一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法

技术领域

本发明涉及单细胞组学分析领域，具体涉及一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法。

背景技术

单细胞RNA测序（scRNA-seq）可揭示每个细胞的独特性，从而在单细胞分子水平上研究生物学并解决以前无法回答的问题，例如揭示细胞异质性、细胞发育、细胞间不同基因表达模式等，目前已广泛应用在生物学、医药研发、临床医学等各个领域。scRNA-seq方法包括步骤有（1）单细胞或单核的分离和裂解、（2）反转录、（3）cDNA扩增和（4）测序文库的制备。目前，单细胞或单核的分离和裂解需要脱离细胞外基质和细胞-细胞粘附（循环细胞除外），通常可以通过酶处理或激光捕获显微切割（LCM）和膜片钳来实现。大多数细胞捕获技术需要从新鲜组织中分离出完整的单个细胞。但是在某些情况下活细胞的解离可能是有问题的。

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是临床上带有患者随访数据的大量资源。由于FFPE在样品在制备的过程中，会发生蛋白核酸交联，mRNA也会存在不同程度的降解、修饰过程，在FFPE样品脱腊、解交联过程中仍会造成mRNA的降解。因此，对FFPE样品的scRNA-seq极具挑战性。目前已有对于FFPE样品分离为单个细胞的方法，但均耗时较长，操作步骤较多，并且需要使用流式细胞仪进行分选，急需一种快速、简便的分离FFPE组织中单细胞用于单细胞RNA测序。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法。所述FFPE样本预处理液可以有效抑制样本中RNA的降解并且促进单细胞的分离，所提供的从FFPE样本中分离单细胞的方法在较短时间内以相对较低成本获得FFPE样品的单细胞悬液。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案得以实现：

本发明的一个方面，是提供一种FFPE样本预处理液，所述的预处理液为含有35~50单位/mL胶原酶iv型（Collagenase Type 4）、60~80单位/mL胶原酶ii型（collagenase Type2）、0.4~0.6单位/mL分散酶 I（Dispase I）、70~100 单位/mL透明质酸酶（hyaluronidase）、0.1~0.2 单位/µL marine RNase抑制剂、0.3~0.5 mM氯化钙（CaCl

作为优选，在本发明的实施方式中，上述用于FFPE样本的预处理液为含有35单位/mL Collagenase Type 4、60单位/mL collagenase Type 2 、0.4单位/mL Dispase I、70单位/mL hyaluronidase、0.1单位/µL marine RNase inhibitor、 0.3mM CaCl

本发明的另一个方面，是提供一种从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中分离单细胞的方法，所述方法包含以下步骤：

（1）切片：去除FFPE组织两侧多余的石蜡后将FFPE组织切成薄片；

（2）脱蜡：将薄片用二甲苯浸泡洗涤多次去除残留的石蜡；

（3）再水化：将薄片依次浸入到浓度逐渐降低的乙醇水溶液中逐步洗涤得到样本组织；

（4）将样本组织用Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 清洗后放入Tris-EDTA溶液中水浴锅处理一段时间，迅速置于冰上冷却，用PBS缓冲液洗涤；

（5）加入FFPE样本预处理液，剪碎样本组织后放入恒温振荡金属浴中消化；

（6）消化后筛网过滤，PBS缓冲液冲洗滤网，离心5 min，弃上清，加入PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞悬液。

步骤（1）中所述切片的厚度为40-60 µm的薄片。

步骤（2）中所述浸泡洗涤多次的第一次浸泡时的环境温度为50~60℃ ，浸泡时间为3 ~5min。

步骤（3）中所述乙醇水溶液的浓度依次为100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇。

步骤（4）中所述水浴的温度为65~75℃，时间为20~30min。

步骤（4）中所述PBS缓冲液中含有终浓度为0.3~0.5 mM的CaCl

步骤（5）中所述消化的时间为15~60 min，所述恒温振荡金属浴的转速为1200rpm/min。

步骤（6）中所述筛网的孔径为30~50 µm，所述PBS缓冲液均需提前预冷，预冷温度为2~5℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的FFPE样本预处理液均为常用分子细胞生物学试剂，RNA酶抑制剂的加入有效抑制样本中RNA的降解；提供的从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离单个细胞的方法，工艺简单，耗时短，试剂耗材低廉；不需要使用流式细胞仪进行分选，对设备要求低，普通实验室即可高质量地实现对福尔马林固定石蜡包埋样品中单个细胞的分离，有效降低分离成本；分离全过程用时仅需3~5 h，具有很强的实用性，可以明显提高单细胞RNA测序的准确性。

附图说明

图1是实施例3中所分离的单个细胞DAPI染色图。

具体实施方式

本发明公开了一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：预处理液的配置

FFPE样本预处理液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例进行配比： FFPE样本预处理液为含有50单位/mL胶原酶iv型（Collagenase Type 4）、80单位/mL胶原酶ii型（collagenase Type 2）、0.6单位/mL分散酶 I（Dispase I）、100 单位/mL透明质酸酶（hyaluronidase）、0.2 单位/µL marine RNase抑制剂、 0.5 mM氯化钙（CaCl

实施例2：预处理液的配置

FFPE样本预处理液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例进行配比： FFPE样本预处理液中含有35单位/mL Collagenase Type 4、60单位/mL collagenase Type 2 、0.4单位/mL Dispase I、70 单位/mL hyaluronidase、0.1单位/µL marine RNaseinhibitor、 0.3mM CaCl

实施例3

本实施例中以小鼠肝FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：

（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约40µm的薄片；

（2）脱蜡：将薄片收集到1.5 mL离心管中，用1 mL二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于55℃ 环境中浸泡3 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡5min）去除残留的石蜡；

（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；

（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在70℃水浴锅中处理20min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；

（5）加入1 mL含有终浓度为0.5 mM CaCl

（6）加入100 µL实施例1中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1 mL新鲜制备的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化15~60 min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔20 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；

（7）消化后，用40 µm筛网过滤，5 mL 4℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；

（8）4℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。

将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。

图1是所分离的单个细胞的DAPI染色图；其中，左图为明场，右图为荧光场；如图1可见， DAPI染色率为78.6%，细胞浓度为1.1ⅹ10

取200 µL细胞核用于RNA提取，提取过程按RNA提取试剂盒的说明书进行操作，完成后使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测RNA质量，经测定DV200值为71.3%。

实施例4

本实施例中以乳腺癌FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：

（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约60 µm的薄片；

（2）脱蜡：将薄片收集到离心管中，用1 mL二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于60℃ 环境中浸泡3 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡3min）去除残留的石蜡；

（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2次、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；

（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在75℃水浴锅中处理30min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；

（5）加入1 mL含有终浓度为0.3mM CaCl

（6）加入100 µL实施例2中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1.5mL新鲜制备的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化15~60 min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔20 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；

（7）消化后，用50 µm筛网过滤，5 mL 2℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；

（8）2℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。

将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。观察发现DAPI染色率为72.3%，细胞浓度为0.92ⅹ10

实施例5

本实施例中以小鼠肝FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：

（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约40µm的薄片；

（2）脱蜡：将薄片收集到离心管中，用二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于50℃ 环境中浸泡5 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡5min）去除残留的石蜡；

（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；

（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在70℃水浴锅中处理20min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；

（5）加入1 mL含有终浓度为0.5 mM CaCl

（6）加入100 µL实施例1中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1 mL实施例1中配置的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化20~60min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔10 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；

（7）消化后，用40 µm筛网过滤，5 mL5℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；

（8）5℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。

将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。DAPI染色率为76.7%，细胞浓度为1.2ⅹ10

本发明所提供的FFPE样本预处理液均为常规实验试剂，耗材低廉，RNA酶抑制剂的加入有效抑制样本中RNA的降解；所提供的从FFPE样本中分离单细胞的方法不需要流式细胞仪进行分选，对设备要求低，分离时间短，且分离后的单细胞浓度较高，可以明显提高单细胞RNA测序的准确性。

应当理解，上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。