一种控制蜡样芽胞杆菌呕吐毒素产生的方法

技术领域：

本发明属于食源性致病菌蜡样芽胞杆菌的危害控制领域，具体涉及一种控制蜡样芽胞杆菌呕吐毒素产生的方法。

背景技术：

蜡样芽胞杆菌作为常见的条件型食源性致病菌，广泛存在于各类环境中，包括水、土壤、空气以及食品存储和加工的各个环节。由于蜡样芽胞杆菌易形成强耐受性芽胞，可以抵抗极端条件，如极端pH、高温、抗菌剂以及紫外线或辐射等环境。因此，在食品储存与加工过程中容易引起污染，很难获得不含蜡样芽胞杆菌芽胞的原料或食品。蜡样芽胞杆菌可污染不同类型的食品，一般易被污染的食品类型包括淀粉类食品、奶及奶制品、肉及肉制品、水果、蔬菜等。摄入的食物中仅含有10

蜡样芽胞杆菌感染后可导致眼部感染、脑膜炎、心内膜炎和骨髓炎等非胃肠道疾病。然而，蜡样芽胞杆菌引起的主要疾病是食物中毒，产生腹泻与呕吐等症状。呕吐毒素(cereulide)所导致的食物中毒是我国由蜡样芽胞杆菌导致食物中毒的主要形式。在较低剂量下，呕吐毒素会影响5-HT

研究表明，环境中的物质可能对毒素产生有影响。通过人工污染致呕型蜡样芽胞杆菌后，各类食品被分类成不同风险等级。人工污染后脂肪含量高、水分低或高渗透压的食品(例如，奶油干酪)不易产生毒素；乳清饮料等pH值较低的食品为低风险的食品，脂肪高的蛋白质产品也是低风险食品，巴氏杀菌奶通常情况下只产生少量的呕吐毒素；葡萄糖对呕吐毒素产生有刺激作用，用葡萄糖或果糖制成的食品如奶油饼干，为中等风险食品；以乳制品和谷物为基础的婴儿食品配方，同时具有丰富维生素和微量元素，可增加呕吐毒素合成酶ces基因活性，在含有大量K

发明内容：

本发明的第一个目的是提供乳糖在控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素中的应用。

本发明通过实验发现，添加一种常见的食品成分乳糖，可以有效抑制致呕型蜡样芽胞杆菌的呕吐毒素合成。通过相对荧光定量分析发现乳糖对毒素合成酶基因有抑制效果；同时通过液相质谱分析确定乳糖对呕吐毒素产生有明确抑制效果。在质谱检测中，呕吐毒素的特征定量离子对m/z为：1170.60→357.40，内标物缬氨霉素valinomycin的特征定量离子对m/z为：1128.70→343.10。

因此可以将乳糖用于控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素。

优选，乳糖在制备控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的制剂中的应用。

优选，是将乳糖添加到需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质中，控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素。

优选，所述的需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质可以是食品等，特别是淀粉类食品、奶及奶制品、肉及肉制品、水果、蔬菜等。

优选，所述的将乳糖添加到需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质中，乳糖浓度为质量分数1～5％。

本发明的第二个目的是提供一种控制蜡样芽胞杆菌呕吐毒素产生的方法，其是将乳糖加入需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质中，通过乳糖控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素。

优选，所述的需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质可以是食品等，特别是淀粉类食品、奶及奶制品、肉及肉制品、水果、蔬菜等。

优选，所述的将乳糖添加到需要控制蜡样芽胞杆菌产呕吐毒素的物质中，乳糖浓度为质量分数1～5％。

本发明以食品成分乳糖为添加剂来有效控制蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的产生，为食品工厂生产加工过程中提供一种新的无毒无害添加剂。通过添加一定量乳糖控制呕吐毒素产生量，使其低于最低致病剂量，达到控制蜡样芽胞杆菌生物危害的目的。

本发明以食品成分入手，提出以乳糖作为食品添加剂达到显著抑制蜡样芽胞杆菌抑制呕吐毒素cereulide合成的效果。对于指导添加乳糖及通过调整食品成分配比，防控蜡样芽胞杆菌致呕型食物中毒具有重要意义。乳糖可作为新型无毒无害新型食品添加剂，成本低；使用方法简单，直接添加乳糖可降低呕吐毒素产生量。

附图说明

图1是不同致呕型菌株在有无乳糖处理下的生长情况，其中LA为LB培养基含有5％乳糖；LB：正常LB培养基，从图中可以看出，乳糖处理前后不同致呕型菌株的生长情况无明显差异。

图2是乳糖处理下不同菌株呕吐毒素产生的情况比较，其中LA为LB培养基含有5％乳糖；LB：正常LB培养基，从图中可以看出乳糖处理下不同菌株呕吐毒素产生量均明显下降。

图3是5％乳糖处理下致呕型菌株中呕吐毒素合成酶cesA的表达，其中LA为LB培养基中含有5％乳糖；LB：正常LB培养基，从图中可以看出5％乳糖处理下可显著抑制致呕型菌株中cesA的表达。

图4是乳糖在食品基质中对呕吐毒素产生的影响，从图中可以看出乳糖在食品基质中可显著抑制呕吐毒素的合成。

具体实施方式：

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

LB肉汤(培养基)购自广东环凯微生物科技有限公司；乳糖购自上海源叶；TB

实施例1

(1)乳糖对致呕型菌株生长的影响

首先配制30％乳糖(w/v g/ml)溶液(将乳糖加入到水中)，用0.22μm水相滤膜过滤除菌。后将30％乳糖溶液加入相应LB肉汤中，分别配制乳糖含量为0-5％(w/v g/ml)的LB培养基。将5株巴氏消毒奶源致呕型菌株(蜡样芽胞杆菌892-1、蜡样芽胞杆菌2132-4、蜡样芽胞杆菌2833-2A、蜡样芽胞杆菌3732、蜡样芽胞杆菌3733-3C)和致呕型临床参考株蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus F4810/72(保藏号：NCTC 11143)接种至LB肉汤培养基中进行复苏。然后用LB肉汤培养基稀释菌液至OD

(2)毒素提取

接种5株巴氏消毒奶源致呕型菌株和致呕型临床参考株F4810/72菌株至100mL含1-5％乳糖的LB培养基，同时等浓度菌液接种到相同体积不含乳糖的LB培养基作为对照。28℃震荡培养48小时，离心菌液(8,000g，4℃离心5分钟)沉淀菌体，弃上清。加5mL甲醇重悬菌体，超声破碎菌体(功率为37％)。破碎后置于120℃高压处理10分钟，灭活其他毒素。28℃振荡过夜，离心(8,000g，4℃离心10分钟)取上清，氮吹上清浓缩并定容溶液体积至1mL。之后用0.22μm有机滤膜过滤除去杂质，提取液于-20℃冰箱保存备用。

(3)毒素提取和高效液相色谱-质谱法定量

将5株巴氏消毒奶源致呕型菌株(蜡样芽胞杆菌892-1、蜡样芽胞杆菌2132-4、蜡样芽胞杆菌2833-2A、蜡样芽胞杆菌3732、蜡样芽胞杆菌3733-3C)和致呕型临床参考株蜡样芽胞杆菌F4810/72菌株(可以商业化购买，名称为Bacillus cereus F4810/72或Bacilluscereus NCTC 11143)分别接种于加入100mL 5％g/ml乳糖的LB培养基(LA培养基)和100mL不含乳糖的LB培养基中，28℃摇床培养48小时。菌体在4℃、8,000g离心10min后弃上清。加入5mL甲醇涡旋混匀，菌液于28℃200rpm过夜；采用超声进行菌体破碎，镜检至菌体原有杆状完全破坏为破碎完全；4℃、8,000g离心5min，转移上清，氮吹上清并用甲醇定容至1mL，过0.22μm滤膜。用甲醇稀释，取稀释液90μL与10μL 1μg/mL缬氨霉素内标配成进样溶液，进样体积为5μL，使用waters C-18柱(Xselect CSH 1.7μm，2.1*50mm)，以流速为0.3mL/min进行洗脱，条件如表1所示，质谱检测参数如表2所示，结果如图2所示，从图2可以看出5％乳糖处理下不同菌株呕吐毒素产生量均明显下降。

表1液相洗脱条件

注：流动相A，超纯水含0.1％甲酸与10mM甲酸铵；流动相B，甲醇含0.1％甲酸。

表2呕吐毒素与缬氨霉素的质谱检测参数

注：*为定量离子对。

(4)荧光定量PCR扩增

提取步骤(3)中在LA与LB培养8小时后的蜡样芽胞杆菌的RNA，进行反转录，具体的反应体系为如表3。以cesA基因作为检测基因，udp作为内参基因，引物见表4，进行荧光定量PCR，具体的反应体系为如表5。将反应体系混匀，短暂离心后，放入荧光定量PCR扩增仪中，按下列反应程序进行PCR反应：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s；72℃延伸30s进行40个循环。经过PCR反应得到C

公式：

ΔC

ΔΔC

表3反转录过程

表4荧光定量引物

表5荧光定量体系

(5)乳糖在食品基质抑制产毒量

购买同一品牌含乳糖牛奶(有乳糖)和零乳糖牛奶(无乳糖)。此外，以零乳糖牛奶为基础培养基添加5％(g/ml)乳糖的作为人工模拟的含乳糖牛奶(加乳糖)。将巴氏消毒奶源致呕型蜡样芽胞杆菌菌株892-1分别接种至100mL的三种牛奶中，28℃200rpm摇床培养48小时。菌体在4℃、8,000g离心10分钟后弃上清。向细菌细胞加入5mL甲醇，涡旋混匀。混合物于28℃200rpm振荡过夜。采用超声破碎菌体，镜检至原有菌体杆状完全破坏为破碎完全；8,000g离心10分钟，转移上清，氮吹上清并用甲醇定容至1mL，过0.22μm滤膜。用甲醇稀释，取稀释液90μL与10μL 100ng/L缬氨霉素进样检测浓度，进样体积为5μL，液相洗脱条件如表1所示，质谱检测参数如表2所示，结果如图4所示，从图4可以看出，乳糖在食品基质中可显著抑制呕吐毒素的合成。