葡萄糖氧化酶纳米反应器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，特别是涉及一种葡萄糖氧化酶纳米反应器及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，葡萄糖氧化酶(GOx)因其固有的生物相容性、无毒性和独特的对β-D-葡萄糖的催化作用引起了生物医学领域越来越多的关注。GOx能有效地催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢(H

然而，葡萄糖和氧气作为GOx催化反应的底物，在人体内无处不在。因此，基于GOx的纳米载体在体内循环时，负载于纳米载体中的GOx会与人体内的葡萄糖和氧气反应产生H

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种安全性好、特异性强的葡萄糖氧化酶纳米反应器，该葡萄糖氧化酶纳米反应器具有酸响应性及良好的生物安全性，其对机体正常组织没有毒性作用，对酸性条件下的肿瘤具有一定程度的杀伤性，可用于肿瘤的治疗。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种葡萄糖氧化酶纳米反应器的制备方法，包括如下步骤：

(1)将葡萄糖氧化酶、硝酸锌和2-甲基咪唑在水中混合均匀，搅拌反应；

(2)将步骤(1)所得反应液离心，取沉淀，将沉淀洗涤，冻干，得GOx/ZIF纳米颗粒；

(3)取所述GOx/ZIF纳米颗粒分散于水中，加入硝酸锌和2-甲基咪唑，混合均匀，搅拌反应；

(4)将步骤(3)所得反应液离心，取沉淀，将沉淀洗涤，冻干，即得所述葡萄糖氧化酶纳米反应器。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述GOx/ZIF纳米颗粒、硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为5：0.5-2：5-50。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述GOx/ZIF纳米颗粒、硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为5：0.8-1.5：8-20。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述GOx/ZIF纳米颗粒、硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为5：0.9-1.2：9-11。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述GOx/ZIF纳米颗粒与所述水的配比为4-6mg：1mL。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述搅拌反应的时间为10-60min。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述搅拌反应的时间为25-35min。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述的葡萄糖氧化酶、硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为1:1-10：50-300。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述的葡萄糖氧化酶、硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为1:4-6：90-110。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述葡萄糖氧化酶与所述水的配比为1-2mg：1mL。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述搅拌反应的时间为10-60min。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述搅拌反应的时间为25-35min。

在其中一些实施例中，所述离心的转速为5000～7000rpm。

在其中一些实施例中，所述冻干的温度为-30～-10℃。

本发明还提供了一种葡萄糖氧化酶纳米反应器。

具体技术方案如下：

一种葡萄糖氧化酶纳米反应器，由上述的葡萄糖氧化酶纳米反应器的制备方法制备得到。

本发明还提供了上述的葡萄糖氧化酶纳米反应器的应用。

具体技术方案如下：

上述的葡萄糖氧化酶纳米反应器在制备抗肿瘤的药物中的应用。

本发明的还提供了一种抗肿瘤的药物。

具体技术方案如下：

一种抗肿瘤的药物，由上述的葡萄糖氧化酶纳米反应器和药物中可接受的其它原辅料制备而成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用外延生长的策略，在GOx/ZIF-8纳米反应器表面继续生长一层ZIF-8，用来屏蔽裸露在外的GOx催化位点，从而实现对机体正常组织内的葡萄糖的极少量的消耗甚至零消耗，同时可以保证屏蔽层ZIF-8在肿瘤的酸性条件下可以崩解，从而暴露出催化位点，实现肿瘤部位的葡萄糖消耗。

用本发明的葡萄糖氧化酶纳米反应器的制备方法制备得到的GOx/ZIF@ZIF纳米反应器具有以下优点：(1)尺寸均匀，粒径较小，粒径分布在100±5nm；(2)具有良好的生物相容性；(3)在中性环境下结构稳定，即在正常组织内不消耗或者消耗很少量的葡萄糖与氧气，安全无毒；(4)具有酸响应性，可在肿瘤的位置特异性响应并持续消耗葡萄糖，对肿瘤细胞造成杀伤，从而具有抗肿瘤的功能。即该GOx/ZIF@ZIF纳米反应器具有很好的生物安全性及特异性，可以用于肿瘤的治疗。

本发明的葡萄糖氧化酶纳米反应器的制备方法工艺简单、条件温和、快速高效、绿色无污染，制备过程仅需实验室常用的普通设备，不需专用设备，工艺过程简单易操作，所用原料丰富且价廉易得，可规模化生产制备。该方法可以显著地提高所述GOx纳米反应器的生物安全性及特异性。

附图说明

图1是对实施例1制得的纳米反应器GOx/ZIF与GOx/ZIF@ZIF用透射电子显微镜观察后拍摄的多张透射电镜(TEM)照片中的之一，其中，A为GOx/ZIF的TEM图像，B为GOx/ZIF@ZIF的TEM图像。

图2是GOx/ZIF纳米颗粒与GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒以及对比例1制备的纳米颗粒在不同pH值下对葡萄糖溶液催化的反应曲线图。

图3是实施例1制备的GOx/ZIF与GOx/ZIF@ZIF与乳腺癌细胞(EMT-6)共同孵育下，细胞的存活情况。

图4是四组Balb/c小鼠分别尾静脉注射PBS、GOx、GOx/ZIF与GOx/ZIF@ZIF后，小鼠的生存曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

实施例1 GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备

(1)GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将1mg GOx与5mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入100mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应30min，待溶液呈乳白色后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF纳米颗粒，其透射电镜图如图1中的A图所示。

(2)GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备：

取步骤(1)制备的5mg GOx/ZIF纳米颗粒分散于1mL的去离子水中，加入1mg的硝酸锌与10mg的2-甲基咪唑迅速混合均匀后，室温搅拌老化30min后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的反应液，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒，备用。制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的透射电镜图如图1中的B图所示，其尺寸均匀，粒径分布在100±5nm。

实施例2 GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备

(1)GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将GOx分散于去离子水中，形成浓度为100mg/mL的GOx溶液,取10μLGOx溶液与5mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入100mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应30min，待溶液呈乳白色后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF纳米颗粒。

(2)GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备：

取步骤(1)制备的5mg GOx/ZIF纳米颗粒分散于1mL的去离子水中，加入2mg的硝酸锌与50mg的2-甲基咪唑迅速混合均匀后，室温搅拌老化30min后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的反应液，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒，备用。

实施例3 GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备

(1)GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将GOx分散于去离子水中，形成浓度为100mg/mL的GOx溶液,取10μLGOx溶液与5mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入100mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应30min，待溶液呈乳白色后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF纳米颗粒。

(2)GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备：

取步骤(1)制备的5mg GOx/ZIF纳米颗粒分散于1mL的去离子水中，加入0.5mg的硝酸锌与5mg的2-甲基咪唑迅速混合均匀后，室温搅拌老化30min后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的反应液，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒，备用。

实施例4 GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备

(1)GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将GOx分散于去离子水中，形成浓度为100mg/mL的GOx溶液,取10μLGOx溶液与5mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入100mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应30min，待溶液呈乳白色后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF纳米颗粒。

(2)GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备：

取步骤(1)制备的5mg GOx/ZIF纳米颗粒分散于1mL的去离子水中，加入1mg的硝酸锌与10mg的2-甲基咪唑迅速混合均匀后，室温搅拌老化10min后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的反应液，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒，备用。

实施例5 GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备

(1)GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将GOx分散于去离子水中，形成浓度为100mg/mL的GOx溶液,取10μLGOx溶液与5mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入100mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应30min，待溶液呈乳白色后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF纳米颗粒。

(2)GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的制备：

取步骤(1)制备的5mg GOx/ZIF纳米颗粒分散于1mL的去离子水中，加入1mg的硝酸锌与10mg的2-甲基咪唑迅速混合均匀后，室温搅拌老化60min后，6000rpm离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的反应液，-20℃冷冻干燥，得GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒，备用。

对比例1

GOx/ZIF纳米颗粒的制备：

将GOx分散于去离子水中，形成浓度为100mg/mL的GOx溶液,取10μLGOx溶液与7mg硝酸锌加入1mL去离子水中混合均匀，再加入150mg的2-甲基咪唑后迅速混合均匀，并将上述溶液置于室温下搅拌反应60min，待溶液呈乳白色后，离心，取沉淀用去离子水反复清洗去除多余的GOx和未反应的前驱体，冻干，得GOx/ZIF纳米颗粒。

实施例6

GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒在不同pH值下催化葡萄糖溶液

配置11份8.4mM的葡萄糖缓冲液待用，pH值为7.4的7份、pH值为6.0的4份。分别取实施例1-5制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒、实施例1制备的GOx/ZIF纳米颗粒以及对比例1制备的样品各1mg分别与1mL的pH值为7.4的葡萄糖缓冲液混合；分别取实施例1制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒、实施例1制备的GOx/ZIF纳米颗粒以及对比例1制备的样品各1mg分别与1mL的pH值为6.0的葡萄糖缓冲液混合；并且取0.2mg GOx与1mL的pH值为6.0的葡萄糖缓冲液混合(作为对照)。将各混合液孵育不同时间(0、10、20、40、80min)后，检测不同时间点的混合液中的葡萄糖浓度。结果如图2所示：实施例1、2和实施例5制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒在中性条件下不消耗葡萄糖，在pH值为6.0时，葡萄糖逐渐减少；实施例3因为锌的添加浓度太低导致其制备的GOX/ZIF表面的ZIF层不能完全阻隔酶与葡萄糖，从而导致其制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒在中性条件下也会消耗一定量的葡萄糖；实施例4因为老化时间太短，同样没有完全形成保护层，从而导致其制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒在中性条件下也会消耗一定量的葡萄糖；GOx/ZIF纳米颗粒和对比例1制备的纳米颗粒没有在GOX/ZIF的表面形成ZIF保护层，从而导致其在中性条件下会消耗较多葡萄糖。

实施例7

GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的细胞毒性

取不同浓度的实施例1制备的GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒与GOx/ZIF纳米颗粒缓冲液(0、5、10、15、25、50μg/mL)与EMT-6细胞共同培养，调节培养基的pH分别为7.4与6.0，继续培养24h后，加入MTT后继续孵育30min，然后加入100μL的DMSO后用酶标仪记录细胞的活力，发现当培养基的pH在7.4时，GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒对EMT-6细胞没有杀伤性，GOx/ZIF纳米颗粒对细胞具有较强的杀伤性，这是由于GOx/ZIF催化葡萄糖产生了有毒的过氧化氢；当培养基的pH在6.0时，GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒也表现出较强的细胞杀伤性(如图3所示)。这说明GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒在中性条件下无细胞毒性，酸性条件下对EMT-6细胞有一定程度的杀伤；而GOx/ZIF纳米颗粒在中性条件下与酸性条件下对EMT-6细胞的杀伤能力相当，GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒表现出更好的生物安全性。

实施例8

GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒的体内毒性

将20只健康的BALB/c小鼠随机分成四组，分别注射PBS、GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒(10mg/kg)、GOx/ZIF纳米颗粒(10mg/kg)与GOx(GOx为10U)，各组小鼠经尾静脉注射上述相应受试物后，在相同的条件下继续饲养，发现GOx/ZIF纳米颗粒与GOx组的小鼠在饲养0.48h与0.8h全部死亡，而GOx/ZIF@ZIF纳米颗粒组的小鼠全部存活下来，如图4所示，说明GOx/ZIF@ZIF具有良好的生物安全性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。