酪氨酸激酶抑制剂、组成及其方法

技术领域

本申请涉及药物活性化合物。本发明提供了化合物及其组合物和使用方法。上述化合物抑制原肌球蛋白相关激酶(Trks)，可用于治疗各种疾病，包括传染病和癌症。

背景技术

原肌球蛋白相关激酶(Trks)是一类受神经营养因子调控的受体酪氨酸激酶，包括TrkA、TrkB和TrkC三个成员，分别由基因NTRK1、NTRK2和NTRK3编码。许多细胞功能，如细胞增殖、细胞分化、代谢和凋亡，都是由Trks通过磷酸化和调控其下游信号通路成员而介导的。涉及NTRK基因的基因融合导致这些激酶的持续激活或过度表达，从而增加肿瘤发生的风险。

Trk在神经的发育过程中起着重要的生理作用，包括神经轴突的生长和功能维持、记忆的发展和神经元的损伤保护等。此外，结果表明，Trk在正常组织或癌组织中表达异常，而融合可引起Trk激酶域的异常高表达和活化。Trk融合见于甲状腺癌、肺癌、结肠癌和黑色素瘤等低融合率的多种肿瘤组织中。据估计，美国每年有1500-5000名患者患有Trk融合阳性癌症。

近年来，Trk融合蛋白正逐渐成为一种有效的肿瘤靶点，其中发展最快的Trk小分子抑制剂是Loxo肿瘤公司的larotrectinib，在临床上对Trk具有很强的抑制作用。先前的申请，WO2010048314、WO2011006074、WO2016097869和WO2018077246公开了一系列Trk抑制剂。相应地，仍然需要具有更强活性和更好的肝微粒体代谢稳定性的Trk抑制剂。另外，鉴于Trk生理学功能的重要性，对Trk抑制剂的需求很大，这种抑制剂不仅可以抑制Trk A、B和C，而且可以抑制Trk A、B和C的突变形式(例如G595R、G667C、A608D、F589L、G623R)，这些突变在接受第一代Trk激酶抑制剂的患者中有报道。在本发明中，申请人发现了具有Trk抑制剂活性的有效小分子，因此可能有助于对抗癌症和/或传染病的治疗给药。这些小分子有望成为有用的药物，具有良好的稳定性、溶解性、生物利用度、治疗指数和毒性价值，这对于促进人类健康至关重要。

发明内容

本发明涉及用作Trk抑制剂的化合物。Trk抑制剂可用于治疗癌症和传染病。

本发明的化合物具有式I的通式结构。式I的化合物或其同分异构体、立体异构体，互变异构体，药学上可接受的盐，前药，螯合物，非共价复合物或溶剂化物，

其中，

环A为C

环B为5元芳香族杂环；

X和Z各自独立地选自C、N、O或S；

Y为C或N；

R

R

R

R

R

R

其中杂环或芳杂环任选地具有1、2或3个独立地选自N、S、O或B的杂原子。

式I的一些实施方案中，环A为

式I的一些实施方案中，X独立地选自O、S或N。

式I的一些实施方案中，Y为C。

式I的一些实施方案中，Z为N。

式I的一些实施方案中，R

式I的一些实施方案中，其中所述化合物是式II的化合物或其同分异构体、立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药、螯合物、非共价复合物或溶剂化物，

其中，

环A为C

R

R

R

R

其中杂环或芳杂环任选地具有1、2或3个独立地选自N、S、O或B的杂原子。

式II的一些实施方案中，环A为

式II的一些实施方案中，R

式II的一些实施方案中，R

式II的一些实施方案中，R

式II的一些实施方案中，R

式I的一些实施方案中，其中所述化合物是式III的化合物或其同分异构体、立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药、螯合物、非共价复合物或溶剂化物：

其中，

环A为C

环C为5-6元的碳环、杂环、芳基环、或杂芳基环；

X和Z各自独立地选自C、N、O或S；

Y为C或N；

R

R

R

或R

R

其中杂环或杂芳环任选地具有1、2或3个独立地选自N、S、O或B的杂原子。

式III的一些实施方案中，环A为

式III的一些实施方案中，环C为6-元芳香环。

式III的一些实施方案中，环C为苯基、吡啶基、哒嗪基或嘧啶基。

式III的一些实施方案中，环C为苯基。

式III的一些实施方案中，X选自O、S或N。

式III的一些实施方案中，X为N。

式III的一些实施方案中，Y为C。

式III的一些实施方案中，Z为N。

式III的一些实施方案中，R

式III的一些实施方案中，R

式III的一些实施方案中，R

式III的一些实施方案中，R

式III的一些实施方案中，R

式I的一些实施方案中，其中所述化合物是式IV的化合物或其同分异构体、立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药、螯合物、非共价复合物或溶剂化物，

其中，

环A为C

R

R’为H、NH

环B’为5-元芳香杂环，其中5-元芳香杂环任选地具有1、2或3个独立地选自N、S、或O的杂原子；

环C’为苯基、6-元杂环基或6-元杂芳环；

X’和Z’各自独立地选自C、N、O或S；

Y’为C或N；

R”为-C(O)-C

任意两个R”与它们所连接的原子一起形成5至12-元环；

R

m和n各自独立地选自0、1、2、3或4。

式IV的一些实施方案中，环A为

式IV的一些实施方案中，R’选自H。

式IV的一些实施方案中，R

式IV的一些实施方案中，环B’选自咪唑、噁唑、噻唑、三唑或吡咯。

式IV的一些实施方案中，环B’选自

式IV的一些实施方案中，环C’选自苯基、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、哌啶或四氢吡喃。

式IV的一些实施方案中，环C’选自

式IV的一些实施方案中，R”选自

式IV的一些实施方案中，两个R”与它们所连接的原子一起形成

式I的一些实施方案中，其中所述化合物是式V的化合物或其同分异构体、药学上可接受的盐，

其中，

环A为C

R

R

环B”为5-元芳香杂环，其中5-元芳香杂环任选地具有1、2或3个独立地选自N、S、或O的杂原子；

环C”为苯基、6-元杂环基或6-元杂芳环；

X”和Z”各自独立地选自C、N、O或S；

Y”为C或N；

R

任意两个R

R

m和n各自独立地选自0、1、2、3或4。

式V的一些实施方案中，环A为

式V的一些实施方案中，R

式V的一些实施方案中，R

式V的一些实施方案中，环B”选自咪唑、噁唑、噻唑、三唑或吡咯。

式V的一些实施方案中，环B”选自

式V的一些实施方案中，环C”选自苯基、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、哌啶或四氢吡喃。

式V的一些实施方案中，环C”选自

式V的一些实施方案中，R

式V的一些实施方案中，两个R

关于式I、式II、式III、式IV或式V的化合物或其同分异构体、药学上可接受的盐或溶剂化物，本发明还提供了一些优选的技术方案，其中所述化合物为：

1)(R)-4-(4-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯基)吗啉；

2)(R)-1-(4-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇；

3)5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(四氢呋喃-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

4)(S)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)乙烷-1-醇；

5)(1S,4s)-4-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环己烷-1-醇；

6)(R)-4-(4-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡啶-2-基)吗啉；

7)(R)-2-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)丙烷-2-醇；

8)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(吡啶-4-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

9)(R)-4-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯酚；

10)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(吡嗪-2-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

11)(S)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)乙烷-1-胺；

12)甲基((S)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)乙基)氨基甲酸酯；

13)(R)-3-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯甲腈；

14)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

15)3-(5-(氮杂环丁烷-2-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

16)乙基(R)-5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸酯；

17)(R)-5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸；

18)(3S)-3-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环己烷-1-醇；

19)(3S)-3-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环戊烷-1-醇；

20)叔-丁基2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)氮杂环丁烷-1-羧酸酯；

21)(R)-1-(4-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-甲基-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇；

22)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(哌啶-4-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

23)(R)-1-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环丁基-1-醇；

24)(R)-1-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环丁基-1-胺；

25)(S)-2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1,1-三氟丙烷-2-醇；

26)(R)-2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1,1-三氟丙烷-2-醇；

27)(R)-2-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷-2-醇；

28)2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1,1-三氟丁烷-2-醇；

29)3-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1,1-三氟-2-甲基丙烷-2-醇；

30)(R)-1-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-甲基丙烷-2-醇；

31)(R)-3-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环丁基-1-醇；

32)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(四氢-2H-吡喃-4-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

33)(R)-2-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-甲基丙烷-1-醇；

34)(R)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)乙烷-1-醇；

35)2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)哌啶-4-醇；

36)(R)-6-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉；

37)(1R,3r)-3-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)金刚烷-1-醇；

38)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

39)(R)-2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)丙-1-醇；

40)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(4-(哌嗪-1-基)苯基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

41)(R)-3-(5-(4,4-二氟环己基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

42)(R)-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)(苯基)甲醇；

43)(R)-(3-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)双环[1.1.1]戊烷-1-基)甲醇；

44)(R)-3-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)双环[1.1.1]戊烷-1-胺；

45)(R)-6-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯并[c][1,2]氧杂硼醇-1(3H)-醇；

46)1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-1,1-二氟丁基-2-醇；

47)1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-2,2,2-三氟乙烷-1-醇；

48)1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)丙-2-炔-1-醇；

49)3-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吗啉；

50)(R)-3-(5-(1H-吲哚-5-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

51)(S)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)乙基L-亮氨酸盐酸盐；

52)2-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-氟乙烷-1-醇；

53)(R)-1-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环丙烷-1-醇；

54)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

55)(S)-1-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)L-缬氨酸乙酯盐酸盐；

56)(R)-6-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)喹啉；

57)(R)-3-(5-(1H-苯并[d]咪唑并-6-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

58)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(4-苯氧基苯基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

59)(R)-3-(5-(1H-吲唑-6-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

60)(1R,2S,3R,5S)-5-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)环己烷-1,2,3,5-四醇；

61)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(2,3-二氢苯并呋喃-6-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

62)5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-((R)-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

63)2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-((R)-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯并[d]噻唑；

64)(R)-4-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)吗啉；

65)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

66)1-(2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-6-基)乙烷-1-醇；

67)(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-6-基)甲醇；

68)1-(2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯并[d]噁唑-6-基)乙烷-1-醇；

69)(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯并[d]噁唑-6-基)甲醇；

70)1-(2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)乙烷-1-醇；

71)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(三氟甲氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

72)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(三氟甲基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

73)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)噁唑[4,5-c]吡啶；

74)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-氟-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

75)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)噻唑[4,5-c]吡啶；

76)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-d]哒嗪；

77)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

78)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5,6-二甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

79)(R)-6-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-2,2-二氟-5H-[1,3]二噁唑[4',5':4,5]苯并[1,2-d]咪唑；

80)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噁唑；

81)(R)-3-(6-(二氟甲氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

82)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7,9,10,12,13-六氢-1H-[1,4,7,10]四氧杂环十二烷基[2',3':4,5]苯并[1,2-d]咪唑；

83)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1-甲基-6,7-二氢-1H-[1,4]二噁英[2',3':4,5]苯并[1,2-d]咪唑；

84)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

85)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

86)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

87)(R)-8-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7H-嘌呤-6-胺；

88)(R)-8-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7H-嘌呤-6-醇；

89)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-N-羟基-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酰胺；

90)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酸；

91)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酰胺；

92)(R)-3-(5-氯-6-(三氟甲氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

93)1-(2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯[d]噁唑-5-基)乙烷-1-醇；

94)(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯[d]噁唑-5-基)甲醇；

95)(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)甲醇；

96)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢-1H-[1,4]二噁英[2',3':4,5]苯并[1,2-d]咪唑；

97)(R)-3-(7-氯-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

98)(R)-3-(7-氯-5-氟-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

99)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

100)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-甲氧基苯并[d]噁唑；

101)(R)-3-(5,6-双(2-甲氧基乙氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

102)(R)-6,7-二氯-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

103)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

104)(R)-3-(4,7-二氯-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

105)(R)-3-(5,6-二氯-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

106)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

107)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

108)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-氟-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

109)(R)-3-(5,6-双(二氟甲氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

110)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(三氟甲基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

111)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,7-二氟苯并[d]噁唑；

112)(R)-3-(5-氯-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

113)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(7-(三氟甲氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

114)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(三氟甲基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

115)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5,6-二基二甲基双(碳酸酯)；

116)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-((三氟甲基)硫基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

117)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5,6-二醇；

118)5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(((R)-四氢呋喃-3-基)氧基)-6-(((S)-四氢呋喃-3-基)氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

119)(R)-2,2'-((2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5,6-二基)双(氧基))二乙腈；

120)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噁唑；

121)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-b]喹喔啉；

122)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7-甲基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶；

123)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-氟-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

124)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶；

125)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

126)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(甲硫基)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

127)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(7-氟-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

128)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪；

129)(R)-6-溴-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪；

130)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-咪唑并[4,5-b]吩嗪；

131)(R)-6-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-[1,3]二噁唑[4',5':4,5]苯并[1,2-d]噁唑；

132)2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三氮唑[1,5-a]吡啶-6-醇；

133)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-腈；

134)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7,8-二氢-1H,6H-[1,4]二氧庚环[2',3':4,5]苯并[1,2-d]咪唑；

135)(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)甲醇；

136)(R)-3-(5,6-二氟-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

137)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5-二氟-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酸酯；

138)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5-二氟-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酸；

139)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-氟-6-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

140)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-乙氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

141)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸；

142)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(甲胺基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

143)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-吗啉代-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

144)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(二甲氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

145)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(3-羟基氮杂苷-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

146)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6,7,8-四氢咪唑并[4',5':4,5]苯并[1,2-e][1,4]二氮杂卓-9(3H)-酮；

147)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-7,8-二氢-3H-咪唑并[4',5':4,5]苯并[1,2-f][1,4]氧杂吖庚因-9(6H)-酮；

148)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5,6-二腈；

149)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-羟基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

150)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(2-羟乙氧基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

151)(R)-6-溴-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

152)甲基(R)-5-氰基-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酸酯；

153)(R)-5-氰基-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酸；

154)(R)-5-氰基-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酰胺；

155)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸酯；

156)(R)-6-(二氟甲氧基)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

157)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

158)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟-1H-苯并[d]咪唑-7-羧酸酯；

159)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

160)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-N-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺；

161)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-N,N-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺；

162)(R)-4-((2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑并-5-基)甲基)吗啉；

163)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

164)2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

165)6-((S)-2-氰基吡咯烷-1-基)-2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

166)甲基(5-氰基-2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑并-6-基)-L-脯氨酸；

167)(5-氰基-2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑并-6-基)-L-脯氨酸；

168)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

169)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(2-甲氧基乙氧基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

170)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-(甲磺酰)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

171)2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(甲磺酰)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

172)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(甲磺酰)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

173)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(甲磺酰)-1H-苯并[d]咪唑-6-羧酰胺；

174)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基苯并[d]噁唑-5-腈；

175)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4-氟苯并[d]噁唑-7-羧酸酯；

176)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噁唑-5-腈；

177)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-羟基苯并[d]噁唑-5-腈；

178)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基苯并[d]噁唑-6-羧酸酯；

179)(R)-6-(二氟甲氧基)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲基苯并[d]噁唑；

180)((2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基苯并[d]噁唑-5-基)甲基)-L-脯氨酸；

181)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,8-二甲氧基-[1,2,4]三氮唑[1,5-c]嘧啶；

182)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二甲氧基-[1,2,4]三氮唑[1,5-a]吡啶；

183)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-氟-1H-吲哚-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；

184)甲基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-羧酸酯；

185)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-羧酸；

186)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-6-醇；

187)(S)-2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三氮唑[1,5-a]吡啶-7-醇；

188)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3,4,6,7-四氢吡喃[3,4-d]咪唑；

189)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5,6,7-四氢噻唑[4,5-c]吡啶；

190)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5,6,7-四氢噻唑[5,4-c]吡啶；

191)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢噻唑[5,4-c]吡啶-5(4H)-羧酰胺；

192)(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢-4H-吡喃[4,3-d]噻唑；

193)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5,6-二甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺；

194)(R)-2-(2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈；

195)(R)-2-(5-(2-(2-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

196)(R)-2-(5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

197)(S)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

198)(R)-2-(5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈；

199)(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6,7-二甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；或

200)(R)-3-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6-二氢-8H-[1,2,4]三氮唑[3,4-c][1,4]噁嗪。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的任何一种化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明进一步提供了一种抑制Trk的方法，包括野生型TrkA、TrkB和TrkC、TrkAG595R、TrkA G667C、TrkA A608D、TrkA F589L和TrkC G623R，所述方法包括向患者施用本发明的任何一种化合物或其药学上可接受的盐或同分异构体。

本发明进一步提供了一种治疗与Trk抑制相关的疾病的方法，所述Trk包括野生型TrkA、TrkB和TrkC，TrkA G595R、TrkA G667C、TrkA A608D、TrkA F589L和TrkC G623R。所述方法包括向有需要的患者提供本发明任意一种化合物的治疗有效量，或药学上可接受的盐或其异构物。其中所述疾病是唾液腺的乳腺类似分泌癌(MASC)、婴儿纤维肉瘤、斯皮茨瘤、结肠癌、胃癌、甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌)、肺癌、白血病、胰腺癌、黑素瘤(例如多发性黑素瘤)、脑癌(例如桥脑神经胶质瘤)、肾癌(例如先天性中胚层肾瘤)、前列腺癌、卵巢癌或乳腺癌(例如分泌型乳腺癌)。

本发明提供了一种抑制患者体内Trk的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或同分异构体。

本发明还提供了本发明化合物或其药物组合物在制备药物中的用途。

在一些实施方案中，其中所述药物在制备治疗或预防癌症中的应用。

在一些实施方案中，其中所述癌症是唾液腺的乳腺类似分泌癌(MASC)、婴儿纤维肉瘤、斯皮茨瘤、结肠癌、胃癌、甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌)、肺癌、白血病、胰腺癌、黑素瘤(例如多发性黑素瘤)、脑癌(例如桥脑神经胶质瘤)、肾癌(例如先天性中胚层肾瘤)、前列腺癌、卵巢癌或乳腺癌(例如分泌型乳腺癌)。

在一些实施方案中，其中所述药物用作Trk的抑制剂。

在一些实施方案中，其中Trk为野生型TrkA、TrkB、TrkC或TrkA G595R、TrkAG667C、TrkA A608D、TrkA F589L或TrkC G623R。

本发明还提供了增强、刺激和/或增加患者免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的化合物或药学上可接受的盐或其同分异构体。

上述结构通式中使用的一般化学术语具有通常的含义。例如，除非另有说明，本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。优选的卤素基团包括氟、氯和溴。

在本文中，除非另有说明，“烷基”包括直链或支链的一价饱和烃基。例如，烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-(2-甲基)丁基、2-戊基、2-甲基丁基、新戊基、正己基、2-己基、2-甲基戊基等。类似的，“C

烯基和炔基包括直链或支链的烯基和炔基。同样地，“C

烷氧基是由前述直链，支链或环状烷基形成的氧醚。

术语“芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的包括碳环的原子的单环或稠环芳香基团。优选芳基为6到10元的单环或双环的芳香环基团。优选为苯基、萘基。最优选为苯基。

术语“杂环基”，在本文中，除非另有说明，是指由碳原子和1-3个选自N、O或S的杂原子组成的未取代或取代的3-8元稳定饱和单环系统，其中氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，并且氮杂原子可以选择性地被季铵化。该杂环基可以被连接到任何的杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。这些杂环基的实施例包括但不限于氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四氢恶唑基、四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜基和四氢恶二唑基。

术语“杂芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的稳定的五元或六元单环芳族环系统或未取代或取代的九元或十元苯并稠合杂芳族环系统或双环杂芳族环系统，其由碳原子和1-4个选自N、O或S的杂原子组成，并且其中所述氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，所述氮杂原子可以选择性地被季铵化。杂芳基可以连接在任何杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。杂芳基的实施例包括但不限于噻吩基、呋喃基、咪唑基、异恶唑基、恶唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、吡啶基、哒嗪基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并异恶唑基、苯并噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基腺嘌呤、喹啉基或异喹啉基。

术语“烯氧基”是指-O-烯基，其中烯基的定义如上所述。

术语“炔氧基”是指-O-炔基，其中烯基的定义如上所述。

术语“环烷基”是指具有3-12个碳原子的环状饱和烷基链，例如，环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

术语“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子分别被相同的或者不同的取代基所取代。典型的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br或I)、C

术语“组合物”，在本文中，是指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接地由指定量的各指定成分的组合生产的任何产品。因此，含有本发明的化合物作为活性成分的药物组合物以及制备本发明化合物的方法也是本发明的一部分。此外，化合物的一些结晶形式可以多晶型存在，并且此多晶型包括在本发明中。另外，一些化合物可以与水(即水合物)或常见的有机溶剂形成溶剂化物，并且此类溶剂化物也落入本发明的范围内。

取代烷基的实施例包括但不限于2-氨基乙基、2-羟乙基、五氯乙基、三氟甲基、甲氧基甲基、五氟乙基和哌嗪基甲基。

取代烷氧基的实施例包括但不限于氨基甲氧基、三氟甲氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-乙氧基羰基乙氧基、3-羟基丙氧基。

本发明的化合物也可以药学上可接受的盐的形式存在。为了药物应用，本发明化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐的形式包括药学上可接受的酸/阴离子或碱/阳离子盐。药学上可接受的酸/阴离子盐一般以碱性氮与无机酸或有机酸质子化的形式存在。典型的有机或无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸、草酸、扑酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己胺磺酸、水杨酸、糖精酸或三氟乙酸。药学上可接受的碱/阳离子盐，包括但不限于，铝盐、钙盐、氯普鲁卡因盐、胆碱、二乙醇胺盐、乙二胺、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐和锌盐。

本发明化合物的药物前体包含在本发明的保护范围内。通常，所述药物前体是指很容易在体内转化成所需化合物的功能性衍生物。因此，本发明提供的治疗方法中的术语“给药”是指施用能治疗不同疾病的本发明公开的化合物，或虽未明确公开但对受试者给药后能够在体内转化为本发明公开的化合物的化合物。有关选择和制备合适药物前体衍生物的常规方法，已记载在例如《药物前体设计》(Design of Prodrugs,ed。H。Bundgaard,Elsevier,1985)这类书中。

显然的，一个分子中任何取代基或特定位置的变量的定义是独立于分子中其他位置的。很容易理解，本领域普通技术人员可以通过现有技术手段及本发明中所述的方法来选择本发明中的化合物的取代基或取代形式，以获得化学上稳定且易于合成的化合物。

本发明所述化合物可能含有一个或多个不对称中心，并可能由此产生非对映异构体和光学异构体。本发明包括所有可能的非对映异构体及其外消旋混合物、其基本上纯的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。

上述式(I)没有确切定义该化合物某一位置的立体结构。本发明包括式(I)所示化合物的所有立体异构体及其药学上可接受的盐。进一步地，立体异构体的混合物及分离出的特定的立体异构体也包括在本发明中。制备此类化合物的合成过程中，或使用本领域普通技术人员公知的外消旋化或差向异构化的过程中，制得的产品可以是立体异构体的混合物。

当式(I)所示化合物存在互变异构体时，除非特别声明，本发明包括任何可能的互变异构体和其药学上可接受的盐，及它们的混合物。

本发明包括式III和式IV的所有异构体及其药学上可接受的盐。此外，还包括异构体的混合物以及分离的特定异构体。在用于制备本发明的本领域技术人员已知的合成方法的过程中，可以通过闭环反应获得两种异构体。例如，化合物7-4的羧基与化合物163-3的两个氨基之一反应，然后可以得到两个异构体，即化合物163及其异构体，并且也可能得到它们的混合物。其中，异构体可以是立体异构体或互变异构体。

当式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐存在溶剂化物或多晶型时，本发明包括任何可能的溶剂化物和多晶型。形成溶剂化物的溶剂类型没有特别的限定，只要该溶剂是药理学上可以接受的。例如，水、乙醇、丙醇、丙酮等类似的溶剂都可以采用。

术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的无毒的碱或酸制备的盐。当本发明提供的化合物是酸时，可以从药学上可接受的无毒的碱，包括无机碱和有机碱，方便地制得其相应的盐。从无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(高价和低价)、三价铁、亚铁、锂、镁、锰(高价和低价)、钾、钠、锌之类的盐。特别优选铵、钙、镁、钾和钠的盐。药学上可接受的能够衍生成盐的无毒有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺，也包括环胺及含有取代基的胺，如天然存在的和合成的含取代基的胺。能够成盐的其他药学上可接受的无毒有机碱，包括离子交换树脂以及精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N',N'-二苄乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡萄糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸，甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。

当本发明提供的化合物是碱时，可以从药学上可接受的无毒的酸，包括无机酸和有机酸，方便制得其相应的盐。这样的酸包括，如，醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸等。较优地，柠檬酸、氢溴酸、甲酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。更优地，甲酸和盐酸。由于式(I)所示化合物将作为药物应用，较优地，使用一定纯度，例如，至少为60％纯度，比较合适的纯度为至少75％，特别合适地纯度为至少98％(％是重量比)。

本发明提供的药物组合物包括作为活性组分的式(I)所示化合物(或其药学上可接受的盐)、一种药学上可接受的赋形剂及其他可选的治疗组分或辅料。尽管任何给定的情况下，最适合的活性组分给药方式取决于接受给药的特定的主体、主体性质和病情严重程度，但是本发明的药物组合物包括适于口腔、直肠、局部和不经肠道(包括皮下给药、肌肉注射、静脉给药)给药的药物组合物。本发明的药物组合物可以方便地以本领域公知的单位剂型存在和药学领域公知的任何制备方法制备。

实际上，根据常规的药物混合技术，本发明式(I)所示化合物，或药物前体，或代谢物，或药学上可接受的盐，可以作为活性组分，与药物载体混合成药物组合物。所述药物载体可以采取各种各样的形式，这取决于期望采用的给药方式，例如，口服或注射(包括静脉注射)。因此，本发明的药物组合物可以采用适于口服给药的独立单元，如包含预定剂量的活性组分的胶囊剂、扁囊剂或片剂。进一步地，本发明的药物组合物可采用粉末、颗粒、溶液、水性悬浮液、非水液体、水包油型乳液，或油包水型乳液形式。另外，除了上述提到的常见的剂型，式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，也可以通过控释的方式和/或输送装置给药。本发明的药物组合物可以采用任何制药学上的方法制备。一般情况下，这种方法包括使活性组分和组成一个或多个必要成分的载体缔合的步骤。一般情况下，所述药物组合物经由活性组分与液体载体或精细分割的固体载体或两者的混合物经过统一的密切的混合制得。另外，该产品可以方便地制备成所需要的外观。

因此，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体和式(I)所示化合物或其同分异构体、立体异构体、互变异构体，多晶型物、溶剂化物、其药学上可接受的盐、其药物前体。式(I)所示化合物或其同分异构体、药学上可接受的盐，与其他一种或多种具有治疗活性的化合物的联合用药也包括在本发明的药物组合物中。

本发明采用的药物载体可以是，例如，固体载体、液体载体或气体载体。固体载体，包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸。液体载体，包括糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体，包括二氧化碳和氮气。制备药物口服制剂时，可以使用任何制药学上方便的介质。例如，水、乙二醇、油类、醇类、增味剂、防腐剂、着色剂等可用于口服的液体制剂如悬浮剂、酏剂和溶液剂；而载体，如淀粉类、糖类、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等可用于口服的固体制剂如散剂、胶囊剂和片剂。考虑到易于施用，口服制剂首选片剂和胶囊，在此应用固体药学载体。可选地，片剂包衣可使用标准的水制剂或非水制剂技术。

含有本发明化合物或药物组合物的片剂可通过压缩或模塑成型，可选地，可以与一种或多种辅助组分或辅药一起制成片剂。活性组分以自由流动的形式如粉末或颗粒，与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合，在适当的机器中，通过压缩可以制得压缩片。用一种惰性液体稀释剂浸湿粉末状的化合物或药物组合物，然后在适当的机器中，通过模塑可以制得模塑片。较优地，每个片剂含有大约0.05mg到5g的活性组分，每个扁囊剂或胶囊剂含有大约0.05mg到5g的活性组分。例如，拟用于人类口服给药的配方包含约0.5mg到约5g的活性组分，与合适且方便计量的辅助材料复合，该辅助材料约占药物组合物总量的5％至95％。单位剂型一般包含约1mg到约2g的活性组分，典型的是25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg。

本发明提供的适用于胃肠外给药的药物组合物可将活性组分加入水中制备成水溶液或悬浮液。可以包含适当的表面活性剂如羟丙基纤维素。在甘油、液态聚乙二醇，及其在油中的混合物，也可以制得分散体系。进一步地，防腐剂也可以包含在本发明的药物组合物中用于防止有害的微生物生长。

本发明提供适用于注射的药物组合物，包括无菌水溶液或分散体系。进一步地，上述药物组合物可以制备成无菌粉末形式以用于即时配制无菌注射液或分散液。无论如何，最终的注射形式必须是无菌的，且为了易于注射，必须是易于流动的。此外，所述药物组合物在制备和储存过程中必须稳定。因此，优选地，所述药物组合物要在抗微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)、植物油及其适当的混合物。

本发明提供的药物组合物可以是适于局部用药的形式，例如，气溶胶、乳剂、软膏、洗液、撒粉或其他类似的剂型。进一步地，本发明提供的药物组合物可以采用适于经皮给药设备使用的形式。利用本发明式(I)所示化合物，或其药学上可接受的盐，通过常规的加工方法，可以制备这些制剂。作为一个例子，乳剂或软膏通过加入约5wt％到10wt％的亲水性材料和水，制得具有预期一致性的乳剂或软膏。

本发明提供的药物组合物，可以以固体为载体，适用于直肠给药的形式。单位剂量的栓剂是最典型的剂型。适当的辅料包括本领域常用的可可脂和其他材料。栓剂可以方便地制备，首先药物组合物与软化或熔化的辅料混合，然后冷却和模具成型而制得。

除了上述提到的辅料组分外，上述制剂配方还可以包括，适当的，一种或多种附加的辅料组分，如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂和防腐剂(包括抗氧化剂)等。进一步地，其他的辅药还可以包括调节药物与血液等渗压的促渗剂。包含式(I)所示化合物，或其药学上可接受的盐的药物组合物，可以制备成粉剂或浓缩液的形式。

一般情况下，治疗上述所示的状况或不适，药物的剂量水平约为每天0.01mg/kg体重到150mg/kg体重，或者每个病人每天0.5mg到7g。例如，结肠癌，直肠癌，套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，乳腺癌，前列腺癌，胶质母细胞瘤，鳞状细胞食管癌，脂肪肉瘤，T细胞淋巴瘤黑素瘤，胰腺癌或肺癌，有效治疗的药物剂量水平为每天0.01mg/kg体重到50mg/kg体重，或者每个病人每天0.5mg到3.5g。

但是，可以理解，可能需要比上述那些更低或更高的剂量。任何特定病人的具体剂量水平和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、综合健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物联用的情况和接受治疗的特定疾病的严重程度。

通过下面对本发明的书面描述，这些和其他方面将变得显而易见。

提供以下示例以更好地说明本发明。除非另有明确说明，否则所有零件和百分比均按重量计算，所有温度均为摄氏度。

将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例用于说明性目的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相同结果的各种非关键参数。根据本文所述的至少一种测定法，发现实施例的化合物抑制Trk。

实施例

下面提供本发明化合物的实验步骤。

示例中使用了以下缩写：

AcOH：乙酸；

DCM：二氯甲烷；

DIBAL-H：二异丁基氢化铝；

DIEA：N,N-二异丙基乙胺；

DMF：二甲基甲酰胺；

DMAP：4-二甲氨基吡啶；

DMSO：二甲基亚砜；

EA：乙酸乙酯；

EDTA：乙二胺四乙酸；

HATU：四甲基脲六氟磷酸酯；

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸；

LCMS：液相色谱-质谱法；

h或hrs：小时或小时；

PE：石油醚；

MeOH：甲醇；

min：分钟；

NCS：N-氯丁二酰亚胺；

rt或R.T：室温；

TFA：三氟乙酸；

THF：四氢呋喃；

TLC：制备薄层色谱法；

1N：1mol.L

实施例7：化合物7的合成

(R)-2-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)丙烷-2-醇

步骤1：乙基(R)-5-(2-(2-氯-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯的制备

向(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷盐酸盐(76g)的1-BuOH(1L)溶液中加入乙基5-氯吡唑[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(78g)和DIEA(89g)。将混合物加热至120℃反应14h。通过LCMS监测直至反应完成。

将混合物在减压下浓缩以除去1-BuOH，将残余物倒入冰水中，并用EA(300mL×3)萃取，合并有机层，用盐水洗涤并经Na

步骤2：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-3-羧酸的制备

向乙基(R)-5-(2-(2-氯-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(122g)的EtOH(1L)溶液中加入LiOH(1M,1L)水溶液。将反应混合物加热至80℃，反应8小时。通过LCMS监测直至反应完成。

将混合物真空浓缩以除去EtOH，向残余物中加入水(1L)，并用HCl(1M)酸化至pH＝4～5，过滤，将固体用水洗涤，真空干燥，得到终产物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(110g,98％)，为白色固体。

步骤3：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺的制备

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(110g)的DMF(1L)溶液中加入HATU(146g)、DIEA(82g)和NH

将反应物倒入水(3L)中，并用EA(1L×5)萃取，合并有机层，并用盐水(1L×3)洗涤，经Na

步骤2：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-硫代酰胺的制备

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺(105g)的二氧六环(1L)溶液中加入Lawesson’s试剂(210g)，将混合物加热至100℃反应3小时。通过LCMS监测直至反应完成。

将反应混合物冷却至室温并过滤，将固体用二氧六环洗涤，将滤液浓缩并将残余物通过combi flash纯化(DCM:MeOH梯度为100％:0至95％:5％)，从而得到终产物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-硫代酰胺(85g，78％)，为黄色固体。

步骤5：甲基(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳亚胺甲硫酯的制备

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-硫代酰胺(78g)的MeOH(800mL)溶液中加入CH

步骤6：(R)-2-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)丙烷-2-醇(化合物7)的制备

向甲基(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳亚胺甲硫酯氢碘酸盐(5g)的吡啶(50mL)溶液中加入2-羟基-2-甲基丙酰肼(2.37g)，将混合物加热至110℃过夜。通过LCMS监测直至反应完成。将反应混合物减压浓缩除去吡啶。残余物用combi flash纯化(DCM:MeOH梯度为100％:0至90％:10％)，得到3.48g的目标化合物(61％yield)。MS(ES

实施例42化合物42的合成

(R)-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)(苯基)甲醇

步骤1：(S)-2-羟基-2-苯乙酰肼的制备

向甲基(S)-2-羟基-2-苯乙酸酯(166mg)的MeOH(10mL)溶液中加入水合肼(200mg)，将混合物加热至80℃并搅拌过夜。通过LCMS监测直至反应完成。将反应混合物真空浓缩得到终产物(S)-2-羟基-2-苯乙酰肼(100mg,60％)，为黄色油状。

步骤2：(S)-(5-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)(苯基)甲醇的制备

向(S)-2-羟基-2-苯乙酰肼(100mg)的吡啶(10mL)溶液中加入甲基(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳亚胺甲硫酯(100mg)，将混合物加热至110℃过夜。通过LCMS监测直至反应完成。将反应混合物真空浓缩，残余物通过combi flash(DCM:MeOH梯度为100％:0至90％:10％)纯化，得到60mg(44.7％,产率)目标化合物。MS(ES

实施例45化合物45的合成

(R)-6-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯并[c][1,2]氧杂硼醇-1(3H)-醇

步骤1：叔丁基2-(1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-羰基)肼-1-羧酸酯的制备

向1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-羧酸(178g)的DMF(10mL)溶液中加入HATU(572mg)、DIEA(259mg)和叔丁基肼羧酸酯(158mg)，将混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS监测直至反应完成。将反应混合物倒入水(50mL)中并用EA(30mL×3)萃取,合并有机层，用盐水洗涤，用Na

步骤2：1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-碳酰肼盐酸盐的制备

向叔丁基2-(1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-羰基)肼-1-羧酸酯(120mg)中加入HCl的二氧六环(4M)溶液，混合物搅拌2h。用LCMS监测直至反应完成。将反应混合物真空浓缩，得到终产物1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-碳酰肼盐酸盐(90mg,97％)，为黄色固体。

步骤3：(R)-6-(5-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-基)苯并[c][1,2]氧杂硼醇-1(3H)-醇(化合物45)的制备

向1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊烯-6-碳酰肼盐酸盐(90mg)的吡啶(10mL)溶液中加入甲基(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳亚胺甲硫酯(100mg)，将混合物加热至110℃过夜。通过LCMS监测直至反应完成。将反应混合物真空浓缩，残余物通过combi flash纯化(DCM:MeOH梯度为100％:0至90％:10％)得到40mg(2％，产率)目标化合物。MS(ES

使用相应的起始原料，基本上按照实施例45所述制备以下实施例(如表1所示)。例如，基本上按照实施例45所述，使用

表1

实施例94化合物94的合成

(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯[d]噁唑-5-基)

甲醇

步骤1：(R)-甲基2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯基[d]噁唑-5-羧酸酯的制备

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(365.8mg)的POCl

步骤2：(R)-(2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯基[d]噁唑-5-基)甲基醇的制备

向(R)-甲基2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯基[d]噁唑-5-羧酸酯(193.6mg)的THF(3mL)溶液中加入DIBAL-H(1mL)在0℃下反应1h。通过TLC和LCMS监测反应，向混合物中加入饱和NH

使用相应的起始原料，基本上按照实施例94所述制备以下实施例(表2中所示)。

表2

实施例101化合物101的合成

(R)-3-(5,6-双(2-甲氧基乙氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶

步骤1：4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸的制备

向甲基4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸酯(986.5mg)的MeOH(15mL)溶液中加入H

步骤2：叔丁基(4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯)氨基甲酸酯的制备

向4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯甲酸(722.8mg)的THF(15mL)溶液中加入Et

步骤3：4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯胺的制备

向4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯)氨基甲酸酯(580.2mg)的二氧六环(2mL)溶液中加入HCl·二氧六环(8mL)，反应物在室温下搅拌13h。通过TLC和LCMS监测反应。然后将混合物真空浓缩，并将残余物调节至pH＝8，得到粗产物4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯胺(381.7mg,89％)，为黄色固体。

步骤4：4,5-双(2-甲氧基乙氧基)苯-1,2-二胺的制备

向4,5-双(2-甲氧基乙氧基)-2-硝基苯胺(380.2mg)的MeOH(6mL)溶液中加入Zn粉(418.7mg)、NH

步骤5：(R)-3-(5,6-双(2-甲氧基乙氧基)-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(化合物101)的合成

向4,5-双(2-甲氧基乙氧基)苯-1,2-二胺(85.9mg)的POCl

使用相应的起始原料制备基本上如实施例101所述的以下实施例(表3中所示)。例如，基本上按照实施例101所述，使用

表3

*注：如果上述化合物中存在异构体，例如互变异构体，则本发明还包括该化合物的异构体，例如互变异构体，还包括其混合物。

实施例125化合物125和/或其同分异构体的合成

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

步骤1：4-氨基-2-甲氧基-5-硝基苯甲腈的制备

在15℃下，向CH

步骤2：4,5-二氨基-2-甲氧基苯甲腈的制备

向4-氨基-2-甲氧基-5-硝基苯甲腈(9.6g)的DCM/MeOH(1:1,60mL)溶液中加入饱和的NH

步骤3：(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈和/或其同分异构体的合成

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(3.44g)的POCl

实施例156化合物156和/或其同分异构体的合成

(R)-6-(二氟甲氧基)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(R)-5-(二氟甲氧基)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

步骤1：4-氨基-2-羟基-5-硝基苯甲腈的合成

在-15℃下向NaOH(8.8g)的水(100mL)溶液中加入4-氨基-2-氟-5-硝基苯甲腈(10g)，混合物在80℃下搅拌8h。通过LC-MS监测反应。在4-氨基-2-氟-5-硝基苯甲腈完全消耗完后，在20℃下将反应混合物用6N HCl调至pH 6-7。将混合物过滤并将滤饼用水洗涤，在50℃下减压干燥10小时，得到4-氨基-2-羟基-5-硝基苯甲腈(9.0g)，为黄色固体。步骤2：叔丁基(4-氰基-5-羟基-2-硝基苯)氨基甲酸酯的合成

向4-氨基-2-羟基-5-硝基苯甲腈(500mg)的THF(15mL)溶液中加入Boc

步骤3：叔丁基(4-氰基-5-(二氟甲氧基)-2-硝基苯)氨基甲酸酯的合成

向混合物叔丁基(4-氰基-5-羟基-2-硝基苯)氨基甲酸酯(100mg)、ClCF

步骤4:叔丁基(2-氨基-4-氰基-5-(二氟甲氧基)苯基)氨基甲酸酯

向混合物叔丁基(4-氰基-5-(二氟甲氧基)-2-硝基苯)氨基甲酸酯(77mg)、锌粉(91mg)和NH

步骤5:4,5-二氨基-2-(二氟甲氧基)苯甲腈的合成

在叔丁基(2-氨基-4-氰基-5-(二氟甲氧基)苯基)氨基甲酸酯(56mg)中加入4MHCl的二氧六环(4mL)溶液。混合物室温搅拌4h。LC-MS检测4,5-二氨基-2-(二氟甲氧基)苯甲腈反应完成后，将反应混合物真空浓缩，残留物用NaHCO

步骤6：(R)-6-(二氟甲氧基)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈和其同分异构体的合成

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(64mg)的CH

实施例163化合物163和/或其同分异构体的合成

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

步骤1：4-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲腈的合成

在15℃以下，向4-氨基-2-氟-5-硝基苯甲腈(18.1g)的THF(300mL)溶液中加入1-甲基哌嗪(12.1g)和DIEA(25.8g)。然后将溶液加热至室温并搅拌3h。LCMS显示反应完成。将反应混合物倒入冰水中，并用EA(3*100mL)萃取，将有机层合并，并用盐水洗涤，用硫酸钠干燥。浓缩得到终产物4-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲腈(21.5g)，为棕色固体。

步骤2：4,5-二氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲腈的合成

向4-氨基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲腈(13.1g)的DCM/MeOH(1:1,60mL)溶液中加入NH

步骤3：(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-腈和其同分异构体

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(3.44g)的POCl

使用相应的起始原料，基本上按照实施例163所述制备以下实施例(如表4所示)。例如，基本上按照实施例163所述，使用

表4

*注：如果上述化合物中存在同分异构体，则本发明也包括其同分异构体，也包括其混合物。

实施例170化合物170和/或其同分异构体的合成

(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6-(甲磺酰)-1H-苯基[d]咪唑-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶

(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5-(甲磺酰)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(344mg)的POCl

使用相应的起始原料，基本上按照实施例170所述制备以下实施例(如表5所示)。例如，基本上按照实施例170所述，使用

表5

*注：如果上述化合物中存在同分异构体，则本发明也包括其同分异构体，也包括其混合物。

实施例63化合物63的合成

2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-((R)-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯并[d]噻唑

步骤1：(R)-5-(六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)-2-硝基苯硫酚的合成

在15℃以下，向5-氟-2-硝基苯硫酚(1.73g)的THF(300mL)溶液中加入(R)-八氢吡咯[1,2-a]吡嗪(1.51g)和DIEA(2.58g)。然后将溶液升温至室温并搅拌3h。LCMS显示反应完成。将反应混合物倒入冰水中，并用EA(3*100mL)萃取，合并有机层，并用盐水洗涤，用Na

步骤2：(R)-2-氨基-5-(六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯硫酚的合成

向(R)-5-(六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)-2-硝基苯硫酚(2.13g)的DCM/MeOH(1:1,30mL)溶液中加入NH

步骤3：2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-((R)-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯并[d]噻唑的合成

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(3.44g)中加入SOCl

LCMS显示反应完成。将混合物用EtOAc(10mL)和饱和NaHCO

使用相应的起始原料，基本上按照实施例63所述，使用

表6

实施例132化合物132的合成

2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三氮唑[1,5-a]吡啶-6-醇

步骤1：(5-氧代四氢呋喃-3-基)甲基甲磺酸的制备

向4-(羟甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮(236.5mg)的DCM(5mL)溶液中加入Et

步骤2：1-氨基-5-羟基哌啶-2-酮的制备

向(5-氧代四氢呋喃-3-基)甲基甲磺酸(226.7mg)的EtOH(5mL)溶液中加入N

步骤3：2-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三氮唑[1,5-a]吡啶-6-醇的合成

向1-氨基-5-羟基哌啶-2-酮(56.3mg)的吡啶溶液中在110℃下12h内加入(R)-甲基5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳亚胺甲硫酯(148.7mg)。通过TLC和LCMS监测反应。将混合物真空浓缩，并将残余物调节至pH＝8，将残余物通过combiflash纯化(DCM:MeOH梯度为100％:0至95％:5％)，得到22.6mg(20％，产率)的目标化合物。MS(ES

使用相应的起始原料，基本上按照实施例132所述，使用

表7

实施例133化合物133的合成

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-腈

步骤1：(R)-甲基2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-氟苯基[d]噁唑-5-羧酸酯的制备

向(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷盐酸盐(2.2g)的n-BuOH(30mL)溶液中加入DIEA(4.82g)和3-溴-5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶(2.61g)，升温至100℃反应3h。通过TLC和LCMS监测反应。然后将混合物真空浓缩，并将混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，将有机层通过Na

步骤2：(R)-叔丁基5-氰基-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-1-羧酸酯的制备

向((R)-3-溴-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(162.8mg)的二氧六环(5mL)溶液中加入Cs

步骤3:(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-腈的制备(化合物133)

向((R)-叔丁基5-氰基-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-1-羧酸酯(102.8mg)的DCM(2mL)溶液中加入TFA(2mL)，室温下反应12h。通过TLC和LCMS检测反应。然后将混合物真空浓缩，并将残余物调节至pH＝8，将残余物通过combi flash纯化(DCM:MeOH梯度为100％:0至93％:7％)得到36.9mg(45％,产率)的目标化合物。MS(ES

使用相应的起始原料，基本上按照实施例133所述制备以下实施例(如表8所示)。例如，基本上按照实施例133所述，使用

表8

实施例188化合物188的合成

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3,4,6,7-四氢吡喃[3,4-d]咪唑

步骤1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-腈的合成

向乙基5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-腈(17.8g)的EtOH(400mL)溶液中加入(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷盐酸盐(26.2g)和DIEA(25.8g)。混合物加热至90℃反应2h。TLC显示反应完成，减压浓缩以除去EtOH，并将残余物倒入冷却的水中并过滤，将固体用1N HCl和水洗涤，在60℃下减压干燥10h得到终产物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-腈(29.9g,92％)，为白色固体。

步骤2：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-羟基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰亚胺的合成

将混合物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-腈(16.2g)、NH

步骤3：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰亚胺的合成

装有(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-羟基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰亚胺(5.0g)的甲醇溶液(150mL)的圆底烧瓶用氮气吹扫。向溶液中加入Pd/C(1g,10％,60％水)，然后进一步吹扫烧瓶。然后将气氛变为氢气，并将混合物在气球中于25℃中搅拌过夜。用氮气吹扫系统后，通过过滤除去固体，减压浓缩滤液，得到终产物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰亚胺(2.9g)，为棕色固体。

步骤4：(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3,4,6,7-四氢吡喃[3,4-d]咪唑的合成

混合物(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰亚胺(685mg)、3-溴二氢-2H-吡喃-4(3H)-酮(358mg)和碳酸钾(552mg)的CH

实施例189化合物189的合成

(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5,6,7-四氢噻唑[4,5-c]吡啶

步骤1：叔丁基3-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺)-4-羟基哌啶-1-羧酸酯的合成

用SOCl

向混合物中加入100mL乙酰乙酸乙酯，然后用水洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥。滤出并减压蒸馏掉，然后将残留物用combiflash纯化，得到终产物叔丁基3-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺)-4-羟基哌啶-1-羧酸酯(2.77g,51％)，为黄色固体。

步骤2：叔丁基3-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺)-4-氧代哌啶-1-羧酸酯的合成

叔丁基4-羟基-3-{[4-(三氟甲基)苯甲酰基]氨基}哌啶-1-羧酸酯(2.17g)溶解在DCM(30mL)，向其中滴加2.5克Dess-Martin高碘试剂。搅拌5小时后，滴加乙酰乙酸乙酯(50mL)，用水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥。将反应溶液过滤，减压蒸馏，然后将残渣蒸馏除去。通过combiflash纯化(DCM:MeOH＝95％:5％)得到终产物叔丁基3-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺)-4-氧代哌啶-1-羧酸酯(1.6g,76％)，为黄色固体。

步骤3：叔丁基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢噻唑[4,5-c]吡啶-5(4H)-羧酸酯的合成

向叔丁基3-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酰胺)-4-氧代哌啶-1-羧酸酯(540mg)的甲苯溶液中加入Lawesson's试剂(485mg)，将所得溶液在回流下搅拌4小时。LCMS表明反应完成，减压蒸馏除去甲苯。残留物用combiflash纯化(DCM:MeOH＝95％:5％)得到产物叔丁基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢噻唑[4,5-c]吡啶-5(4H)-羧酸酯(242mg)，为棕色固体。

步骤4：(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5,6,7-四氢噻唑[4,5-c]吡啶盐酸盐的合成

向叔丁基(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6,7-二氢噻唑[4,5-c]吡啶-5(4H)-羧酸酯(240mg)的DCM(10mL)溶液中加入4N HCl/二氧六环(4mL)。混合物搅拌3h。LCMS显示反应完成。减压浓缩除去DCM和二氧六环得到产物(R)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-4,5,6,7-四氢噻唑[4,5-c]吡啶盐酸盐(148mg)，为棕色固体。MS:[M+H]

使用相应的起始原料，基本上按照实施例189的方法准备以下示例(表9中所示)。

表9

实施例193化合物193的合成

(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5,6-二甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺

步骤1：乙基(R)-2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯的合成

在室温下，向(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷盐酸盐(1.00g)的EtOH(150mL)溶液中加入DIEA(1.93g)和乙基2-氨基-5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(1.13g)，然后加热至80℃反应3h。通过TLC和LCMS监测反应。将反应冷却至室温，然后将混合物真空浓缩。将反应混合物加入冷却水中并搅拌。过滤混合物，将残余固体在1N HCl溶液中搅拌，然后将混合物过滤得到粗产物，并在50℃下干燥16h得到乙基(R)-2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(1.51g)，为淡黄色固体。

步骤2：(R)-2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸的合成

向乙基(R)-2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(1.50g)的EtOH(150mL)和H

步骤3：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(5,6-二甲氧基-1H-苯并[d]咪唑并-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺的合成

向(R)-2-氨基-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(1.30g)的MeCN(150mL)溶液中加入4,5-二甲氧基苯-1,2-二胺(669mg)和POCl

使用相应的起始原料，基本上按照实施例193所述，使用

表10

*注：如果上述化合物中存在同分异构体，则本发明也包括其同分异构体，也包括其混合物。

实施例195化合物195和/或其同分异构体的合成

(R)-2-(5-(2-(2-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(R)-2-(5-(2-(2-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

向(R)-5-(2-(2-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(13.0g)的MeCN(150mL)溶液中加入4,5-二氨基-2-甲氧基苯甲腈(7.15g)和POCl

实施例196化合物196和/或其同分异构体的合成

(R)-2-(5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(R)-2-(5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

步骤1：(R)-2-(5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈和/或其同分异构体

向(R)-5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(13.0g)的MeCN(150mL)溶液中加入4,5-二氨基-2-甲氧基苯甲腈(7.15g)和POCl

实施例197化合物197的合成

(S)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(S)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]

咪唑-6-腈

步骤1：乙基(S)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯的合成

在室温下，向(S)-2-(2,4-二氟苯基)吡咯烷盐酸盐(10.00g)的EtOH(150mL)溶液中加入DIEA(17.62g)和乙基5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(9.76g)，然后加热至80℃反应3h。通过LCMS检测反应。将反应冷却至室温，然后将混合物真空浓缩。将反应混合物加入冷却水中并搅拌。过滤混合物，将残余固体在1N HCl溶液中搅拌，然后将混合物过滤得到粗产物，并在50℃下干燥16h得到乙基(S)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(15.20g)，为淡黄色固体。

步骤2：(S)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸的合成

向乙基(S)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(15.2g)的EtOH(150mL)和H

步骤3：(S)-2-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈和/或其同分异构体

向(S)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(13.0g)的MeCN(150mL)溶液中加入4,5-二氨基-2-甲氧基苯甲腈(6.77g)和POCl

实施例198化合物198和/或其同分异构体

(R)-2-(5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈

(R)-2-(5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-腈

步骤1：(R)-乙基5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯的合成

室温下，向(R)-2-(4-氟苯基)吡咯烷盐酸盐(10.00g)的EtOH(150mL)溶液中加入DIEA(19.25g)和乙基5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(10.62g)，然后加热至80℃反应3h。通过TLC和LCMS检测反应。将反应冷却至室温，然后将混合物真空浓缩。将反应混合物加入冷却水中并搅拌。过滤混合物，将残余固体在1N HCl溶液中搅拌，然后将混合物过滤得到粗产物，并在50℃下干燥16h得到(R)-乙基5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(15.20g)，为淡黄色固体。

步骤2：(R)-5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸的合成

向(R)-乙基5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(15.2g)的EtOH(150mL)和H

通过TLC和LCMS检测反应。将混合物真空浓缩并将残余物倒入1N HCl溶液中。将混合物过滤并在50℃加热16h，得到粗产物(R)-5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]噻吩-3-羧酸(13.0g)，为灰白色固体。

步骤3：(R)-2-(5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-5-腈和/或其同分异构体的合成

向(R)-5-(2-(4-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(13.0g)的MeCN(150mL)溶液中加入4,5-二氨基-2-甲氧基苯甲腈(7.15g)和POCl

实施例199化合物199的合成

(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6,7-二甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)吡唑并

[1,5-a]嘧啶

步骤1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳酰肼的合成

室温下，向(R)-2-(4-氟苯基)吡咯烷盐酸盐(1.00g)的EtOH(15mL)溶液中加入DIEA(1.93g)和1-(5-氯吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)ethan-1-酮(923.5mg)，加热至80℃反应3h。通过TLC和LCMS监测反应。将反应冷却至室温，然后将混合物真空浓缩。将反应混合物加入冷却水中并搅拌。将混合物过滤并将残余固体在1N HCl溶液中搅拌，然后将混合物过滤以得到粗产物，并在50℃下干燥16h得到(R)-1-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酮(1.56g)，为淡黄色固体。

步骤2：(R)-2-氯-1-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酮的合成

向(R)-1-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酮(1.50g)的MeCN(15mL)溶液中加入NCS(1.17g)和p-TsOH(151.5mg)在90℃下反应6h。通过TLC和LCMS监测反应。将混合物真空浓缩，残余物通过combiflash纯化(PE:EA＝50％:50％)，得到(R)-2-氯-1-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酮(906mg)，为淡黄色固体。

步骤3：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6,7-二甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶的制备

向(R)-2-氯-1-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酮(900.00mg)的n-BuOH(10mL)溶液中加入4,5-二甲氧基吡啶-2-胺(1.11g)，升温至130℃反应6h。通过TLC和LCMS监测反应。将混合物真空浓缩并将残余物通过combiflash纯化(DCM:MeOH＝95％:5％)得到(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-3-(6,7-二甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(906mg)，为淡黄色固体。MS:[M+H]

实施例200化合物200的制备

(R)-3-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6-二氢-8H-[1,2,4]三氮唑[3,4-c][1,4]噁嗪

步骤1：(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳酰肼的合成

室温下向乙基(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸酯(1.00g)的EtOH(10mL)溶液中加入N

步骤2：(R)-3-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6-二氢-8H-[1,2,4]三氮唑[3,4-c][1,4]噁嗪的合成

向(R)-5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-碳酰肼(1.00g)的THF(10mL)溶液中在70℃下于6h内加入Lawesson’s试剂(3.39g)和吗啡-3-酮(459.8mg)。通过TLC和LCMS监测反应。将混合物真空浓缩，并将残余物倒入1N HCl溶液中。在130℃下向混合物中加入t-BuOH(10mL)反应6h。将反应冷却至室温，然后将混合物真空浓缩，残余物通过combiflash(DCM:MeOH＝5％:95％)纯化，得到(R)-3-(5-(2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-5,6-二氢-8H-[1,2,4]三氮唑[3,4-c][1,4]噁嗪(906mg)，为淡黄色固体。MS:[M+H]

对比化合物A 5-[2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷-1-基]-3-(5-甲基-1H-1,2,4-三氮唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶

根据WO2016097869中实施例43所描述的方法制备如下对比化合物A。

实施例201TrkA激酶测定

用迁移率变动分析法测定化合物对TrkA激酶的抑制活性。分析步骤如下：

1.反应缓冲液

1x激酶基础缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5；0.0015％Brij-35)

终止缓冲液(100mM HEPES,pH 7.5；0.015％Brij-35；0.2％涂层试剂#3；50mMEDTA)

2.制备化合物:

1)用100％DMSO将化合物稀释至反应中最终所需的最高抑制剂浓度的50倍。将100μl此化合物稀释液转移至96孔板的孔中。例如，如果所需的最高抑制剂浓度为300nM，然后在此步骤中准备15μM化合物的DMSO溶液。

2)对于所有化合物，将管中的化合物转移到96孔存储板上的一个孔中，并通过在下一个孔中将30μl转移到60μl的100％DMSO中来依次稀释化合物，依此类推，总共10种浓度。

3)在相同的96孔板中，将100μl 100％DMSO加至无化合物对照和无酶对照两个空孔中。将该板标记为源板。

4)制备中间板

从源板转移10μl化合物到新的96孔板作为中间板

在中间板的每个孔中加入90μl 1x激酶缓冲液。

在振荡器上将化合物在中间板上混合10分钟。

3.制备测定板

1)将每孔5μl从96孔中间板转移到384孔板中，一式两份。例如，将96孔板的A1转移到384孔板的A1和A2中。将96孔板转的A2移到384孔板的A3和A4，依此类推。

4.激酶反应

1)制备2.5倍酶溶液

在1x激酶基本缓冲液中添加激酶。

2)制备2.5倍肽溶液

在1x激酶基本缓冲液中添加FAM标记的肽和ATP。

3)分析板中已经包含5μl化合物的10％DMSO溶液。

4)将2.5倍酶溶液转移到测定板上

在384孔测定板的每个孔中加入10μl 2.5x酶溶液。

5)在室温下孵育10分钟。

6)将2.5倍肽溶液转移至测定板

在384孔测定板的每个孔中加入10μl 2.5x肽溶液。

激酶反应条件如表11所示：

表11

7)激酶反应并停止

在28℃下孵育指定的时间。

加入25μl终止缓冲液以终止反应。

5.Caliper读数

收集Caliper数据。

6.曲线拟合

1)从Caliper程序中复制转换数据。

2)将转换值转换为抑制值。

抑制率＝(最大值-转换值)/(最大值-最小值)*100

“最大值”为DMSO对照值；“最小值”为无激酶对照孔值。

3)使用XLFit excel插件版本5.4.0.8中的数据拟合来获得IC

方程是：Y＝最小抑制率+(最大抑制率-最小抑制率)/(1+(IC

结果用IC

表12

实施例202 Ba/F3-TPM3-NTRK1和Ba/F3-ETV6-NTRK3细胞增殖测定分析

1.细胞培养

细胞系：具有TPM3-NTRK或ETV6-NTRK3融合突变基因稳定表达的Ba/F3细胞命名为Ba/F3-TPM3-NTRK1和Ba/F3-ETV6-NTRK3。

A.培养基

RPMI 1640和10％FBS和1％PS和2ug/mL嘌呤霉素。

B.细胞复苏

a)预先在37℃水浴中预热培养基。

b)从液氮罐中取出冻存管，迅速将其放入37℃的水浴中，并在1分钟内完全融化。

c)将细胞悬液转移至装有8mL培养基的15mL离心管中，以1000rpm离心5分钟。

d)弃去上清液，将细胞重悬于1mL培养基中，转移至装有15mL培养基的75cm

C.细胞传代

a)预先在37℃水浴中预热培养基。

b)将细胞收集到15mL离心管中，以1000rpm离心5分钟。弃去上清液，计数，使细胞密度达到1x10

2.化合物的制备

a)将测试化合物(20mM储备溶液)以100％DMSO稀释至60μM作为起始浓度，然后以"9+0"浓度进行3倍系列稀释。在384孔稀释板中(Cat#P-05525,Labcyte)；

b)用培养基将上述化合物溶液稀释1:20倍以制备10倍的工作溶液；

3.细胞铺板

a)取处于对数生长期的细胞，以1000rpm离心5分钟，然后用培养基重悬细胞，然后计数细胞；

b)将细胞以800个细胞/孔的密度接种到96孔细胞培养板上；

4.化合物处理

a)将第2步制备的化合物以每孔15μL的量添加到细胞板中，终浓度为300、100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.14、0.05和0nM，DMSO终浓度为0.5％。空白对照孔是培养基(0.5％DMSO)；

c)将细胞在培养箱中再培养72小时。

5.检测

a)移开96孔细胞培养板，并添加50μl CTG试剂(CellTiter Glo试剂盒，promega，Cat#G7573)。

b)将板摇动2分钟，然后在室温下冷却30分钟。

c)使用PerkinElmer读取器读取发光信号值。

实验数据分析

用GraphPad Prism 6.0软件分析数据，得到化合物活性的拟合曲线。

根据非线性回归方程拟合化合物IC

方程是：Y＝最小抑制率+(最大抑制率-最小抑制率)/(1+(IC

X：化合物浓度的对数；Y：发光值。

表13

注意：“-”代表“未测试”。

实施例203肝微粒体代谢稳定性测定

混合人肝微粒体(Cat.452117)购自Corning。混合雄性大鼠肝微粒体(Cat.R1000)和混合雄性小鼠肝微粒体(Cat.M1000)购自XENOTECH。微粒体在-80℃下保存。

1)按照表14配制含磷酸盐缓冲液、超纯水和氯化镁的母液。

表14 母液的制备

2)分别进行了以下两个实验

a)含NADPH：向培养基中分别加入10μL 20mg/mL肝微粒体和40μL 10mM NADPH。微粒体和NADPH的终浓度分别为0.5mg/mL和1mM。

b)不含NADPH：将10μL 20mg/mL肝微粒体和40μL的超纯水加入培养液中。微粒体的终浓度为0.5mg/mL。

3)加入4μL测试化合物溶液或对照化合物溶液(维拉帕米)使得终浓度为2μM后开始反应，并在37℃下进行。

4)在0、15、30、45和60分钟从反应溶液中取50微升的小份。通过添加4体积的冷乙腈和IS(100nM阿普唑仑、200nM咖啡因、200nM拉贝洛尔和2μM酮洛芬)停止反应溶液。样品在3,220g离心40分钟。将100微升上清液与100微升超纯水混合，然后用于LC-MS/MS分析。所有实验一式两份。

斜率k由母体药物剩余百分比与孵育时间曲线的自然对数的线性回归确定

体外半衰期(体外t 1/2)由斜率值确定：

体外t

体外内在清除率(in vitro CL

测定中包括对照化合物(维拉帕米)。任何不在规定范围内的化合物值将被拒绝，并重复进行实验。

表15显示了不同种类的肝微粒体代谢稳定性的结果。

表15

注意：“-”代表“未测试”。

结果证实，本发明的示例性化合物与对比化合物A相比，在人/大鼠/小鼠肝微粒体中具有显着改善的代谢稳定性。这种改善的稳定性预示着其在人体内具有优异的药代动力学性质和更好的临床结果。

实施例204血浆蛋白结合测定

按照以下步骤测定血浆蛋白结合。

1)100mM磷酸钠和150mM NaCl缓冲液(PBS)的制备

通过在去离子水中溶解14.2g/L Na

2)血浆的制备

冷冻的血浆立即在室温下解冻。

将血浆以3,220g离心10分钟以去除凝块，并将上清液收集到新的试管中。检查并记录血浆的pH值。

注意：a).仅使用到达后融化不超过两次的血浆。b).仅使用pH 7到pH 8范围内的血浆。

3)工作溶液的制备

用DMSO以200μM的浓度制备测试化合物和对照化合物酮康唑的工作溶液。然后移去3μL的工作溶液使与597μL的人、大鼠或小鼠血浆混合，最终得到浓度为1μM(0.5％DMSO)的混合溶液。将血浆样品彻底涡旋。

4)透析膜的制备

将透析膜在超纯水中浸泡60分钟以分离条带，然后在20％的乙醇中浸泡20分钟，最后在透析缓冲液中浸泡20分钟。

5)平衡透析步骤

按照制造商的说明组装透析设备。每个细胞中装有120μL血浆样品，并用等体积的透析缓冲液(PBS)透析。一式两份进行测定。在37℃下5％CO

6)样品分析步骤

向每个缓冲液样品中加入50μL空白血浆，并向收集的血浆样品中补充等体积的PBS。300μL室温淬灭溶液(含有内标的乙腈(IS，100nM阿普唑仑，500nM Labetalol和2μM加入酮洛芬))使蛋白质沉淀。将板中的样品涡旋5分钟，并在4℃下以3220g离心30分钟。然后用100μL或200μL水将100μL的上清液转移至新的96孔板中用于LC-MS/MS分析(取决于LC-MS信号响应和峰形)。

计算测试化合物和对照化合物结合的百分比，如下所示：

％游离＝(峰面积比

％结合＝100-％游离

％回收＝(峰面积比

峰面积比

峰面积比

峰面积比

表16显示了不同物种中对照化合物和测试化合物的血浆蛋白结合结果。

表16

注意：“-”代表“未测试”。

通常，只有未结合的部分才具有生物学作用或被代谢。因此，与血浆蛋白的结合程度会显著影响药物的药代动力学和药效学性质。

如表16所示，对比化合物A反映了与血浆蛋白的高度结合，因此该药的功效可能降低。出乎意料的是，与对比化合物A相比，本发明的示例性化合物具有较低的血浆蛋白结合度。预示本发明对人体具有优良的药代动力学和药效学性质。

实施例205细胞色素P450的测定

按照以下步骤测量细胞色素P450：

1)根据表17制备包含磷酸盐缓冲液、超纯水、MgCl

表17

2)对于抑制CYP1A2，向上述溶液中加入终浓度为40μM的特定药物底物(非那西丁：8mM)1μL。

3)对于抑制CYP2C8，向上述溶液中加入终浓度为5μM的特定药物底物(紫杉醇:1mM)1μL。

4)对于抑制CYP2C9，向上述溶液中加入终浓度为200μM的特定药物底物(甲苯磺丁酰胺:40mM)1μL。

5)对于抑制CYP2C19，向上述溶液中加入终浓度为50μM的特定药物底物((s)-美芬妥因:10mM)1μL。

6)对于抑制CYP3A4，向上述溶液中加入终浓度为5μM的特定药物底物(咪达唑仑:10mM)1μL。

7)对于抑制CYP3A4，向上述溶液中加入终浓度为50μM的特定药物底物(睾酮:10mM)1μL。

8)将混合物在37℃下预热5分钟。通过添加20μL 10mM NADPH溶液以终浓度1mM进行反应，并在37℃下进行。

9)在指定的时间点(非那西丁：20分钟；紫杉醇：10分钟；甲苯磺丁酰胺：20分钟；(s)-美芬妥因：20分钟；咪达唑仑：5分钟；睾酮：10分钟)加入300μL冷淬灭溶液(含甲醇的内标物(IS、500nM拉贝洛尔、100nM阿普唑仑和2μM酮洛芬)停止反应。将样品涡旋震荡5分钟，并在4℃在3220g下离心40分钟。然后将100μL的上清液转移到新的96孔板中，其中装有100μL或200μL的水(取决于LC-MS信号响应和峰形)，以进行LC-MS/MS分析。

所有实验一式两份进行。

表18所示的化合物为对CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19和CYP3A4的抑制百分比(单位为％)。

表18

注意：“-”代表“未测试”。

结果证实，本发明的示例性化合物对CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19和CYP3A4具有低抑制作用。特别是对于CYP3A4(其是药物代谢的主要亚型)，与对比化合物A相比，本发明中的化合物具有更少的抑制作用。