一种新型的杂交捕获方法及其装置

技术领域

本发明属于检测装置领域，更具体地，本发明涉及一种新型的杂交捕获方法及其装置。

背景技术

杂交捕获技术是一种利用抗体检测靶核酸的技术。其原理为靶DNA与RNA探针杂交(或靶RNA与DNA探针杂交)形成DNA-RNA杂合体，此杂合体作为抗原可被抗DNA-RNA杂合体抗体识别并捕获，进而进行检测。杂交捕获技术不涉及核酸的提取、逆转录和扩增等程序，无需昂贵的PCR扩增仪和单独的核酸扩增实验室，对操作人员的要求也相应的较低。

通常，杂交捕获技术在酶标板、磁珠等经典的固相载体上实施。杂交捕获技术与酶联免疫吸附技术具有区别，比如其核酸变性和杂交的步骤涉及到温度的变化，实际操作中所需考虑的因素和可能面临的问题也不同。

对于杂交捕获技术，目前面临的问题是通量上难以提高、操作便利性有待提高，因此本领域亟待进行此类的改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的杂交捕获方法及其装置。

在本发明的第一方面，提供一种高通量的杂交捕获方法，所述方法包括：

(1)提供高通量杂交捕获的装置，其包括相配合的反应池组件、膜组件和气控组件；所述反应池组件包括：加样池，多列径向排列的反应池组及废液池，每列反应池组包括反应池一、反应池二、反应池三；加样池、反应池一及反应池二以连通槽串联连通；反应池二与反应池三之间、反应池三与废液池之间存在间隔区；所述膜组件为具有延展性(弹性)的膜，位于反应池组件与气控组件之间；所述气控组件包括内圈气控通道和外圈气控通道，该组件与膜组件接触后能形成与内圈气控通道和外圈气控通道相配合的气控阀区；每列径向排列的反应池组中，反应池二与反应池三之间的间隔区对应内圈气控通道相应的气控阀区，反应池三与废液池之间的间隔区对应外圈气控通道相应的气控阀区；通过控制气控阀区的膜组件形变而控制间隔区的液流，所述内圈气控通道或外圈气控通道充气后膜组件正向形变(膨胀)、抽气后膜组件负向形变(收缩)；

(2)在所述反应池三中包被抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体；在所述反应池二中加入核酸探针，当待测样品为DNA时该核酸探针为RNA探针、当待测样品为RNA时该核酸探针为DNA探针；

(3)将待测样品加入到加样池，从加样池引入到反应池一；所述待测样品为经核酸解链的样品，或在反应池一进行核酸解链；

(4)将内圈气控通道充气、气控阀区膜组件正向形变、反应池二与反应池三之间的间隔区封闭；将待测样品引入反应池二，核酸探针与样品中相应核酸进行杂交反应，形成DNA-RNA杂合体；

(5)将内圈气控通道抽气、气控阀区膜组件负向形变、反应池二与反应池三之间的间隔区打开；将外圈气控通道充气、气控阀区膜组件正向形变、反应池三与废液池之间的间隔区封闭；将杂交反应后的产物引入到反应池三中，以抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体捕获DNA-RNA杂合体；

(6)将所述外圈气控通道抽气、气控阀区膜组件负向形变、反应池三和废液池之间的间隔区打开；将捕获反应后的废液排入废液池；

(7)检测捕获的DNA-RNA杂合体的存在情况或存在量。

在一个优选例中，所述多列径向排列的反应池组为2～200组，具体如5、10、12、15、20、30、50、80、100、150组。

在另一优选例中，(1)中，所述反应池组件还包括：独立于加样池的阳性质控反应池组和阴性质控反应池组；所述阳性质控反应池组包括以连通槽相互连通的阳性质控加样池和阳性反应池一，独立的阳性反应池二；阳性反应池一与阳性反应池二之间、阳性反应池二与废液池之间存在间隔区；所述阴性质控反应池组包括以连通槽相互连通的阴性质控加样池和阴性反应池一，独立的阴性反应池二；阴性反应池一与阴性反应池二之间、阴性反应池二与废液池之间存在间隔区；阳性反应池一与阳性反应池二之间、阴性反应池一与阴性反应池二之间的间隔区对应内圈气控通道相应的气控阀区，阳性反应池二与废液池之间、阴性反应池二与废液池之间的间隔区对应外圈气控通道相应的气控阀区；

(2)中，还包括：分别在阳性反应池二和阴性反应池二中包被抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体；分别在阳性反应池一和阴性反应池一中加入核酸探针；(3)中，还包括：分别将阳性质控和阴性质控加入到阳性质控加样池和阴性质控加样池；所述阳性质控或阴性质控为经核酸解链的样品，或在阳性质控加样池或阴性质控加样池进行核酸解链；

(4)中，内圈气控通道充气、气控阀区膜组件正向形变后，阳性反应池一与阳性反应池二之间、阴性反应池一与阴性反应池二之间的间隔区封闭；分别将阳性质控和阴性质控引入阳性反应池一和阴性反应池一，进行杂交反应；

(5)中，内圈气控通道抽气、气控阀区膜组件负向形变后，阳性反应池一与阳性反应池二之间、阴性反应池一与阴性反应池二之间的间隔区打开(液流可流通)；外圈气控通道充气、气控阀区膜组件正向形变后，阳性反应池二与废液池之间、阴性反应池二与废液池之间的间隔区封闭(液流不流通)；分别将杂交反应后的产物引入到阳性反应池二和阴性反应池二中，以抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体捕获DNA-RNA杂合体；

(6)中，所述外圈气控通道抽气、气控阀区膜组件负向形变后，阳性反应池二与废液池之间、阴性反应池二与废液池之间的间隔区打开；将捕获反应后的废液排入废液池；

(7)中，检测捕获的DNA-RNA杂合体的存在情况或存在量时，还包括与阳性质控和阴性质控的检测结果进行比较。

在另一优选例中，所述反应池组件还包括：试剂池，其与所述径向排列的反应池组的反应池一、阳性质控反应池组的阳性反应池一和阴性质控反应池组的阴性反应池一相连通，用于输送反应试剂、缓冲液或洗涤试剂；较佳地，所述反应试剂包括(但不限于)：抗DNA-RNA杂合体的检测抗体；更佳地其携带可检测标记物。

在另一优选例中，(2)中，将变性试剂加样于试剂池，输送至反应池一、阳性反应池一或阴性反应池一，进行核酸解链。

在另一优选例中，(2)中，所述的核酸探针为冻干的探针。

在另一优选例中，(6)与(7)之间，还包括步骤：将洗涤试剂加样于试剂池，输送至反应池三、阳性反应池二或阴性反应池二，去除未被捕获的样品。

在另一优选例中，(7)中，检测捕获的DNA-RNA杂合体的存在情况或存在量时，将抗DNA-RNA杂合体的检测抗体加样于试剂池，输送至反应池三、阳性反应池二或阴性反应池二，较佳地该检测抗体携带可检测标记物；更佳地进一步还包括：将检测所述可检测标记物的试剂(如所述可检测标记物的特定底物)加样于试剂池，输送至反应池三、阳性反应池二或阴性反应池二，根据标记物获得DNA-RNA杂合体的存在情况或存在量。

在另一优选例中，所述反应池组件位于装置的下层、所述膜组件位于装置的中层，所述气控组件位于装置的上层。

在另一优选例中，反应池二与反应池三相靠近的池壁、反应池三与废液池相靠近的池壁、阳性反应池一与阳性反应池二相靠近的池壁、阴性反应池一与阴性反应池二相靠近的池壁、阳性反应池二与废液池相靠近的池壁、阴性反应池二与废液池相靠近的池壁，设置有彼此相对但不连通的槽。

在另一优选例中，所述的气控组件中，内圈气控通道与外圈气控通道各自独立地连接气体供给及抽取装置。

在另一优选例中，所述的反应池组件、膜组件和气控组件的结构中心具有中心孔；较佳地，该中心孔与离心装置相匹配(可套接于离心装置上)。

在另一优选例中，所述加样池和/或试剂池位于装置的中心区域，所述的多列反应池组沿该中心区域向外辐射，所述废液池位于装置的外周。

在另一优选例中，所述的反应池组件的下部，还包括：温控装置，以调节反应或孵育的温度。

在另一优选例中，所述膜组件和气控组件中，对应于反应池组件的加样池、试剂池的区域为镂空区域。

在本发明的另一方面，提供一种用于高通量杂交捕获的装置，其包括相配合的反应池组件、膜组件和气控组件；所述反应池组件包括：加样池，多列径向排列的反应池组及废液池，每列反应池组包括反应池一、反应池二、反应池三；加样池、反应池一及反应池二以连通槽串联连通；反应池二与反应池三之间、反应池三与废液池之间存在间隔区；所述膜组件为具有延展性(弹性)的膜，位于反应池组件与气控组件之间；所述气控组件包括内圈气控通道和外圈气控通道，该组件与膜组件接触后能形成与内圈气控通道和外圈气控通道相配合的气控阀区；每列径向排列的反应池组中，反应池二与反应池三之间的间隔区对应内圈气控通道相应的气控阀区，反应池三与废液池之间的间隔区对应外圈气控通道相应的气控阀区；通过控制气控阀区的膜组件形变而控制间隔区的液流，所述内圈气控通道或外圈气控通道充气后膜组件正向形变(膨胀)、抽气后膜组件负向形变(收缩)。

在一个优选例中，所述反应池组件还包括：独立于加样池的阳性质控反应池组和阴性质控反应池组；所述阳性质控反应池组包括以连通槽相互连通的阳性质控加样池和阳性反应池一，独立的阳性反应池二；阳性反应池一与阳性反应池二之间、阳性反应池二与废液池之间存在间隔区；所述阴性质控反应池组包括以连通槽相互连通的阴性质控加样池和阴性反应池一，独立的阴性反应池二；阴性反应池一与阴性反应池二之间、阴性反应池二与废液池之间存在间隔区；阳性反应池一与阳性反应池二之间、阴性反应池一与阴性反应池二之间的间隔区对应内圈气控通道相应的气控阀区，阳性反应池二与废液池之间、阴性反应池二与废液池之间的间隔区对应外圈气控通道相应的气控阀区。

在另一优选例中，所述反应池组件还包括：试剂池，其与所述径向排列的反应池组的反应池一、阳性质控反应池组的阳性反应池一和阴性质控反应池组的阴性反应池一相连通，用于输送反应试剂、缓冲液或洗涤试剂。

在另一优选例中，所述反应池组件位于装置的下层、所述膜组件位于装置的中层，所述气控组件位于装置的上层。

在另一优选例中，反应池二与反应池三相靠近的池壁、反应池三与废液池相靠近的池壁、阳性反应池一与阳性反应池二相靠近的池壁、阴性反应池一与阴性反应池二相靠近的池壁、阳性反应池二与废液池相靠近的池壁、阴性反应池二与废液池相靠近的池壁，设置有彼此相对但不连通的槽。

在另一优选例中，所述的气控组件中，内圈气控通道与外圈气控通道各自独立地连接气体供给及抽取装置。

在另一优选例中，所述的反应池组件、膜组件和气控组件的结构中心具有中心孔；较佳地，该中心孔与离心装置相匹配(可套接于离心装置上)。

在另一优选例中，所述加样池和/或试剂池位于装置的中心区域，所述的多列反应池组沿该中心区域向外辐射，所述废液池位于装置的外周。

在另一优选例中，所述的反应池组件的下部，还包括：温控装置，以调节反应或孵育的温度。

在另一优选例中，所述的反应池三、阳性反应池二或阴性反应池二中，包被有抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体。

在另一优选例中，所述的反应池二、阳性反应池一或阴性反应池一中，包含有核酸探针，当待测样品为DNA时该核酸探针为RNA探针、当待测样品为RNA时该核酸探针为DNA探针；较佳地，所述探针为冻干的探针。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的装置的应用，用于进行高通量的杂交捕获检测。

在本发明的另一方面，提供一种检测试剂盒，其中包括前面任一所述的高通量杂交捕获的装置；较佳地，其中还包括(但不限于)：抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体；核酸探针，当待测样品为DNA时该核酸探针为RNA探针、当待测样品为RNA时该核酸探针为DNA探针；核酸解链试剂(变性试剂)；洗涤试剂；识别可检测标记物的底物；或显色剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、常规杂交捕获技术的流程示意图。

图2、本发明的高通量杂交捕获装置的俯视透视示意图。

图3、本发明的高通量杂交捕获装置的单组径向排列的反应池及废液池的示意图。

图4、本发明的高通量杂交捕获装置的分层结构示意图，包括位于上层的气控组件、位于中层的膜组件和位于下层的反应池组件。

图5、本发明的高通量杂交捕获装置的气控组件示意图。

图6、本发明的高通量杂交捕获装置的膜组件。

图7、本发明的高通量杂交捕获装置的反应池组件。

图8、利用所述高通量杂交捕获装置进行杂交捕获的流程示意图。

各个附图标记如下：

1、反应池组件(下层)；

11、加样池；

121、反应池一；

122、反应池二；

123、反应池三；

13、废液池；

14、连通槽；

151、阳性质控加样池；

152、阳性反应池一；

153、阳性反应池二；

161、阴性质控加样池；

162、阴性反应池一；

163、阴性反应池二；

17、试剂池；

2、膜组件(中层)；

3、气控组件；

31、内圈气控通道；

32、外圈气控通道；

33、气控阀区；

34、气体供给及抽取装置

4、中心孔；

5、废液通道。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种新型杂交捕获装置，以及利用所述装置进行杂交捕获的方法。本发明的装置通过上中下层的巧妙组合、以及各个反应池的有序排列，可以高效便捷地进行多通量或高通量的杂交捕获实验，保持理想的灵敏度、特异性和准确性。

本发明的技术方案，将原本在酶标板、磁珠等载体上进行的杂交捕获技术转移到一体化的装置中，实现了杂交捕获技术的小型化、自动化，且可以同时检测多种靶标核酸或多个样本。

术语

如本发明所用，“待测样品”、“待测样本”或“待测核酸(DNA)样本”可互换使用，是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在感兴趣的目标核酸。所述的待测样品可以是含有双链核酸的样品(未经解链反应)，也可以是经过解链反应后、含有核酸单链的样本。

如本发明所用，“DNA-RNA杂合体”是指一种核酸，其含有两条链，其中一条链是DNA链，另一条链是RNA链，所述的DNA链和RNA链的核苷酸序列是互补的。

如本发明所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(本发明中优选RNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带荧光基团或不携带荧光基团。例如，荧光基团可以连接在探针的5’末端或3’末端。

如本发明所用，所述反应池组的“径向排列”，是指一组反应池中每一反应池沿着同一条轴线进行排列。

如本发明所用，“目标核酸(DNA)”是指感兴趣的核酸，例如其是一种与HPV病毒相关的核酸，或与念珠菌相关的核酸。

如本发明所用，“捕获抗体”是指可被包被在固相载体上的，特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“捕获抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。将抗体包被在固相载体上是本领域技术人员熟知的技术。术语“捕获抗体”可以与“包被抗体”互换使用。

如本发明所用，“检测抗体”或“酶偶联抗体”是指特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“检测抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。所述的“检测抗体”携带有可检测标记物，用于报告双链杂交体的捕获情况。

杂交捕获装置

本发明提供了一种用于高通量杂交捕获的装置，其包括相配合的反应池组件、膜组件和气控组件。三者位于下、中、上层。

所述反应池组件包括：加样池，多列径向排列的反应池组及废液池，每列反应池组包括反应池一、反应池二、反应池三；加样池、反应池一及反应池二以连通槽串联连通；反应池二与反应池三之间、反应池三与废液池之间存在间隔区。所述反应池一、2、3和废液池的连接处均可设置阀门，也可以设置具有大液体阻力的微结构，用于控制液体。

所述的加样池用于加入待测样品。优选地该加样池位于所述装置的中心区域的一侧。本发明对于加样池的形状没有特别的限制。考虑到杂交捕获的待测样品加样量，较佳地其容积约在0.2～0.4mL，较佳地其深度约在2～4mm。然而，根据实验需要，本领域技术人员也可将所述加样池设计为所述范围以外的容积和深度，这种设计也包含在本发明涵盖的范围内。

在优选的实施方式中，所述装置还包括试剂池。优选地该加样池位于所述装置的中心区域的另一侧(加样池的对侧)。本发明对于试剂池的形状也没有特别的限制。考虑到杂交捕获的试剂添加量，较佳地其容积约在0.2～0.4mL，较佳地其深度约在2～4mm。然而，根据实验需要，本领域技术人员也可将所述加样池设计为所述范围以外的容积和深度，这种设计也包含在本发明涵盖的范围内。

所述多列径向排列的反应池组中，反应池一通过连通槽与加样池相连通，从而待测样品可被引入到反应池一中，之后在被引入到反应池二中，与反应池二中的探针进行混合和反应，获得DNA-RNA杂合体。

在优选的实施方式中，为了提供阳性质控品对照，所述装置还包括阳性质控反应池组，包括以连通槽相互连通的阳性质控加样池和阳性反应池一，独立的阳性反应池二；阳性反应池一与阳性反应池二之间、阳性反应池二与废液池之间存在间隔区。

在优选的实施方式中，为了提供阴性质控品对照，所述装置还包括阴性质控反应池组，包括以连通槽相互连通的阴性质控加样池和阴性反应池一，独立的阴性反应池二；阴性反应池一与阴性反应池二之间、阴性反应池二与废液池之间存在间隔区。

本发明所述气控组件包括包括内圈气控通道和外圈气控通道，该组件与膜组件接触后能形成与内圈气控通道和外圈气控通道相配合的气控阀区；每列径向排列的反应池组中，反应池二与反应池三之间的间隔区对应内圈气控通道相应的气控阀区，反应池三与废液池之间的间隔区对应外圈气控通道相应的气控阀区；通过控制气控阀区的膜组件形变而控制间隔区的液流，所述内圈气控通道或外圈气控通道充气后膜组件正向形变(膨胀)、抽气后膜组件负向形变(收缩)。

本发明所述膜组件为具有延展性(弹性)的膜，位于反应池组件与气控组件之间。较佳地，所述膜为热塑性弹性体膜。当向弹性膜上方的气控通道中充气时，弹性膜材发生正向形变，封闭下层反应孔间间隙，隔绝孔间液体的转移；当从弹性膜上方的气控通道中抽气时，弹性膜材发生负向形变，下层反应孔间间隙增大，有利于孔间液体的转移。当不向弹性膜上方的气控通道中充气或放气时，由于该膜的介导，孔间液体的转移也可以在一定的驱动力下实现。

可以采用多种方式来使得待测样品或试剂从加样池/阳性质控加样池/阴性质控加样池向各个后续反应池以及废液池的流动。包括但不限于：泵驱动、离心力驱动、充气驱动、吸气驱动等。优选地，以离心力驱动装置中的液体流动。

本发明中，对于所述的反应池组件或气控组件本体对于的制作材料没有特别的限制，较佳地其是可视的，具有良好的机械强度。可以应用的材料例如包括但不限于：亚克力(PMMA，又称作有机玻璃)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)类塑料、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)等，也可以是玻璃和金属等。在发明的优选方式中，所述组件由PMMA制造。PMMA的透明属性可以方便观察反应状态，PMMA的硬质属性可以使得所述组件不易变形、经久耐用以及轻便，并且，此类材料还具有耐高温(从而可以用于烘干和高温灭菌)和耐湿(从而便于洗涤)的性能。应理解，本发明中并不限于此类材料，其它可以制成透明或半透明装置的材料也是可用的。

作为本发明的优选方式，膜组件使用PDMS(聚二甲基硅氧烷)，为一种弹性材料，也可以使用TPE(热塑性弹性体)，或它们的类似材料。

作为本发明的优选方式，所述的反应池组件或气控组件可以通过激光、CNC雕刻或注塑来获得；所述的膜组件可通过注塑或切割获得。

作为本发明的优选方式，在将三层结构进行整合时，在反应池组件中相应于气控阀区的结构区域涂覆防粘剂；先将上层气控组件与中间膜组件对准并热压键合获得中间体层，然后将中间体层与反应池组件对准并热压键合，即可获得完整的杂交捕获装置。

本发明的装置，通过巧妙的设计来控制液流，基于膜组件的延展性性能，利用气控阀区的充气(鼓气)或抽气(放气)来使得膜组件中相应区域形成正向形变或负向形变，调节相应间隔区液流的关闭和流通。兼顾了特定反应时对反应容器的封闭的需求，以及单次反应结束后进行下一流程反应时对液体转运的需求，简单便捷。

本发明也提供了含有所述杂交捕获装置的试剂盒，其中包括所述的高通量杂交捕获的装置；较佳地，其中还包括(但不限于)：抗DNA-RNA杂合体的捕获抗体；核酸探针，当待测样品为DNA时该核酸探针为RNA探针、当待测样品为RNA时该核酸探针为DNA探针；核酸解链试剂(变性试剂)；洗涤试剂；识别可检测标记物的底物；显色剂等。此外，所述试剂盒中还可包括说明本发明的装置的组装方法或本发明的杂交捕获方法的具体操作建议的使用说明书。

杂交捕获方法

本发明的杂交捕获方法，所基于的基本原理如图1所示，常规杂交捕获技术的流程：当使用RNA探针时，①首先将样本中的双链DNA变性分解成单链，②单链DNA与特异性RNA探针结合为DNA-RNA杂合体，③DNA-RNA杂合体与固相载体的特异性抗DNA-RNA抗体结合被固定，④再与有标记的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体结合，⑤通过标记的信号定性检测样本中的靶标核酸。通过使用不同的探针，可以对不同的靶核酸进行区分。

利用所述装置进行所述杂交捕获方法时，样本和变性试剂在反应池一内进行变性解链；随后进入反应池二与其内的探针试剂混合进行杂交反应，形成DNA-RNA杂合体；再进入反应池三，其内固定有抗DNA-RNA杂合体抗体，捕获杂合体；剩余液体进入废液池，再注入有标记的抗DNA-RNA杂合体抗体，形成夹心复合物；较佳地，之后利用清洗液重复清洗；最后在反应池三内对标记的信号进行定性检测。

通过本发明的装置实施杂交捕获，可以大大减少试剂和样本的用量，降低试剂成本；整套流程在同一装置内完成，可实现自动化，避免交叉污染，也减少了操作和误差；多个通道可以集成在同一装置上或以模块的形式组合，实现一个样本检测多个靶标，亦或多个样本检测单个或多个靶标。

本发明中的杂交捕获方法中，所述变性步骤可以在反应池一内完成，也可以在加入到加样池之前完成。也即，本发明中，所述的待测样品可以是含有双链核酸的，也可以是经过解链反应后、含有核酸单链的。

本发明中的杂交捕获方法中，所述探针包括RNA探针和单链DNA探针，当待测样品为DNA时该核酸探针为RNA探针、当待测样品为RNA时该核酸探针为DNA探针。

作为本发明的可实施方式，所述探针也可以是携带标记物的，如荧光基团，生物素化等。

作为本发明的可实施方式，所述探针可以是冻干的形式预先放置在反应池二内；亦可在变性结束后从加样池引入，此时反应池一和2可合并。

所述反应池三内抗体固定形式可以是物理吸附也可以是化学偶联；亦可先固定在磁珠、微球等材料表面后，再置于反应池三内(预先放置或杂交结束后从入口注入)。

所述的捕获抗体与所述的检测抗体可以应用相同的抗体或不同的抗体来制备，即检测抗体在不携带可检测标记物的情况下可以是与捕获抗体相同的或不同的。以DNA-RNA杂合体作为抗原与以蛋白质作为抗原不同，抗DNA-RNA杂合体所产生的抗体无特定的序列或抗原决定簇的要求，其特异性识别双链杂交体所特有的双螺旋结构。抗DNA-RNA抗体(无论是单克隆或多克隆抗体)能与任何DNA-RNA双链杂交体相结合。利用特定的双链杂交体来制备抗所述双链杂交体的抗体的方法是本领域已知的技术，例如可以按照Kitagawa&Stollar的方法(Kitagawa Y,Stollar BD,Mol Immunol 1982，19：413-420)来制备多克隆抗体；或可以按照Fliss等的方法(Fliss I,Laurent M,Emond E,et al.,Appl EnvironMicrobiol,1993,59(8):2698-2705)来制备单克隆抗体。

作为本发明的优选方式，检测抗体的溶液中还含有一定浓度的NaCl、MgCl

所述的可检测标记物是连接或偶联于检测抗体上的、用于报告检测抗体的结合情况的报告分子。优选的，所述的可检测标记物选自：碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)，生物素，亲和素，地高辛，量子点，荧光基团(FAM、HEX、CY3、ROX、CY5等)，葡萄糖氧化酶，β–D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶，等等。一些可检测标记物具有特定的底物，在与底物接触后可以发生显色反应或其它可被检测到或可见的反应，从而报告检测抗体的结合情况。所述的底物比如：用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)、CDP-Star；用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；等等。

在本发明的实施例中，对单份样本分别检测14种HPV型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，结果呈现了良好的灵敏度和特异性，准确性达到100％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

HPV样本：为国家HPV参考品盘，购自中国食品药品检定研究院。

DNA-RNA杂合体(用于制备抗DNA-RNA杂合体抗体)的制备：Poly(A)和Poly(dT)购自美国Sigma公司。在0.15M NaCl 0.015M柠檬酸钠pH 7.0的溶液中混合Poly(A)和Poly(dT)，两者浓度均为10μM。65℃孵育60分钟，即得DNA-RNA杂合体。

山羊抗DNA-RNA杂合体抗体的制备：前述制备的DNA-RNA杂合体与甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin,即mBSA)混合后再加Freund氏佐剂(CompleteFreund’s Adjuvant)注射到山羊体内。第二次开始使用Incomplete Freund氏佐剂。山羊抗体用常规免疫纯化方法进行纯化制备。

鼠抗DNA-RNA杂合体单克隆抗体：购自美国Z-BioMed,Inc.公司。该抗体的细胞株(S9.6)来自美国ATCC(#HB-8730)。

标记有碱性磷酸酶的抗DNA-RNA杂合体抗体(AP偶联抗体)：通过将鼠抗DNA-RNA杂合体单克隆抗体与碱性磷酸酶(AP，即Alkaline Phosphatase)偶联，获得。

探针试剂和质控品的制备

制备方法如下：

(1)首先合成下列DNA序列片段(SEQ ID NO:1)：

(2)将上述合成DNA序列克隆到pUC19载体的KpnⅠ和XbaⅠ位点中，从而得到经修饰的pUC19载体。

(3)分别合成HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68亚型的基因组DNA的片段，各DNA的序列片段分别是：

HPV16：GenBank登录号K02718的序列中第83-1558，3193-4628，5559-7154位(三个片段串联；后同)；

HPV18：GenBank登录号X05015的序列中第105-1593，2376-3867，5430-7136位；

HPV31：GenBank登录号HQ537666的序列中第108-1463，3564-4982，5558-7072位；

HPV33：GenBank登录号M12732的序列中第109-1654，3789-5087，5594-7093位；

HPV35：GenBank登录号X74477的序列中第110-1476，3452-4897，5601-7109位；

HPV39：GenBank登录号M62849的序列中第107-1608，2654-4187，5643-7160位；

HPV45：GenBank登录号X74479的序列中第102-1543，3421-4872，5530-7149位；

HPV51：GenBank登录号M62877的序列中第68-1476，2875-4452，5894-7431位；

HPV52：GenBank登录号X74481的序列中第89-1565，2459-4098，5565-7154位；

HPV56：GenBank登录号X74483的序列中第102-1567，2432-3896，5492-7096位；

HPV58：GenBank登录号D90400的序列中第110-1542，2763-4389，5565-7139位；

HPV59：GenBank登录号X77858的序列中第55-1398，3567-4896，5606-7132位；

HPV66：GenBank登录号U31794的序列中第67-1534，2679-4231，5647-7158位；

HPV68：GenBank登录号FR751039的序列中第150-1678，2986-4476，5508-7025位；

并且，在上述序列的5’端加上NheⅠ位点序列(GCTAGC)，3’端加上NotⅠ位点序列(GCGGCCGC)。

(4)合成后的上述DNA序列分别克隆到所述经修饰的pUC19载体的NheⅠ/NotⅠ位点中。

(5)上述DNA序列的上游连接有T7。分别以构建后的载体作为模板(模板DNA)，经NotⅠ酶切后，应用T7 RNA聚合酶制备HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的RNA探针。应用T7 RNA聚合酶制备RNA的反应条件：10μl 5×转录缓冲液，10μl 10mM 4NTP(ATP，CTP，GTP，UTP)混合液，1μg模板DNA，50U RNA酶抑制剂，1.5μl T7 RNA聚合酶(20U/μl)，加DEPC-处理水至总体积50μl。上述混合液在37℃保温100分钟后，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。

质控品的制备

制备含有HPV6 DNA、HPV16 DNA、HPV58 DNA的质控品，方法如下：

(1)用化学合成法合成HPV6(GenBank登录号FR751337的序列中第1-8031位)、HPV16(GenBank登录号K02718的序列中第1-7904位)、HPV58序列(GenBank登录号D90400的序列中第1-7824位)；在两端分别加上KpnⅠ和XbaⅠ位点。

(2)分别将上述序列克隆到pUC18载体KpnⅠ和XbaⅠ位点中，构建HPV质粒；

(3)HPV质粒转化到大肠杆菌DH5α中；

(4)在含有氨苄抗性的固体琼脂糖培养平板上挑选单克隆菌株；

(5)单克隆菌株在LB培养基中扩大培养；

(6)提取质粒DNA，并进行鉴定、定量。获得的重组质粒DNA即可作为质控品，低危型HPV质控品中，HPV6 DNA质粒的浓度为5pg/ml；高危型HPV高值质控品中，HPV16 DNA质粒的浓度为5pg/ml，HPV58 DNA质粒的浓度为5pg/ml；高危型HPV低值质控品中，HPV16 DNA质粒的浓度为1pg/ml，HPV58 DNA质粒的浓度为1pg/ml，均为独立放置于每个质控品管中。质控品稀释溶液中还包括：10mM Tris，10mM EDTA，pH为7.2±0.2。

探针的冻干

配制含有冻干保护剂的探针溶液，将定量溶液加入到冻干剂中，以冻干机冷冻干燥。

实施例1、高通量杂交捕获装置的制作

本实施例中，提供一种用于高通量杂交捕获的装置，其俯视示意图如图2，单组径向排列的反应池及废液池的示意图如图3，分层结构示意图如图4，其气控组件、膜组件、反应池组件的示意图如图5～7。

根据图2～图7，本发明的装置包括相配合的反应池组件1、膜组件2和气控组件3。

所述反应池组件1包括：加样池11，多列径向排列的反应池组及废液池13，每列反应池组包括反应池一121、反应池二122、反应池三123；加样池11、反应池一121及反应池二122以连通槽14串联连通；反应池二122与反应池三123之间、反应池三123与废液池13之间存在间隔区(不直接连通)。

所述膜组件4为具有延展性(弹性)的膜，位于反应池组件1与气控组件3之间。

所述气控组件3包括内圈气控通道31和外圈气控通道32，该组件与膜组件接触后形成气控阀区33，该气控阀区33在通过所述气控通道通入气体后膨胀、抽出气体后收缩。

每列径向排列的反应池组中，反应池二122与反应池三123之间的每一间隔区对应内圈气控通道31上相应的气控阀区33，反应池三123与废液池13之间的间隔区对应外圈气控通道32上相应的气控阀区33，气控阀区33通过控制膜组件2形变而变化、从而控制间隔区的液流。

所述反应池组件1还包括：独立于加样池11的阳性质控反应池组和阴性质控反应池组。

所述阳性质控反应池组包括以连通槽14相互连通的阳性质控加样池151和阳性反应池一152，独立的阳性反应池二153；阳性反应池一152与阳性反应池二153之间、阳性反应池二153与废液池13之间存在间隔区。

所述阴性质控反应池组包括以连通槽14相互连通的阴性质控加样池161和阴性反应池一162，独立的阴性反应池二163；阴性反应池一162与阴性反应池二163之间、阴性反应池二163与废液池13之间存在间隔区。

阳性反应池一152与阳性反应池二153之间、阴性反应池一162与阴性反应池二163之间的间隔区对应内圈气控通道31相应的气控阀区33，阳性反应池二153与废液池13之间、阴性反应池二163与废液池13之间的间隔区对应外圈气控通道32相应的气控阀区33。

所述反应池组件1还包括试剂池17，其与所述径向排列的反应池组的反应池一121、阳性质控反应池组的阳性反应池一152和阴性质控反应池组的阴性反应池一162相连通，用于输送反应试剂、缓冲液或洗涤试剂。

所述反应池组件1位于装置的下层、所述膜组件2位于装置的中层，所述气控组件3位于装置的上层。

反应池二122与反应池三123相靠近的池壁、反应池三123与废液池13相靠近的池壁、阳性反应池一152与阳性反应池二153相靠近的池壁、阴性反应池一162与阴性反应池二163相靠近的池壁、阳性反应池二153与废液池13相靠近的池壁、阴性反应池二163与废液池13相靠近的池壁，设置有彼此相对但不连通的槽。

所述膜组件2和气控组件3中，对应于反应池组件的加样池11、试剂池17的区域为镂空区域。

所述的气控组件中，内圈气控通道31与外圈气控通道32各自独立地连接气体供给及抽取装置34。

所述的反应池组件1、膜组件2和气控组件3的结构中心具有中心孔4，该中心孔为近六边形的孔结构，可套接于离心装置上。

所述加样池11和试剂池17分别位于中心孔4的两侧，多列反应池组沿该中心区域向外辐射，所述废液池13位于装置的外周。

还设置废液通道5，加样池11或试剂池17流出的液体在分配进入各个反应池一121之后，多余的液体通过废液通道5直接进入废液池13。

组装所述装置时，先分别制作在性状和尺寸上相互匹配的反应池组件1、膜组件2和气控组件3，之后进行整合。在将三层结构进行整合时，在反应池组件1中相应于气控阀区33的结构区域涂覆防粘剂(避免粘合后液流无法通过)；先将上层气控组件3与中间膜组件2对准并热压键合获得中间体层，然后将中间体层与反应池组件1对准并热压键合，即可获得完整的杂交捕获装置。

实施例2、利用实施例1的装置进行杂交捕获和检测

本实施例中，利用实施例1的装置进行杂交捕获和检测，利用所述高通量杂交捕获装置进行杂交捕获的流程示意图如图8。图中，(S1)为进液分样(如可在12000rpm条件下进行12s)；(S2)为杂交反应(如在4000rpm条件下进行12s)；(S3)为免疫反应(如在5000rpm条件下进行30s)；(S4)为废液排出(如在4000rpm条件下进行10s)；图中黑色色块所示为相应反应时反应液体所在区域。

杂交捕获操作过程如下：

(1)将抗DNA-RNA杂合体抗体包被于反应池三：以山羊抗DNA-RNA杂合体抗体包被，每孔用100μl PBS(10mM磷酸缓冲液，pH 7.4，150mM氯化钠)含有0.5μg/100μl山羊抗DNA-RNA杂合体抗体，4℃，包被16小时。包后用PBS清洗3次后用含有3％BSA的PBS进行封闭处理。14种探针分别以冻干的形式预先放入分别14个的反应池二(每孔2.5ng RNA)，阴性质控和阳性质控的通道的反应池二放入HPV16的冻干探针(阴性质控和阳性质控的通道没有反应池一)；

(2)变性解链步骤在装置外进行：样本200μL与100μL 2M NaOH 5mM EDTA混匀，65℃孵育30min；阴性质控(无HPV核酸)和阳性质控(HPV16 10^5拷贝/mL)各20μL，与10μL 2MNaOH 5mM EDTA混匀，65℃孵育30min；

(3)将样本(经解链)和阴、阳性质控(经解链)分别加入加样池、阴性质控池、阳性质控池，1200rpm离心12s，样本进入反应池一；

(4)向上层气控组件中的内圈气控通道充气，4000rpm离心12s，样本进入反应池二，与其内的冻干探针混合；

(5)反应池二的底部接触加热模块，加热至65℃，孵育1h，进行杂交；

(6)杂交后的装置脱离加热模块、恢复室温，向上层气控组件中的外圈气控通道充气、内圈气控通道放气，5000rpm离心30s，样本进入反应池三；

(7)将该装置在1100rpm振荡1h，完成捕获；

(8)外圈气控通道放气，4000rpm离心10s，将废液排入废液池；

(9)试剂池加入350μL标记有碱性磷酸酶的抗DNA-RNA杂合体抗体，向外圈气控通道充气，5000rpm离心30s，试剂进入反应池三；

(10)室温静置45min，形成夹心复合物；

(11)外圈气控通道放气，4000rpm离心10s，将废液排入废液池；

(12)在试剂池注入350μL0.1M Tris-HCl pH7.4，0.6M NaCl缓冲液(清洗液)，4000rpm离心12s；

(13)第(12)步骤重复6次，清洗未发生反应的样本和标记有碱性磷酸酶的抗DNA-RNA杂合体抗体；

(14)试剂池加入350μL碱性磷酸酶发光底物CDP-Star，外圈气控通道充气，4000rpm离心12s，底物试剂进入反应池三；

(15)室温避光孵育15min后用化学发光仪读取数据。

结果判定：阳性质控与阴性质控的信号值的比值大于等于2.0认为该次实验检测有效；某个型别HPV与阴性质控的信号值的比值大于等于2.0判定为该型别HPV阳性，否则为阴性。

实施例3、灵敏度实验

将所有14型的HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)进行混合，每种型别的病毒浓度均为10^5拷贝/mL，作为待测样品。阴性质控(无HPV核酸)以及阳性质控(10^5拷贝/mL)同实施例2中。

利用实施例2的杂交捕获和检测方法进行检测。结果如表1。

表1

根据表1结构，每种HPV型别均可在10^5拷贝/mL时得到稳定的阳性结果。

实施例4、特异度实验

样本为单个型别HPV，浓度10^7拷贝/mL，14种高危型，和2种低危型(6、11)进行16次实验。结果分别如表2～表17。阴性质控(无HPV核酸)以及阳性质控同实施例2中。

根据表2～表15，每一型别的HPV病毒，在10^7拷贝/mL的样本量下，都能呈现极为显著的阳性结果(信噪比显著高)；同时非对应型别的通道均没有检出信号，每种型别之间在10^7拷贝/mL的样本量下均不存在交叉反应。

根据表16～17，当以HPV6(10^7拷贝/mL)或HPV11(10^7拷贝/mL)作为测试样品时，均呈现阴性结果。

上述结果说明，本发明的测试方法，准确性可达到100％。

本发明的高通量杂交捕获的装置及其检测方法，可以一次性实现多种病毒的检测，能达到高通量要求，检测条件稳定、节省时间。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州德同生物技术有限公司

<120> 一种新型的杂交捕获方法及其装置

<130> 211811

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 多核苷酸

<400> 1

gagggtacct aatacgactc actatagggc tagcaaagcg gccgctctag agac 54