一种真菌漆酶驱动酚类污染物腐殖化的方法及应用

技术领域

本发明属于环境微生物酶学、污染生态学和农艺学等交叉融合领域，具体涉及真菌漆酶驱动腐殖化在酚类污染物解毒和植物促生长中的应用。

背景技术

全球淡水资源中雌激素等酚类污染日趋严重，对水产生物和人群健康构成极大威胁。水生态系统中的雌激素主要来源于污水处理厂的直接排放和农用动物粪尿的间接输入。雌激素被生物体吸收和富集后，会干扰细胞内源性激素的合成和代谢功能，从而对机体的生长、发育和繁殖产生负面影响。虽然，水环境中雌激素的浓度相对较低，但其在纳克每升的含量即可引发水生物种的毒性效应，特别是雌激素活性最高的17β-雌二醇(E2)。例如，低浓度E2能够导致雄鱼雌性化，甚至加速某些水生动物的死亡和灭绝。因此，如何高效去除水体中雌激素等酚类污染物已经成为水生态修复领域亟待解决的关键问题之一。

当前，污水处理厂主要通过化学氧化和微生物代谢的方法，消减水体中雌激素等酚类污染物。众多资料已证实，化学氧化可快速去除环境中高浓度的雌激素等酚类污染物，但对低浓度有害酚类的净化效果不明显，且反应过程中经常产生毒性更强的副产物，会对生态环境造成二次破环。功能微生物在酚类污染物的降解和代谢中发挥重要作用，然而它们对环境要求苛刻，容易受到pH、温度、金属离子、土著微生物、腐殖酸(HA)、天然小分子酚类如香草酸(Vaa)和阿魏酸(Fea)等的影响，导致菌体生长缓慢、降解周期延长，难以实际应用。白腐真菌普遍存在于生态系统中，其分泌的胞外漆酶(EC 1.10.3.2，一种含铜多酚氧化酶)能够催化多种有毒酚类的氧化分解和再聚合反应，生成种类繁多的自聚合和共聚合产物。在真菌漆酶的催化中心包含4个铜原子，其中T1-Cu位点负责从底物中提取电子并将其氧化成苯氧自由基或醌类中间体，而T2/T3-Cu位点(三核铜簇)则接收组氨酸-半胱氨酸-组氨酸三肽序列转移的电子并将氧气还原成水。该过程类似于天然腐殖化反应，不仅有利于酚类污染物的解毒，也能够调节全球有机碳的循环。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种净化水体中雌激素和天然小分子酚类化合物的方法，以及如何利用反应过程中生成的聚合沉淀物促进植物生长。

本发明的技术方案为：一种去除水体中酚类污染物的方法，该方法以变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶作为催化剂，以17β-雌二醇(E2)与酚类物质作为底物，腐殖化反应形成聚合物沉淀；所述酚类物质为腐殖酸(HA)、香草酸(Vaa)或阿魏酸(Fea)中的任一种或多种的混合。

一类聚合物，由变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶催化17β-雌二醇和酚类物质聚合而成，所述酚类物质为腐殖酸(HA)、香草酸(Vaa)或阿魏酸(Fea)，形成的聚合物为E2-Ha聚合物、E2-Vaa聚合物或E2-Fea聚合物。

上述所述的聚合物在促进植物种子萌芽、加速幼苗根伸长上的应用。

上述所述的聚合物在提高植物幼苗NaCl耐受性上的应用。

进一步地，所述植物为萝卜。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶驱动腐殖化对溶液中E2的去除率均高达99.9％以上。与传统的化学氧化和微生物代谢相反，变色栓菌漆酶能催化E2、Vaa和Fea等酚类污染物的单电子氧化，生成化学结构稳定、不易迁移、毒性小甚至无毒的大分子C—C或C—O—C共价聚合沉淀物。这些含有多种亲水/极性基团的高度交联的大分子聚合沉淀产物可显著地提高萝卜种子的发芽率、根长和盐耐受性。

本发明提供的一种变色栓菌漆酶驱动酚类污染物腐殖化的方法，能用于高效去除混合溶液中雌激素等酚类物质，规避母体化合物的生物毒性。该反应遵循绿色化学的核心原理，具有处理工艺简单、催化效率高、绿色生态环保等优点。利用变色栓菌漆酶驱动腐殖化制备的高度交联聚合物，具有类似腐殖质的生物学功能，可有效地促进植物种子发芽、根伸长和盐耐受性。变色栓菌漆酶驱动腐殖化在实现酚类污染物解毒、有机碳固定和全球作物增产增收等方面具有重要的环境意义和广阔的产业前景。

附图说明

图1 HA、Vaa和Fea对变色栓菌漆酶催化E2去除的影响；

图2腐殖化聚合沉淀产物的表面形态特征；

图3腐殖化聚合沉淀产物的官能团结构；

图4腐殖化聚合沉淀产物的化学结构；

图5腐殖化聚合沉淀产物影响萝卜种子发芽和根伸长；

图6腐殖化聚合沉淀产物对萝卜幼苗叶绿素含量和盐耐受性的影响。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1 HA、Vaa和Fea对变色栓菌漆酶驱动E2转化动力学的影响

采用批量平衡试验方法，研究HA、Vaa和Fea对变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶驱动E2转化动力学的影响。在50mL玻璃反应器中分装20mL、pH 5.0的10mmol·L

如图1所示，在酶促反应3h以内，添加HA、Vaa和Fea均显著地抑制了变色栓菌漆酶催化E2的转化；随着反应时间的增加，E2去除率呈现递增趋势。当反应12h后，不同处理组中E2的去除率均高达99.9％，表明变色栓菌漆酶驱动腐殖化可有效地消除环境中E2。拟合准一级动力学方程，计算出未添加HA、Vaa和Fea处理组中E2的转化速率常数(k)值为2.17h

实施例2变色栓菌漆酶驱动腐殖化中形成的大分子聚合沉淀物的性能表征

通过大规模试验方法，收集变色栓菌漆酶驱动腐殖化反应中形成的高度交联的E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合沉淀产物。1L玻璃反应器中包含500mL 10mmol·L

结果如图2所示，变色栓菌漆酶驱动腐殖化中形成的高度交联的E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合沉淀物分别呈现深褐色、深棕色和深黄色，SEM图像显示这些聚合物的表面形貌紧密且不规则。主要是因为变色栓菌漆酶可以驱动E2、HA、Vaa和Fea发生腐殖化反应，生成大量高度交联的疏水性聚合沉淀产物(周围水分子对疏水分子的挤压)。FTIR数据显示，E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合沉淀产物分别在3431.8、3439.5和3439.4cm

实施例3腐殖化聚合产物对萝卜种子发芽率和发芽指数(GI)的影响

选用广泛种植的萝卜(Raphanus sativus L.)作为受试植物，研究E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物对萝卜种子发芽率、根伸长和发芽指数(GI)的影响。采用75％乙醇对萝卜种子进行表面消毒灭菌5min后，再用无菌水充分清洗5次并浸泡2h。将上述处理的萝卜种子分别播种在含有100mg·L

GI的计算公式如下：

GI＝GP×(La÷Lc) (1)

其中GP表示萌发种子数量占空白对照组的百分比，La和Lc分别表示处理组和空白对照组中萝卜幼苗根长的平均值。

供试样品对萝卜种子的毒性程度：GI>80％，无抑制；60％

不同处理组对萝卜种子形态学的影响如图5所示，具体表现为：添加E2-Vaa和E2-Fea对萝卜种子产生明显毒害作用，如抑制萝卜种子的萌芽和幼苗的根伸长；而添加E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物可以提高种子发芽率、根伸长，显著地降低E2和酚类化合物对萝卜种子的毒害作用。例如，在MS固体培养基中添加E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea培养1.5d后，萝卜种子发芽率分别为30.0％、15.0％和45.0％，GI分别为26.35％、4.77％和10.26％，种子萌芽受到严重抑制(GI<40％)；而在MS固体培养基中添加E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物培养1.5d后，萝卜种子发芽率分别为82.5％、80.0％和77.5％，GI分别为129.34％、127.18％和117.36％(表1)。这些结果证实变色栓菌漆酶驱动腐殖化中形成的聚合物不仅能够有效地减低E2、Vaa和Fea的生物毒性，也可以用于促进萝卜种子萌芽、加速幼苗根伸长。由此可见，真菌漆酶驱动腐殖化有利于酚类污染物的自然解毒、有机碳固定和作物增产增收。

表1腐殖化聚合沉淀产物对萝卜种子发芽率、根长和GI的影响

实施例4腐殖化聚合产物对萝卜幼苗NaCl耐受性的影响

通过测定植物叶绿素水平，定量评估萝卜幼苗对NaCl胁迫的抗性。将在固体MS培养基上育苗3d(根长1.64cm)的萝卜幼苗，重新移栽到分别含有E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物的新鲜固体MS平板上(包含250mmol·L

C

C

C

其中C

选择E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物作为类腐殖质有机肥，通过检测萝卜幼苗生长状况和叶绿素含量评估其对NaCl的耐受性。如图6所示，在未添加聚合物的对照组中，萝卜幼苗出现了一定程度的表观伤害，具体症状为叶片卷缩，出现萎蔫等现象；而添加聚合物处理的萝卜幼苗对NaCl的敏感性显著地降低，表现出良好的生长状态(叶片未出现卷缩和萎蔫现象)。例如，与未添加聚合物的对照组相比，添加E2-HA、E2-Vaa和E2-Fea聚合物的处理组中萝卜叶片的叶绿素a含量分别增加了33.42％、29.04％和42.59％，叶绿素b含量分别增加了41.91％、42.08％和64.26％，叶绿素a+b含量分别增加了36.83％、34.25％和51.22％。分析原因可能是由于这些聚合物在萝卜幼苗根表面的细胞壁上短暂积累，随后导致聚合物的构象发生变化，该变化属于有益的胁迫作用，可提高幼苗对盐的耐受性。由此可见，真菌漆酶作为一种“绿色生物催化剂”，其驱动的腐殖化反应在酚类污染物解毒、有机碳固定、全球作物增产增收等方面发挥重要作用。