一种凝结芽孢杆菌BC99的保藏方法

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌BC99的保藏方法，属于微生物技术领域。

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)为革兰氏阳性菌，在温度30～50℃，pH4.0～10.0的范围内均能生长，能分解糖类产生L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。凝结芽胞杆菌作为一种既具有乳酸菌营养和免疫的功效，又具有芽孢菌抗逆性强的优良菌种，已被广泛应用于食品、药品、保健品及畜牧水产行业。

凝结芽孢杆菌BC99，其对于高温、酸性条件、胃液、胆盐具有较强的耐受性，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.19487。由于菌株的差异性及生产工艺等方面的影响，导致市面上关于凝结芽孢杆菌的产品质量参差不齐。使用一般菌种保藏方法，存在菌种后期活化困难以及操作繁琐等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌BC99的保藏方法。

本发明涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC99，保藏编号为CGMCCNo.19487，保藏日期为2020年3月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。凝结芽孢杆菌BC99，其对于高温、酸性条件、胃液、胆盐具有较强的耐受性。

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC99的保藏方法。

本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC99的保藏方法，包括如下步骤：

(1)使用PCA培养基，制备成茄子瓶斜面，37℃空培24-48h备用；

(2)用移液枪吸取凝结芽孢杆菌BC99的甘油菌液，打入准备好的茄子瓶斜面上，用接种针自下而上将菌液涂布均匀；

(3)将茄子瓶置于40-45℃恒温培养箱培养48～72h；

(4)取出斜面，向茄子瓶中加入已灭菌的10～30vol％甘油，将斜面上的菌苔完全洗脱下来，分装至已灭菌的冻存管中，置于冰箱冷藏保存。

上述方案中，作为进一步的优选，步骤(3)中，培养箱中的温度是42℃。

上述方案中，作为进一步的优选，步骤(4)中，冰箱中的温度是-20℃。

本发明提供的凝结芽孢杆菌菌株BC99相对于市面上的凝结芽孢杆菌产品，具有较高的耐高温、耐酸、耐胃液、耐胆盐等的耐受能力，对于产品的加工、储藏、运输以及使用等方面具有明显的优势。常用的甘油管保藏，存在着长期保藏后活化困难的情况，冷冻干燥保藏又存在操作繁琐，技术要求高，且需要冻干机等设备的不便，本发明提供一种凝结芽孢杆菌BC99的菌种保藏方法。通过本发明方法培养后，使斜面上的菌大量形成芽孢后进行保藏。芽孢具有抗逆性强的优点。长期保藏也能保持较高活性，菌体一致性好，不存在后期活化困难等问题，操作简单方便。

附图说明

图1，使用本发明保藏方法保藏的菌液进行芽孢染色镜检结果。

图2，使用常规菌液保藏方法保藏的菌液进行芽孢染色镜检结果。

具体实施方式

本发明实验中所用样品为凝结芽孢杆菌BC99经发酵处理后获得的菌粉，以下实验所用样品均为同一批次菌粉，菌粉芽孢数为2200亿cfu/g。

实施例1菌种耐受性实验

耐高温实验：取2g菌粉均匀的铺平在9mm培养皿中，盖上平皿，分别置于120℃和150℃烘箱中加热，在加热15min和30min后取出样品，按微生物检测方法检测其中芽孢数，计算其芽孢存活率，检测结果如下:

凝结芽孢杆菌BC99菌粉在经过120℃和150℃高温处理的条件下，其芽孢仍然具有较高的存活率，表明凝结芽孢杆菌BC99具有很好的耐高温能力。

耐酸实验：取3个灭菌的250ml三角瓶(瓶中装入适量小玻璃珠)，每个三角瓶中加入99.0ml无菌水(无菌水灭菌前加入0.5％吐温80)，分别用盐酸将pH调为3.0、2.5、2.0，精确称量1.0g凝结芽孢杆菌菌粉分别加入3个三角瓶中，置于摇床上摇2.5h，摇床温度控制为20℃，转速为250r/min，待时间结束后，分别检测其芽孢存活数，计算芽孢存活率，检测结果如下:

实验结果表明凝结芽孢杆菌BC99菌粉在pH为3.0、2.5、2.0的酸性条件下处理2.5h后仍具有较高的存活率，表明其具有较强的耐酸性。

耐胃液实验：称量200ml纯净水，加入0.6g胃蛋白酶配制成0.3％的人工胃液溶液，加入1.0g吐温80，用盐酸将pH调为2.0后使用0.22um无菌滤头过滤备用。取灭菌后的250三角瓶(瓶中装入适量小玻璃珠)，三角瓶中加入99.0ml配制好的人工胃液，精确称量1.0g凝结芽孢杆菌菌粉加入三角瓶中，置于摇床上摇2.5h，摇床温度控制为20℃，转速为250r/min，待时间结束后，取样检测其芽孢数为1400亿cfu/g，芽孢存活率为63.6％。

耐胆盐实验：称量200ml纯净水，加入0.6g胆盐配制成0.3％的胆盐溶液，加入1.0g吐温80，用0.22um无菌滤头过滤备用。取灭菌后的250三角瓶(瓶中装入适量小玻璃珠)，三角瓶中加入99.0ml配制好的胆盐溶液，精确称量1.0g凝结芽孢杆菌菌粉加入三角瓶中，置于摇床上摇2.5h，摇床温度控制为20℃，转速为250r/min，待时间结束后，取样检测其芽孢数为2100亿cfu/g，芽孢存活率为95.5％。

实施例2菌种保藏方法

一般常规菌种保藏方法为取菌种接种在液体培养基中进行液体扩培，培养12～24h后取菌液与甘油进行1：1混合，制备成甘油终浓度为15％～30％的甘油菌液，置于-20℃条件下保藏。

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌BC99的保藏方法。配制PCA液体培养基，pH调为7.0，每个茄子瓶中装入60mlPCA液体培养基，按1.8％的含量加入琼脂粉，封口摇匀后按121摄氏度20min的条件灭菌，灭菌结束后取出倾斜一定角度摆放制成斜面，待培养基凝固后，放置于37℃培养箱空培48h取出备用。

取保存的凝结芽孢杆菌BC99甘油管，解冻后用移液枪吸取0.1ml甘油菌液，打入准备好的斜面上，用接种针自下而上将菌液涂布均匀，操作完成后将斜面置于42℃恒温培养箱培养48～72h。待培养时间结束后取出斜面，向茄子瓶中加入适量灭菌的10％～30％甘油，将斜面上的菌苔完全洗脱下来，分装至已灭菌的冻存管中，置于-20℃冰箱冷藏保存。取该方法与常规保藏方法制备的甘油菌液检测活菌数与芽孢数，检测结果如下：

将使用该保藏方法与常规菌液保藏方法保藏的菌液进行芽孢染色镜检(显微镜放大倍数为1600倍)，对比结果如图1和图2所示。

从镜检结果可以明显看出，本发明方法保藏的甘油管菌液中，芽孢率显著高于常规菌种保藏方法的芽孢率，且其芽孢成熟度更好。根据检测结果可知：本发明保藏方法甘油菌液芽孢率为81.7％，常规保藏方法保藏的甘油菌液芽孢率仅为3.7％，本发明方法保藏的甘油菌液芽孢率显著高于常规保藏方法。将保藏半年后的甘油管取出检测其活菌数，该保藏方法活菌存活率为96.7％，常规保藏方法活菌存活率为80.6％，该方法保藏的凝结芽孢杆菌BC99保藏存活率更高，长时间保藏其稳定性也更好。