一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2的潜伏期可长达24天，传染性强，与引发非典SARS 病毒不同，部分病例潜伏期具有传染性，另有一些病毒携带者没有表现出任何明显 症状。这对疫情的防控增加了难度。针对新型冠状病毒，目前国内外尚无明确验证 的特效抗病毒药物。因此做好预防，阻断病毒的传播是控制疫情的关键。而疫苗的 应用已在消除多种传染病中发挥了不可替代的作用。

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，传播速度快，传染性强，并具有一定季 节性。流感病毒会不定期地引起大流行，导致严重的呼吸系统疾病,死亡率很高。流感病毒完整基因片段的重组形成新亚型，而且由于人群缺少对新亚型变异病毒株的免疫力，从而引起大流行。病毒基因突变的发生以及新亚型病毒的出现，都引起了人们对健康问题的担忧。由于耐药性的产生，流感没有得到有效的控制，所以疫苗接种是预防和控制流感的主要策略。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种基于流感病毒载体的的新型冠状病毒疫苗。

本发明的第二个目的在于提供一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗的 制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种基于流感病毒载体的的新型冠状病毒疫苗，其 包括负载有新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1的流感病毒载体。

作为优选的：所述的疫苗为DNA质粒或RNA表达质粒。

作为优选的：所述流感病毒载体包含截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列，截短的基因序列保留3’与5’端的编码区包装信号序列；

所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1插入截短的PB2、PB1、 PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列中。

优选在PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列的开放阅读框 中插入新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1。

作为优选的：所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1 3’端连接有 NA基因截短片段，所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号。

NA是流感病毒粒子表面的第二种糖蛋白，是一种典型的Ⅱ型糖蛋白，氨基端 朝向病毒粒子内部。NA蛋白在结构上形成一个四聚体，每个蛋白单体都由一段短 的非保守的氨基端细胞质区、一个疏水的跨膜区、一个茎区和一个球状的头部组成。 本申请选取3’端第1-201个核苷酸，该段包含了NA的3’端编码区包装信号(183 个核苷酸)，将该段与新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1用接头序列 连接，再插入截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列上。此时， NA的第1-201个核苷酸作为一个基座，达到将新型冠状病毒S蛋白受体结合区带 到流感病毒表面的目的。

所述NA基因截短片段所编码的氨基酸序列为：

MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYK NSTWVKDTTS(SEQ ID NO.1)；

作为优选的：所述NA基因截短片段的核苷酸序列为：

atgaatccaaatcagaaaataacaaccattggatcaatctgtctggtagtcggactaattagcctaatattgcaaataggga atataatctcaatatggattagccattcaattcaaactggaagtcaaaaccatactggaatatgcaaccaaaacatcattacctataa aaatagcacctgggtaaaggacacaacttca(SEQ ID NO.2)。

作为优选的：所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1与NA基因 截短片段通过接头序列(Linker)相连。

常用的linker有GGGSG、GGGGS或GSG。当然，还可以采用其他常用的融 合蛋白linker。

作为优选的：所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区的氨基酸序列如下所示：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP DDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCN GVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS (SEQ ID NO.3)

新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1的核苷酸序列如下所示： agggtgcagccaacagagtccatcgtgcgctttcccaatatcaccaacctgtgcccttttggcgaggtgttcaatgccacacgctt cgccagcgtgtacgcctggaataggaagcgcatctccaactgcgtggccgactattctgtgctgtacaacagcgcctccttctct acctttaagtgttatggcgtgagccccaccaagctgaatgatctgtgctttacaaacgtgtacgccgattccttcgtgatcaggggc gacgaggtgcgccagatcgcaccaggacagaccggcaagatcgcagactacaattataagctgcctgacgatttcacaggct gcgtgatcgcctggaactctaacaatctggatagcaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagtctaat ctgaagccattcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggccggctctacaccctgcaatggcgtggagggctttaactgt tatttccctctgcagtcctacggcttccagccaaccaacggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgtcttttgagct gctgcacgcacctgcaaccgtgtgcggcccaaagaagagcacaaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacg gactgaccggcacaggcgtgctgaccgagagcaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagatac cacagacgccgtgcgcgaccctcagaccctggagatcctggacatcacaccatgttcc(SEQ ID NO.4)。

所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区的氨基酸序列所表达的蛋白可在人体内：

诱导免疫应答；或

产生生物报告分子；或

用于检测的追踪分子；或

调节基因功能；或

作为治疗性分子。

作为优选的：所述流感病毒载体衍生自甲型或乙型流感病毒株，优选为H1N1 亚型流感病毒株。

作为优选的：所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。

本发明第二个方面，提供一种基于流感病毒载体的的新型冠状病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将流感病毒基因组PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS基因中的 至少一个截短，保留3’与5’端的编码区包装信号序列；

(2)将NA基因截短片段与新型冠状病毒S蛋白受体结合区编码基因SC2R1 连接后，插入流感病毒截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列 上，得到一种基于流感病毒载体的的新型冠状病毒疫苗；

作为优选地：所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号。

作为优选地：所述NA基因截短片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

作为优选地：所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选的：所述新型冠状病毒S蛋白受体结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果是：本发明是基于流感病毒载体的的新型冠状病毒疫苗，能 够高效表达两种抗原，即本身的HA抗原与外源的SC2R1抗原，这使得该疫苗能诱 发两种抗原的免疫反应，达到同时预防流感病毒和新冠肺炎病毒的目的，一次性解 决流感和新冠两大传染病对社会经济等带来的影响。同时，流感疫苗基于现有成熟 流感平台技术，可大规模制备生产，且流感疫苗使用历史悠久，具有良好安全性。

附图说明

图1载体构建设计示意图。

图2载体pMPR8-NA-SC2R1、pMPR8-PB2-NA SC2R1、pMPR8-PB1-PB2构建 流程图。

图3载体pMPR8-NA-SC2R1、pMPR8-PB2-NA-SC2R1、pMPR8-PB1-PB2骨 架与片段的PCR扩增结果。

图4质粒pMPR8-NA-SC2R1、pMPR8-PB2-NA-SC2R1、pMPR8-PB1-PB2的 PCR扩增鉴定结果。

图5反向遗传技术拯救流感病毒示意图。

图6病毒PR8-NA-SC2R1的SC2R1蛋白表达验证结果。

图7病毒PR8-NA-SC2R1的HA蛋白表达验证结果。

图8 SC2R1抗体ELISA结果。

图9 HA抗体的HAI结果。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明术语“2019-nCoV”是一种新型冠状病毒，传染性强。其蛋白分为：刺突糖蛋白(S蛋白)、包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)，和核衣壳蛋白(N蛋白)。S蛋 白(刺突蛋白，spike protein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)， S1和S2。S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合，对于病毒颗粒进入细胞至关重要， 是病毒感染宿主细胞的关键因子。其中S1主要包含有受体结合区，负责识别细胞的受体， 受体结合区直接参与了宿主受体的识别，该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感 染特性的变化。S蛋白的第331～524个氨基酸，被称为受体绑定结构域，本申请截取完 整的受体结合区SC2R1序列，即S的319-591个氨基酸，通过密码子优化，得到819bp 的碱基片段，如SEQ IDNO.4所示。

本发明术语“流感病毒”是单负链RNA病毒，表达包含PB2、PB1、PA、NP、 HA、NA、M、NS在内的八个蛋白，其中PB2蛋白通过与宿主mRNA前体分子的 帽子结构结合，对于产生病毒vRNA转录所需的引物和转录过程的起始发挥重要作 用。PB2蛋白还参与vRNA的复制，是流感病毒致病性的重要决定因子。PB2全长 759个氨基酸，在将其适时截短后，其容纳外源基因的能力也相对变大。NA是流 感病毒粒子表面的第二种糖蛋白，是一种典型的Ⅱ型糖蛋白，氨基端朝向病毒粒子 内部。NA蛋白在结构上形成一个四聚体，每个蛋白单体都由一段短的非保守的氨 基端细胞质区、一个疏水的跨膜区、一个茎区和一个球状的头部组成。我们选取N 端第1-201个核苷酸，该段包含了NA的3’端编码区包装信号(183个核苷酸)， 将该段与SC2R1用接头序列连接，再插入截短的PB2基因序列上。此时，NA的第 1-201个核苷酸作为一个基座，达到将SC2R1带到流感病毒表面的目的。

实施例1一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗

作为本发明的一个实施例，所述流感病毒载体包含截短的PB2基因序列，所述 截短的PB2基因序列分别保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全 部截掉；将NA基因截短片段(SEQ ID NO.2)与新型冠状病毒S蛋白受体结合区 编码基因SC2R1(SEQ IDNO.4)通过接头序列连接后，插入截短的PB2基因序列 的开放阅读框上。具体的制备方法如下：

1构建pMPR8-NA-SC2R1质粒

以pCDNA3.1-S质粒(pCDNA3.1为已知且高表达的载体，S为本实验优化的 SARS-CoV-2的S基因，已申请专利，专利号为202010110070.8，载体pCDNA3.1-S 可通过生物公司合成)为模板，以SC2R1-F和SC2R1-R为引物，PCR扩增获得SC2R1 片段(SEQ ID NO.4)，做胶回收纯化；以pMPR8-NA质粒(pM为已知且高表达的 载体，NA可于NCBI查到，基因序列号为AF389120.1，载体pMPR8-NA可通过生 物公司合成)为模板，以NA-F和NA-R为引物，PCR扩增得到PR8-NA骨架，做 胶回收纯化。其中PR8-NA骨架中的NA片段为NA基因截短片段，其包含3’端 编码区包装信号，序列如SEQ ID NO.2所示。将SC2R1片段与PR8-NA骨架片段 用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆 质粒pMPR8-NA-SC2R1。

SC2R1-F：gtaaaggacacaacttcaggcagcggcagggtgcagccaacagagtccatctgtgc(SEQID NO.5)，

SC2R1-R：acccagaagcacggcctctttaggaacatggtgtgatgtccaggatctt(SEQ IDNO.6)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；60℃，10s；72℃，40s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

NA-F：taaagaggccgtgcttctgggttgaattaatcaggggacgaccta(SEQ ID NO.7)，

NA-R：tgaagttgtgtcctttacccaggtgctatttttataggta(SEQ ID NO.8)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；60℃，20s；72℃，40s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

2质粒pMPR8-NA-SC2R1的PCR鉴定

SC2R1-F：gtaaaggacacaacttcaggcagcggcagggtgcagccaacagagtccatctgtgc(SEQID NO.9)，

SC2R1-R：acccagaagcacggcctctttaggaacatggtgtgatgtccaggatctt(SEQ IDNO.10)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；60℃，10s；72℃，40s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

3构建pMPR8-PB2-NA-SC2R1质粒

以pMPR8-NA-SC2R1质粒为模板，以PB2-NA(TY)-F和PB2-NA-SC2R1-R为 引物PCR扩增获得，NA-SC2R1片段，做胶回收纯化；以pMPR8-PB2质粒(pM 为已知且高表达的载体，PB2可于NCBI查到，基因序列号为AF389115.1，载体 pMPR8-PB2可通过生物公司合成)为模板，以PB2-F和PB2-R为引物，PCR扩增 得到PR8-PB2骨架，做胶回收纯化。所得PR8-PB2骨架中的PB2基因被截短，仅 保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号。将NA-SC2R1片段与PR8-PB2骨架 片段用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到 克隆质粒pMPR8-PB2-NA-SC2R1。

PB2-NA(TY)-F：ctaagaaatctaatatcgatgaatccaaatcagaaaataacaaccattggatca(SEQ ID NO.11)，

PB2-NA-SC2R1-R：aattcttttggtcgctgttttaggaacatggtgtgatgtccaggatctcc(SEQID NO.12)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；50℃，5s；72℃，35s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

PB2-F：acagcgaccaaaagaattcggatggccatcaattagtgtcga(SEQ ID NO.13)，

PB2-R：cgatattagatttcttagttcttttattctttctatattgaatata(SEQ ID NO.14)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；50℃，15s；72℃，35s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

4质粒pMPR8-PB2-NA-SC2R1的PCR鉴定

PB2-NA(TY)-F：ctaagaaatctaatatcgatgaatccaaatcagaaaataacaaccattggatca(SEQ ID NO.15)，

PB2-NA-SC2R1-R：aattcttttggtcgctgttttaggaacatggtgtgatgtccaggatctcc(SEQID NO.16)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；50℃，5s；72℃，35s；cycles 30；72℃， 5min；4℃10min。

5构建pMPR8-PB1-PB2质粒

以pMPR8-PB2质粒为模板，以PB2-P5-F和PB2-P6-R为引物PCR扩增获得 PB2片段，做胶回收纯化。以pMPR8-PB1质粒(pM为已知且高表达的载体，PB1 可于NCBI查到，基因序列号为CY148249.1，载体pMPR8-PB1可通过生物公司合 成)为模板，以PB2-P7-F和PB2-P7-R为引物，PCR扩增得到PR8-PB1骨架，做 胶回收纯化。将PB2片段与PR8-PB1骨架片段用Exnase酶进行同源重组，转化Top10 接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pMPR8-PB1-PB2。

PB2-P5-F：cacaaaatgctataagcacaatggaaagaataaaag(SEQ ID NO.17)，

PB2-P6-R：ttcatgatctcagtgaactcctaattgatggccatccga(SEQ ID NO.18)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，15s；72℃，30s；cycles 30；72℃， 5min；12℃保存。

PB2-P7-F：cttttattctttccattgtgcttatagcattttgtg(SEQ ID NO.19)，

PB2-P8-R：tcggatggccatcaattaggagttcactgagatcatgaa(SEQ ID NO.20)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，15s；72℃，30s；cycles 30；72℃， 5min；12℃保存。

6质粒pMPR8-PB1-PB2的PCR鉴定

PB2-P5-F：cacaaaatgctataagcacaatggaaagaataaaag(SEQ ID NO.21)，

PB2-P6-R：ttcatgatctcagtgaactcctaattgatggccatccga(SEQ ID NO.22)，

PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，15s；72℃，30s；cycles 30；72℃， 5min；12℃保存。

7反向遗传学技术拯救流感病毒

利用流感病毒反向遗传学系统，将质粒pMPR8-PB2-NA-SC2R1、 pMPR8-PB1-PB2与流感病毒其他7个片段质粒(pMPR8-PB1、pMPR8-PA、 pMPR8-NP、pMPR8-HA、pMPR8-NA、pMPR8-M、pMPR8-NS)共转染至293T与 MDCK混合生长细胞，60h后收取细胞与上清混合液。将此混合液接种至9日龄SPF 鸡胚，置于37℃生化培养箱培养，72h后测定血凝效价(HA)并收取鸡胚尿囊液， 即为拯救病毒PR8-NA-SC2R1(图5)。

8病毒PR8-NA-SC2R1的SC2R1蛋白表达验证

将病毒PR8-NA-SC2R1进行蔗糖梯度离心纯化，并进行WB检测，使用SC2R1 兔多抗(购自义翘神州的SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD Antibody,Rabbit PAb, AntigenAffinity Purified)作为一抗检测到SC2R1蛋白的表达。取纯化病毒加入PBS 分别使其稀释5倍、50倍、500倍，加入5×Loading Buffer(含有β-巯基乙醇)，沸 水浴10min，得到线性化蛋白产物。配制蛋白胶(5％浓缩胶+10％分离胶)，将制备 的样品上样到蛋白胶里，经过跑胶-转膜-封闭-洗膜-孵育一抗-孵育二抗-显色等过程， 得到病毒PR8-NA-SC2R1的SC2R1蛋白表达验证结果。

验证结果如图6所示，结果表明，病毒PR8-NA-SC2R1能检测到SC2R1蛋白 的表达。

9病毒PR8-NA-SC2R1的HA蛋白表达验证

将病毒PR8-NA-SC2R1进行蔗糖梯度离心纯化，并进行WB检测，使用HA 兔多抗(购自义翘神州的Influenza A H1N1(A/Puerto Rico/8/1934)Hemagglutinin/ HA Antibody,Rabbit PAb,Antigen Affinity Purified)作为一抗检测到HA蛋白的表达。 取纯化病毒感染MDCK细胞产物，加入5×Loading Buffer(含有β-巯基乙醇)，沸 水浴10min，得到线性化蛋白产物。配制蛋白胶(5％浓缩胶+10％分离胶)，将制备 的样品上样到蛋白胶里，经过跑胶-转膜-封闭-洗膜-孵育一抗-孵育二抗-显色等过程， 得到病毒PR8-NA-SC2R1的HA蛋白表达验证结果。

验证结果如图7所示，结果表明，病毒PR8-NA-SC2R1能检测到HA蛋白的表 达。

10病毒PR8-NA-SC2R1的小鼠免疫原性研究

将疫苗PR8-NA-SC2R1以不同形式免疫(滴鼻、肌注)小鼠，免疫后取血检 测SC2R1结合抗体滴度与HI滴度。结果如图8所示，经PR8-NA-SC2R1的滴鼻与 肌注免疫组均能检测到SC2R1结合抗体；如图9所示，经PR8-NA-SC2R1的滴鼻 与肌注免疫组均能检测到HA抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司

<120> 一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗及其制备方法

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 67

<212> PRT

<213> influenza virus

<400> 1

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val

1 5 10 15

Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile

20 25 30

Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile

35 40 45

Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp

50 55 60

Thr Thr Ser

65

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> influenza virus

<400> 2

atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60

agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120

ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180

tgggtaaagg acacaacttc a 201

<210> 3

<211> 273

<212> PRT

<213> 2019-nCoV

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser

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<211> 819

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

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agggtgcagc caacagagtc catcgtgcgc tttcccaata tcaccaacct gtgccctttt 60

ggcgaggtgt tcaatgccac acgcttcgcc agcgtgtacg cctggaatag gaagcgcatc 120

tccaactgcg tggccgacta ttctgtgctg tacaacagcg cctccttctc tacctttaag 180

tgttatggcg tgagccccac caagctgaat gatctgtgct ttacaaacgt gtacgccgat 240

tccttcgtga tcaggggcga cgaggtgcgc cagatcgcac caggacagac cggcaagatc 300

gcagactaca attataagct gcctgacgat ttcacaggct gcgtgatcgc ctggaactct 360

aacaatctgg atagcaaagt gggcggcaac tacaattatc tgtaccggct gtttagaaag 420

tctaatctga agccattcga gcgggacatc tccaccgaga tctaccaggc cggctctaca 480

ccctgcaatg gcgtggaggg ctttaactgt tatttccctc tgcagtccta cggcttccag 540

ccaaccaacg gcgtgggcta tcagccctac agagtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg 600

cacgcacctg caaccgtgtg cggcccaaag aagagcacaa atctggtgaa gaacaagtgc 660

gtgaacttca acttcaacgg actgaccggc acaggcgtgc tgaccgagag caacaagaag 720

ttcctgccat ttcagcagtt cggcagggac atcgcagata ccacagacgc cgtgcgcgac 780

cctcagaccc tggagatcct ggacatcaca ccatgttcc 819

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtaaaggaca caacttcagg cagcggcagg gtgcagccaa cagagtccat ctgtgc 56

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acccagaagc acggcctctt taggaacatg gtgtgatgtc caggatctt 49

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taaagaggcc gtgcttctgg gttgaattaa tcaggggacg accta 45

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgaagttgtg tcctttaccc aggtgctatt tttataggta 40

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtaaaggaca caacttcagg cagcggcagg gtgcagccaa cagagtccat ctgtgc 56

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acccagaagc acggcctctt taggaacatg gtgtgatgtc caggatctt 49

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctaagaaatc taatatcgat gaatccaaat cagaaaataa caaccattgg atca 54

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattcttttg gtcgctgttt taggaacatg gtgtgatgtc caggatctcc 50

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acagcgacca aaagaattcg gatggccatc aattagtgtc ga 42

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgatattaga tttcttagtt cttttattct ttctatattg aatata 46

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctaagaaatc taatatcgat gaatccaaat cagaaaataa caaccattgg atca 54

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

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<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cacaaaatgc tataagcaca atggaaagaa taaaag 36

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttcatgatct cagtgaactc ctaattgatg gccatccga 39

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cttttattct ttccattgtg cttatagcat tttgtg 36

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcggatggcc atcaattagg agttcactga gatcatgaa 39

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cacaaaatgc tataagcaca atggaaagaa taaaag 36

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttcatgatct cagtgaactc ctaattgatg gccatccga 39