一种制备中药提取物吸收成分群的方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种制备中药提取物吸收成分群的方法。

背景技术

中药特别是复方的化合物组成庞杂，就根据目前所掌握的知识得知，这些成分不可能均起效，但哪些成分起效，我们还不完全知道。

目前广泛应用于中药分离制备的技术大多来源于西药的柱色谱技术，如C

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种制备中药提取物吸收成分群的方法，能够解决现有技术很难对中药提取物中共同起效的多组分化合物进行整体制备的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种制备中药提取物吸收成分群的方法，包括以下步骤：

步骤1、制备液液两相体系I；

步骤2、获得拟制备吸收成分群在液液两相体系I中的分配系数logK

步骤3、根据分配系数logK

步骤4、采用高速逆流色谱法，根据拟制备吸收成分群的收集时间，制备中药提取物中吸收成分群。

作为本发明再进一步的方案：所述液液两相体系Ⅰ中各组分满足以下比例关系：

A组分:B组分:C组分的体积比为(0～25)：(25～7)：25；

其中，所述A组分为乙腈和/或异丙醇；所述B组分为正辛醇；所述C组分为0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

优选的，C组分独立选自0.1mol/L磷酸盐缓冲液、0.12mol/L磷酸盐缓冲液、0.15mol/L磷酸盐缓冲液、0.18mol/L磷酸盐缓冲液、0.2mol/L磷酸盐缓冲液、0.23mol/L磷酸盐缓冲液、0.25mol/L磷酸盐缓冲液、0.27mol/L磷酸盐缓冲液、0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

具体的，液液两相体系Ⅰ的上相为乙腈和/或异丙醇、正辛醇和水的混合溶液；液液两相体系Ⅰ的下相为水和磷酸盐的混合溶液，分配系数logK

优选的，A组分：B组分：C组分体积比独立选自0:25:25、5:20:25、10:15:25、15:10:25、25:15:25、25:10:25、25:7:25。

优选的，液液两相体系Ⅰ为异丙醇-正辛醇-0.1mol/L磷酸盐缓冲液，异丙醇：正辛醇：0.1mol/L磷酸盐缓冲液的体积比为(0～25)：(25～7)：25。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤2具体包括以下步骤：

步骤2.1、测量化合物在液液两相体系Ⅰ中的分配系数logK

具体的，化合物在液液两相体系I中的分配系数logK

步骤2.2、获得化合物在液液两相体系Ⅱ中的分配系数logP

具体的，化合物在液液两相体系Ⅱ中的分配系数logP

步骤2.3、拟合logK

步骤2.4、根据吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

具体的，吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

作为本发明再进一步的方案：所述液液两相体系Ⅱ为正辛醇/水两相体系。

具体的，液液两相体系Ⅱ的上相为正辛醇，液液两相体系Ⅱ的下相为水。

优选的，根据吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

当吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

当吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

优选的，当吸收成分群在液液两相体系Ⅱ中的理论分配系数logP

作为本发明再进一步的方案：所述中药提取物是中药标准品的混合物，或者是从中药、中药复方或非药用植物中提取得到的次生代谢产物的混合物中的一种或多种。

优选的，采用甲醇溶液或乙醇溶液提取得到中药提取物。

作为本发明再进一步的方案：所述制备液液两相体系I之前，至少包括以下步骤：

步骤S1、测定至少20种化合物在预设液液两相体系Ⅰ中的分配系数logK

步骤S2、获得所述至少20种化合物在液液两相体系Ⅱ中的分配系数logP

步骤S3、拟合logK

步骤S4、测量所述预设液液两相体系Ⅰ在高速逆流色谱法中的固定相保留率，当所述预设液液两相体系Ⅰ在高速逆流色谱法中的固定相保留率大于第二预设值时，则所述预设液液两相体系Ⅰ为制备中药提取物中吸收成分群方法中的液液两相体系Ⅰ；当所述预设液液两相体系Ⅰ在高速逆流色谱法中的固定相保留率小于或等于第二预设值时，则重复S1步骤。

作为本发明再进一步的方案：所述第一预设值为0.6。

作为本发明再进一步的方案：所述第二预设值为20％。

具体的，采用液液两相体系Ⅰ中的上相和下相分别为流动相和固定相。高速逆流色谱法的洗脱方式有两种：一种是上相为固定相，下相为流动相，由尾端向首端洗脱；另外一种是下相为固定相，上相为流动相，由尾端向首端洗脱；根据液液两相体系Ⅰ的组成和比例确定洗脱方式，以获得20％以上的固定相保留；优选的，采用第二种洗脱方式，固定相保留率更高。

作为本发明再进一步的方案：所述高速逆流色谱仪为J-型高速逆流色谱仪，螺旋管自转半径和公转半径之比为0.5～0.8。

具体的，高速逆流色谱仪为J-型半制备高速逆流色谱仪，配备三个串联的螺旋管柱，柱体积280mL。

使用时，首先在高速逆流色谱仪中注满液液两相体系Ⅰ，然后使高速逆流色谱仪的主机转动，将流动相泵入螺旋管柱内；由进样阀进样；根据K值和保留时间关系确定馏分接收起止时间。

其中，进样样品的溶剂为异丙醇溶液；优选50％异丙醇溶液。

具体的，K值和保留时间关系为：

Rt＝Vr/v＝(VsK+Vm)/v

Vs＝280×Sf；

Vm＝280-Vs；

其中，Rt:化合物保留时间；Vr：化合物保留体积；v：流动相流速；Vs：固定相保留体积；K：化合物在体系中分配系数，由logK

将K值、固定相保留值(Sf)、流动相流速(v)带入上述公式即可确定收集的起止时间。

本申请中，所有涉及数值范围的条件均可独立地选自所述数值范围内的任意中间范围。

本申请中，如无特别说明，所有涉及数值范围的条件均包含端点值。

本发明的有益效果包括但不限于：

(1)本发明提供的制备中药提取物吸收成分群的方法，首先制备液液两相体系I，然后获得拟制备吸收成分群在液液两相体系I中的分配系数logK

(2)本发明方法中高速逆流色谱保留时间与分配系数唯一相关，化合物依据其分配系数大小依次洗脱，通过分段收集即可实现吸收成分群的整体制备。本发明方法具有整体性制备的特点，在高速逆流色谱无固体支撑体，保证了化合物量无损失、比例不变，操作过程简单、快速，适用于中药提取物中多组分药效物质的研究和制药工艺改进研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中的中药提取物在异丙醇-正辛醇-0.1mol/L磷酸盐缓冲液＝25:7:25(v/v/v)的logK

图2为本发明实施例2中的中药提取物在异丙醇-正辛醇-0.3mol/L磷酸盐缓冲液＝25:7:25(v/v/v)的logK

图3为本发明实施例3中的中药提取物在异丙醇-正辛醇-0.1mol/L磷酸盐缓冲液＝0:25:25(v/v/v)的logK

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

实施例1：

本实施例为中药提取物中口服吸收成分群的整体制备。

(1)中药提取物的制备

称量中药化合物(表1)标准品，溶于75％甲醇溶液制备成约1mg/mL的储备液，分别取上述储备液200μL混合制备成中药化合物混合液。

表1中药化合物列表

(2)液/液两相体系Ⅰ的选择和制备

根据现有技术中的经验值，口服吸收成分的logP

分别取异丙醇、正辛醇和0.1mol/L磷酸盐缓冲液，按比例加入分液漏斗中，摇匀，静置分层。

(3)中药化合物分配系数logK

取中药化合物混合物溶液50μL，氮吹干燥，加入液/液两相体系Ⅰ中的上相和下相各2mL，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，分别转移离心管中的上层和下层溶液各1.4mL至新离心管。氮吹干燥，加入1mL甲醇，超声溶解，涡旋30秒，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液0.7mL至新离心管。氮吹干燥，加入100μL甲醇，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液50μL至液相分析瓶，进样5μL分析，得到中药各化合物的logK

通过化合物结构计算得到logP

拟合logK

Y＝2.7862X-0.0395 (1)

R

根据最佳口服吸收的logP

(4)高速逆流色谱参数优化

将步骤(2)中的液/液两相体系Ⅰ注入高速逆流色谱仪，柱体积为280mL，优化条件为：上相为流动相，下相为固定相，主机转速800rpm，流动相流速(v)2mL/min，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样5mL中药标准品混合物，溶剂为50％异丙醇。固定相保留值(Sf)为：20％。

(5)中药化合物肠吸收成分群收集

根据公式：Rt＝Vr/v＝(VsK+Vm)/v (2)

Vs＝280×Sf；

Vm＝280-Vs；

其中，Rt:化合物保留时间；Vr：化合物保留体积；v：流动相流速；Vs：固定相保留体积；K：化合物在体系中分配系数，由logK

将K值、固定相保留值(Sf)、流动相流速(v)带入上述公式(2)确定收集的起止时间为216～266分钟。

表2中药化合物口服吸收成分群整体制备收集起止时间

实施例2：

本实施例为中药化合物小肠吸收成分群的整体制备。

(1)中药提取物的制备

称量中药化合物(表3)标准品，溶于75％甲醇溶液制备成约1mg/mL的储备液，分别取上述储备液200μL混合制备成中药化合物混合液。

表3中药化合物列表

(2)液/液两相体系Ⅰ制备

根据现有技术中的经验值，小肠吸收成分的logP

分别取异丙醇、正辛醇和0.3mol/L磷酸盐缓冲液，按比例加入分液漏斗中，摇匀，静置分层。

(3)液/液两相体系Ⅱ制备

本实施例中液/液两相体系Ⅱ为正辛醇/水两相体系。

(4)中药化合物分配系数logK

取中药化合物混合物溶液50μL，氮吹干燥，加入液/液两相体系Ⅰ中的上相和下相各2mL，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，分别转移离心管中的上层和下层溶液各1.4mL至新离心管。氮吹干燥，加入1mL甲醇，超声溶解，涡旋30秒，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液0.7mL至新离心管。氮吹干燥，加入100μL甲醇，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液50μL至液相分析瓶，进样5μL分析，得到中药各化合物的logK

通过上述方法测定中药化合物在液/液两相体系Ⅱ中的logP

拟合logK

Y＝2.3383X-0.4261 (3)

R

根据最佳小肠吸收的logP

(5)高速逆流色谱参数与实施例1一致

(6)中药小肠吸收成分群收集

与实施例1一致，将K值、固定相保留值(Sf)、流动相流速(v)带入公式(2)确定收集的起止时间为241～308分钟。

表4中药化合物肠吸收成分群整体制备收集起止时间

实施例3：

本实施例为中药化合物肠吸收成分群的整体制备。

(1)中药提取物的制备

称量中药化合物(表5)标准品，溶于75％甲醇溶液制备成约1mg/mL的储备液，分别取上述储备液200μL混合制备成中药化合物混合液。

表5中药化合物列表

(2)液/液两相体系Ⅰ的选择和制备

根据现有技术中的经验值，肠吸收成分的logP

分别取异丙醇、正辛醇和0.1mol/L磷酸盐缓冲液，按比例加入分液漏斗中，摇匀，静置分层。

(3)中药化合物分配系数logK

取中药化合物混合物溶液50μL，氮吹干燥，加入液/液两相体系Ⅰ中的上相和下相各2mL，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，分别转移离心管中的上层和下层溶液各1.4mL至新离心管。氮吹干燥，加入1mL甲醇，超声溶解，涡旋30秒，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液0.7mL至新离心管。氮吹干燥，加入100μL甲醇，超声溶解，在6000rpm转速下离心10分钟，转移离心管中的上清液50μL至液相分析瓶，进样5μL分析，得到中药各化合物的logK

通过化合物结构计算得到logP

拟合logK

Y＝0.7003X+0.04 (4)

R

根据肠吸收的logP

(4)高速逆流色谱参数优化与实施例1一致

区别在于，流动相流速(v)为3mL/min。

(5)中药化合物肠吸收成分群收集

与实施例1一致，将K值、固定相保留值(Sf)、流动相流速(v)带入上述公式(2)确定收集的起止时间为1085～1589分钟。

表6中药化合物口服吸收成分群整体制备收集起止时间

实施例4：

本实施例为川芎提取物神经系统吸收成分群整体制备。

(1)川芎提取物制备

川芎道地药材2kg粉碎，70％乙醇溶液8倍量浸泡过夜，回流提取2小时，过滤，残渣重复提取一次，过滤合并提取液并减压浓缩，得川芎提取物。

(2)液/液两相体系Ⅰ制备

根据现有技术中的经验值，神经吸收成分的logP

分别取异丙醇、正辛醇和0.1mol/L磷酸盐缓冲液，按比例加入分液漏斗中，摇匀，静置分层。

(3)川芎提取物中化合物分配系数logK

由于本实施例液液两相体系Ⅰ与实施例1中的液液两相体系Ⅰ一致，因此本实施例中logK

根据最佳神经系统吸收logP

(4)高速逆流色谱参数与实施例1一致

(5)川芎提取物神经系统吸收成分群收集

与实施例1一致，将K值、固定相保留值(Sf)、流动相流速(v)带入公式(2)确定收集的起止时间为325～431分钟。

表7川芎提取物神经系统吸收成分群整体制备收集起止时间

最终13个川芎内酯类成分被整体制备，这些化合物已被报道可被神经系统吸收，为川芎主要的药效物质。

表8整体制备川芎提取物有神经系统吸收成分群

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。