一种肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球制备方法

技术领域

本发明涉及兽用药物制剂技术领域，特别涉及一种肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂及其制备技术。

背景技术

头孢喹诺(Cefquinome)，又称头孢喹肟，是德国Hoechst Roussel Vet公司开发的第1代兽用第4代头孢菌素类抗生素，因其强抗菌活性、广谱抗菌和低耐药性而被国内广泛应用于治疗家畜的呼吸系统疾病。

我国对头孢喹诺及其制剂的研究和开发起步较晚，目前仅有硫酸头孢喹诺原料药以及注射剂(混悬注射剂，注射粉针剂)获得农业部批准生产和销售，与之相匹配的剂型种类偏少。头孢喹诺口服吸收效果不好，注射吸收较为迅速，但是体内半衰期较短，仅为1～3小时。药物全身分布，肺部难以达到治疗的有效浓度，需要多次注射给药，临床应用受到限制。因此，开发具有靶向缓释性能的制剂是未来的发展方向。

肺靶向微球可滞留在肺部，使药物在肺部持续释放并富集，有效提高药物在靶器官的治疗水平，大大降低药物对非靶器官的毒副作用；同时，微球的缓释性能，可以延长药物的半衰期，避免频繁给药的不便。

以下中国专利公开的肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂：

其中，CN107308118A：原料药与分散剂混匀，球磨，挥干液体，得到处理后原料药头孢喹诺；称取PLGA和PLA作为载体，将所述载体溶解于混合溶剂中，待完全溶解后，加入原料药，再加入助流剂，通过超声波混匀进行喷雾干燥，同时进行磁力搅拌，然后通过涡流分离器得到微球。

其中，CN105030629A公开了一种硫酸头孢喹诺肺靶向PLGA微球制剂，制备方法是：分别称取硫酸头孢喹诺和PLGA载体，以探头超声将硫酸头孢喹诺分散到明胶溶液中作为水相，PLGA加入有机溶剂溶解作为油相；水相和油相混合，探头超声乳化，形成初乳；1％PVA水溶液作为外水相，与初乳混合，在2500-5000rpm转速下，高速剪切形成复乳；得到的复乳分散到PVA溶液中，低速搅拌4h后离心收集微球，超纯水冲洗并冻干，获得PLGA微球制剂。

CN105030629A中的制剂，其缺点是：制备的PLGA微球的粒径范围在7-35μm，粒径范围宽，可能会被不同直径的血管截留，无法实现精准靶向。

基于上述情况，本发明的目的基于乳化法制备被动肺靶向PLGA微球的技术，利用高速匀质机结合筛网筛分提供一种窄粒径范围的肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂。相比于单独使用乳化法制备的PLGA微球，使用高速匀质机结合筛网筛分具有更窄的粒径范围，并安全的应用于肺部药物的递送。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种窄粒径范围的肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明是通过如下措施实现的：一种窄粒径范围的肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球，制备方法包括以下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机分别以10000、8000、6000和2000rpm的转速将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为10000、8000、6000和2000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是800、600、400、300目。

另外，本发明还提供了所述的窄粒径肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球的制备方法，其中，制备方法包括以下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机分别以10000、8000、6000和2000rpm的转速将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

本发明的有益效果为：通过调控高速匀质机的转速结合筛网制备的微球粒径分别是2-5μm、6-12μm、20-30μm、35-50μm，其中，6-12μm具有最高的肺靶向效率。本制备方法具有操作简单方便、可制备多种粒径范围的微球、制备条件温和、粒径分布窄等优点。并且重现性高，稳定，制备得到的微球分散性好，外观均一，经体外生物相容性研究和小鼠体内组织分布和毒性研究表明，所制备的微球制剂具有优良的生物相容性和肺靶向性。

附图说明

图1为微球的粒径分布图；

图2为不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球的细胞毒性；

图3为不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球血液相容性；

图4为不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球的生物分布；

图5为注射最佳肺靶向粒径粒径条件下硫酸头孢喹诺PLGA微球后大鼠肺组织和空白肺组织的组织病理切片。

具体实施方式

本发明是通过如下措施实施的：一种窄粒径肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球，制备方法包括如下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机以10000、8000、6000和2000rpm的转速将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为10000、8000、6000和2000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是800、600、400、300目。

另外，本发明还提供了所述的窄粒径肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球的制备方法，其中，制备方法包括以下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机分别以10000、8000、6000和2000rpm的转速将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

对本发明得到的微球进行性能检测

一、得到的硫酸头孢喹诺PLGA微球的粒径分布分析

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

实验所需的材料与试剂见表1-1。

表1-1实验材料与试剂

实验所需的仪器与设备见表1-2。

表1-2实验仪器与设备

1.2实验方法

1.2.1微球粒径的测量

称取适量微球置于生理盐水中分散，经涡旋处理后使用棉棒蘸取并涂布在载玻片上，放置于倒置光学显微镜下，在视野中按照“弓”字形移动，测量视野中500个微球的粒径并计算粒径平均值，绘制粒径分布图。

1.3实验结果与分析

1.3.1微球粒度分布分析

硫酸头孢喹诺PLGA微球粒径分布结果见图1。

由图1，可见制备的硫酸头孢喹诺PLGA微球粒径分布较窄，制备的四个粒径范围的微球粒径分别为2-5μm、6-12μm、20-30μm、35-50μm，平均粒径分别是3μm、10μm、25μm、40μm(见表1-3)。

表1-3 PLGA微球的粒径范围和平均粒径

1.4小结

本部分实验通过分析得到以下结论：粒径分布结果证明制备的硫酸头孢喹诺PLGA微球粒径分布范围窄，制备的到的四个粒径范围的PLGA微球分别是2-5μm、6-12μm、20-30μm、35-50μm，平均粒径分别是3μm、10μm、25μm、40μm。

二、制备得到的硫酸头孢喹诺PLGA微球的体外生物相容性研究

2.1实验材料

2.1.1材料与试剂

实验所需的材料与试剂见表2-1。

表2-1实验材料与试剂

2.1.2仪器与设备

实验所需的仪器与设备见表2-2。

表2-2实验仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1细胞毒性实验

2.2.1.1细胞复苏

将冷冻管从-80℃冰箱中取出，迅速投入37℃水浴融化，细胞融化后要尽快(约1min)移出37℃水浴。迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，然后放置在冰浴上。小心开启瓶盖，把细胞转入含有4mL培养基的培养瓶中，然后把培养瓶移至培养箱，26℃-28℃培养1h，让细胞贴壁。细胞贴壁后，弃去培养基，主要是去掉DMSO、死细胞及其碎片，加5mL新鲜培养基，26℃-28℃培养。细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到形成单层。

2.2.1.2细胞培养

吸掉旧瓶中的培养液，加入2mL新的DMSO，使用移液枪对细胞进行反复吹打，直到贴壁细胞完全脱离瓶壁。对细胞进行计数，计数完成后将细胞分别转移到新的培养瓶中，加DMSO补足至5mL。将培养瓶放置于5％CO

2.2.1.3细胞活性检测

通过首先将细胞以1×10

2.2.2血液相容性实验

将200μL新鲜稀释的小鼠血液添加到800μL含不同量(0.01、0.05、0.1、0.5和1mg)PLGA微球的PBS(pH 7.4)中，并在37℃下孵育3小时。血液(200μL)与PBS(800μL)混合分别用作阴性和阳性对照。3小时后，将所有样品溶液以860×g离心5分钟，然后将200μL上清液置于96孔板中，并使用微板分光光度计测定540nm的吸光度来分析释放的血红蛋白。然后计算溶血百分比。

2.3实验结果与分析

2.3.1细胞毒性分析

不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球的细胞毒性见图2。

由图2可见，实验结果表明细胞在不同粒径的PLGA微球共孵育情况下保持良好的细胞活性，即使在高浓度(100μg/mL)处理下的细胞系在37℃孵育24小时后仍保持高度活力(>90％)。

2.3.2血液相容性分析

不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球的溶血活性图见图3。

由图3可见，不同粒径的PLGA微球没有表现出明显的溶血现象，定量分析的结果也证明没有达到溶血的上限(<5％)。同时，微球的溶血作用随着尺寸的增加而降低，这类似于某些纳米粒子的尺寸越大，毒性越小。在小鼠血液中，即使在高浓度(1mg/mL)下，相对溶血度也小于1％，这表明用PLGA微球通过静脉注射的方式进行治疗时不会引起小鼠血液的明显溶血。

2.4小节

本部分实验通过分析得到以下结论：(1)不同粒径的硫酸头孢喹诺PLGA微球的细胞毒性实验结果证明制备的不同粒径的微球都不会对细胞生长造成影响。(2)血液相容性实验证明制备的不同粒径的硫酸头孢喹诺PLGA微球均没有出现溶血现象。证明制备的不同粒径的硫酸头孢喹诺PLGA微球均具有良好的体外生物相容性。

三、制备得到的不同粒径的硫酸头孢喹诺PLGA微球体内生物分布研究

本实验以昆明小鼠为对象，进行不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球的体内生物分布实验。

3.1实验材料

3.1.1材料与试剂

实验所需的材料见表3-1。

表3-1实验材料与试剂

3.1.2仪器与设备

实验所需的仪器与设备见表3-2。

表3-2实验仪器与设备

3.2实验方法

3.2.1硫酸头孢喹诺PLGA微球荧光标记

在制备硫酸头孢喹诺PLGA微球的过程中，水相中加入罗丹明B并与油相混合，置于黑暗环境下制备荧光标记PLGA微球。

3.2.2硫酸头孢喹诺PLGA微球注射液的配置

注射液分散剂为经过灭菌的0.25％Span-80的PBS水溶液，微球制剂至于棕色瓶中避光，于-20℃冰箱中保存备用临用前将微球分散于分散剂中，充分混合均匀后注射。

3.2.3不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球全身荧光成像检测

小鼠尾静脉注射相同剂量的不同粒径荧光标记的PLGA微球，10min后使用异氟烷麻醉小鼠，待小鼠麻醉后将小鼠置于小动物活体成像系统中，设置激发和发射波长(λex＝540nm，λem＝600nm)，对小鼠进行活体的荧光成像，追踪PLGA微球在体内的位置。

3.2.4不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球主要脏器荧光成像检测

活体成像完成后将小鼠处死并获取小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，将小鼠的主要脏器置于小动物活体成像系统中，使用相同的激发和发射波长进行主要脏器的荧光成像。

3.2.5肺组织细胞因子的检测

在活体成像的基础上，对注射PLGA微球的小鼠获取肺组织，并使用ELISA试剂盒检测小鼠肺组织的细胞因子。

3.2.6小鼠组织病理学分析

解剖小鼠收集肺组织，在10％中性福尔马林中固定，石蜡包埋，切成5μm切片，并使用苏木素和伊红(H&E)染色。观察病理变化。

3.3实验结果与分析

不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球全身荧光成像检测

试验小鼠给药后，不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球在体内的生物分布图见图4。

由图4可知，注射不同粒径硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂后，活体成像和主要脏器的荧光成像结果说明，3μm和10μm PLGA微球都具有肺靶向能力。对主要脏器进行荧光强度进行定量分析，结果表明3μm PLGA微球的肺靶向效率是76％，10μm PLGA微球的肺靶向效率是81％，25μm PLGA微球的肺靶向效率是6％，40μm PLGA微球的肺靶向效率是6％，其中，粒径为10μm PLGA微球的肺靶向效率最高(见表3-3)。

表3-3不同粒径PLGA微球主要脏器的荧光累积量

肺组织细胞因子的表达

依据小动物活体成像系统，我们获得了3μm和10μm这两种肺靶向效率较高的PLGA微球。对这注射这两种粒径的小鼠的肺组织使用ELISA检测细胞因子的表达。结果表明，注射3μm PLGA微球后的小鼠肺组织炎症因子和趋化因子的表达会高于10μm PLGA微球。说明10μm PLGA微球更加安全(见表3-4至3-6)。

表3-4肺组织中IL-1β的浓度

表3-5肺组织中TNF-α的浓度

表3-6肺组织中IL-8的浓度

组织病理切片分析

由图5可见，小鼠注射10μm硫酸头孢喹诺PLGA微球7天和14天后，与对照组相比，实验组未发现明显的病理变化。

3.4小节

本实验证明了小鼠注射硫酸头孢喹诺PLGA微球后，有效增强了硫酸头孢喹诺药物的肺靶向性以及所制备的窄粒径范围的PLGA微球的安全性。

综上，本发明制备的窄粒径肺靶向硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂同时，大大提高了硫酸头孢喹诺肺部靶向性，并且得到的硫酸头孢喹诺PLGA微球制剂在体外和体内试验证明微球制剂的安全性。制备方法高效稳定，体内外生物相容性好，成功获得了一种肺靶向硫酸头孢喹诺微球制剂。

本发明操作简单方便，可通过调节高速均质机转速配合筛分调控获得不同窄粒径范围的PLGA微球，其中制备的10μm PLGA微球具有极高的肺部靶向效率和体内外安全性。

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

制备方法包括如下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为10000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是800目。

上述制备的微球，88.45％的微球粒径范围在2-5μm，平均粒径是3μm，光学显微镜显示微球外观圆整。

实施例2

制备方法包括如下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为8000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是800和600目。

上述制备的微球，84.84％的微球粒径范围在6-12μm，平均粒径是10μm，光学显微镜显示微球外观圆整。

实施例3

制备方法包括如下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为6000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是500和400目。

上述制备的微球，86.00％的微球粒径范围在20-30μm，平均粒径是25μm，光学显微镜显示微球外观圆整。

实施例4

制备方法包括如下步骤：

1)称取硫酸头孢喹诺20mg溶解于0.4mL水相中，称取PLGA500mg溶解于5mL油相中；

2)将水相和油相混合，超声乳化，形成初乳；

3)将步骤2)得到的初乳加入到35mL的乳化液中，使用高速匀质机将混合物充分混匀，形成复乳；

4)将步骤3)得到的复乳加入到0.4％PVA溶液中，使用磁力搅拌器常温条件下低速搅拌4-5h，挥发除去二氯甲烷；

5)分别使用不同目数的筛网对步骤4)得到的微球进行过滤筛选，然后以4000rpm的转速离心5-10min，用超纯水洗涤三次后冷冻干燥，即得具有窄粒径范围的肺靶向PLGA微球。

其中，水相为明胶溶液，明胶与水的比例为0.06g：0.34mL。

其中，乳化液为1％的PVA水溶液。

其中，高速匀质机设置的转速参数分别为2000rpm。

其中，不同目数的筛网分别是400和300目。

上述制备的微球，76.22％的微球粒径范围在35-50μm，平均粒径是40μm，光学显微镜显示微球外观圆整。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。