”应当意指对于要求保护的组合物和实质方法步骤排除其他成分的多于微量的要素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开文本的范围内。因此，意图是方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含)或者可替代地包括不重要的步骤和组合物(基本上由……组成)或者可替代地仅包括所述方法步骤或组合物(由……组成)。

实施例

实施例1：个性化组织工程化静脉(P-TEV)

制备了猪P-TEV接枝物并进行了体内测试，以显示它们的安全性和可行性。具体地，选择了猪腔静脉作为替代模型系统，以模拟人股静脉血管壁的大小和厚度。

P-TEV的制备

从猪尸体中取出了腔静脉，并进行了脱细胞化以去除供体细胞和DNA。简言之，依次用DC溶液1、DC溶液2和DC溶液3灌注静脉段，其中在不同的DC溶液之间使用无菌水进行洗涤步骤。在本实施例中，使用了24小时Triton X、8h TNBP和16h DNA酶。然后用DC底液和PBS彻底洗涤静脉段1小时，并最终洗涤48小时。接下来，将静脉段在灭菌溶液中灭菌，并且在PBS中彻底洗涤(1小时灭菌洗涤和48小时最终洗涤)。然后将每个无菌DC静脉段转移到带有永久附着标签的容器中，并且在PBS中于-80℃下冷冻。用于脱细胞化和灭菌的溶液的组成在表1中提供。

表1：用于脱细胞化和灭菌的溶液

通过使用苏木精和伊红(H&E)染色和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的组织学验证了脱细胞化静脉支架的无细胞性。具体地，在未经处理的静脉中观察到了H&E染色中代表细胞核的蓝点，但是在脱细胞化样品中没有观察到。类似地，在未经处理的静脉中可检测到指示DNA的来自DAPI的荧光，但是在脱细胞化样品中没有检测到。还使用Qubit

为了修复/再细胞化静脉支架，通过常规静脉穿刺在含有17IU/mL肝素钠的无菌10mL BD真空采血管玻璃管中从受体猪采集了外周全血(PWB)样品。将PWB与离体器官灌注液(STEEN

手术

将经修复/经再细胞化的P-TEV通过手术植入了受体猪体内。具体地，通过白线形成了切口。对于前两头猪使用了定位腔静脉的常规技术：用在盐水中浸湿的纱布和手术钩将肠保留在一旁，并且从周围组织中解剖出腔静脉位于肾静脉与股静脉分叉处之间的部分。由于这两头动物中的一头形成了肠粘连，因此使用一种改进的后腹膜技术来在其他六头猪(四头植入了P-TEV，两头进行了假手术)中定位腔静脉：腹膜和腹壁向下分离至右侧的腔静脉，从而不会触及肠。对于P-TEV移植的猪，切下腔静脉，并且用端对端吻合口连接大约4cm的P-TEV。在假手术的猪中，静脉的张力不允许像P-TEV移植那样在两个地方切割和缝合。取而代之的是切开腔静脉，并用一个吻合口缝合。

在手术期间，用替来他明、唑拉西泮和美托咪定对猪进行了镇静，然后用异氟醚进行了插管麻醉。在手术期间给予了丁丙诺啡以用于术后疼痛缓解。为了防止凝血和血栓形成，在手术之前用160mg乙酰水杨酸(每日一次持续一周)，并且用2mg/kg利伐沙班(自手术前一天起每日两次直至安乐死)口服处理了所有猪。另外，在手术期间静脉施用了10,000IU肝素。

手术后猪的情况

两头猪在手术后发展了肠粘连，并且由于肠梗阻症状，在计划终点之前不得不被实施安乐死。一头是P-TEV猪，其中使用常规技术定位了腔静脉。它在手术后16天不得不被实施安乐死，并且肠在解剖时显示大量粘连。另一头是在手术后7天实施安乐死的假手术猪。这头猪的腹膜在手术期间破裂，并且肠必须像常规技术那样用湿润的纱布和钩子处理。

另外六头猪在解剖期间没有观察到肠粘连。在这六头动物中，一头假手术猪和三头P-TEV猪在手术后4-5周的计划终点被实施安乐死。由于与腔静脉移植无关的并发症，两头P-TEV猪不得不提前被实施安乐死。一头在手术后3天因为腹壁缝线断裂而被实施安乐死。另一头在手术后17天因为左前腿膝盖骨折而被实施安乐死。

移植的P-TEV的表征

在对手术后存活4-5周的一头假手术猪和三头P-TEV猪实施安乐死之前，在麻醉下进行了血管造影术。将造影液注入股静脉，并且使用C臂X线实时监测腔静脉。如图1A-1B所示，P-TEV(图1B)和假(图1A)手术静脉均开放且有自由血流。

在对每头猪实施安乐死后，检查了腔静脉。两条假手术静脉和六条P-TEV均开放且有自由血流，而无凝血或血栓形成迹象。在肉眼检查时没有观察到血凝块或血栓形成。

然后对静脉进行切片并做好H&E染色和DAPI染色准备。如图2A-2B所示，在手术后3天被实施安乐死的P-TEV(图2B)猪中，通过H&E和DAPI染色在P-TEV接枝物中观察到细胞。如所述地对3天样品进行了分析。也对RC后的样品进行了常规分析(这些代表未植入P-TEV样品的最后阶段)。在手术后17天被实施安乐死的猪中，P-TEV接枝物细胞化良好。在手术后四至五周，P-TEV中的细胞数量(图2B)似乎与天然组织(图2A)相等。重要的是，在植入的P-TEV中没有观察到内膜增生，这是本研究中的一种主要潜在并发症。

还通过免疫组织化学对静脉样品进行了表征。在手术后两周被实施安乐死的猪中，P-TEV的近端、中心和远端部分具有大量的细胞，并且CD31阳性细胞可以被鉴定(图3A-3D)。图3A示出了吻合口近端的天然腔静脉。图3B-3D示出了P-TEV的近端(图3B)、中心(图3C)和远端(图3D)部分。箭头指示CD31阳性细胞。

在手术后4-5周被实施安乐死的猪中，P-TEV的近端、中心和远端部分具有与天然腔静脉相似的细胞密度，并且P-TEV腔覆盖有CD31阳性内皮层(图4A-4D)。图4A-4D是一系列免疫直方图，其示出了手术后四周腔静脉的DAPI染色和CD31免疫染色。图4A示出了吻合口近端的天然腔静脉。图4B-4D示出了P-TEV的近端(图4B)、中心(图4C)和远端(图4D)部分。箭头指示CD31阳性细胞。

腔表面内衬的内皮样细胞的形态与天然腔静脉的形态几乎没有区别(图5A-5B)。图5A-5B是一系列40倍放大的图像，其示出了手术后四周天然腔静脉(图5A)和P-TEV移植物(图5B)的H&E染色。箭头指示天然组织中的内皮细胞以及P-TEV移植物中具有板状内皮细胞样形态的细胞。

总而言之，这项体内研究表明，P-TEV用于静脉移植是安全可行的。

实施例2：生理灌注液的制备：

在室温下以60rpm连续搅拌了900ml具有钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。通过使粉末在液体表面上分层(以避免结块)缓慢地添加了74g人血清白蛋白，并搅拌直至完全溶解。通过暂时降低rpm避免了起泡。随后向溶液中添加了6,7g葡聚糖-40，并搅拌直至完全溶解。使用NaOH将pH滴定至7,4，并且使用具有钙和镁的DPBS将最终体积调节至1000ml。然后使用低蛋白结合无菌过滤器对生理灌注液进行了无菌过滤，在50ml无菌管中等分成25ml等分试样，并在2℃-8℃下储存最多12个月。

实施例3：替代生理灌注液(不需要昂贵的HSA)的制备：

将来自患者的25ml无菌血浆置于50ml无菌管中。然后将1,5ml100g/L经无菌过滤的葡聚糖-40储备溶液添加到血浆中，并且仔细搅动溶液直至完全混合。将无菌的生理灌注液在2℃-8℃下储存最多7天。

实施例4：制备的生理灌注液的另外变型形式：

具有钙和镁的DPBS，含有70g/L HSA、5g/L葡聚糖-40和11mmol/L葡萄糖

具有钙和镁的DPBS，含有40g/L HSA和10g/L葡聚糖-40

人血浆，含有另外的30g/L HSA和5g/L葡聚糖-40

人血浆，含有另外的5g/L葡聚糖-40和总共11mmol/L葡萄糖

具有钙和镁的DPBS，含有70g/L HSA、5g/L葡聚糖-60和11mmol/L葡萄糖

实施例5：可商购的生理灌注液的组成：

实施例6：由通过生物打印制备的无细胞管状支架制备个性化血管

实施例1描述了使用脱细胞化管状支架制备个性化血管的方法。可替代地，由生物打印管状无细胞支架制备了个性化血管。简言之，在聚合物(天然或合成)上制备了生物打印血管支架，所述聚合物呈凝胶形式、海绵形式、泡沫形式、贴片形式或半液体/流体形式。在此方法中，用全血或在溶液中稀释的全血(例如，包括全血的悬浮液)灌注聚合物支架，用于制备个性化血管。

实施例7：个性化血管的植入

选择了需要移植血管的受试者，并且将通过本公开文本实施例1或2中提供的方法制备的个性化血管植入/移植到受试者体内。监测受试者的预后和移植后的恢复情况。

本文公开的个性化血管用于治疗各种血管疾病和障碍，如深静脉血栓形成(DVT)、慢性静脉功能不全(CVI)、静脉曲张、静脉性溃疡(例如，静脉性腿部溃疡)以及复发性腿部癌症(例如，由深静脉返流和/或静脉高压引起)。

具体地，选择了患有血管疾病或障碍的受试者。通过手术将个性化血管引入受试者体内：切除天然血管受疾病或障碍折磨的区段；将个性化血管或其功能区段与天然血管吻合，从而替换被切除的天然血管区段。由手术产生的混合血管在功能上与天然血管相似或等同，并改善包括以下的症状：腿部的钝痛、沉重或抽筋，瘙痒和刺痛，站立时变得更糟的疼痛，腿部抬起时变得更好的疼痛，腿部的肿胀，腿部和脚踝的发红，脚踝周围的皮肤颜色变化，表面(浅表)上的静脉曲张，腿部和脚踝上的皮肤增厚和硬化(脂性硬皮病)，腿部和脚踝上的溃疡以及腿部或脚踝上的愈合缓慢的伤口。

实施例8

用于制备个性化血管的无细胞管状支架的再细胞化/修复过程涉及来自患者的少量全血样品。在本实施例中，涉及全血的细胞以及非细胞组分(例如，血小板、有核细胞、蛋白质、生长因子、信号传导因子、免疫球蛋白)的再细胞化/修复过程被选择或富集用于在所述过程中使用。在一个例子中，将全血的细胞以及非细胞组分与全血组合。可替代地，在再细胞化/修复过程中使用全血的细胞以及非细胞组分代替全血。后一个过程是出于与过程相关的原因，和/或为了优化血管的个性化而进行的。使用例如离心、梯度离心、选择性粘附、色谱、过滤或分选(FACS、MACS)进行富集或选择。

其他实施方案

应理解的是，虽然已经结合本公开文本的具体实施方式描述了本公开文本，但前面的描述旨在说明而非限制本公开文本的范围，本公开文本的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。出于理解本发明主题的目的以及为了构造所附专利权利要求，包括本文提供的任何定义。本文所用的缩写具有其在化学和生物领域内的常规含义。