针对K-ras基因启动子G-四连体靶向抗癌的氨基甾体盐类化合物

技术领域

本发明涉及化合物领域，特别涉及针对K-ras基因启动子G-四连体靶向抗癌的氨基甾体盐类化合物。

背景技术

世界卫生组织/国际癌症研究署(WHO/IARC)发布了最新《2020全球癌症报告》。报告显示，2018年全球新发癌症例数为1810万，死亡960万例。全球最常见的5种癌症依次为：肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌和宫颈癌。全球死亡率最高的5种癌症为：肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌。男性患癌者中，肺癌发病率(14.5％)和死亡率(22％)最高。男性癌症发病率其次分别是前列腺癌(13.5％)、结肠直肠癌(10.9％)、胃癌(7.2％)、肝癌(6.3％)，死亡率其次则分别是肝癌(10.2％)、胃癌(9.5％)、结肠直肠癌(9％)、前列腺癌(6.7％)。女性患癌者中，乳腺癌发病率(24.2％)和死亡率(15％)最高。女性癌症发病率其次分别是结肠直肠癌(9.4％)、肺癌(8.4％)、宫颈癌(6.6％)、甲状腺癌(5.1％)，死亡率其次分别是肺癌(13.8％)、结肠直肠癌(9.5％)、宫颈癌(7.5％)、胃癌(6.5％)。

我国是人口大国，也是癌症高发国家。1800万新增癌症病例及960万癌症死亡病例中，我国新增病例数占380.4万例、死亡病例数占229.6万例。相比于其他国家，我国癌症发病率、死亡率全球第一！(来源：中国疾病预防控制中心)。全球每新增100个癌症患者中，中国人就占了21个。也就是说，我国每天有超过1万人确诊癌症，平均每分钟有7个人得癌症。全球每死亡100个癌症患者中，中国人占将近24个。平均每天都有6000多人死于癌症，每分钟就有将近5人死于癌症。其中，肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、女性乳腺癌是我国主要的常见恶性肿瘤，约占全部新发病例的77％。这就是目前我们面临的癌症现状！

癌症之所以难以治愈，就在于癌症治疗后容易复发转移。患者接受治疗后，患者症状也得到缓解，临床检测结果显示肿瘤消失。而转移和复发大多发生在治疗后3年之内，少部分发生在治疗后5年之内，如果在治疗后5年内不复发，则意味着已接近治愈，一般大家习惯用5年生存率代表癌症的疗效。但目前癌症的5年生存率普遍较低，这就是我们医药研究者所面临的挑战和责任！

尽管目前治疗癌症已经有很多方法，如手术治疗，化学治疗，放射治疗和生物治疗，但各种治疗方法各有其缺点和局限，癌症的化学治疗，化疗药物不但杀伤癌细胞，同时还杀伤正常细胞，使得机体功能受损，乃至加快病人的死亡。放射治疗同样损伤正常机体，还带来各种并发症。生物治疗尽管有一定优势，但成本高，技术难，也有局限性。

目前癌症的治疗已经发展到精准医疗，即癌症靶向治疗，临床上已经出现很多靶向药物，对某些特定的癌症的靶点可以精准作用，效果也比较理想。

针对目前发病率和死亡率都较高的胰腺癌，肺癌以及结肠癌，靶向药还不够完备，可以供临床选用的靶向药还不够多。而在这三种癌症中，K-ras基因的突变率可以高达70-90％。在国际上，针对K-ras基因的靶向药还没有出现，尽管有人在研究针对K-ras基因蛋白的抑制剂，但K-ras基因突变后，蛋白往往变构，导致药物分子与之结合的脱靶，失去效果或产生耐药性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了针对K-ras基因启动子G-四连体靶向抗癌的氨基甾体盐类化合物。本发明针对癌症高表达突变的K-ras基因，靶向治疗癌基因，以达到精准医疗的目的

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一类化合物，该化合物是由氨基甾体与酸成盐制得的，所述氨基甾体的主核结构如式I所示：

其中，R选自羰基或羟基；

所述酸不包括咖啡酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述氨基甾体的主核结构如式II或式III所示：

在本发明的一些具体实施方案中，所述盐为一酸盐或二酸盐；

所述酸包括无机酸或有机酸；

所述无机酸包括盐酸，硫酸，碳酸，磷酸，硝酸，亚硝酸，氢溴酸或氢氟酸中的一种或两种；

所述有机酸包括甲酸，甲磺酸，乙酸，草酸，丙酸，丙二酸，丙酮酸，丁酸，丁二酸，戊酸，戊二酸，苯甲酸，水杨酸，枸橼酸，酒石酸，苹果酸，肉桂酸，丙戊酸，维甲酸，苦参酸中的一种或两种。

基于上述研究，本发明还提供了所述化合物的制备方法，采用式(Ⅰ)所示的雄酮类为起始原料，经过溴化制得式(II)所示化合物，再经哌嗪环取代制得式(III)所示化合物，还原后制得式(IV)所示化合物、氧化制得式(V)所示化合物，成盐，经五步化学反应而得到目的化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)以表雄酮(I)为原料，于无水吡啶中，加入溴化亚铜，搅拌，回收吡啶后得半固体物；加入乙酸乙酯萃取，滤集后蒸干，重结晶得白色结晶，制得式(II)所示化合物；

(2)将式(II)所示化合物、甲基哌嗪、水和醋酸钠混合，搅拌，分离有机层，洗至中性，浓缩后得固体，重结晶后得白色结晶，制得式(III)所示化合物；

(3)将式(III)所示化合物溶于无水乙醇中，加入四氢硼钠，搅拌，回收无水乙醇，加水析出固体，滤集后重结晶得式(IV)所示化合物；

(4)将式(IV)所示化合物和PPC氧化剂混合，加水析出固体，收集重结晶制得式(V)所示化合物，成盐，即得本发明的化合物；

在本发明的一些具体实施方案中，由雄酮类(Ⅰ)合成(Ⅱ)时，利用立体选择性，将CuBr在无水吡啶中反应，混合物萃取分离而直接制得(Ⅱ)，Br取代在α位，产率尚可。在哌嗪环取代反应中，产物(Ⅲ)的碱性较大，应尽可能地用水洗至中性，以免影响下一步还原反应。在哌嗪环取代反应中，水的存在可对反应起促进作用，采用甲基哌嗪/水的比例为100比20时可使反应时间缩短为10小时左右。在还原和氧化反应中，3-位和17-位的化学立体选择性都较好，得到所需化合物的比例较大。在成盐反应中，由于哌嗪基团上氮原子的碱性，较容易与各种无机或有机酸形成盐类化合物，产物稳定性较好，在水或醇中有一定的溶解度。采用(IV)或(V)形成各种盐类。

基于上述研究，本发明提供了所述化合物或所述的制备方法制得的化合物在制备K-ras癌症基因启动子靶向抑制剂中的应用。

本发明还提供了所述化合物或如所述的制备方法制得的化合物在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

具体的，本发明提供了所述化合物或如所述的制备方法制得的化合物在制备针对癌症细胞启动子G-四连体的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述癌症包括肺癌，胰腺癌，结肠癌，白血病，淋巴瘤，乳腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，肾癌，前列腺癌，子宫癌，卵巢癌中的一种或多种。

更重要的是，本发明还提供了药物，包括所述化合物或所述的制备方法制得的化合物以及药学上可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂；

所述口服制剂包括固体口服制剂，液体口服制剂中的一种或多种；

所述注射制剂包括肌肉注射剂或静脉注射剂中的一种或多种；

所述固体口服制剂包括片剂，胶囊剂，颗粒剂，缓释片或缓释微丸中的一种或多种；

所述液体口服制剂包括混悬液、芳香剂或发泡剂中的一种或多种。

在本发明中，推荐的成人口服剂量为3-5x10

此外，本发明还提供了所述的药物在制备预防和/或治疗癌症的药物制剂中的应用。

癌细胞之所以可以无限增殖生长，是由于癌基因启动子的启动表达。启动子启动时，在DNA双链结构上需要形成特定的四连体结构，这种结构一般有G碱基构成，在启动子序列，往往富含G碱基，也就为形成G-四连体(G-quadruplex)提供了基础。本申请人发明的这一类氨基甾体化合物盐类，就能特异性地与K-ras基因的G-四连体DNA结构结合，从而稳定G-四连体，使其不能启动，不能表达，达到抑制癌细胞生长的目的。

G-四连体配体抑制K-ras基因的原理图如图1所示。

有文献报道，在癌细胞中，癌基因形成G-四连体的启动结构较为普遍，癌细胞中形成的G-四连体的量是正常细胞的四倍以上，这意味着，癌细胞中的G-四连体结构是一个较好的药物靶点。我们的实验也证实，这一类化合物对癌细胞的选择性较高，主要杀伤癌细胞，对正常细胞的毒性很小，这对开发抗癌药是很重要的优势。所以，我们发明的这一类氨基甾体抗癌药具有以下优点：

1)靶点性，针对K-ras癌基因。

2)选择性，针对癌细胞的G-四连体结构，对正常细胞几无作用。

3)广谱性，可以针对所有癌细胞启动子的G-四连体结构。

4)新颖性，目前国际上还未出现该机理的抗癌药。

5)现实性，目前临床上急需这样的靶向药。

综上，本发明提供了小分子氨基甾体盐类化合物，经过本申请人的实验验证，具有很好的抑制K-ras基因表达的作用，其作用机理不是抑制K-ras基因蛋白，而是直接抑制K-ras基因的DNA启动子序列，是一种特异性的K-ras癌基因抑制剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示四连体配体抑制K-ras基因的原理图；

图2示试验例1中氨基甾体甲磺酸盐对肺癌A549细胞的抑制作用；

图3示氨基甾体甲磺酸盐类对肺癌A549细胞K-ras基因启动子DNA片段的结合抑制(UV)；

图4示氨基甾体盐类对肺癌A549细胞K-ras基因启动子DNA片段的结合抑制(CD)；

图5示软件预测癌基因启动子存在G-四连体结构的打分数；

图6示氨基甾体甲磺酸盐类与白血病细胞融合基因bcr/abl启动子DNA片段的结合(UV)；其中，图6a示片段1的加药UV结果；图6b示片段2的加药UV结果；

图7示氨基甾体甲磺酸盐类与白血病细胞融合基因bcr/abl启动子DNA片段的结合(CD)；图7(A)示片段1的加药CD结果；图7(B)示片段2的加药CD结果；

图8示氨基甾体甲磺酸盐与氨基甾体咖啡酸盐对脑瘤U251细胞的抑制结果比较；其中，a示第三天的结果；b示第五天的结果；

图9示氨基甾体甲磺酸盐与氨基甾体咖啡酸盐对脑瘤U251细胞的诱导凋亡荧光图片；

图10示氨基甾体甲磺酸盐与氨基甾体咖啡酸盐对脑瘤U251细胞的诱导凋亡百分率。

具体实施方式

本发明公开了一种针对K-ras基因启动子G-四连体靶向抗癌的氨基甾体盐类化合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的关键点：

1)发明了一类小分子氨基甾体盐类，其具有与K-ras基因启动子DNA的G-四连体结合的特性，从而稳定G-四连体结构，抑制癌基因的表达，达到抑制癌细胞生长的目的。

2)该盐类只对癌细胞的G-四连体有结合，对正常细胞无抑制作用。

3)对多种癌细胞的启动子G-四连体都有效，故是一种广谱抗癌药。

4)目前，国际上没有该机理的药物上市，该发明为本申请人独创。

本发明提供的针对K-ras基因启动子G-四连体靶向抗癌的氨基甾体盐类化合物及其制备方法，所用原料及制剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 5α-甾体-2-溴-3-酮(Ⅱ)的制备

雄酮类(Ⅰ)4g(14mmol)溶于无水吡啶20ml中，加入CuBr24mmol，搅拌反应6h后回收吡啶后得半固体物。加入乙酸乙酯萃取，滤集后蒸干，重结晶得白色结晶，收率50％左右，mp.101-103℃，IR(KBr)cm

实施例2 2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-5α-甾体-3-酮(Ⅲ)的制备

将(II)，甲基哌嗪21ml，水8ml和醋酸钠1.2g混合，室温搅拌反应10h，加入乙酸乙酯，分离有机层，洗至中性，浓缩后得固体，重结晶后得白色结晶，收率约72％，mp.126-128℃，IR(KBr)cm

实施例3 2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-醇(Ⅳ)的制备

将Ⅲ3.0mmol的III溶于无水乙醇中，加入1.0mmol的四氢硼钠，室温搅拌反应0.5h,回收无水乙醇，加水溶液析出固体，滤集，重结晶后收率约70％，mp.163-165℃，元素分析C

实施例4 2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(V)的制备

称量化合物IV 3.6mmol于反应瓶中，加入PPC氧化剂0.3mmol，PPC(pyridiniumchlorochromate)是CrO

实施例5 2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮(醇)甲磺酸盐(VI)或其他盐类的制备

将等摩尔量的V和甲磺酸或其他有机酸溶于70％的乙醇，加热冷却后析出白色结晶，重结晶后收率约为50％，mp.229-231℃，LC/MS检测为单峰，MS m/z 389(M+1)，371(M-OH)，98(盐基M-OH)，81(盐基M+1)。

实施例6 本发明化合物盐类口服片剂的制备

每片含该化合物盐类30mg，片剂组成如下：

将以上成份混匀(除硬脂酸镁外)，过120目筛，加入温热蒸馏水搅拌，然后制粒，干燥，加入硬脂酸镁混匀，压片即得。

实施例7 本发明化合物盐类口服胶囊剂的制备

每囊含该化合物盐类30mg，胶囊组成如下：

将以上成份混匀，过100目筛，加入温热蒸馏水搅拌制软材，过筛制粒，干燥后填充入胶囊即得。

实施例8 本发明化合物盐类注射剂的制备

每安瓶1ml溶液含该化合物盐类20mg，注射剂组成如下：

将原料溶于注射用水，无菌过滤，分装于10支安瓶中，使药物含量为20mg/ml/安瓶，灭菌即得。由于该化合物已成盐，溶液pH值接近中性，可供肌肉注射或加入输液剂中静脉滴注。

试验例1：氨基甾体甲磺酸盐对肺癌A549细胞的抑制作用

试药与仪器

试药：实施例5制得的氨基甾体甲磺酸盐化合物(VI)，氢氧化钠、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、氯化亚砜、乙酸乙酯、乙醇等试剂均为化学纯；A549细胞由醇健制药研究室提供，MTT试剂盒(美国Sigma)，RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)，琼脂(美国Sigma)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，

仪器：YRT-3型熔点测定仪(天津天光光学仪器有限公司)，RV-20A旋转蒸发仪(上海豫康科教仪器设备有限公司)，RSD-050Z真空干燥箱(昆山荣事达电子设备有限公司)，多功能酶标仪(美国Thermo公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)。

试验方法

细胞培养：A549细胞株均由醇健制药研究室传代保存，将两种细胞分别加入含10％新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5％CO

样品溶液配制：RPMI1640培养基用无菌双蒸水溶解，加NaHCO

MTT法测定药物对细胞增殖的抑制作用：取处于对数生长期的A549细胞，制成每毫升含5×10

表1

注：A549细胞，加药后48h，MTT检测。

以上结果说明，氨基甾体甲磺酸盐KH对肺癌细胞A549具有明显的抑制作用，且具有剂量浓度梯度，10

试验例2：氨基甾体甲磺酸盐类对肺癌A549细胞K-ras基因启动子DNA片段的结合抑制(UV)

主要仪器和设备

荧光显微镜(Fluorescence Microscope,Nikon,Japan)，超净工作台(苏州净化)，恒温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器公司)，制冰机(长沙市精拓仪器设备有限公司)，定量移液器(Eppendorf,USA)，超低温冰箱(中科美菱,Forma Scientific)，低温离心机-TD5A(YINGTAI)，全波长多功能酶标仪(Varioskan Flash,Thermo Fisher Scientific,USA)，凝胶成像分析系统(Molecular Imager ChemiDoc XRS System,Bio-Rad,USA)，PCR仪(Bio-rad，USA)，电子天平秤(Adventurer公司)，常温离心机-TGW16(上海上碧实验仪器有限公司)，圆二色谱仪(InstrumentName J-815)。

溶液的配置

(1)配置pH＝7.4且含100mmol/L KCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液。

在大烧杯中，用电子天平准确称取Tris(三羟甲基胺)0.6057g溶于450mL蒸馏水中；加入3.7275g固体KCl，用搅拌子一边搅拌一边滴加稀盐酸(1mol/L)调节溶液的pH值至7.4，定容到500mL，配成Tris(三羟甲基甲胺)为10mmol/L的缓冲液。

(2)配置pH＝7.4且含100mmol/LNaCl的10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液。

在大烧杯中，用分析天平准确称取Tris(三羟甲基胺)0.6057g溶于450mL蒸馏水中。加入2.9220g固体NaCl，用搅拌子一边搅拌一边滴加稀盐酸(1mol/L)调节溶液的pH值至7.4，定容到500mL，配成Tris(三羟甲基甲胺)为10mmol/L的缓冲液。

(3)配置pH＝7.4的10mmol/L Tris-HCl缓冲溶液。

在大烧杯中，用分析天平准确称取Tris(三羟甲基胺)0.6057g溶于450mL蒸馏水中。用搅拌子一边搅拌一边滴加稀盐酸(1mol/L)调节溶液的pH值至7.4，定容到500mL，配成Tris(三羟甲基甲胺)为10mmol/L的缓冲液。

G4(G-四链体DNA)溶液：将5OD的富G序列的寡核苷酸DNA及普通序列DNA 4℃10000g离心10min，加入ddH

实验

在0.2ml的PCR管中分别配置下列溶液：

(1)实验组溶液的配置：

1μLG4(G-四链体DNA)溶液(1000μmol/L)+50μL Tris-HCl-KCl-MB-+49μL Tris-HCl-KCl→100μL

(2)对照组溶液的配置：

50μL Tris-HCl-KCl-MB+50μL Tris-HCl+Tris-HCl-KCl→稀释到100μL

(3)20μmol/L G4四链体DNA溶液的配置：

2μLG4(1000μmol/L)+50μL Tris-HCl-KCl-MB+48μL Tris-HCl-KCl→稀释到100μL

(4)将母液为10

1μLG4+50μL Tris-HCl-KCl-MB+48μL Tris-HCl-KCl+1μL化合物(氨基甾体甲磺酸盐类)→100μL

(5)将上述溶液在PCR仪上进行反应，程序设置如下：

95℃3min→95℃5min→92℃1min(每分钟降3℃)→26℃→23℃→20℃→4℃∞，4℃保存6小时以上。

(6)检测前恢复室温(空调调整至26℃，打开全波长多功能酶标仪，20min后把PCR管放在仪器室20min)。

(7)将上述PCR管内的溶液用移液枪转移到96孔UV板中，全波长多功能酶标仪检测500-750nm处亚甲蓝波形的变化，并用origin7.5作图。

结果：如图3所示。

结果提示，加药处理后，Kras基因启动子的G-四连体DNA片段可以与药物特异性的结合，导致UV光谱曲线的位移(与未加药对照)。这是氨基甾体药物抑制Kras启动子表达的体外直接证据。

试验例3：氨基甾体盐类对肺癌A549细胞K-ras基因启动子DNA片段的结合抑制(CD)

该试验所用设备为InstrumentName J-815，温度：室温，样品池为1mm玻璃石英皿，扫描范围为220-350nm，带宽：1.00nm；扫描速度：200nm/min，每种样扫描3次，溶剂校正基线，测定完毕后收集数据，用orgin7.5作图，并对比加药前后色谱图的变化。

具体的操作步骤如下：

1μLG4(G-四连体DNA)溶液+98μL Tris-HCl-KCl+1μL药物→100μL(三复孔)

设置程序：

95℃3min→95℃5min→92℃1min(每分钟降3℃)→26℃→23℃→20℃→4℃∞，4℃保存6小时以上，检测前恢复室温。

(2)用75％酒精洗1mm玻璃石英皿2次，双蒸水洗2次，烘干。

(3)检测基线：10mmol/L的Tris-HCl含100mmol/L KCl检测基线。

(4)上样顺序(250uL)：3G4、3G4+BH10-5M、3G4+KH10-5；4G4、4G4+BH10-5M、4G4+KH10-5；5G4、5G4+BH10-5M、5G4+KH10-5M；8G4、8G4+BH10-5M、8G4+KH10-5M；每上一次样后用75％酒精洗1mm玻璃石英皿2次，超纯水洗2次，烘干(KH和BH分别为氨基甾体的甲磺酸盐和氢溴酸盐)。

(5)参数设置：波长200-350nm；带宽1.00nm；扫描速度200nm/min，收集数据，作图。

结果：如图4所示。

结果提示，加药处理后，Kras基因启动子的G-四连体DNA片段可以与药物特异性的结合，导致CD光谱曲线的位移(与未加药对照)。这是氨基甾体药物抑制Kras启动子表达的体外直接证据。

试验例4：抑制白血病细胞增殖的效果

1)方法：取指数生长期的白血病细胞系或经淋巴细胞分离液分离的临床原代慢粒白血病细胞，以适宜细胞浓度(1x10

计算白血病细胞生长抑制率按公式：

抑制率(I％)＝[对照组-处理组]/对照组×100％

以该化合物不同浓度对生长抑制率作图得剂量抑制曲线，经线性回归可求得该化合物盐类的IC50值。

2)结果：该化合物盐类对K562，Meg-01和K562/R抗药株以及原代慢粒白血病细胞均有较好的抑制活性(P<0.01)。

表2细胞抑制率

根据MTT检测的抑制结果，其IC50值分别为：

K562(IC50)＝1.84×10-6mol/L

Meg-01(IC50)＝2.27×10-9mol/L

CML(IC50)＝4.18×10-7mol/L

K562/R(IC50)＝3.76×10-6mol/L

在这些细胞中，K562为红系来源的人类慢粒白血病细胞系，Meg-01为巨核系来源的人类慢粒白血病细胞系，K562/R为抗Imatinib的白血病细胞株，原代慢粒白血病细胞来自一例临床慢粒白血病患者的外周血。经检测，这些细胞均为bcr/ab1融合基因表达阳性，是典型的慢性粒细胞白血病细胞。

试验例5：抑制白血病细胞融合基因bcr/ab1 mRNA表达的效果

1)方法：收集经该氨基甾体化合物甲磺酸盐类KH(10

配制退火混合物

RNA 2μg

0.5μg/μl Oligo(dT)18 1μl

加无RNA酶的H2O至总体积 10μl

混合液在70℃水浴3分钟,降到37℃放置10分钟。

RT反应液

加10μl的RT反应液到10μl退火混合物中，37℃水浴60分钟，加热到95℃维持5min。得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。

几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。

体系配置如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。配置PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

结果：实时定量PCR时各样品加样量均为1μl，由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因beta-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参得值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。以下为待测基因以内参校正列表(bcr/ablmRNA)，处理组与对照组比较，P值均小于0.01:

结果提示，氨基甾体盐类处理组(Treated)相对于未处理对照组(Control)，慢粒白血病细胞(细胞系和临床原代白血病细胞)的bcr/abl融合基因的表达都降低了。这说明，氨基甾体盐类可以抑制融合癌基因的表达，从而抑制白血病细胞的生长，达到治疗白血病的目的。这也是氨基甾体盐类抑制白血病细胞生长的细胞内机理之一。

试验例6：软件预测癌基因启动子存在G-四连体结构的打分值

QGRS Mapper是一款可预测G-四链体结构是否存在的在线软件，设计灵活、综合性强、操作简单、方便实用，输入富G核苷酸序列，它即可预测能否形成G-四链体结构。该程序提供了许多选项，包括用户自定义结构组成。它可分析用户提供的raw或FASTA格式的DNA或RNA序列。该应用程序还提供了多种搜索功能如：从NCBI数据库中检索出来的基因ID、symbol或者GI number。并且数据输出格式不止一种，包括excel形式、序列形式以及图表形式。

QGRS Mapperprogram主要是用来在核苷酸序列中预测QGRS的存在，理论上可形成G-四链体的核苷酸序列需满组下列公式：

GxNy1GxNy2GxNy3Gx，其中X表示在G-四链体中鸟嘌呤个数且需满足x≥2；y表示连接鸟嘌呤四分体环的长度。预测结果如表3：

表3.各启动子序列及其互补链的G-score得分

从NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，promoterhttp://www.genecopoeia.com/product/search/index.php？prt＝22，EPDhttp://epd.vital-it.ch/，以上三个网站查找的BCR/ABL,KRAS,C-kit,C-myc的启动子序列，特别是查找的BCR启动子序列正确无误。为了验证BCR启动子区能否形成G-四链体结构，首先利用QGRS在线软件对各启动子分别进行正义链及其互补链预测，当公式GxNy1GxNy2GxNy3Gx的x取3及2时，所预测的BCR/ABL的启动子5’→3’正义链及其互补链上的富含G序列均可形成G-四链体结构，与阳性对照组c-myc，kras，c-kit相比，打分如上表所示。

我们实验所用的Kras启动子DNA片段就是(打分40)：

表4

我们的预测结果如图5所示(分数接近20说明形成G-四连体的可能性很大)。

结果提示，选用启动子DNA区域的不同片段，经过以上软件预测，几种癌基因启动子片段的打分都较高，在20分左右。软件说明，打分在20分，形成G-四连体的可能性就较大，这也是我们用氨基甾体化合物盐类抑制癌基因表达的理论依据。所以，这几种癌基因有可能形成G-四连体，氨基甾体又在体外可与G-四连体特异性结合，这样就能抑制癌基因的表达，由于癌基因广泛形成G-四连体，而且比正常细胞形成的G-四连体结构较多，这也就是氨基甾体盐类作为广谱抗癌药的理论基础。

试验例7：氨基甾体2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮乙酸盐类与白血病细胞融合基因bcr/abl启动子DNA片段的结合(UV)

亚甲蓝溶液的配置及适宜浓度的筛选

(1)根据说明书计算亚甲蓝原始浓度：

C＝n/V＝(m/M)/V＝m/MV＝20×10-3g/373.90g/mol×2×10-3L＝26745.12umol/L。

(2)用PBS分别将亚甲蓝原液稀释成2umol/L、4umol/L、6umol/L、8umol/L、10umol/L、12umol/L，并分别取100uL至UV板中，用多功能酶标仪检测500-700nm处的波形图，导出结果后用origin7.5作图，筛选亚甲蓝的适宜浓度。

亚甲蓝不同溶剂的筛选及亚甲蓝与氨基甾体乙酸盐小分子化合物的作用

(1)分别用Tris-HCl、Tris-HCl-NaCl、Tris-HCl-KCl配置20mol/L的亚甲蓝溶液，方法如下：

1μL亚甲蓝原液+Tris-HCl 1336.256μL→1337.256μL Tris-HCl-MB

1μL亚甲蓝原液+Tris-HCl-NaCl 1336.256μL→1337.256μL Tris-HCl-NaCl-MB

1μL亚甲蓝原液+Tris-HCl-KCl 1336.256μL→1337.256μL Tris-HCl-KCl-MB

(2)将母液为10

50μL Tris-HCl-KCl-MB+49μL Tris-HCl-KCl+1μL药物→100μL

50μL Tris-HCl-NaCl-MB+49μL Tris-HCl-NaCl+1μL药物→100μL

50μL Tris-HCl-MB+49μL Tris-HCl+1μL药物→100μL

(3)将上述溶液分别转移至干净的UV板中，用全波长多功能酶标仪检测500-750nm处亚甲蓝波形的变化，并用origin7.5作图。

方法：在0.2ml的PCR管中分别配置下列溶液：

(1)实验组溶液的配置：

1μLG4(1000μmol/L)+50μL Tris-HCl-KCl-MB-+49μL Tris-HCl-KCl→100μL

(2)对照组溶液的配置：

50μL Tris-HCl-KCl-MB+50μL Tris-HCl+Tris-HCl-KCl→100μL

(3)20μmol/L G4溶液的配置：

2μLG4(1000μmol/L)+50μL Tris-HCl-KCl-MB+48μL Tris-HCl-KCl→100μL

(4)将母液为10

1μLG4+50μL Tris-HCl-KCl-MB+48μL Tris-HCl-KCl+1μL化合物→100μL

(5)将上述溶液在PCR仪上进行反应，程序设置如下：

95℃3min→95℃5min→92℃1min(每分钟降3℃)→26℃→23℃→20℃→4℃∞，4℃保存6小时以上。

(6)检测前恢复室温(空调调整至26℃，打开全波长多功能酶标仪，20min后把PCR管放在仪器室20min)。

(7)将上述PCR管内的溶液用移液枪转移到96孔UV板中，全波长多功能酶标仪检测500-750nm处亚甲蓝波形的变化，并用origin7.5作图。

UV光谱结果如下表：

表5

紫外-可见吸收光谱是常用作研究DNA与小分子化合物相互作用。通常配合物与DNA相互作用的方式有三种：静电相互作用，插入作用，和沟槽结合作用，插入结合方式，配合物的特征吸收红移、蓝移或者减色、增色效应较强，而静电相互作用和沟槽结合相互作用对配合物的特征吸收谱带影响不大。

亚甲蓝本身在紫外可见光区有特征吸收峰，当亚甲蓝与G-四链体DNA形成复合物时，π-π

亚甲蓝单独与氨基甾体乙酸盐化合物作用，其吸收谱带及吸收峰无明显变化，但加入G-四链体后吸收峰红移且增色，加入氨基甾体乙酸盐化合物及G-四链体后发生蓝移及减色，说明氨基甾体化合物可与亚甲蓝竞争结合G-四链体。

结果如图6所示。

结果提示，氨基甾体乙酸盐在体外可与bcr/abl融合基因启动子序列的DNA片段结合，导致UV光谱的位移，这种结合是特异性的，也是氨基甾体乙酸盐抑制白血病细胞生长的理论依据。

试验例8：氨基甾体2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮乙酸盐类与白血病细胞融合基因bcr/abl启动子DNA片段的结合(CD)

该试验所用设备为Instrument Name J-815，温度：室温，样品池为1mm玻璃石英皿，扫描范围为220-350nm，带宽：1.00nm；扫描速度：200nm/min，每种样扫描3次，溶剂校正基线，测定完毕后收集数据，用orgin7.5作图，并对比加药前后色谱图的变化。

具体的操作步骤如下：

1μLG4+98μL Tris-HCl-KCl+1μL药物(氨基甾体乙酸盐类)→100μL(三复孔)

设置程序：

95℃3min→95℃5min→92℃1min(每分钟降3℃)→26℃→23℃→20℃→4℃∞，4℃保存6小时以上，检测前恢复室温。

(2)用75％酒精洗1mm玻璃石英皿2次，双蒸水洗2次，烘干。

(3)检测基线：10mmol/L的Tris-HCl含100mmol/L KCl检测基线。

(4)上样顺序(250uL)：3G4、3G4+BH10

(5)参数设置：波长200-350nm；带宽1.00nm；扫描速度200nm/min，收集数据，作图。

波长和强度结果：

表6

结果图如7(A)、图7(B)所示。

结果提示，氨基甾体乙酸盐在体外可与bcr/abl融合基因启动子序列的DNA片段结合，导致CD光谱的位移，这种结合是特异性的，也是氨基甾体乙酸盐抑制白血病细胞生长的理论依据。7(A)是启动子片段1，图7(B)是启动子片段2。

圆二色谱(CD)是利用不对称分子(具有手性的化合物、生物大分子等)对左、右圆偏振光吸收的不同的圆二色性来对分子结构进行分析的光谱方法，不对称分子在结构上微小变化都能在圆二色谱上反映出来。运用CD光谱能得到G-四链体和G-四链体配体形成的复合物的结构信息。

在一般情况下，CD光谱能用于区分G-四链体的平行和反平行结构。而且CD光谱的灵敏度高，当小分子化合物与G-四链体DNA形成复合物后，G-四链体的特征CD光谱在吸收强度和形状上发生一定的改变。而且从她的特征吸收变化(最大吸收)强弱，可以判断小分子配体对结构不同的G-四链体的作用的选择性。与双螺旋DNA的CD光谱不同，G-四链体DNA光谱比较复杂，反平行G-四链体CD光谱特征为：260nm有负的最大吸收，在290nm有正最大的吸收，而平行G-四链体CD光谱特征为：在240nm有负的最大吸收，在260nm附件有最大的正吸收峰。

在含100mmol/L K

试验例9：氨基甾体甲磺酸盐类对其他肿瘤细胞的抑制作用

细胞培养

胰腺癌细胞Panc-1，结肠癌细胞HCT-116和乳腺癌细胞MCF-7分别用10％FBS的RPMI 1640培养基(含有100U/ml青霉素及100U/ml链霉素)培养；培养条件为37℃、饱和湿度、5％CO

加药

待细胞生长到基本融合后，加入氨基甾体甲磺酸盐(实施例5制得)，使药物在体系中的终浓度为10

表7

结果提示，氨基甾体甲磺酸盐对胰腺癌Panc-1细胞呈剂量依赖性抑制，10

表8

结果提示，氨基甾体甲磺酸盐对结肠癌HCT-116细胞呈剂量依赖性抑制，10

表9

结果提示，氨基甾体甲磺酸盐对乳腺癌MCF-7细胞呈剂量依赖性抑制，10

试验例10：氨基甾体甲磺酸盐类对脑胶质瘤U251细胞的抑制作用，与氨基甾体咖啡酸盐的比较

神经胶质瘤(glioma)是一种最常见的颅内原发性中枢神经系统肿瘤，其恶性程度高，侵袭力强,目前临床上治疗效果欠佳。本研究旨在探究两种氨基甾体类化合物(2-aminosteroid)盐类，氨基甾体甲磺酸盐和氨基甾体咖啡酸盐对U251细胞的抑制作用。

实验方法

1 细胞培养

U251细胞在完全培养基中，置5％CO2，37℃培养箱中培养，倒置显微镜下观察其生长情况，约48小时胰酶消化传代。

2 MTT实验测定U251细胞生长曲线

胰酶重悬细胞，计数板计数，计算细胞悬液浓度。用完培将细胞液稀释成2×10

3 MTT实验测定药物对U251细胞抑制作用

胰酶重悬细胞，计数板计数，估算细胞悬液细胞浓度。用完培将细胞液稀释成2×10

4 PI和hochest33258双染

将种板培养3天的U251细胞用PI染料染色：PBS轻轻洗两次待测孔,90uPI(10ug/ml)/孔，4度避光反应20min,加30ul/孔4％多聚甲醛，固定10min,PBS洗两次，3min/次，边洗边摇,吸尽PBS,Hochest33258 90ul/孔，染色5min，PBS洗两次，3min/次，边洗边摇,吸尽PBS，荧光显微镜下观察拍照。

5 流式细胞术PI-annex V双染测定细胞凋亡

培养传代后将U251分成4组，贴壁后后分别加入含有氨基甾体甲磺酸盐5X10

6 统计方法

所有数据用SPSS1.8统计软件进行统计学分析并制图。两组间比较采用独立样本T检验，P<0.05为有统计学差异。

结果

1 抑制率

两种化合物盐类作用的抑制率比较如表10所示：

表10

结果如图8所示。

结果显示，独立样本T检验P值<0.05，培养3，5天后甲磺酸盐组和咖啡酸盐组结果差异有统计学意义，即培养3，5天后甲磺酸盐组抑制率高于咖啡酸盐组。图8(a)甲磺酸盐组和咖啡酸盐组培养3天抑制率比较；图8(b)甲磺酸盐组和咖啡酸盐组培养5天抑制率比较。

2 PI染色和hochest33258染色

PI染色后，荧光显微镜下观察可以发现，U251细胞在甲磺酸盐组，1×10

3 流式细胞术PI-annex V双染测定细胞凋亡

表11

实验组凋亡率与对照组凋亡率比较均有显著性差异(P<0.01)；甲磺酸盐1×10

以上结果均说明，氨基甾体甲磺酸盐对脑瘤U251细胞的抑制率作用要比氨基甾体咖啡酸盐的作用强，这说明，不同的氨基甾体的盐类，其抗癌活性可能存在差异，本发明的氨基甾体盐类，如甲磺酸盐，其对脑瘤的抗癌活性就比咖啡酸盐的活性要强些。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。