嵌合黄病毒丽沙病毒疫苗

技术领域

本发明涉及基于嵌合黄病毒的疫苗。本发明进一步涉及针对狂犬病的疫苗。

背景技术

在人类中使用的狂犬病疫苗是纯化的细胞培养物和包含灭活的狂犬病病毒(RABV)的基于鸡胚的狂犬病疫苗(CCEEV)。

这些疫苗是灭活的病毒疫苗，其要求多剂量方案，生产和保持它们需要冷链且成本高。这些疫苗不能预防处于疫区中的人中的主要目标群体中的人类狂犬病。此外，通过预防性疫苗接种所诱导的免疫保护作用相对迅速地减小，这涉及需要利用免疫球蛋白(RIG)和疫苗组合方案的暴露后治疗。

狂犬病病毒糖蛋白G(RabG)负责细胞粘附和膜融合，是被靶向用于疫苗开发的关键免疫原。狂犬病病毒糖蛋白G及其表位的综述参见Kuzmina等人，(2013)J antivirantiretrovir.5:2 37-43。

Bonaldo等人，(2014)Human Vacc.&Immunother.10,1256–1265综述了黄热病病毒(YFV)嵌合构建体，其中非黄病毒抗原被插入到YFV基因组中。

已经采用了涉及复制缺陷性疫苗平台RepliVax

这些构建体需要体外转录和在表达结构性WN C-prM-E蛋白的幼仓鼠肾(BHK)辅助细胞(HC)中转染，需要所述结构性WN C-prM-E蛋白用来将RV-RabG复制子包装为用作疫苗的单组分假感染性病毒(sPIV)。这些PIV诱导针对狂犬病和WN的特异性抗体反应。

黄热病病毒17D已经被用作用于拉沙病毒糖蛋白(GPC)或其亚基G1和GP2的载体(Bredenbeek等人，(2006)Virology 345,299-304和Jiang等人，(2011)Vaccine.29,1248-1257)。在这些构建体，GP基因(缺少信号肽，SSP)(或GP1序列或GP2序列)被插入到YF-E/NS1之间。这些构建体体在插入物融合体的C末端处具有源自YF-E(YF-E的23个C末端疏水氨基酸)、WNV-E或人工设计的序列的序列。这些构建体需要在细胞中转染，并且由它们得到的病毒用作疫苗。

RepliVax

鉴于使用YFV17D作为载体表达糖蛋白前体，利用此重组病毒的主要问题是不稳定性，该不稳定性不允许根据疫苗生产的要求放大该技术。

发明内容

本发明描述了嵌合黄病毒构建体，该构建体在E/NS1基因间区域中包含丽沙病毒(lyssavirus)G蛋白。

如下述通过将RabG插入到YFV-17D的黄热病E/NS1基因间区域中改造了一种新的基于黄热病病毒的转基因疫苗：RabG的N-末端(Nt)信号肽缺失，将NS1的前9个氨基酸(27个核苷酸)添加到RabG的N-末端以使得能够正确地释放RabG蛋白，保留RabG胞质C末端序列并将其融合到WNV(西尼罗病毒)跨膜结构域2。得到的狂犬病病毒/YFV-17D构建体产生了表达功能性RabG和YFV-17D蛋白的有活力的活的减毒病毒。包含此YFV17D-RabG构建体的细菌人工染色体可以直接用作疫苗，表明YFV17D-RabG构建体的这种基于DNA的模态可以用作热稳定性疫苗。所述疫苗在单针免疫后诱导针对RABV和YFV两者的免疫应答。

YFV17D-RabG是诱导YFV和狂犬病病毒特异性免疫的双重疫苗。包含YFV17D-RabG的BAC还可以用于生产组织培养来源的活减毒疫苗。

本发明总结为下列的声明：

1.一种多核苷酸，其包含活的感染性减毒黄病毒的序列，其中编码丽沙病毒G蛋白的至少一部分的核苷酸序列插入在/位于所述黄病毒的E和NS1基因之间的基因间区域处，使得嵌合病毒得以表达，其特征在于，在所述黄病毒的E蛋白的C末端和所述黄病毒的NS1蛋白的信号肽的N末端的编码序列以下列次序包含：

-黄病毒NS1蛋白的另一信号肽，

-丽沙病毒G蛋白，所述丽沙病毒G蛋白包含功能缺陷的信号肽或缺少功能性信号肽，包含IIb表位，包含C末端TM膜序列和包含C末端胞质序列，以及

-黄病毒E蛋白的TM2结构域。

2.根据声明1所述的多核苷酸，其中所述活的感染性减毒黄病毒的序列是黄热病病毒，典型地是YF17D株。

3.根据声明2所述的多核苷酸，其中所述黄病毒主链是嵌合病毒。

4.根据声明1-3中任一项所述的多核苷酸，其中所述丽沙病毒是狂犬病病毒，

5.根据声明1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述狂犬病病毒G蛋白是ERA株的G蛋白。

6.根据声明1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述G蛋白的核苷酸序列为在哺乳动物细胞中表达提高进行了密码子优化。

7.根据声明1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述活的感染性减毒黄病毒的NS1蛋白的所述另一信号肽包含序列DQGCAINFG[SEQ ID NO:6]或由序列DQGCAINFG[SEQ IDNO:6]组成。

8.根据声明1-6中任一项所述的多核苷酸，其中位于TM2结构域的C末端处的NS1蛋白的信号肽包含序列DQGCAINFG[SEQ ID NO:6]或由序列DQGCAINFG[SEQ ID NO:6]组成。

9.根据声明1-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述IIb表位具有序列GCTNLSGFS[SEQ ID NO:15]。

10.根据声明1-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄病毒E蛋白的TM2结构域来自西尼罗病毒。

11.根据声明1-10中任一项所述的多核苷酸，其中黄病毒E蛋白的TM2结构域具有序列RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA[SEQ ID NO 13]。

12.根据声明1-11中任一项所述的多核苷酸，其中Rab G的功能缺陷的信号肽是F14S突变。

13.根据声明1-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述Rab G缺少氨基酸1-19的N末端信号序列MVPQALLFVPLLVFPLCFG[SEQ ID NO 18]。

14.根据声明1-13中任一项所述的多核苷酸，其中所述嵌合病毒的序列在黄病毒E基因、NS1信号肽和Rab G蛋白的连接处包含序列LGVGA

15.根据声明1-14中任一项所述的多核苷酸，其中所述嵌合病毒的序列在WNV TM2结构域和YFV蛋白的连接处包含序列VNVHA DQGCAINFG KRELK[SEQ ID NO:22]。

16.根据声明1-15中任一项所述的多核苷酸，其中所述嵌合病毒的编码序列包含SEQ ID NO:2的序列或与SEQ ID NO:2的序列具有95％或99％序列同一性的序列，或根据声明1-15中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1的序列或与SEQ IDNO:1的序列具有95％或99％序列同一性的序列。

17.根据声明1-16中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸是细菌人工染色体。

18.根据声明1-17中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸用作药物。

19.根据声明18所述的用作药物的多核苷酸，其中所述药物是疫苗。

20.根据声明1-19中任一项所述的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列用于针对丽沙病毒的疫苗接种。

21.一种嵌合的活的感染性减毒黄病毒，其中丽沙病毒G蛋白(诸如狂犬病病毒G蛋白)的至少一部分位于所述黄病毒的E蛋白和NS1蛋白之间，使得所述病毒在E蛋白的C末端和NS1蛋白的信号肽的N末端以下列次序包含：

-黄病毒NS1蛋白的另一信号肽，

-丽沙病毒G蛋白，所述丽沙病毒G蛋白包含功能缺陷的信号肽或缺少功能性信号肽，且包含IIb表位，包含C末端TM膜序列和包含C末端胞质序列，以及

-黄病毒E蛋白的TM2结构域。

22.根据声明21所述的嵌合病毒，所述嵌合病毒用作药物。

23.根据声明22所述的嵌合病毒，所述嵌合病毒用于预防丽沙病毒。

24.由根据声明23所述的核苷酸编码的嵌合病毒，所述嵌合病毒用于预防丽沙病毒和预防黄病毒。

25.一种制备针对丽沙病毒感染(诸如狂犬病)的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供BAC，所述BAC包含：

诱导性细菌ori序列，所述诱导性细菌ori序列用于将所述BAC扩增到每个细菌细胞超过10个拷贝，和

病毒表达盒，所述病毒表达盒包含根据声明1-15中任一项所述的黄病毒丽沙病毒嵌合病毒的cDNA，并且包含顺式调控元件，所述顺式调控元件用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA并且将所转录的RNA加工成感染性RNA病毒，

b)用步骤a)的BAC转染哺乳动物细胞，并将所感染的细胞传代，

c)验证步骤b)所感染的细胞的复制病毒的毒力和生成抗体以及诱导针对丽沙病毒感染的保护作用的能力，

d)将在步骤c)中验证的病毒克隆到载体中，以及

e)将所述载体配制成疫苗制剂。

26.根据声明25所述的方法，其中所述载体是BAC，所述BAC包含诱导性细菌ori序列，所述诱导性细菌ori序列用于将所述BAC扩增到每个细菌细胞超过10个拷贝。

本项目接受了来自欧盟的地平线2020研究和创新计划(European Union’sHorizon 2020research and innovation programme)的资金资助，RABYD-VAX基金协议号为733176。

附图说明

图1.A)YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)的示意性图示。SP:信号肽；TM:跨膜结构域。B)YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)与YFV17D的空斑表型比较^C)在AG129小鼠中测试YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)的免疫原性的疫苗接种时间表。在AG129小鼠中的死亡率和对YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)的血清学反应(表格)(IP–腹腔内；TCID50–半数组织培养感染剂量；PEI–聚乙烯亚胺)。

图2:A)表达在YF-E/NS1位点处插入的ERA-RabG或Δ82-ERA-RabG的BAC子代的空斑表型。B)在图面A中所示的构建体的图例。

图3:A)在AG129小鼠中测试YFV17D-RabG-ERA-Δ82和Rabipur的免疫原性的疫苗接种时间表。(IP–腹腔内；TCID50–半数组织培养感染剂量)。B)针对RABV的中和抗体效价。

图4:A)YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)的示意性图示。SP:信号肽；TM:跨膜结构域。B)YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)与YFV17D的空斑表型比较。

图5:A)在AG129小鼠中测试YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)的免疫原性的疫苗接种时间表。B)在AG129小鼠中的死亡率和对YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)血清学反应(IP–腹腔内)。

图6.A)按下述将RabG-ERA插入到YF-E/NS1之间：移除N-末端RabG信号肽(SP)以使RabG容纳在YF多聚蛋白中，在Rab G的Nt处添加NS1的前9个氨基酸(aa)以允许正确地释放RabG，保留C末端处的RabG胞质结构域并将其融合到WNV的跨膜结构域锚蛋白-2从而将RabG配合到YF多聚蛋白拓扑结构中。B)YFV17D-RabG

图7:A)表达RabG

图8.对在YF17D-RabG

图9:在AG129小鼠中测试YF17D-RabG

图10:在AG129小鼠中测试下列的体内免疫原性的单次疫苗接种时间表：(i)PLLAV-YF17D-RabG

图11:在AG129小鼠中利用下列经腹腔内(IP)疫苗接种(A)第07天、(B)第14天、(C)第21天和(D)第28天针对RABV的血清中和抗体(SNA)效价：(i)PLLAV-YF17D-RabG

图12：A)在JE-E和YF-NS1之间(ChimeriVax JE主链)插入的RabG的示意性图示。B)ChimeriVaxJE-RabG与YF17D的空斑表型比较。C).在ChimeriVaxJE-RabG病毒的连续传代期间收获的病毒样品的RT-PCR分析。C+，对照阳性pShuttle-ChimeriVaxJE-RabG；-RT:不含逆转录酶的RT-PCR反应；RNA:含病毒RNA的RT-PCR反应。

图13:A)在AG129小鼠中测试ChimeriVaxJE-RabG的免疫原性的疫苗接种时间表。B)在AG129小鼠中的死亡率和对ChimeriVaxJE-RabG血清学反应(IP–腹腔内)。

图14:A)在ZIK-E和YF-NS1之间(ChimeriVaxZIK主链)插入的RabG的示意性图示。B)ChimeriVaxZIK-RabG与YF17D的空斑表型比较。C).在ChimeriVaxZIK-RabG病毒的连续传代期间收获的病毒样品的RT-PCR分析。C+，对照阳性pShuttle-ChimeriVaxZIK-RabG；-RT:不含逆转录酶的RT-PCR反应；RNA:含病毒RNA的RT-PCR反应。

图15:A)在AG129小鼠中测试ChimeriVaxZIK-RabG的免疫原性的疫苗接种时间表。B)在AG129小鼠中的死亡率和对ChimeriVaxZIK-RabG血清学反应(IP–腹腔内)。

图16:主链修饰的实施方案。

(A)黄病毒载体主链。用作活疫苗的典型的活减毒黄病毒的基因组结构的示意性图示。每个疫苗病毒编码：包含C基因和NS1-5基因的主链(1)，和病毒表面蛋白prME(2)。组件(1)和(2)已知诱导病毒特异性体液免疫和细胞免疫；尤其是组件(2)诱导中和抗体(nAb)。

YF17D–黄热病疫苗株17D；JE SA14-14-2–日本脑炎疫苗株SA14-14-2；ZIKV–待用作疫苗的寨卡病毒，或其活减毒寨卡病毒变异株。

(B)由YF17D载体主链(其中黄病毒表面蛋白中有变异)表达的原型丽沙病毒疫苗。典型的活减毒黄病毒的基因组结构的示意性图示，所述活减毒黄病毒转基因了狂犬病病毒G蛋白(RabG,组件3)，所述狂犬病病毒G蛋白作为待用作针对狂犬病的疫苗的来源于所述原型丽沙病毒狂犬病病毒的保护性抗原。示出了三种可能的变异体，它们使用YF17D病毒的组件(1)作为主链，以及分别使用来自YF17D、JE SA14-14-2和ZIKV的组件(2)作为黄病毒表面蛋白。

YF17D-RabG–表达RabG的重组YF 17D；CVax-JE-RabG–表达RabG的嵌合YF17D/JE疫苗株(如例如由Arroyo等人，2001PMID:11134306公开)；Cvax-ZIK-RabG–表达RabG的YF17D/ZIK疫苗株(如例如由Kum等人2018PMID:30564463公开)。

(C)由YF17D载体主链表达的抗原性丽沙病毒疫苗株变体。典型的活减毒黄病毒的基因组结构的示意性图示，所述活减毒黄病毒使用YF17D病毒的组件(1)作为主链，使用分别代表抗原性不同的遗传谱系I(狂犬病病毒)、II(拉哥斯蝙蝠病毒,LBV；和莫科拉病毒,MOKV)和III(莱里达蝙蝠病毒，LLEBV)的一些丽沙病毒的G蛋白序列作为转基因组件(3)。每种G蛋白都被认为是诱导针对相关的丽沙病毒、至少针对属于相同遗传谱系的病毒的免疫性的保护性抗原。

YF17D-RabG–表达RabG的重组YF 17D；YF17D-LBV-G–表达LBV G蛋白的重组YF17D；YF17D-MOKV-G–表达MOKV G蛋白的重组YF17D；YF17D-LLEBV–表达LLEBV G蛋白的重组YF17D。

(D)由JE SA14-14-2载体主链表达的原型丽沙病毒疫苗。活减毒黄病毒的基因组结构的示意性图示，所述活减毒黄病毒使用JE SA14-14-2病毒的组件(1)作为主链，使用组件(3)作为转基因。

具体实施方式

本发明以黄热病病毒举例说明，但也适用于使用黄病毒种的其他病毒主链，诸如，但不限于，日本脑炎病毒、登革病毒、墨累谷脑炎病毒(Murray Valley Encephalitis，MVE)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis Encephalitis，SLE)、西尼罗病毒(WN)、森林脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis，TBE)、俄罗斯春夏脑炎病毒(Russian Spring-SummerEncephalitis，RSSE)、库京病毒(Kunjin virus)、波瓦桑病毒(Powassanvirus)、科萨努尔森林病病毒(Kyasanur Forest Disease virus)、寨卡病毒(Zika virus)、乌苏土病毒(Usutu virus)、韦塞尔斯布朗病毒(Wesselsbron)和鄂木斯克出血热病毒(OmskHemorrhagic Fever virus)。

本发明进一步适用于黄病毒科，黄病毒科包括黄病毒属，还包括Pegivirus病毒属、丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)和瘟病毒属(Pestivirus)。

丙型肝炎病毒属包括例如丙型肝炎病毒C(丙型肝炎病毒)和丙型肝炎病毒B(GB病毒B)。

Pegivirus属包括例如Pegivirus A(GB病毒A)、Pegivirus C(GB病毒C)和Pegivirus B(GB病毒D)。

瘟病毒属包括例如牛病毒性腹泻病毒1和猪瘟病毒(以前称为猪霍乱病毒)。

用作主链的黄病毒本身可以是由不同的黄病毒的多个部分组成的嵌合病毒。

例如C和NS1-5区来自黄热病病毒，prME区是日本脑炎或寨卡病毒的。其实例在表2和图16中示出。

本发明以狂犬病丽沙病毒的G蛋白举例说明，但也适用于其他丽沙病毒的G蛋白。其实例为阿拉万丽沙病毒阿拉万病毒(Aravan lyssavirus Aravan virus，ARAV)、澳大利亚蝙蝠丽沙病毒、伯克罗蝙蝠丽沙病毒(Bokeloh bat lyssavirus)、杜文黑基丽沙病毒(Duvenhage lyssavirus)、欧洲蝙蝠丽沙病毒1、欧洲蝙蝠丽沙病毒2、伊科马丽沙病毒(Ikomalyssavirus)、Irkut丽沙病毒、苦盏丽沙病毒(Khujand lyssavirus)、拉各斯蝙蝠丽沙病毒、莫科拉丽沙病毒(Mokola lyssavirus)、狂犬病丽沙病毒、西莫尼蝙蝠丽沙病毒(Shimoni bat lyssavirus)和西高加索蝙蝠丽沙病毒，以及其可能的嵌合体和抗原变体。这些种属中的许多在蝙蝠中发现。然而病毒从蝙蝠传播到人类是极大的健康风险。

本发明的构建体允许将编码的插入物正确地递呈至ER腔和蛋白水解加工。如RabG蛋白所例证的那样，由所述插入物编码的蛋白仅在C末端处包含跨膜结构域，紧接着跨膜结构域的是驻留在细胞溶质中的肽。为了实现这种构型，Rab G的N末端信号肽已经被移除(或成为无功能的)。基于此原理，可以经由本发明的载体递呈任何免疫原性蛋白，所述蛋白缺少N末端膜靶向结构域并且在C末端处包含靶向膜序列，接着所述靶向膜序列的是细胞质序列，以允许与NS1蛋白前面的跨膜序列连接。

本发明现在进一步描述其中黄病毒用作主链和丽沙病毒的G蛋白用作插入物的实施方案。

狂犬病病毒的G蛋白综述于Kuzmina等人，(2013)J antivir antiretrovir.5:2,37-43。序列中的特征编号参照成熟蛋白，成熟蛋白的前面是19个AA(MVPQALLFVPLLVFPLCFG)[SEQ ID NO:18]的信号肽。成熟蛋白中的相关序列元件是IIb表位GCTNLSGFS(AA 34-42)[SEQ ID NO:15]、跨膜结构域VLLSAGALTALMLIIFLMTCC(AA 440-461)[SEQ ID NO:19]和胞质结构域RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL[SEQ IDNO:20](AA 462-505)。

不同丽沙病毒的G蛋白之间的高序列同一性使得技术人员毫无问题地在相关的序列中鉴定与在狂犬病病毒G蛋白中存在的那些对应的序列元件。

黄病毒具有长度为大约11,000个核苷酸的正义单链RNA基因组。该基因组包含5′非翻译区(UTR)、长开放阅读框(ORF)和3′UTR。ORF编码三个结构蛋白(衣壳蛋白[C]、前体膜蛋白[prM]和包膜蛋白[E])和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白与基因组RNA一起形成病毒颗粒。非结构蛋白参与病毒多聚蛋白加工、复制、病毒粒子组装和逃避宿主免疫应答。C蛋白的C末端处的信号肽(C-信号肽；也称为C-锚定结构域)通过协调对在信号肽序列的N末端(通过细胞质中的病毒NS2B/NS3蛋白酶)和C末端(通过内质网[ER]腔中的宿主信号肽酶)处的顺序切割来调节黄病毒包装。

正义单链基因组被翻译成单个多聚蛋白，该多聚蛋白被病毒和宿主蛋白共同切割和翻译后切割成三个结构蛋白[衣壳蛋白(C)、前体膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E))和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白负责形成病毒粒子的(球形)结构，启动病毒粒子粘附细胞、内化到细胞中和病毒RNA释放到细胞中，由此开启病毒生命周期。另一方面，非结构蛋白负责在被感染细胞中的病毒复制、调节和逃避免疫应答，以及将病毒传播给蚊子。结构蛋白和非结构蛋白之间的分子内和分子间相互作用在病毒感染和发病机制中具有关键作用。

E蛋白在其C末端包括两个跨膜序列，标为例如图6中的TM1和TM2。

NS1通过对应于E的最后24个氨基酸的信号序列易位到ER腔中，并且在其氨基末端处被ER驻留的宿主信号肽酶裂解而从E释放(Nowak等人，(1989)Virology 169,365–376)。NS1在其C末端处包含一个8-9个氨基酸的信号序列，所述信号序列包含蛋白酶的识别位点(Muller&Young(2013)Antiviral Res.98,192-208)。

本发明的构建体是其中丽沙病毒G蛋白在E蛋白和NS1蛋白之间的边界处插入的嵌合病毒。然而，在G蛋白插入物的N末端和C末端处提供了附加的序列元件。

本发明涉及包含活的感染性减毒黄病毒的序列的多核苷酸，其中编码丽沙病毒G蛋白的至少一部分的核苷酸序列在所述黄病毒的E基因和NS1基因之间的基因间区域处插入，使得嵌合病毒得以表达，其特征在于，在所述黄病毒的E蛋白的C末端和所述黄病毒的NS1蛋白的N末端的编码序列以下列次序包含：

序列元件，所述序列元件允许通过信号肽酶对G蛋白进行蛋白水解加工以离开E蛋白，

-丽沙病毒G蛋白，所述丽沙病毒G蛋白包含功能缺陷的信号肽或缺少功能性信号肽，包含IIb表位，包含C末端TM膜序列和包含C末端胞质序列，以及

-黄病毒E蛋白的TM2结构域。

为了允许在丽沙病毒G蛋白的氨基末端进行蛋白水解加工以离开黄病毒E蛋白并允许在丽沙病毒G蛋白的C末端进行蛋白水解加工以离开黄病毒NS1蛋白，提供作为信号肽酶底物的序列元件。这些元件可以在长度和序列上有所改变，并且可以短至一个氨基酸，如上文引用的Jang等人中所示。关于信号传导蛋白酶的合适识别位点的讨论参见Nielsen等人(1997)Protein Eng.10,1-6。

一般来说，在G蛋白的C末端处，将使用在NS1蛋白的N末端处的信号肽(或允许蛋白水解加工的片段)。

一般来说，在G蛋白的N末端处，引入黄病毒主链的NS1蛋白的相同信号肽(或片段)。

本发明同样涉及包含活的感染性减毒黄病毒的序列的多核苷酸。在本文中，编码丽沙病毒G蛋白的至少一部分的核苷酸序列在所述黄病毒的E基因和NS1基因之间的基因间区域处插入。提供附加的序列，使得当表达所述嵌合病毒时使得从E蛋白的C末端到NS1蛋白的信号肽的N末端的编码序列以下列次序包含：

黄病毒NS1基因的另一信号肽(或其可裂解片段)，在E蛋白的C末端和NS1蛋白的N末端，

丽沙病毒G蛋白，所述丽沙病毒G蛋白包含功能缺陷的信号肽或缺少功能性信号肽，包含IIb表位，包含C末端TM膜序列和包含C末端胞质序列。此G蛋白位于NS1信号肽的C末端。G蛋白的C末端是黄病毒的黄病毒TM2跨膜结构域的序列。此TM2序列的C末端接NS1蛋白，包括其天然信号肽序列。

因此，G蛋白和TM2结构域在N末端和C末端侧接NS1序列。在实施例公开的实施方案中，两个NS1的蛋白质序列和DNA序列都是相同的。

在典型的实施方案中，两个NS1信号序列具有序列DQGCAINFG[SEQ ID NO:6]。

本发明的构建体由于存在此重复序列而不显示重组。可以引入序列修饰或可以使用来自不同黄病毒的NS1序列来避免相同序列的存在，只要编码的肽仍然是蛋白酶的靶标(所述靶标具有这些NS1 N末端信号序列)即可。

在典型的实施方案中，如实施例中所公开，G蛋白是狂犬病病毒的G蛋白，优选是狂犬病病毒的ERA株的G蛋白。

为了促进病毒在哺乳动物宿主中的产生，所述G蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。

本发明的构建体中的G蛋白当存在IIb表位时提供了免疫原性。狂犬病病毒的IIb表位典型地具有序列GCTNLSGFS[SEQ ID NO:15]。

此外为了在病毒的加工期间获得狂犬病病毒G蛋白的期望拓扑结构，需要存在G蛋白的跨膜序列，以及C末端胞质序列。G蛋白的TM结构域序列和胞质序列典型地分别是狂犬病病毒G蛋白的氨基酸440-461和氨基酸462-505的序列。

据认为可以在G蛋白和C末端尾部中引入微小的序列修饰，而不会丧失这些序列元件的功能。例如，其中在跨膜结构域中保留疏水侧链的氨基酸取代，或胞质结构域的截短形式(该截短形式具有足够的长度以允许所述跨膜结构域在胞质结构域的N末端和C末端处的正确定位)。

已经发现G蛋白的功能信号肽的存在产生了选择压力，由此G蛋白的包含其信号肽的一部分缺失或突变。因此，本发明的构建体典型地包含通过部分或全部地移除此序列或通过引入使得信号蛋白无功能的突变(诸如信号肽MVPQALLFVPLLV

位于G蛋白的C末端和NS1的N末端的TM结构域一般是黄病毒的TM结构域，典型地来自E蛋白，且更典型地是E蛋白的TM2结构域。在优选的实施方案中，E蛋白的此TM2结构域来自与形成主链的病毒不同的黄病毒。本发明的实施例记载了西尼罗病毒的E蛋白的TM2结构域。此结构域具有序列RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA[SEQ ID NO 13]。

在下面的实施例部分和示意性图示中，所有序列元件形成连续序列，不含任何插入的序列元件。认为在这些序列元件之间，可以存在附加的氨基酸，只要在ER腔或细胞溶质处的蛋白定位不受干扰或保持蛋白水解加工即可。

上述核苷酸序列可以是病毒本身的或可以是指载体中的序列。用于克隆黄病毒和嵌合病毒形式的合适载体是细菌人工染色体，如下面更详细描述的那样。

本发明的方法和化合物具有医药用途，其中病毒和编码所述病毒的载体可以用来进行针对丽沙病毒的疫苗接种，所述丽沙病毒包含克隆在所述黄病毒中的G蛋白。另外，来自黄病毒的蛋白同等地提供保护作用使得本发明的化合物可以用来使用单一病毒或DNA疫苗针对黄病毒和丽沙病毒进行疫苗接种。

本发明人在WO2014174078中公开的细菌人工染色体的用途，且特别是诱导性BACS的用途特别适合于高产量、高质量扩增RNA病毒的cDNA，诸如本发明的嵌合构建体。

如本公开中所述的BAC包含：

-诱导性细菌ori序列，所述诱导性细菌ori序列用于将所述BAC扩增到每个细菌细胞超过10个拷贝，和

-病毒表达盒，所述病毒表达盒包含RNA病毒基因组的cDNA，并且包含顺式调控元件，所述顺式调控元件用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA并且将所转录的RNA加工成感染性RNA病毒。

如本发明中一样，所述RNA病毒基因组是RNA病毒基因组和狂犬病病毒G蛋白的嵌合病毒cDNA构建体。

在这些BACS中，所述病毒表达盒包含正义链RNA病毒基因组的cDNA，典型地

-在所述cDNA的5’端前面有RNA聚合酶驱动的启动子，用于起始所述cDNA的转录，和

-在所述cDNA的3’端后有用于RNA自剪接的元件，用于在设定的位置处剪接所述病毒cDNA的RNA转录物。

所述BAC可以进一步包含酵母自主复制序列用于穿梭到酵母中并在酵母中维持所述细菌人工染色体。酵母ori序列的实例是2μ质粒起始点或ARS1(自主复制序列1)或其功能上同源的衍生物。

本发明的此第一个方面的RNA聚合酶驱动的启动子可以是RNA聚合酶II启动子,诸如巨细胞病毒极早期(CMV-IE)启动子，或猿猴病毒40启动子或其功能上同源的衍生物。

所述RNA聚合酶驱动的启动子可以同等地是RNA聚合酶I或III启动子。

所述BAC还可以包含用于RNA自剪接的元件，诸如丁型肝炎病毒的基因组核酶的cDNA或其功能上同源的RNA元件。

将DNA配制到疫苗制剂中在本领域中是已知的并且详细记述于例如Methods inMolecular Medicine Vol 127,(2006)Springer Saltzman,Shen和Brandsma(编辑)HumanaPress.Totoma,N.J.中“DNA疫苗”的第6-10章和Vaccines(第6版)(2013)(Plotkin等人编辑)第1200-1231页第61章“Alternative vaccine delivery methods(可选的疫苗递送方法)”。关于在DNA疫苗的制备中适合的可接受的运载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的细节也可以见如下所述的WO2005042014。

“可接受的运载体、稀释剂或赋形剂”是指可接受在人和/或兽用药品(特别是免疫疗法)中使用的附加物质。

作为实例，可接受的运载体、稀释剂或赋形剂可以是可以安全地用于全身或局部施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据特定的施用途径，可以使用本领域中熟知的多种运载体。这些运载体可以选自包括下列的组：糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙和碳酸盐、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐类诸如矿物酸盐包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐和无热原水。

记载药学上可接受的运载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考文献是Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,(1991))，该书通过引用并入本文。

任何安全的施用途径可以被采用用于向患者提供DNA疫苗。例如，可以采用经口、经直肠、肠胃外、舌下、含服、静脉内、关节内、肌内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脑室内、透皮等。肌内和皮下注射可以是适宜的，例如用于免疫治疗性组合物、蛋白疫苗和核酸疫苗的施用。还考虑微粒轰击或电穿孔可以特别地用于递送核酸疫苗。

剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液剂、糖浆剂、口含片、胶囊剂、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型也可以包括专门设计用于此目的的注射或植入控释装置或被修改以另外地以此方式作用的其他形式的植入物。治疗剂的控释可以通过例如利用疏水性聚合物包覆治疗剂来实现，所述疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物诸如羟丙基甲基纤维素。另外，控释可以通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现。

适合用于经口或肠胃外施用的DNA疫苗可以作为离散单位诸如胶囊剂、小药囊剂或片剂呈现，每个离散单位包含预定量的质粒DNA,作为散剂或颗粒剂呈现或作为在水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液中的溶液剂或混悬剂呈现。此类组合物可以通过药学方法制备但所有方法均包括将如上所述的一种或多种药剂与构成一种或多种必要成分的运载体缔合的步骤。通常，所述组合物通过将DNA质粒与液体运载体或精细分散的固体运载体或两者均一地和密切地混合，然后如果需要，将产物成型为期望的形式来制备。

上述组合物可以以与剂型相容的方式以及以有效的量施用。施用于患者的剂量应当足以在适宜的时间段内在患者中实现有益的反应。待施用的药剂的量可以取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，将取决于主治医生的判断的因素。

此外，DNA疫苗可以通过细菌转导递送，如使用利用由Darji等人(2000)FEMSImmunol Med Microbiol 27,341–349和Cicin-Sain等人，(2003)J Virol 77,8249-8255(提供两者作为参考文献)所举例说明的所述DNA质粒转化的沙门氏菌的活减毒株。

典型地，DNA疫苗用于人类的预防性或治疗性免疫，但对于某些病毒也可以应用于脊椎动物(典型地哺乳动物、鸟类和鱼类)，包括驯养动物诸如家畜和伴侣动物。疫苗接种设想的动物是病毒的活储库(人畜共患病)，诸如猴子、犬、小鼠、大鼠、鸟类和蝙蝠。

在某些实施方案中，疫苗可以包括佐剂，即，增强疫苗组合物的免疫原性和/或功效的一种或多种物质。然而，疫苗的有效期可能最终被佐剂损害，佐剂可能不依赖病毒复制而刺激先天免疫应答。合适的佐剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或动物来源的其他油)；嵌段共聚物；去污剂，诸如Tween-80；Quill A,矿物油诸如Drakeol或Marcol,植物油，诸如花生油；棒状杆菌属(Corynebacterium)-衍生的佐剂，诸如短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)；丙酸杆菌属(Propionibacterium)-衍生的佐剂，诸如痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacne)；牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis，卡介苗或BCG)；白介素类，诸如白介素2和白介素12；单核因子，诸如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素，诸如γ干扰素；组合，诸如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝；脂质体；ISCOMt)和ISCOMATRIX(B)佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成糖肽，诸如胞壁酰二肽或其他衍生物；阿夫立定(Avridine)；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或含有磷酸铝；羧聚乙烯(carboxypolymethylene)，诸如卡波普'EMA(Carbopol'EMA)；丙烯酸共聚物乳液，诸如Neocryl A640；牛痘病毒或动物痘病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂，诸如霍乱毒素，或其混合物。

实施例

实施例1.在E/NS1中插入Rab G

1.1.PLLAV-YFV17D-RabG-ERA

如下述克隆携带在YF-E/NS1基因之间的基因间区域中插入的全长RabG(ERA株)的第一构建体：在RabG信号肽(SP)前加入NS1的前9个氨基酸(27个核苷酸)以在E和NS1之间重新产生信号肽酶切割位点并允许释放RabG蛋白，保留RabG C末端并将其融合到WNV-E第二跨膜结构域(图1A)。

对系列继代和空斑纯化的YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)病毒的序列分析显示在ERA-RabG编码序列开始处有246bp缺失(82aa)，指示该构建体不稳定。此缺失在RabG的信号肽(SP)的第一个氨基酸处开始，并且涉及部分表位II以及一些二硫键(它是蛋白折叠所必需的)的丢失。然而，此活减毒YFV-ERA-RabG(E/NS1)病毒能够在小鼠中诱导针对RABV的中和抗体，它对YF和狂犬病均发生血清转化(图1C)。由于此Δ82-ERA-RabG蛋白似乎是免疫原性的，因此将来源于空斑纯化病毒的cDNA克隆到上述的具有诱导性ori的BAC载体(PLLAV-YFV17D)中。在对13个大肠杆菌克隆测序后检测到携带不同突变的4个变体(分别是pSYF17D-Δ82-ERA-RabG-ENS1#1、#2、#9和#12,图2)。将这些新的pSYF17D-Δ82-ERA-RabG(E/NS1)构建体中的每一个都在BHK21J细胞中转染。它们所有都表现出一致地诱导典型的病毒诱发的致细胞病变效应(CPE)。同样，从转染细胞收获的病毒上清液含有能够形成特征性病毒溶解空斑的感染性颗粒(图2)。将也已经用来生成cDNA的空斑纯化的病毒接种到AG129小鼠中，尽管对YF有血清转化，但没有检测到针对狂犬病病毒的中和抗体(图3)。因此，没有继续对这些构建体进行进一步的体外和/或体内表征。

1.2.PLLAV-YFV17D-RabG-CVS

已经显示ERA-RabG蛋白诱导显著的细胞凋亡(Préhaud等人，(2003)J Virol.77,10537-10547)。将来自非凋亡性狂犬病攻击病毒株(CVS)的密码子优化的全长RabG以与对ERA株所述相同的构造插入到E/NS1之间(图4A)。

将此构建体转染到BHK-21J中并观察到病毒诱发的CPE。组织来源的病毒上清液能够诱发CPE和空斑(图4B)。对来源于此构建体的三个空斑纯化病毒的进一步表征表明在此情况下RabG序列中没有缺失但在RabG蛋白的信号肽中检测到单个核苷酸点突变。此突变将氨基酸苯丙氨酸改变为丝氨酸(F14S)。在利用该构建体转染后收获组织培养的病毒上清液并将空斑纯化病毒接种到AG129小鼠中以确定免疫原性。所有小鼠对RABV和YFV两者均能血清转化(图5)。因此，因为此CVS-RabG-F14S显示是免疫原性的，因此将来源于空斑纯化病毒的cDNA克隆到pShuttle-YF17D(PLLAV)中，并如上文对之前的构建体所述那样(CPE和斑块表型分析)对此新构建体进行表征，表明其能够产生有活力的完全复制-感受态的重组转基因疫苗病毒。将PLLAV-YFV17D-RabG-CVS-F14S与空斑纯化病毒YF17D-CVS-RabG-F14S平行地注射到AG129小鼠(n＝10)中，分别有4/10只动物和9/10只动物对RABV和YFV两者有血清转化(表1和图11)。此结果提示仍然需要对PLLAV进一步优化以提高PLLAV YF17D-RabG(E/NS1)的免疫原性。

上文的实施例指示通过使整个信号肽缺失，或通过在信号肽中引入突变来获得原始Rab G蛋白信号肽的无功能变体存在压力。

因此，生成新的sYF17D-RabG构建体，其中RabG SP序列被缺失以提高所表达的RabG蛋白的免疫原性。

实施例2.PLLAV YF17D-RabG-ΔSP(E/NS1)构建体

Rab G的信号肽参与该蛋白的免疫原性。RabG蛋白需要容纳在YF多聚蛋白的整体拓扑结构中以允许正确地表达转基因和复制YFV载体(图6)。全长RabG SP的存在向病毒构建体中添加一个额外的跨膜段，干扰了YF多聚蛋白构象，并影响RabG的天然折叠，而天然折叠是完全的抗原性所要求的。

生成了携带RabG

通过进行RT-PCR检测在YF17D-RabG

在AG129小鼠(n＝5)中在利用用此PLLAV转染细胞后获得的重组病毒IP接种后在体内评估BAC构建体PLLAV-YF17D-RabG

为了证实利用YF17D-RabG

第一次，血清学分析揭示了不仅YFV17D-RabG病毒而且相应的BACS都能够诱导抗-YFV和抗-RABV抗体(表1和图11)。BAC构建体PLLAV-YF17D-RabG

表1:在AG129小鼠中的死亡率和对第二代YFV-RabG构建体的血清学反应

*Rabipur

除了PLLAV-YFV17D-RabG

出人意料的是，与Giel-Moloney等人2017(上文引用)所提出的最佳RabG表达相反，YFV17D-RabG

然而，接种YFV17D-RabG

实施例3.ChimeriVax-JE-RabG

基于利用生成PLLAV-YF17D-RabG

在PLLAV ChimeriVax-JE主链中引入RabG

将PLLAV ChimeriVaxJE-RabG转染至BHK21J细胞中，观察到典型的CPE，与YFV17D的空斑表型相比，从其收获的病毒上清液形成显著较小的空斑(图12B)。因此，得到的嵌合(JEV/YFV)转基因(RabG)病毒是进一步减毒的，并且来自狂犬病病毒/嵌合(JEV/YFV)PLLAV构建体的病毒产量比来自同源狂犬病病毒/YFV PLLAV的病毒产量小至少100倍。

通过进行RT-PCR检测在ChimeriVaxJE-RabG病毒的连续传代期间收获的病毒样品中的转基因插入物来确定PLLAV ChimeriVaxJE-RabG的稳定性(图12C)。对RT-PCR产物的测序表明至少直到第4代可以检测到没有突变的RabG插入物(将分析更多的继代)。

关于PLLAV-ChimeriVaxJE-RabG的免疫原性，在AG129小鼠(n＝9)中在IP接种后在体内评估利用此PLLAV转染细胞后获得的重组病毒(图13A)。通过间接免疫荧光测定(IIFA)(Euroimmune YFV和JEV)和/或血清中和测定(SNA)(JEV和RABV)定量JEV-、YFV-和RABV-特异性抗体反应。

每天监测疫苗接种小鼠的发病率/死亡率，并且在基线和以两周间隔采血用于血清学分析。一些动物(9只小鼠中有4只)在利用ChimeriVaxJE-RabG(病毒)首次接种后2周使用与第一次疫苗接种相同的剂量和途径加强免疫(图13A)。

对ChimeriVaxJE-RabG的免疫原性分析揭示了通过IP施用细胞培养来源的病毒的9只小鼠中有8只在疫苗接种后14天对JEV、YFV和RABV有血清转化(图13B)。而且，在2只病毒接种的小鼠中在接种后第7天检测到超过0.5IU/ml的抗-RABV抗体，并且同时还在4只动物中观察到0.48IU/ml的抗体效价。值得注意的是，根据WHO指南，使用0.5IU/ml的最小血清抗体浓度作为疫苗接种后充分的血清转化的量度。此外，JEV SNA测试(在疫苗接种后第42天收获的血清样品)证实在通过IIFA检测到结合抗体的8只小鼠中存在针对JEV的中和抗体。此外，关于疫苗安全性，在利用疫苗病毒接种AG129小鼠后没有观察到死亡率。

这些结果显示甚至低至1.2PFU的剂量就诱导针对以下三种病毒的强力免疫应答：JEV、RABV和YFV。

实施例4.ChimeriVax-ZIK-RabG

类似于对PLLAV ChimeriVaxJE-RabG所述，生成了携带优化的G蛋白序列(RabG

在PLLAV ChimeriVax-ZIKV主链中引入此RabG

将PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG转染至BHK21J细胞中，观察到典型的CPE，与YFV17D的空斑表型相比，从其收获的病毒上清液形成显著较小的空斑(图14B)。因此，得到的嵌合(ZIKV/YFV)转基因(RabG)病毒是进一步减毒的，并且来自狂犬病病毒/ZIKV PLLAV构建体的病毒产量比来自同源狂犬病病毒/YFV PLLAV的病毒产量小至少100倍。

通过进行RT-PCR检测在ChimeriVaxJE-RabG病毒的连续传代期间收获的病毒样品中的转基因插入物来确定PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG的稳定性(图14C)。对RT-PCR产物的测序表明直到第2代可以检测到没有突变的RabG插入物。

在AG129小鼠(n＝5)中在IP接种后在体内评估构建体PLLAV-ChimeriVaxZIKV-RabG和利用此PLLAV转染细胞后获得的重组病毒的免疫原性(图15A)。通过间接免疫荧光测定(IIFA)(Euroimmune YFV和ZIKV)和/或血清中和测定(SNA)(ZIKV和RABV)定量ZIKV-、YFV-和RABV-特异性抗体反应。

每天监测疫苗接种小鼠的发病率/死亡率，并且在基线和以两周间隔采血用于血清学分析。

对ChimeriVaxZIKV-RabG的免疫原性分析揭示了利用细胞培养来源的病毒疫苗接种(i.p.)的所有小鼠在疫苗接种后17天对ZIKV、YFV和RABV有血清转化(图15B)。在疫苗接种后第28天进行的ZIKV SNA(数据未显示)证实在用结合抗体阳性(IIFA)的细胞培养来源的病毒疫苗接种的5只小鼠中的4只中存在针对ZIKV的中和抗体。

此外，关于疫苗安全性，在利用疫苗病毒接种AG129小鼠后没有观察到死亡率。

总之，ChimeriVaxZIKV-RabG诱导针对ZIKV、YFV和RABV病毒的强力免疫应答，尽管与YF17D-RabG相比毒力相当弱。

实施例5.具有嵌合黄病毒主链的构建体。

制备包含丽沙病毒G蛋白的不同构建体，并且其中黄病毒的主链本身是两种不同的黄病毒的嵌合体。图16示出了示例性构建体的概况，其中主链可以包含黄热病病毒、寨卡病毒或日本脑炎病毒的一部分。

这使得能够产生提供针对丽沙病毒和超过一种黄病毒的保护作用的疫苗。这在表2中说明，其中指示了疫苗的哪部分提供体液免疫、细胞介导免疫和中和抗体。

表2.具有嵌合主链的构建体的免疫应答

[RabG–狂犬病病毒G蛋白；CMI–细胞介导的免疫性；nAb–中和抗体；prME–黄病毒表面糖蛋白；YFV–黄热病病毒]。

本申请中所述序列的概述

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

YF-E蛋白的C末端部分

GKLFTQTMKGVERLAVMGDTAWDFSSAGGFFTSVGKGIHTVFGSAFQGLFGGLNWITKVIMGAVLIWVGINTRNMTMSMSMILVGVIMMFLSL

SEQ ID NO:4

YFE-TM1

GGLNWITKVIMGAVLIWVGINT

SEQ ID NO:5

YFE-TM2

MTMSMSMILVGVIMMFLSLGVGA

SEQ ID NO:6

NS1 N末端9AA

DQGCAINFG

SEQ ID NO:7

Rab G的末端部分(没有信号肽)

KFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGF

SEQ ID NO:8

SEQ ID NO:9

Rab G跨膜结构域

Rab G C末端胞质尾部

西尼罗病毒TM2结构域

NS1信号肽

SEQ ID NO:10

C末端部分狂犬病病毒糖蛋白G

NQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL

SEQ ID NO:11

TM狂犬病病毒糖蛋白G

VLLSAGALTALMLIIFLMTCC

SEQ ID NO:12

Rab胞质C末端

RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL

SEQ ID NO:13

WNV TM-2

RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA

SEQ ID NO:14

N末端部分YF NS1

DQGCAINFGKRELKCGDGIFIFRDSDDWLNKYSYYPEDPVKLASIVKASFEEGKCGLNSVDSLEHEMWRSRADEIN

SEQ ID NO:15

狂犬病病毒糖蛋白G的IIb表位

GCTNLSGFS

SEQ ID NO:16SEQ ID NO:17

糖蛋白G狂犬病病毒

(经密码子优化的ERA株)

SEQ ID NO:17

Rab G蛋白序列

SEQ ID NO:18

狂犬病病毒糖蛋白G的AA 1-18

MVPQALLFVPLLVFPLCFG

SEQ ID NO:19

TM结构域狂犬病病毒糖蛋白G

VLLSAGALTALMLIIFLMTCC

SEQ ID NO:20

胞质尾部RABG

RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL

SEQ ID NO:21

连接YFV NS1信号肽–狂犬病病毒糖蛋白G

LGVGA

SEQ ID NO:22

连接WNV TM2-NS1信号序列–YFV

VNVHA

序列表

<110> 勒芬天主教大学

<120> 嵌合黄病毒丽沙病毒疫苗

<130> ZL917184GB

<150> GB1814563.1

<151> 2018-09-07

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 片段YFV - Rab G嵌合构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(441)

<400> 1

gga aag ttg ttc act cag acc atg aaa ggc gtg gaa cgc ctg gcc gtc 48

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

atg gga gac acc gcc tgg gat ttc agc tcc gct gga ggg ttc ttc act 96

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

tcg gtt ggg aaa gga att cat acg gtg ttt ggc tct gcc ttt cag ggg 144

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

cta ttt ggc ggc ttg aac tgg ata aca aag gtc atc atg ggg gcg gta 192

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

ctt ata tgg gtt ggc atc aac aca aga aac atg aca atg tcc atg agc 240

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

atg atc ttg gta gga gtg atc atg atg ttt ttg tct cta gga gtt ggc 288

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly

85 90 95

gcc gac cag ggc tgc gcg ata aat ttc ggt aaa ttt cca ata tac aca 336

Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr

100 105 110

att ccc gac aaa ctt gga ccc tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg 384

Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu

115 120 125

tct tgc cct aat aac ctt gtg gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg 432

Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu

130 135 140

agt ggg ttc 441

Ser Gly Phe

145

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly

85 90 95

Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr

100 105 110

Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu

115 120 125

Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu

130 135 140

Ser Gly Phe

145

<210> 3

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YF-E蛋白的C末端部分

<400> 3

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu

85 90

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YFE-TM1

<400> 4

Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile

1 5 10 15

Trp Val Gly Ile Asn Thr

20

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YFE-TM2

<400> 5

Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe

1 5 10 15

Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala

20

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NS1 N末端9 AA

<400> 6

Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly

1 5

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 7

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe

35 40

<210> 8

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 片段YFV - Rab G嵌合构建体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(540)

<400> 8

aat caa gtt tct gga gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat 48

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

gtt ctt ctg tct gcg gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc 96

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

ctc atg act tgc tgt aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac 144

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

aac ctt cga ggc aca ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc 192

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

aag att atc tca agt tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg 240

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

ctg agg tca att gct atg acg ttt ctt gcg gtt gga gga gtt ttg ctc 288

Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu

85 90 95

ttc ctt tcg gtc aac gtc cat gct gat caa gga tgc gcc atc aac ttt 336

Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe

100 105 110

ggc aag aga gag ctc aag tgc gga gat ggt atc ttc ata ttt aga gac 384

Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp

115 120 125

tct gat gac tgg ctg aac aag tac tca tac tat cca gaa gat cct gtg 432

Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val

130 135 140

aag ctt gca tca ata gtg aaa gcc tct ttt gaa gaa ggg aag tgt ggc 480

Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly

145 150 155 160

cta aat tca gtt gac tcc ctt gag cat gag atg tgg aga agc agg gca 528

Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala

165 170 175

gat gag atc aat 540

Asp Glu Ile Asn

180

<210> 9

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu

85 90 95

Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe

100 105 110

Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp

115 120 125

Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val

130 135 140

Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly

145 150 155 160

Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala

165 170 175

Asp Glu Ile Asn

180

<210> 10

<211> 81

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 10

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

Leu

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 11

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

1 5 10 15

Leu Met Thr Cys Cys

20

<210> 12

<211> 44

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 12

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

35 40

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 西尼罗病毒

<400> 13

Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Ser Val Asn Val His Ala

20

<210> 14

<211> 76

<212> PRT

<213> 黄热病病毒

<400> 14

Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr

20 25 30

Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala

35 40 45

Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu

50 55 60

His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn

65 70 75

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 15

Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser

1 5

<210> 16

<211> 1572

<212> DNA

<213> 狂犬病病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1572)

<400> 16

atg gtc cct caa gcg ctg ctt ttc gtt ccc ctc ctt gtc ttt cca ctt 48

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

tgt ttt gga aaa ttt cca ata tac aca att ccc gac aaa ctt gga ccc 96

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg tct tgc cct aat aac ctt gtg 144

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg agt ggg ttc agt tat atg gaa 192

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

ctt aag gtg ggg tat ata ttg gct att aaa atg aac ggg ttc aca tgc 240

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

aca ggt gtt gtc acg gag gca gag acc tat aca aac ttt gtt ggg tac 288

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

gta act act acg ttc aag agg aaa cat ttt cgc ccg act cct gat gct 336

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

tgt cgc gcg gcc tat aac tgg aaa atg gcc ggg gac cca cgg tac gag 384

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

gag agc ctc cac aat cca tat ccc gac tac cgg tgg ctc cgc aca gta 432

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

aag acg act aag gaa tct ctg gtt ata ata tcc ccc tca gtc gcc gac 480

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

ctc gat cca tat gat cgg tca ctt cat agt cgc gta ttt cca tcc ggt 528

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly

165 170 175

aaa tgt agt ggg gta gcc gtc agt agc acg tac tgt tcc act aat cac 576

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

gat tac act att tgg atg ccg gaa aac ccg cgg ctt ggg atg agt tgc 624

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

gat att ttc acg aac tct cgg gga aag cgc gca agt aag ggt tct gag 672

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

acc tgt ggt ttc gtg gat gaa cga ggt ctc tac aag tca ctc aag ggt 720

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

gcc tgc aag ctt aag ctt tgt gga gta ctg gga ctc agg ctg atg gac 768

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

ggc aca tgg gtg gct atg caa acg tca aat gaa acc aag tgg tgt ccg 816

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

cca gat caa ctc gta aat ctt cac gat ttt cgc agt gac gag att gaa 864

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

cat ctt gta gtc gaa gaa ctc gtt aga aag agg gaa gaa tgt ctc gac 912

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

gca ctc gaa tct atc atg act act aaa tct gtc tca ttt cga cgc ctc 960

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

agt cac ctg aga aaa ctc gtg cca gga ttc ggc aaa gct tat act atc 1008

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

ttc aac aag acg ttg atg gaa gcg gac gct cat tac aaa tca gta aga 1056

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

act tgg aat gaa att ctg cca tcc aag ggc tgc ctt cgc gta gga ggg 1104

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

cga tgc cat cct cat gta aat ggg gtc ttc ttt aac ggg ata atc ttg 1152

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

gga ccc gac ggc aac gta ctt ata cca gag atg cag agt agt ctc ctc 1200

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

caa cag cac atg gag ttg ttg gaa tcc agc gtg atc cct ctc gtt cac 1248

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His

405 410 415

ccc ttg gct gat ccg agc act gtg ttc aaa gat gga gac gag gcg gag 1296

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

gat ttc gtc gaa gtt cac ctc ccg gat gtc cat aat caa gtt tct gga 1344

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly

435 440 445

gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat gtt ctt ctg tct gcg 1392

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc ctc atg act tgc tgt 1440

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys

465 470 475 480

aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac aac ctt cga ggc aca 1488

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc aag att atc tca agt 1536

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg ctg 1572

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

515 520

<210> 17

<211> 524

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 17

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly

165 170 175

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His

405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly

435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys

465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

515 520

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 18

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 19

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

1 5 10 15

Leu Met Thr Cys Cys

20

<210> 20

<211> 44

<212> PRT

<213> 狂犬病病毒

<400> 20

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

35 40

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接YFV NS1信号肽 - 狂犬病病毒糖蛋白G

<400> 21

Leu Gly Val Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe

1 5 10 15

Pro Ile Tyr

<210> 22

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接 WNV TM2- NS1信号序列-YFV

<400> 22

Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg

1 5 10 15

Glu Leu Lys