预防狂犬病的疫苗组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种狂犬病病毒糖蛋白，其包含由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，以及用于预防狂犬病的疫苗组合物，其包含糖蛋白作为活性成分。

背景技术

由于狂犬病是携带狂犬病毒的动物咬人时发生的一种疾病，因此许多人暴露于狂犬病病毒，因为不仅生活在野外的各种动物而且宠物也携带狂犬病病毒，据报道每年有70,000或更多的人死于狂犬病。最近，通过定期给宠物接种疫苗，由宠物引起的狂犬病的发病率已急剧下降，但由如浣熊和獾等野生动物产生的森林型传播仍在继续。

同时，由于诸如蛋白质折叠和糖基化作用的问题，主要使用动物细胞而不使用细菌来生产用于预防这种狂犬病的疫苗。然而，对于使用动物细胞的疫苗生产方法而言，由于扩大大规模生产设备的成本高昂，因此疫苗生产不容易，并且在大多数情况下，疫苗价格高昂。此外，使用动物细胞制备的灭活的狂犬病病毒疫苗不仅具有难以保存的缺点，而且极有可能被可感染动物的病毒污染。但是，与动物细胞不同，植物极不可能被可感染动物的病毒污染，并且只要能够确保耕种区域，就可以在任何时间大规模生产疫苗，并且可以通过植物体长期保存。因此，预期可以稳定地生产廉价的疫苗(韩国专利申请公开号10-2013-0111581)。

发明内容

技术问题

为了解决如上所述的相关技术中的问题而提出了本发明，并且本发明的目的是提供可以使用植物体高效地生产并且显示出高的免疫原性和病毒中和能力的一种重组狂犬病病毒糖蛋白，包括其的疫苗组合物，糖蛋白的制备方法等。

然而，本发明意图解决的技术问题不限于上述的技术问题，并且从以下描述本发明所属领域普通技术人员将清楚地理解未提及的其他技术问题。

技术方案

本发明提供了包含由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的狂犬病病毒糖蛋白。在本发明的范围内，狂犬病病毒糖蛋白还包括由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的功能等同物。由于氨基酸的增加，取代或缺失，功能等同物与氨基酸序列具有至少60％或更高，优选70％或更高，更优选80％或更高，最优选90％或更高的序列同源性，并且是指显示与由SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列基本相同的活性的多肽，并且不限于此，只要该氨基酸序列是可以使用植物体稳定产生的狂犬病病毒糖蛋白的氨基酸序列即可。

此外，本发明提供了一种用于预防狂犬病的疫苗组合物和一种用于预防狂犬病的饲料组合物，其包含狂犬病病毒糖蛋白作为活性成分。

此外，本发明提供了通过将狂犬病病毒糖蛋白施用到个体来预防或治疗狂犬病的方法。

此外，本发明提供了狂犬病病毒糖蛋白在预防或治疗狂犬病中的用途。

另外，本发明提供了用于表达狂犬病病毒糖蛋白的载体，其包含编码由SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸优选为由SEQ ID NO：1表示的多核苷酸序列。

在本发明的示例性实施方式中，可以将载体顺序地连接以便在启动子基因的序列和编码由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多核苷酸中可操作。

在本发明的另一个示例性实施方式中，该启动子是花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子、pEMU启动子、甘露氨酸合酶(MAS)启动子、组蛋白启动子、Clp启动子等，但不限于此。

在本发明的另一个示例性实施方式中，重组表达载体可以进一步包括编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸，编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的基因，编码四个或更多个连续的组氨酸的基因等。

此外，本发明提供了用载体转化的转基因生物体。

在本发明的示例性实施方式中，转基因生物体可以是微生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、沙门氏菌(Salmonella)和酵母，包括昆虫细胞和人细胞的动物细胞，动物如小鼠、大鼠、狗、猴子、猪、马和牛，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，植物等，该植物可以是粮食作物，包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、小麦、红豆、燕麦和高粱；蔬菜作物，包括芥菜、大白菜、白萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、卷心菜、甜瓜、南瓜、葱、洋葱和胡萝卜；特色作物，包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生和油菜籽；水果，包括苹果、梨、枣、桃子、葡萄、橘子、柿子、李子、杏子和香蕉；开花植物包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合和郁金香等，但不限于此，只要它可以是可以用本发明的载体转化的生物即可。

此外，本发明提供了狂犬病病毒糖蛋白的生产方法，该方法包括：(a)培养转基因生物体；(b)从转基因生物体或培养液中分离出狂犬病病毒糖蛋白，并纯化分离的狂犬病病毒糖蛋白。转基因生物体可以优选是细胞本身，植物体或包括该细胞的培养产物，并且培养液可以优选是在培养细胞后从中去除细胞的培养液，但不限于此，只要它包括本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白。

有益效果

由于根据本发明的狂犬病病毒糖蛋白不仅在植物体内有效表达，而且具有高溶解度，因此易于分离和纯化，可以低成本大量生产狂犬病病毒糖蛋白，从而预期本发明的狂犬病病毒糖蛋白可广泛用于使用狂犬病病毒糖蛋白的各个领域。此外，由于本发明的狂犬病病毒糖蛋白在体内显示出显著的免疫原性和病毒中和能力，因此还可以用作新型狂犬病疫苗组合物。

附图说明

图1是说明根据本发明示例性实施方式的用于表达重组狂犬病病毒糖蛋白的基因的排列的图。

图2是说明通过蛋白质印迹确认根据本发明的实施方式的重组狂犬病病毒糖蛋白的溶解度的结果的图。

图3是说明在分离根据本发明的示例性实施方式的重组狂犬病病毒糖蛋白并纯化分离的重组狂犬病病毒糖蛋白之后通过SDS-PAGE确认的结果的图。

图4是说明确认根据本发明示例性实施方式的重组狂犬病病毒糖蛋白是否被糖基化的结果的图。

图5是说明确认根据本发明示例性实施方式的重组狂犬病病毒的免疫原性的结果的图。

具体实施方式

在本发明中，证实了，当使用由SEQ ID NO：1表示的狂犬病病毒糖蛋白基因时，即使在植物体内也可以有效地生产和分离具有高免疫原性和病毒中和能力的狂犬病病毒糖蛋白。因此，由于可以稳定且有效地大量生产本发明的狂犬病病毒糖蛋白，因此预期可以提供便宜且稳定的狂犬病疫苗。

如本文所用，“抗原”通常是指在体内引起免疫应答的所有物质，并且优选是病毒、化学物质、细菌、花粉、癌症细胞、虾等，或其部分肽或蛋白质，但不限于此，只要它是可以在体内引起免疫反应的物质即可。

如本文所用，“狂犬病病毒”是指弹状病毒科(Rhabdoviridae)的最广为人知的病原体，属于狂犬病病毒属(Lyssavirus)。弹状病毒科的基因组由约11至15kb的非分段(non-segmented)负单链RNA组成，并且五个基因以3'-N(核蛋白)-P(磷酸蛋白)-M(基质蛋白)-G(糖蛋白)-L(聚合酶)-5'的顺序排列。狂犬病病毒具有子弹形的外衣壳，外衣壳部分由包含糖蛋白(G)和基质蛋白(M)的双层脂质膜组成。糖蛋白优选由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列表示。此外，本发明的糖蛋白在本发明的范围内包括SEQ ID NO：1的变体。具体而言，该基因可包括与SEQ ID No.1的碱基序列具有70％或更高，更优选80％，或最优选90％或更高的序列同源性的碱基序列。

如本文所用，“疫苗”是含有在生物体中引起免疫应答的抗原的生物制剂，并且是指通过注射或口服给药给人或动物以预防感染性疾病而在生物体中诱导免疫力的免疫原。动物是人类或非人类动物，并且非人类动物是指猪、牛、马、狗、山羊、绵羊等，但不限于此。

如本文所用，“表达载体”是指能够表达由插入载体中的外源核酸编码的肽或蛋白质的载体，优选地是制备载体以表达融合有猪Fc片段的靶抗原。“载体”是指用于在体外、离体或体内将碱基引入和/或转移到宿主细胞中的任何介质，并且可以是复制子，可以将另一个DNA片段结合到该复制子上以产生结合片段的复制，“复制子”是指任何遗传单元(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒等)，其在体内起着DNA复制的自主单元的作用，也就是说，能够在自身控制下复制的遗传单元。本发明的重组表达载体可以优选地包括作为RNA聚合酶结合的转录起始因子的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、调节转录和翻译终止的序列、终止子等，更优选地，可以进一步包括M17的5'UTR位点基因以增加蛋白质的合成量，用于将靶蛋白转移至内质网状组织的BiP基因，用于使蛋白质的降解最小化使得该蛋白可以稳定地保持在内质网中的HDEL基因等，甚至更优选地，可以进一步包括选择标记基因例如用于容易分离重组蛋白的标签基因(tag gene)和用于选择转基因生物体的抗生素抗性基因等。

标签基因可以包括例如Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、IgG-Fc标签、CTB标签、Softag 1标签、Softag 3标签、Strep标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签等，选择标记基因可包括，例如，除草剂抗性基因例如草甘膦或草丁膦(phosphinothricin)，抗生素抗性基因例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素和氯霉素，aadA基因等，启动子可以包括例如pEMU启动子、甘露氨酸合酶(MAS)启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、花椰菜花叶病毒衍生的35S启动子、花椰菜花叶病毒衍生的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1a)启动子等，终止子的代表性实施例包括胭脂氨酸合酶(NOS)终止子、水稻淀粉酶A终止子、菜豆蛋白终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱基因的终止子，大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，但是实施例仅是说明性的，并且不限于此。

如本文所用，“转化”统指通过注射DNA而引起的活生物体的遗传特性的变化，“转基因生物体”是通过分子遗传方法注射外部基因而制备的生物体，优选地，是通过本发明的重组表达载体转化的生物体，生物体不受限制，只要是活的生物体就可以，如微生物，真核细胞，昆虫，动物和植物，优选大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴子、猪、马、牛、根癌土壤杆菌、植物等，但不限于此。可以通过如转化、转染、土壤杆菌介导的转化、粒子枪轰击、超声处理、电穿孔和聚乙二醇(PEG)介导的转化的方法来制备转基因生物体，但是没有限制，只要它是一种能够注射本发明的载体的方法即可。

如本文所用，“溶解度”是指靶蛋白或肽可以溶解在适于向人体施用的溶剂中的程度。具体地，溶解度可以指示在特定温度下的溶质在给定溶剂中的饱和度。可以通过确定溶质的饱和浓度来测量溶解度，例如，将过量的溶质添加到溶剂中，搅拌并过滤所得混合物，然后可以使用UV分光光度计、HPLC等测量浓度，但测定溶解度的方法不限于此，高溶解度在重组蛋白的分离和纯化中是有利的，并且具有抑制重组蛋白的聚集并因此具有保持重组蛋白的生理活性或药理活性的优点。

如本文所用，“预防”是指通过施用根据本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白来抑制狂犬病或延迟狂犬病发作的所有作用。

如本文所用，“个体”是指可以对其施用本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白的受试者，并且该受试者不受限制。

本发明的“疫苗组合物”可以根据常规方法以口服制剂的形式配制，如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂、无菌注射溶液等。当制备组合物时，可以使用常用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂来制备组合物。用于口服制剂的固体制剂包括片剂、药丸、粉末、颗粒等，并且所述固体制剂可以通过混合至少一种赋形剂和卵磷脂类乳化剂来制备，所述赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。另外，除了简单的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。作为口服施用的液体制剂，可以使用悬浮液、内部使用的液体、乳剂、糖浆等，并且除了水和液体石蜡是简单常用的稀释剂之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂的实施例包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂和冻干制剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇，诸如橄榄油的植物油，诸如油酸乙酯的可注射酯等。此外，可以进一步包括常规已知的“免疫抗原佐剂”。佐剂可以不受限制地使用，只要其在本领域中是已知的即可，但是例如，可以通过进一步包括弗氏完全佐剂或不完全佐剂来增强免疫原性。

本发明的疫苗组合物或药物组合物可以以口服制剂的形式使用，例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆和气雾剂，和根据常规方法的外用制剂、栓剂或无菌注射液。

根据本发明的疫苗组合物的施用途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠途径。口服或肠胃外给药是优选的。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘膜内、病变内和颅内注射或输注技术。本发明的疫苗组合物也可以栓剂的形式用于直肠给药。

考虑到个体的年龄、体重、性别、身体状况等来选择根据本发明的疫苗组合物或药物组合物的剂量。在没有特殊副作用的情况下诱导个体免疫保护应答所需的量可能会有所不同，取决于用作免疫原的重组蛋白和随机赋形剂的存在。通常，每剂量包含0.1至1000μg，优选0.1至100μg的蛋白质/每毫升本发明的重组蛋白的无菌溶液。在疫苗组合物的情况下，如果需要，可以进行初始剂量，然后进行任选的重复抗原刺激。

如本文所用，“佐剂”通常是指增加对抗原的体液和/或细胞介导的免疫应答的任何材料。

本发明的“饲料组合物”是指包括本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白的饲料，该饲料的实施例包括副产品，例如猪肉、牛肉和鸡肉、玉米、大米、普通稻草、野草、草、青贮饲料、干草、山野草等，但不限于此，只要是用于饲养牲畜的饲料，就没有特别限制。将本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白添加到饲料中的方法的实施例包括如机械混合、吸附和包藏(occlusion)的方法，但不限于此。

在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

[实施例]

实施例1：表达重组狂犬病病毒糖蛋白的载体的制备

为了制备用于在植物中表达重组狂犬病病毒糖蛋白(RVGe)的表达载体，作为进行在确保公开可获得的狂犬病病毒糖蛋白基因序列后进行优化植物体中蛋白表达的研究的结果，获得编码SEQ ID NO：1的狂犬病病毒糖蛋白的多核苷酸。此外，通过在pCAMBIA1300载体的CaMV 35S启动子基因和NOS终止子之间按此顺序克隆编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸(SEQ ID NO：3)，编码狂犬病病毒糖蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：1)，编码6个连续的组氨酸的多核苷酸(SEQ ID NO：4)，以及编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的多核苷酸(SEQ IDNO：5)，构建了表达重组狂犬病病毒糖蛋白的载体。

实施例2：重组狂犬病病毒糖蛋白的表达的确认

为了确认以与实施例1相同的方式构建的载体的重组蛋白的表达，进行了瞬时表达实验，其中将转化的根癌土壤杆菌接种到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的叶片中。更具体地，使用电穿孔将用于表达重组狂犬病病毒糖蛋白的载体转化土壤杆菌(Agrobacterium)LBA4404。将转化的土壤杆菌接种到5ml的YEP液体培养基中(10g酵母提取物，10g蛋白胨，5g NaCl，50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)，然后在28℃的条件下振荡培养16小时。然后，将1ml的培养液接种到50ml的新YEP培养基中，在28℃的条件下再次振荡培养细菌6小时，然后通过将50ml所获得的培养液在4℃和7,000rpm下离心5分钟移除上清液。接下来，将获得的细菌细胞悬浮在渗透缓冲液(10mM MES(pH 5.7)，10mM MgCl

然后，通过从表达重组狂犬病病毒蛋白的本氏烟草的叶片中提取蛋白并且离心蛋白得到水溶液级分(fraction)中的重组蛋白(S)和颗粒级分中的重组蛋白(P)进行蛋白质印迹。在蛋白质提取过程中，使用添加有0.1％Triton X-100、20mM咪唑(pH 7.5)和300mMNaCl的20mM磷酸钠(pH 7.3)溶液。对于蛋白质印迹，将30μl每种获得的蛋白质级分与SDS样品缓冲液混合后，加热所得混合物，并在10％SDS-PAGE凝胶上电泳，以按大小分离蛋白质，然后将分离的蛋白质转移至PVDF膜，然后使用5％脱脂奶进行封闭步骤，并结合至与6His反应的抗体，并通过制造商提供的方法处理ECL溶液来确认重组狂犬病病毒糖蛋白。结果在图2中示出。

如图2所示，在水溶液级分(S)中确认了大多数表达的重组狂犬病病毒糖蛋白，而在颗粒级分(P)中仅观察到少量重组狂犬病病毒糖蛋白。通过该结果，可以确认表达本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白的载体可以在植物体内有效表达重组狂犬病病毒糖蛋白，使用该载体制备的重组狂犬病病毒糖蛋白具有高溶解度，因此易于分离和纯化，并且抑制了重组蛋白的聚集，从而对于维持重组蛋白的生理活性或药理活性是有效的。

实施例3：重组狂犬病病毒糖蛋白的分离和纯化

将200ml蛋白质提取液(50mM磷酸钠(pH 8.0)，300mM NaCl，20mM咪唑，0.1％Triton X-100和1X蛋白酶抑制剂)添加到40g以与实施例2相同的方式获得的本氏烟草中，通过搅拌器将组织压碎，通过在4℃和13,000rpm下离心20分钟获得蛋白质提取物。然后，为了从蛋白质提取物中分离和纯化重组狂犬病病毒糖蛋白，使用装有Ni-NTA琼脂糖树脂填充的柱子进行亲和层析。更具体地说，该柱填充有5ml的树脂，然后使用50ml的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠(pH 8.0)，300mM NaCl和20mM咪唑)进行平衡。将蛋白提取物注入平衡柱中，使用100ml洗涤缓冲液去除未结合的蛋白质，然后使用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠(pH 8.0)，300mM NaCl和300mM咪唑)进行洗脱。然后，使用大小为30kD的过滤器用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替洗脱液，并通过浓缩蛋白质获得重组狂犬病病毒糖蛋白。通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色确认所获得的蛋白质。结果在图3中示出。

如图3所示，确认纯化了具有约51Kd大小的重组狂犬病病毒糖蛋白。

实施例4：确认重组狂犬病病毒糖蛋白是否被糖基化

为了确认以与实施例3相同的方式获得的重组狂犬病病毒糖蛋白是否被糖基化，进行了内切H糖苷酶N-糖基化去除分析。更具体地，在将10X变性缓冲液(5％SDS和0.4MDTT)添加至1μg的重组狂犬病病毒糖蛋白之后，将所得混合物在100℃加热，并且加入柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)使得重组蛋白质的终浓度为50mM。然后，向其中加入50U的内切H糖苷酶，并使所得混合物在37℃下反应1小时。加入相同量的蒸馏水代替内切H糖苷酶作为对照后进行实验。反应完成后，通过与实施例2相同的方式进行蛋白质印迹，确认了根据重组狂犬病病毒糖蛋白的N-糖基化的去除而发生的分子量变化。结果在图4中示出。

如图4所示，已确认通过内切H糖苷酶降低了重组狂犬病病毒糖蛋白的分子量，由此可以确认使用植物体得到的重组狂犬病病毒糖蛋白通常被N-糖基化。

实施例5：确认重组狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性的实验

为了通过以体内诱导抗体作为抗原来确认以与实施例3相同的方式获得的重组狂犬病病毒糖蛋白是否具有免疫原性，使用6周龄的雄性C57BL/6J小鼠进行了实验。更具体地，将1μg的重组狂犬病病毒糖蛋白给予实验组小鼠(6周龄和8周龄)，并将磷酸盐缓冲盐水(PBS)给予阴性对照小鼠。当施用重组狂犬病病毒糖蛋白时，混合并施用相同量的弗氏佐剂，首先施用完全佐剂，然后再次施用不完全佐剂。两次施用重组狂犬病病毒糖蛋白后两周，收集血液，并使用涂有重组狂犬病病毒糖蛋白的ELISA板确认是否产生了针对所施用抗原的特异性抗体。使用阴性对照的4只动物(CT)和实验组的5只动物(RVGe)进行实验，结果在图5中示出。

如图5所示，在施用重组狂犬病病毒糖蛋白前的血清样品(前)和将磷酸盐缓冲盐水施用于阴性对照后的血清样品(后)中均未观察到反应性，但可以确认施用重组狂犬病病毒糖蛋白后的血清样品显示出高反应性。通过该结果，可以确认本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白充当抗原并且可以有效地产生抗体。

实施例6：确认重组狂犬病病毒糖蛋白的病毒中和能力的实验

使用以与实施例5相同的方式获得的血清，确认通过施用本发明的狂犬病病毒糖蛋白形成的抗体是否具有狂犬病毒中和能力。更具体地，将100μl的DMEM培养基等分到96孔板中每个样品4个孔中，然后将50μl待稀释的血清添加到每个第一孔中。然后，使用等分培养基的剩余三个孔进行3倍系列稀释。将稀释至浓度为100组织培养感染剂量(TCID)

表1

如表1所示，确认了实验组中两次施用本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白的个体均显示出高滴度的病毒中和抗体。

通过该结果，可以确认本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白不仅在植物体内有效表达，而且具有高溶解度，因此易于分离和纯化，并且蛋白质活性也稳定。此外，可以确认本发明的重组狂犬病病毒糖蛋白显示出高的免疫原性和病毒中和活性，因此可以用作新型狂犬病疫苗组合物。

在下文中，将描述本发明的药物组合物和饲料组合物的制备实施例，但是该描述并非旨在限制本发明，而仅旨在详细描述本发明。

制备实施例1.药物组合物的制备

1.1粉末的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白20毫克

乳糖100毫克

滑石粉10毫克

通过混合各成分并用这些成分填充密封包装来制备粉末。

1.2片剂的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白10毫克

玉米淀粉100毫克

乳糖100毫克

硬脂酸镁2毫克

混合成分之后，根据典型的片剂制备方法通过将混合物压片来制备片剂。

1.3胶囊的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白10毫克

结晶纤维素3毫克

乳糖14.8毫克

硬脂酸镁0.2毫克

通过根据常规的胶囊制备方法混合各成分并用该混合物填充明胶胶囊来制备胶囊。

1.4注射剂的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白10毫克

甘露醇180毫克

注射用无菌蒸馏水2,974毫克

Na

根据制备注射剂的常规方法，以每1安瓿瓶(2ml)中成分的含量制备注射剂。

1.5液体的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白20毫克

异构糖10克

甘露醇5克

纯净水适量

根据制备液体的常规方法，将每种成分添加至纯净水中并溶解，添加适量的柠檬香精，然后将这些成分混合，然后向其中添加纯净水以将总体积调节至100毫升，然后通过将混合物填充到棕色瓶中并对该棕色瓶进行灭菌来制备液体。

制备实施例2.饲料组合物的制备

重组狂犬病病毒糖蛋白100毫克

维生素E 0.7毫克

左旋肉碱0.7毫克

根据制备饲料的常规方法，通过混合成分来制备饲料。

提供本发明的上述描述是出于说明性目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或必要特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施方式在所有方面仅是示例性的，而不是限制性的。

工业实用性

本发明涉及一种狂犬病病毒糖蛋白，其包括由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，用于产生该糖蛋白的表达载体，用该表达载体转化的转基因生物体，用于预防狂犬病的包括糖蛋白作为活性成分的疫苗组合物等。本发明的狂犬病病毒糖蛋白不仅可以有效地在植物中表达，而且具有高溶解度，因此易于分离纯化，从而预期可以实现以低成本大量生产狂犬病病毒糖蛋白。

<110> 巴伊沃爱普有限公司

大韩民国农林畜产食品部农林畜产检疫本部

<120> 预防狂犬病的疫苗组合物及其制备方法

<130> MPCT19-146

<150> KR 10-2018-0150436

<151> 2018-11-29

<160> 5

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RVGe的DNA序列

<400> 1

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cttcagcaac acatggagtt gttggaatcc tcagtcatcc ccctgatgca tccgctggcc 1200

gatccgtcta cagttttcaa agatggcgat gaagcagaga actttgtgga ggttcacctt 1260

ccggatgtac ataaacagat ctcgggagtt gatctgggtc tccctaactg gggg 1314

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RVGe的氨基酸序列

<400> 2

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val

50 55 60

Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr

65 70 75 80

Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala

85 90 95

Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu

100 105 110

His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr Thr

115 120 125

Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu Asp Pro

130 135 140

Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Asn Gly Lys Cys Ser

145 150 155 160

Gly Ile Thr Ile Ser Ser Thr Tyr Cys Pro Thr Asn His Asp Tyr Thr

165 170 175

Ile Trp Leu Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys Asp Ile Phe

180 185 190

Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Lys Thr Cys Gly

195 200 205

Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Lys

210 215 220

Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp

225 230 235 240

Val Ala Met Gln Ala Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln

245 250 255

Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val

260 265 270

Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu

275 280 285

Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu

290 295 300

Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys

305 310 315 320

Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn

325 330 335

Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His

340 345 350

Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp

355 360 365

Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His

370 375 380

Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala

385 390 395 400

Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asn Phe Val

405 410 415

Glu Val His Leu Pro Asp Val His Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu

420 425 430

Gly Leu Pro Asn Trp Gly

435

<210> 3

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伴侣结合蛋白的DNA序列

<400> 3

atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60

tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120

ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180

ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240

tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 6 His的DNA序列

<400> 4

caccaccatc accaccat 18

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDEL的DNA序列

<400> 5

catgatgagc tc 12