曲札茋苷在治疗小肠缺血再灌注损伤中的应用

技术领域

本发明具体涉及曲札茋苷在治疗小肠缺血再灌注损伤中的用途。

背景技术

曲札茋苷是从拉萨大黄根茎中提取的化合物，其结构名称为(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，或称为3，5，3′，4′-四羟基茋-3′-O-β-葡萄糖。

【英文名称】Piceatannol-3'-O-β-D-glucopyranoside

【分子式】C

【分子量】406.13

茋类物质是一类由二苯乙烯作为母体结构的衍生物。茋类物质广泛的存在于自然界的廖科植物中。目前研究证明，曲札茋苷具有多种药理活性，主要包括抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗肿瘤、抗病毒和抑菌

小肠缺血再灌注(intestinal ischemia/reperfusion injury，II/R)损伤是一种临床常见的病理生理过程。在脓毒症、出血、肠移植、严重感染以及外科手术（如肠道移植和腹主动脉瘤修复）等情况下，都可能会造成小肠的缺血性损伤。而在解除或缓解缺血损伤后，会继发缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/R）。小肠是一个代谢活跃的器官，具有独特的免疫系统，对I/R损伤非常敏感。II/R不仅会对肠道本身造成损害，还会引发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome ，MODS）等，甚至死亡。小肠缺血再灌注损伤机制复杂，涉及中性粒细胞浸润、炎症反应、细胞凋亡、氧自由基损伤、钙超载等多个病理生理过程。目前临床应对小肠缺血再灌注损伤的治疗方法主要有缺血预处理，改善微循环，抗凋亡，抗细胞因子与炎性介质损伤等方法，但效果均不理想。其根源在于该疾病发病机制多样、复杂，不同机制间相互交叉，互相作用。因此，研发多机制、多靶点的抗小肠缺血再灌注损伤药物意义重大。

本发明发现，曲札茋苷给药治疗可有效的减轻小肠粘膜病理损伤，大体损伤评分和Chiu评分均显著降低。此外，曲札茋苷治疗还可有效的抑制髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性，下调肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达水平，降低脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的产生，提高抗氧化物酶总-超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）的活性并上调内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表达水平。以上结果说明，曲札茋苷对小肠缺血再灌注损伤具有显著的治疗作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种曲札茋苷的新作用，即曲札茋苷能够治疗小肠缺血再灌注导致的急危重病象。

曲札茋苷在治疗小肠缺血再灌注损伤药物中的应用。

所述小肠缺血再灌注损伤为肠道粘膜坏死、出血或炎症反应。

治疗小肠缺血再灌注损伤的药物为曲札茋苷注射液。所述曲札茋苷注射液的制备方法如下：取曲札茋苷3mg，3ml0.9%氯化钠注射液溶解，得到1.0mg/ml的曲札茋苷注射液，置于锡纸包裹的5ml EP管中于4°C冰箱避光保存备用。

所述曲札茋苷能显著下调小肠缺血再灌注损伤导致的促炎因子TNF-α的表达。

所述曲札茋苷能显著抑制小肠缺血再灌注损伤导致的MDA水平升高，有效抑制脂质过氧化。

所述曲札茋苷能显著增强小肠组织内的T-SOD的活性，提高机体对氧自由基的清除能力。

所述曲札茋苷能显著抑制小肠缺血再灌注损伤导致的MPO表达水平的升高。该结果说明曲札茋苷能有效抑制中性粒细胞向炎症组织浸润。

所述曲札茋苷能显著上调小肠组织中的eNOS的表达，有效保护内皮细胞功能。

本发明的有益效果：曲札茋苷起效快，能在缺血再灌注早期显著减轻肠组织病理损伤，有效保护内皮细胞功能，下调肠组织中炎症因子水平，缓解氧化应激，下调中性粒细胞相关的细胞因子MPO的表达水平，对小肠缺血再灌注损伤具有显著疗效。此外，曲札茋苷比较易得，成本低廉，毒副作用小，相比目前临床上正在应用的同类药物优势明显。因此，曲札茋苷在抗肠缺血再灌注损伤领域具有良好的开发前景。

具体实施方式：

本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的：

材料和方法

药品和试剂

曲札茋苷自提于拉萨大黄，纯度高于 98.0％。TNF-α ELIASA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司（上海，中国）；eNOS ELIASA试剂盒和T-SOD生化试剂盒购自Elabscience公司（武汉，中国）。MPO和MDA 生化试剂盒购自南京建成生物有限公司（南京，中国）。

试验动物

雄性昆明小鼠，（25g±2g，辽宁长生生物技术股份有限公司，本溪，中国）。饲养在恒温（20±2°C）环境中，12h循环光照，喂以常规饮食和水。实验方案经大连医科大学动物实验伦理委员会批准(伦理编号：AEE20024)。

手术过程

在术前12h给小鼠禁食不禁水饲养，首先按小鼠体重（0.50mL/20g）腹腔注射1.75%的阿弗丁，麻醉后，置于电热保温毯上，用剪刀剪除去腹部毛。仰卧位固定四肢，常规用75%酒精对腹部进行消毒。沿腹部正中距剑突下缘约 0.5cm 处做一长约 2.0cm 的纵向垂直切口，眼科剪依次剪开皮肤及腹肌，用眼科镊提起腹膜，眼科剪剪开腹膜打开腹腔。用生理盐水沾湿的棉签将肠管挤向左侧，暴露右侧腹腔视野。沿左肾动脉找到肠系膜上动脉（Superior mesenteric artery，SMA），用玻璃分针分离，用无创微血管夹夹闭SMA根部。观察到SMA搏动消失,小肠颜色由粉红变苍白后，回纳肠襻，将切开的腹壁拉拢缝合暂时封闭腹腔。用温生理盐水浸湿纱布覆盖切口，最后盖上干纱布。用电烤灯照射，以维持小鼠体温。开腹后皮下注射0.1ml生理盐水以补充蒸发丢失的体液。夹闭动脉45min后，打开腹腔，用手松开微创动脉夹，观察血流恢复的情况，小肠颜色由苍白转为红色，提示复流成功，逐层缝合关闭腹腔。二次开腹后皮下注射0.1ml生理盐水补液。手术期间注意动物保暖。假手术组动物手术操作同模型组,分离但不夹闭动脉。再灌注30min后，麻醉小鼠放血致死。取回盲部向近端10cm的空肠组织，用预冷的生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干，储存在-80°C冰箱留备组织和生物化学检测。

实验分组

小鼠随机分为3组，每组6只：

假手术（Sham）组：尾静脉注射与治疗组等量生理盐水，并接受对照处理，包括开腹、分离肠系膜上动脉，但不夹闭，总共75min。

造模（I/R）组：小鼠如前述方法造模，再灌注前5min尾静脉注射与治疗组等量生理盐水，至再灌30min结束，总共75min。

治疗（I/R+QZZG）组：小鼠如前述方法造模，再灌注前5min尾静脉注射曲札茋苷注射液（5.25mg/kg·BW），至再灌30min结束，总共75min。

小肠大体损伤评估

再灌注30min后，对各组小鼠的小肠进行大体损伤评分，评分标准：0分-肠壁无充血、出血，粘膜无溃疡；1分-肠壁充血、出血，粘膜无溃疡；2分-肠壁充血、出血，粘膜溃疡面积<10%；3分-肠壁充血、出血，粘膜溃疡，面积10-25%；4分-肠壁充血、出血，粘膜溃疡，面积25-50%；5分-肠壁充血、出血，粘膜溃疡，面积>50%

组织学损伤评估

将取下来的空肠展平并浸泡在4%的多聚甲醛中48h固定，制成5μm厚的石蜡切片后HE染色。在镜下，每个切片取六个视野进行盲法评分，标准参考Chiu评分

小肠组织MPO活性测定

MPO活性是反映多形核中性粒细胞（Polymorphonuclear Neutrophils,PMNs）聚集水平的重要指标。我们采用髓过氧化物酶活性检测试剂盒（南京建成生物有限公司，南京，中国）来测定：精确称取小鼠的肠组织，按照质量体积1：9加入匀浆介质PBS制备成10%的组织匀浆。取300 μl匀浆液与300 μl试剂二混合均匀。然后，取540μl 的混合液和60μl 三号试剂混合均匀，充分混匀后37°C水浴15分钟，取出后作为待测样本。每个样品设置对照管和测定管：在对照管中加入样本0.2ml，试剂四0.2ml，双蒸水3ml；样品管中加入样本0.2ml，试剂四0.2ml，显色剂3ml。37°C水浴30分钟后，将两管都加入0.05ml的试剂七，混匀后，60°C水浴10分钟，取出后立即用酶标仪在460nm处测量OD值。

小肠组织TNF-α水平测定

TNF-α是炎症早期的促炎因子。我们采用TNF-α的ELIASA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，上海，中国）来测定：精确称取小鼠的肠组织，按照质量体积1：9加入匀浆介质PBS制备成10%的组织匀浆。将组织匀浆液4℃下12000rpm离心10min，取上清液置于1.5ml离心管中分装，作为待测样本。提前60分钟取出试剂盒平衡至室温，各孔加50μl标准品或样品和100μl 辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，37°C孵育60分钟。甩尽孔内液体，每孔加350μl洗涤液，浸泡1分钟，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，重复洗涤五次。甩尽孔内液体，每孔依次加50μl 底物A溶液和50μl 底物B溶液，37°C避光孵育15分钟。每孔加入50μl终止液，于15min内在450nm波长处测量OD值。

小肠组织MDA水平测定

MDA水平可准确反映组织的脂质过氧化程度。我们采用MDA检测试剂盒（南京建成生物有限公司，南京，中国）来测定：精确称取小鼠的肠组织，按照质量体积1：5加入匀浆介质PBS制备成16.7%的组织匀浆。将组织匀浆液4℃下12000rpm离心10min，取上清液置于1.5ml离心管中分装，作为待测样本。取肠组织16.7%匀浆上清0.1ml，加试剂一0.1ml 混匀，加试剂二3ml，试剂三1ml，漩涡混匀器混匀后，95℃水浴 60分钟，取出后流水冷却，然后3000转/分离心20min，取上清，用酶标仪在波长 532nm处测量OD值。

小肠组织T-SOD活性测定

T-SOD的活性可反映机体清除氧自由基的能力。我们采用T-SOD检测试剂盒（Elabscience，武汉，中国）来测定：按照质量体积1：5加入匀浆介质PBS制备成16.7%的组织匀浆。将组织匀浆液4℃下12000rpm离心10min，取上清液置于1.5ml离心管中分装，作为待测样本。加试剂一90µl混匀，加酶工作液30µl，振板器振板10s混匀后，37℃金属浴50分钟，加入显色液180µl，振板器振板10s混匀后，置于酶标仪中静止10min，用酶标仪在波长550nm处测量OD值。

小肠组织eNOS表达水平测定

eNOS是一种存在于内皮组织中的Ca

数据分析

所有数据分析皆应用GraphPad Prism 8.4软件进行分析。实验结果以均数土标准差表示，各组间比较采用方差分析（One-Way ANOVA）。

结果

小肠大体损伤评估

本实验于再灌注30min对各组小鼠小肠大体损伤进行评估。假手术组小鼠的肠壁呈现健康的粉色，无明显内容物（图1， A；评分见图2，Sham），肠管亦无扩张现象。而I/R造模组小鼠的小肠在再灌注30min时有明显的出血和水肿，肠管内有血状内容物，（图1，B；评分见图2，I/R））。曲札茋苷治疗组在再灌注30min时与I/R造模组相比，出血和水肿有显著改善（图1，C；评分见图2，I/R+QZZG）。图2为各组处理小鼠小肠I/R损伤的大体评分。数据表示为均数土标准差（n=6）。###表示与假手术组相比，

组织学损伤评估

从HE染色的组织切片观察，假手术组小鼠的肠粘膜上皮完整，杯状细胞清晰可见（图3，A；评分见图4，Sham）。而再灌注30min时，I/R造模组小鼠的肠粘膜上皮严重受到破坏，几乎全部脱落并伴有严重的出血（图3，B；评分见图4，I/R）。曲札茋苷治疗组绒毛结构均有明显的恢复和再生，绒毛中仍有少量充血（图3，C；评分见图4，I/R+QZZG）。图4为各组处理小鼠的组织学损伤Chiu评分。数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

曲札茋苷对小肠缺血再灌注引起的中性粒细胞浸润的抑制作用

MPO是PMNs的标志酶，可准确反映组织内中性粒细胞浸润程度。如图5所示，I/R造模组小肠组织MPO活性较假手术组显著增高，而曲札茋苷治疗组的MPO活性较造模组显著降低。该结果提示，曲札茋苷治疗可有效抑制肠组织中缺血再灌注导致的中性粒细胞浸润。图5数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

曲札茋苷下调缺血再灌注小肠组织内TNF-α水平

TNF-α是缺血再灌引起的肠损伤过程中大量释放的主要促炎因子之一。如图6所示，造模组组织中的TNF-α水平较假手术组显著增高，而曲札茋苷给药能显著降低TNF-α水平。图6数据表示为均数土标准差（n=6）。#表示与假手术组相比，

曲札茋苷抑制小肠缺血再灌注引起的脂质过氧化反应

MDA是反映脂质过氧化水平的重要指标。如图7所示，小肠缺血再灌注后肠组织中的MDA的含量与假手术组相比显著增高，曲札茋苷治疗可显著降低组织中的MDA的含量。图7数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

曲札茋苷清除小肠缺血再灌注引起的氧自由基增多

缺血再灌引起的肠损伤过程中有大量氧自由基释放。T-SOD可有效清除氧自由基。如图8所示，造模组组织中的T-SOD活性较假手术组显著降低，而曲札茋苷给药能显著提高T-SOD的酶活性。图8数据表示为均数土标准差（n=6）。**表示与假手术组相比，

曲札茋苷对小肠缺血再灌注后内皮细胞功能的保护作用

缺血再灌注损伤可导致内皮细胞功能障碍。而eNOS可有效保护内皮细胞功能。如图9所示，与假手术组相比，造模组组织中的eNOS表达水平在再灌30min时明显降低，而曲札茋苷给药能显著上调eNOS表达水平，有效保护肠内皮细胞功能。图9数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

本研究的主要发现有以下几点：（1）曲札茋苷能有效降低小鼠小肠I/R损伤程度。（2）曲札茋苷能够改善I/R后的氧化应激及脂质过氧化损伤。（3）曲札茋苷能够有效抑制I/R后炎症反应。（3）曲札茋苷能够有效保护I/R后内皮细胞功能。本研究指出曲札茋苷能够通过多种途径减轻由再灌注引起的小肠损伤，主要包括维护小肠屏障系统完整性，抑制中性粒细胞侵润和促炎因子释放，维持小肠内氧化还原平衡。这些结果为曲札茋苷成为临床上治疗小肠I/R损伤的治疗药物提供了新的科学依据。

附图说明

图1各组小鼠小肠大体损伤。曲札茋苷治疗能明显减轻小肠缺血再灌注所引起的损伤。图中，A：Sham组（假手术组，下同），B：I/R组（造模组，下同），C：I/R+QZZG治疗组（曲札茋苷治疗组，下同）。

图2各组小鼠小肠I/R损伤的大体评分。数据表示为均数土标准差（n=6）。###表示与假手术组相比，

图3各组小鼠的肠组织损伤（HE染色）。

图4各组小鼠的组织学损伤Chiu评分。数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

图5各组小鼠肠组织中MPO活性。小肠缺血再灌注后组织中的MPO活性与假手术组相比显著提高，治疗组MPO活性显著降低。数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比

图6 各组小鼠肠组织中TNF-α含量。小肠缺血再灌注后组织中的TNF-α的表达水平与假手术组相比显著上调。治疗组显著下调组织中的TNF-α的表达水平。数据表示为均数土标准差（n=6）。#表示与假手术组相比，

图7 各组小鼠肠组织中MDA含量。小肠缺血再灌注后组织中的MDA的含量与假手术组相比显著升高，曲札茋苷治疗能显著降低组织中的MDA的含量。数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

图8 各组小鼠肠组织中T-SOD活性。小肠缺血再灌注后组织中的T-SOD活性与假手术组相比显著降低，曲札茋苷治疗可显著提高T-SOD活性。数据表示为均数土标准差（n=6）。**表示与假手术组相比，

图9 各组小鼠肠组织中eNOS 表达水平。小肠缺血再灌注后组织中的eNOS 表达水平与假手术组相比显著降低。曲札茋苷治疗可显著上调eNOS 表达水平。数据表示为均数土标准差（n=6）。***表示与假手术组相比，

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