一种包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，更具体地说，涉及一种包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

钙是人体所必需的重要营养元素，是骨骼和牙齿的重要组成部分。此外，钙在人体内还参与许多重要的生理功能，对细胞代谢、骨骼生长、血液凝固、神经传导、肌肉收缩和心脏功能具有十分重要的作用。历次全国营养调查结果显示，钙是我国居民最容易缺乏的膳食营养素。日常饮食钙的摄入量不足以及摄入钙的生物利用度低都会导致钙的缺乏，缺钙可诱发代谢性骨病，例如骨质疏松症、佝偻病等。

钙补充和食物钙强化是目前应对钙缺乏的主导膳食策略。目前，广泛使用的第一代、第二代补钙制剂，如碳酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙等，在小肠弱碱性环境中易与食物中的植酸、草酸等结合形成沉淀，影响钙的吸收与生物利用。研究发现食源性蛋白肽与钙形成的复合物在小肠上皮细胞可促进钙的吸收，提高其生物利用度。然而，作为食品中的补钙因子，肽钙复合物能否顺利通过胃肠道的消化作用到达小肠吸收部位是至关重要的。我们前期研究发现，肽钙复合物在胃液消化阶段会发生解聚行为，使钙离子游离出来，导致钙离子在小肠的吸收率明显降低。

脂质体作为一种重要的液体运载体系，其主要组分磷脂是一种常见的双亲性物质，亲水性头部插入水中，疏水性尾部则伸向空气中，可形成脂质双分子层的球形结构。脂质体通过磷脂及其附加物可以营养物质包封于脂质双分子层中，达到活性保护或缓释的作用。肽钙复合物可通过脂质体技术被卵磷脂包裹，服用后到达胃部将避开胃酸分解，顺利抵达小肠吸收部位，可以大大提高钙吸收率。利用纳米脂质体包埋肽钙复合物的研究，目前还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于公开一种包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体及其制备方法，以使得蛋清肽钙复合物能够在小肠位置得到充分吸收。

为了实现上述目标，本发明采取如下技术方案：

一种包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、蛋清肽钙复合物的制备：

取蛋清蛋白粉加水配制成浓度为4～6g/100mL的蛋清蛋白溶液，将蛋清蛋白溶液进行沸水浴10min后，待蛋清蛋白溶液温度冷却至50～60℃，调节蛋清蛋白溶液pH至9～11，并按3000U/g底物蛋白的比例加入碱性蛋白酶进行酶解反应，反应2～4h后，调节蛋清蛋白溶液pH至7.0，并在100℃温度下灭酶10min，离心收集上清液，冷冻干燥即得蛋清肽粉；

将蛋清肽粉溶解于超纯水中，配置成浓度为50mg/mL的蛋清肽粉溶液，按蛋清肽与CaCl2质量比为1:1～3:1的比例在蛋清肽粉溶液中加入CaCl2，在温度为40～60℃、pH值为7.0～9.0的条件下反应0.5～1h后得到反应液，用体积是反应液体积9倍的无水乙醇对反应液进行洗涤沉淀后，将反应液进行真空冷冻干燥得到蛋清肽钙复合物；

S2、包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体的制备：

取蛋黄卵磷脂、胆固醇、脱氧胆酸钠、维生素E溶解于无水乙醇中得到混合溶液；混合溶液中蛋黄卵磷脂浓度为4mg/mL，蛋黄卵磷脂与维生素E的质量比为10:1，蛋黄卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4:1～6:1，蛋黄卵磷脂与胆固醇的质量比为10:1～10:4；将混合溶液通过水浴超声处理使其内溶质充分溶解，通过旋转蒸发将混合溶液中的无水乙醇去掉；

在混合溶液中加入含有蛋清肽钙复合物的磷酸盐缓冲液，在30～40℃的温度条件下水合60min，得到包封率高于50％、粒径小于400nm、电位小于-20mV 的包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体；其中，蛋黄卵磷脂与所加入蛋清肽钙复合物的质量比为10:1～15:1；

S3、包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的制备：

将步骤S2所得包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体经动态高压微射流均质处理，得到粒径小于120nm、电位小于-20mV的包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体。

其中，步骤S3中动态高压微射流均质压力为100～120MPa，均质循环次数为1～3次。

一种利用上述方法制备的包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体，以钙含量为 40～60mg/g的蛋清肽钙复合物为包埋的芯材物质，以蛋黄卵磷脂、胆固醇、脱氧胆酸钠、维生素E为壁材；通过薄膜分散法和动态高压微射流技术制备得到粒径小于120nm、电位小于-20mV、具有良好的缓释特性和促钙吸收活性的纳米脂质体。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明方法采用薄膜分散法结合动态高压微射流技术，包封蛋清肽钙复合物，制备粒度小、稳定性好的纳米级脂质体，具有良好的缓释特性，不但解决了蛋清肽钙复合物在胃肠道环境中结构易被破坏的问题，同时它的纳米级尺寸赋予了其特殊的肠道细胞吸收能力，能够在钙补充剂、营养强化食品等领域应用。包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体经模拟胃液消化后钙释放率小于35％，再经模拟肠液消化后钙释放率可达75％以上；经大鼠翻转肠模型实验得到，包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的钙吸收量是未包埋的蛋清肽钙复合物的3倍以上。

附图说明

图1为本发明包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的粒径和多分散性指数结果。

图2为本发明包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的透射电镜结果。

图3为本发明包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的电位结果。

图4为本发明包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体在体外模拟胃肠消化中的钙释放率结果。

图5为本发明蛋清肽钙复合物及其纳米脂质体的促钙吸收量结果。

图6为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：一种包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的制备

实施例1的总体流程图参考图6。

S1、蛋清肽钙复合物的制备：取一定量的蛋清蛋白粉，加水配制成5g/100mL 的蛋清蛋白溶液，沸水浴10min，进行变性处理；待温度冷却至50℃，调pH 至10.66，按3000U/g底物蛋白的比例加入碱性蛋白酶进行酶解反应，反应时间为3h，调pH至7.0，100℃灭酶10min，离心收集上清液，冷冻干燥即得蛋清肽粉；将蛋清肽粉溶解于超纯水中，配置成浓度为50mg/mL溶液，按蛋清肽与 CaCl

S2、包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的制备：取一定量的蛋黄卵磷脂、胆固醇、脱氧胆酸钠、维生素E溶解于无水乙醇中，使得蛋黄卵磷脂浓度为4 mg/mL，蛋黄卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4:1，蛋黄卵磷脂与胆固醇的质量比为10:2，蛋黄卵磷脂与维生素E为10:1；通过旋转蒸发将有机溶剂去掉，按照蛋黄卵磷脂与蛋清肽钙复合物的质量比为15:1，加入含有蛋清肽钙复合物的磷酸盐缓冲液，在30℃下水合60min，得到包封率高于50％、粒径小于400nm、电位小于-20mV的包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体；

S3、将步骤S2得到粗脂质体在120MPa的条件下经动态高压微射流均质循环处理3次得到纳米脂质体。

利用动态光散射与激光粒度仪分析了包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体与纳米脂质体的粒径和电位大小，采用透射电镜观察包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体与纳米脂质体的微观结构。

实验结果：经上述步骤获得的包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体包封率达到 81.1±1.1％，再经动态高压微射流均质处理得到包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体；图1(A)和(B)显示了包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的粒径和多分散性指数结果。包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体粒径达到 397.80±32.27nm，经高压微射流处理后得到的纳米脂质体的粒径为94.48±10.01 nm。图1(B)显示出包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的多分散性指数分别为0.75±0.13、0.45±0.03。因此，与包埋的蛋清肽钙复合物粗脂质体相比，其纳米脂质体显示出均匀的分散性和较小的粒径。如图2所示，包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体具有大尺寸的聚集，并且具有许多相对较大和不规则形状的颗粒，而纳米脂质体是具有均一粒径分布的纳米球。脂质体的电荷是决定脂质体稳定性和包封效率的重要特征。高的电位绝对值(>30mV)表明脂质体在胶体分散体系上更加的稳定。图3显示了包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体的电位值，分别为-26.8±1.3mV和-24.2±1.7mV。该结果表明，由于带负电的粒子之间的强静电排斥作用，蛋清肽钙复合物脂质体具有动力学稳定性。

实施例2：包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的胃肠道缓释特性分析

S1、将制备的包埋蛋清肽钙复合物的粗脂质体和纳米脂质体溶于超纯水中，并用0.1M的HCl将pH调至2.0，加入模拟胃消化液，在37℃下消化90min，分别在0、30、60、90min时收取5mL的胃消化物，100℃水浴灭酶5min；然后，用1.0M的NaHCO

S2、纳米脂质体在体外模拟胃肠消化中的钙释放分析：取1mL的脂质体原液破乳后总钙含量M

实验结果：如图4所示，包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体经模拟胃液消化后钙释放率为32.08±1.91％，显著低于其粗脂质体经模拟胃液消化后的钙释放率(51.07±8.21％)，再经模拟肠液消化后纳米脂质体的钙释放率为76.63± 5.05％，粗脂质体的钙释放率为79.33±5.86％，表明在模拟胃肠消化过程中，包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体有效地降低胃消化环境对蛋清肽钙复合物的结构破坏，使更多的蛋清肽钙复合物进入肠道，有利于促进钙的吸收。

实施例3：包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体的促钙吸收特性研究

S1、大鼠外翻肠囊模型建立：实验前，将180～220g的Wistar大鼠禁食12-16 h。经腹腔注射4％的水合氯醛对禁食后的大鼠进行麻醉，待大鼠失去知觉后，剖腹并取出约7cm小肠，将肠内容物冲洗干净，置于通氧(95％O

S2、包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体促钙吸收实验：将准备好的肠段置于37℃溶有样品的缓冲液中，持续通入氧气，孵育120min，然后收集肠内溶液，利用原子吸收分光光度计测定肠内溶液的钙含量；其中，样品缓冲液的配置为：将包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体体外模拟胃肠消化后的样品溶于步骤S1所述的缓冲液中。

实验结果：本发明以蛋清肽钙复合物为对照，采用大鼠外翻肠囊模型分析蛋清肽钙复合物纳米脂质体经肠道细胞的促钙吸收活性。如图5所示，所述蛋清肽钙复合物纳米脂质体经大鼠外翻肠囊模型转运120min时，钙转运量为 11.51±0.86μg/mL，显著高于未包埋的蛋清肽钙复合物(3.23±1.55μg/mL)(P <0.05)，表明包埋蛋清肽钙复合物的纳米脂质体具有良好的促钙吸收活性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。