一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法。

背景技术

黄柏为芸香科植物黄皮树(Phellodendron chinense Schneid.)的干燥树皮。习称“川黄柏”。性苦，寒。归肾、膀胱经。清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮

现行《中国药典》(2020年版)收载黄柏、盐黄柏和黄柏炭，未收载酒黄柏，也无薄层色谱鉴别标准。但酒黄柏在我国应用广泛，历史悠久

文献报道黄柏炮制方法多样

薄层色谱是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。其以设备要求低，分离速度快、效率高、适用性强、操作简便等优势在中药材快速鉴别中得到广泛应用

表1黄柏、酒黄柏鉴别方法

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法，包括如下步骤：

(1)将样品磨粉得到药材粉末，所得药材粉末与第一溶剂混合后，通过超声或加热回流的方式提取，得到提取液；

(2)将步骤(1)所得提取液固液分离，向所得液体中加入第二溶剂，制备得到供试品溶液；

(3)将步骤(2)所得供试品溶液与对照品溶液于硅胶板点样，展开，取出，干燥后于紫外灯下检视。

步骤(1)中，所述样品为黄柏或黄柏的伪品。

其中，所述黄柏的伪品为市场上常见的伪品，包括但不限于山杨皮和川楝皮。

其中，所述山杨皮为杨柳科植物山杨Populus davidiana Dode.去掉木栓层的树皮，经黄色染料染色加工而成。呈大小不等的板片，色较淡，且不均匀，切面稍纤维性裂片分层，味淡，不苦。

其中，所述川楝皮为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb.et Zucc去掉木栓层的树皮。呈板片状，大小不一，厚1～4mm，外表面浅黄棕色，内表面黄白色，具不规则黄白不一纵向纹理，质韧，难折断，断面纤维性，易成片剥离。味苦。

步骤(1)中，所述药材粉末为磨粉过24-40目筛；优选地，所述药材粉末为磨粉后过30目筛。

其中，所述第一溶剂和第二溶剂分别独立选自甲醇、乙醇和乙酸乙酯中的任意一种或几种组合；优选地，所述第一溶剂和第二溶剂相同；进一步优选地，所述第一溶剂和第二溶剂均为甲醇。

步骤(1)中，当所述提取的方法为超声，所述药材粉末与第一溶剂的用量比为0.1g：2-8mL；优选地，所述药材粉末与第一溶剂的用量比为0.1g：3-7mL；进一步优选地，所述药材粉末与第一溶剂的用量比为0.1g：4-6mL；更进一步优选地，所述药材粉末与第一溶剂的用量比为0.1g：5mL。

步骤(1)中，当所述提取的方法为加热回流，所述药材粉末与第一溶剂的用量比为0.5-0.8g/mL。

步骤(1)中，所述提取的方法优选为通过超声的方式提取。

其中，所述超声的温度为10-30℃；优选地，所述超声的温度为25-30℃；其中，所述超声的温度为超声的初始温度，随着超声的进行，温度不超过40℃。

其中，所述超声的功率为200-300W；优选地，所述超声的功率为225-275W；进一步优选地，所述超声的功率为250W。

其中，所述超声的频率为10-70kHz；优选地，所述超声的频率为20-60kHz；进一步优选地，所述超声的频率为30-50kHz；更进一步优选地，所述超声的频率为40kHz。

其中，所述超声的时间为10-50min；优选地，所述超声的时间为20-40min；进一步优选地，所述超声的时间为30min。

步骤(1)中，所述加热回流的温度为30-90℃；优选地，所述加热回流的温度为20-80℃；进一步优选地，所述加热回流的温度为加热回流温度。

步骤(1)中，所述加热回流的时间为20-100min；优选地，所述加热回流的时间为40-80min；进一步优选地，所述加热回流的时间为60min。

步骤(2)中，所述固液分离包括但不限于过滤。

步骤(2)中，控制第二溶剂的加入量，使所得液体与第二溶剂的总体积为3-7mL；优选地，控制第二溶剂的加入量，使所得液体与第二溶剂的总体积为5mL。

步骤(3)中，所述对照品溶液为黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液中的任意一种或两种组合。

其中，所述黄柏对照药材溶液的制备方法为以黄柏对照药材为原料，按照供试品溶液的制备方法制备所得。

其中，所述盐酸小檗碱溶液为盐酸小檗碱与甲醇的混合溶液；所述混合溶液中盐酸小檗碱的浓度为0.2-0.8mg/mL；优选地，所述混合溶液中盐酸小檗碱的浓度为0.5mg/mL。

步骤(3)中，所述点样，展开等薄层层析的环境温度为0-40℃。

步骤(3)中，所述硅胶板为高效硅胶板；优选地，所述硅胶板为硅胶G板(烟台市江友硅胶开发有限公司)。

步骤(3)中，所述点样的点样量为1-9μL；优选地，所述点样量为1-5μL；进一步优选地，所述点样量为1-2μL。

步骤(3)中，所述展开的展开剂为乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、氨水和三乙胺按体积比为4-8：1-3：1-3：0.5-1.5：1组成的混合溶液；优选地，所述展开的展开剂为乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、氨水和三乙胺按体积比为6：2：2：1：1组成的混合溶液。

步骤(3)中，所述展开的展距为6-10cm；优选地，所述展开的展距为7-8cm。

步骤(3)中，所述干燥包括但不限于晾干。

步骤(3)中，所述紫外灯检视优选为紫外灯(365nm)下检视。

步骤(3)中，当供试品溶液在与对照品溶液在相同水平位置有荧光斑点时，所述样品为黄柏或黄柏酒炙品。

步骤(3)中，当供试品溶液在与对照品溶液在相同水平位置有荧光斑点，且仅有一个荧光斑点时，所述样品为川黄柏或川黄柏酒炙品；当供试品溶液在与对照品溶液在相同水平位置有荧光斑点，且上下方向有两个荧光斑点时，所述样品为关黄柏或关黄柏酒炙品。

其中，所述荧光斑点为亮黄色荧光斑点。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、样品粉末取样量为0.1g，本方法精度增加。

2、提取溶剂为甲醇，加入量为5mL，溶剂用量大幅减少，且省去了溶剂配置环节。

3、本发明所采用的展开剂为乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺，不需要分层展开剂，展开剂现用现配，斑点集中、边界清晰、稳定无漂移；同时，本发明所提供的薄层色谱鉴别方法操作简单易行，重复性好，稳定性强。

4、本发明所提供的方法，在展开剂中展开结束后，直接在365nm下检视，方便直观；解决了现有技术中需要将薄层板置氨蒸汽中饱和的展开剂中展开，展开结束后需喷以稀碘化铋钾试液显色后检视，操作复杂的问题。

5、本方法还可作为黄柏与关黄柏的快速薄层色谱鉴别之用，斑点分离清晰稳定。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为黄柏及酒黄柏药材图(左：黄柏，右：酒黄柏)。

图2为不同提取溶剂对薄层色谱鉴别效果的影响。

图3为不同展开剂对薄层色谱鉴别效果的影响。

图4为不同提取方法对薄层色谱鉴别效果的影响。

图5为不同展距对薄层色谱鉴别效果的影响。

图6为不同点样量对薄层色谱鉴别效果的影响。

图7为薄层色谱专属性考察。

图8为不同硅胶板对薄层色谱鉴别效果的影响。

图9为温度对薄层色谱鉴别效果的影响。

图10为应用《中国药典》2020版方法薄层检测十五批黄柏饮片。

图11为应用本方法薄层鉴别检测十五批黄柏饮片

图12为应用本方法薄层鉴别检测十五批酒黄柏饮片。

图13应用本文方法薄层鉴别检测黄柏和关黄柏饮片。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述展开剂指体积比。

实施例1

1材料

1.1主要仪器与材料

AB135-S型电子天平(METTLER)；SB25-12DTD型超声波清洗器(宁波新芝)；CBIO21多功能暗箱式紫外分析仪(北京赛百奥)；CY型滚筒式炒药机(南京腾阳)；双槽层析缸(垒固玻璃)。硅胶G板(批号：020190411，烟台江友)；硅胶GF254板(批号：20061021，青岛海洋)；微量毛细管(1μL，批号：889892；3μL，批号：895254，德国，HIRSCHMANN)。

1.2药材

所用黄柏饮片(黄柏丝)(十五批黄柏药材和三批关黄柏)购自河北安国，经山西省药检所罗晋萍主任药师鉴定分别为木兰科植物黄皮树(Phellodendron chinenseSchneid.)的干燥树皮和芸香科植物黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥树皮。将所得黄柏饮片经加工后制得酒黄柏饮片。饮片(黄柏与酒黄柏)信息见表2。

表2中药饮片来源及制备

1.3药品与试剂

盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、黄柏对照药材(批号：110713-202015，111895-201805，121510-201807，中国食品药品检定研究院)；冀州黄酒(批号：20200806)，石家庄栾城黄酒厂，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1黄柏酒炙

参照国家及多省份中药材炮制标准、中药饮片厂通行酒黄柏炮制规范并采信老药工的数十年酒黄柏炮制经验，采用以下酒黄柏炮制方法：取黄柏丝100kg，加黄酒10kg拌匀，置罐或适宜的容器内闷润60分钟至酒尽，取出，炒干(品温150-170℃)，偶有焦斑，即得酒黄柏。黄柏酒炙前后见图1。

2.2供试品溶液、对照品溶液的制备及检视方法

(1)供试品溶液：将样品(步骤2.1所得黄柏、或关黄柏、或酒黄柏或酒关黄柏)磨粉，过筛30目，取药材粉末0.1g，加提取溶剂(甲醇)5mL，超声提取(功率250W，频率40kHz，超声温度为室温)30min，滤过，滤液用甲醇补足5mL。

(2)对照品溶液：

a.黄柏对照药材溶液：取黄柏对照药材0.1g，同“供试品溶液”制备。

b.盐酸小檗碱溶液：取盐酸小檗碱，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液。

c.盐酸黄柏碱溶液：取盐酸黄柏碱，同“盐酸小檗碱溶液”制备。

(3)检视方法：用毛细管点样1μL，展开、取出、晾干，置紫外灯(365nm)下检视。

硅胶G板：烟台市江友硅胶开发有限公司。

展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三氯甲烷：氨水：三乙胺(6：2：2：1：1)。

展距：7cm。

环境温度：室温，25℃。

2.3薄层色谱鉴别条件的考察

薄层色谱鉴别影响因素包括：提取方法、提取溶剂、展开系统、展距、点样量等。本实验分别对上述的影响因素进行考察。下述方法若无特殊说明，均以步骤2.2为基准。

2.3.1提取溶剂考察

考察提取溶剂分别为甲醇、乙醇、乙酸乙酯为酒黄柏1的提取效果的比较。

供试品溶液：以酒黄柏1为原料，分别以甲醇、乙醇、乙酸乙酯作为提取溶剂，制得三种供试品溶液。

对照品溶液：以盐酸小檗碱溶液和盐酸黄柏碱溶液为对照品。

点样量：3μL。

结果见图2(供试品溶液：1.甲醇；2.乙醇；3.乙酸乙酯；4.盐酸黄柏碱溶液；5.盐酸小檗碱溶液)，甲醇提取液荧光点的大小和强度最高，荧光点均匀且聚集，明显高于乙醇和乙酸乙酯，甲醇作为提取溶剂利于提升检测系统的灵敏度。

2.3.2薄层层析展开系统考察

考察五种展开剂：展开剂Ⅰ：环己烷：乙酸乙酯：异丙醇：甲醇：水：三乙胺(3：3.5：1：1.5：0.5：1)；展开剂Ⅱ：甲苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇：水(6：3：2：1.5：0.3)；展开剂Ⅲ：三氯甲烷：甲醇：水(30：15：4)；展开剂Ⅳ：环己烷：乙酸乙酯：异丙醇：甲醇：水：三乙胺(3：3.5：1：1.5：0.5：1)；展开剂Ⅴ：乙酸乙酯：甲醇：三氯甲烷：氨水：三乙胺(6：2：2：1：1)。

供试品溶液：分别以黄柏1、黄柏酒1、酒黄柏7、酒黄柏13为原料，制得四种供试品溶液。

对照品：以黄柏对照药材溶液、盐酸小檗碱溶液和盐酸黄柏碱溶液为对照品。

结果见图3(供试品溶液：1.黄柏1；2.酒黄柏1；3.酒黄柏7；4.酒黄柏13；5.黄柏对照药材溶液；6.盐酸黄柏碱溶液；7.盐酸小檗碱溶液)，展开剂V：乙酸乙酯：甲醇：三氯甲烷：氨水：三乙胺(6：2：2：1：1)的荧光点相对集中，边界清晰、不易漂移，且检测精度较高，重复性较好。同时，出现了三色界限清晰，显色差异明显的荧光点，增加了薄层色谱鉴别的信息量(除了出现了小檗碱的亮黄色荧光，还出现了蓝色荧光和绿色荧光)。初步估计薄层色谱图中亮绿色荧光点为黄柏酮类物质，亮蓝色荧光点为木兰花碱类物质的荧光所致，有待后续验证。

2.3.3薄层层析提取方法考察

考察两种提取方法：(1)超声提取，即步骤2.2供试品溶液的提取方法；(2)加热回流提取：将样品磨粉，过筛30目，取药材粉末0.5g，加提取溶剂(甲醇)40mL，单口烧瓶，口上加冷凝管，冷凝管口通道空气中，口部加适量脱脂棉花，防止甲醇外泄，加热60℃，甲醇蒸发，经过冷凝管冷却变成液体在流回到单口烧瓶中，加热回流提取60min，滤过，滤液用甲醇补足5mL。。

供试品溶液的制备：以酒黄柏1为原料，分别采用超声提取和加热回流的方法，制得两种供试品溶液。

对照品：以黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液为对照品。

结果见图4(供试品溶液：1.酒黄柏1(超声提取)；2.酒黄柏1(回流提取)；3.黄柏对照药材溶液(超声提取)；4.盐酸小檗碱溶液)，可见，采用超声法提取后，小檗碱呈现边界清晰，醒目亮黄色荧光点。后续可以进行薄层扫描进行较为精确的定量。采用超声提取法黄柏药材中的标志性物质小檗碱(C

2.3.4薄层层析展距考察

考察五种展距：展距Ⅰ：6cm；展距Ⅱ：7cm；展距Ⅲ：8cm；展距Ⅳ：9cm；展距Ⅴ：10cm。

供试品溶液：分别以黄柏1、酒黄柏1、酒黄柏7、酒黄柏13为原料，制得四种供试品溶液。

对照品：以黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液为对照品。

实验考察了不同展距对展开效果的影响，见图5(供试品溶液：1.黄柏1；2.酒黄柏1；3.酒黄柏7；4.酒黄柏13；5.黄柏对照药材溶液；6.盐酸小檗碱溶液)。结果显示展距为7-8cm时效果较好，拖尾现象少，随着层析时间的延长，展距的加大，耗时、费板且溶剂前沿和荧光点容易产生漂移，对薄层板的加工要求和硅胶颗粒均匀度要求变高。

2.3.5薄层层析点样量考察

考察九种点样量：1-9μL。

供试品溶液：以黄柏1原料，制得供试品溶液。

对照品：以盐酸小檗碱溶液和盐酸黄柏碱溶液为对照品。

点样量：供试品溶液的点样量分别是1-9μL，对照品的点样量均为1μL。

结果如图6(供试品溶液：1-9：黄柏1；10、盐酸小檗碱溶液；11、盐酸黄柏碱溶液)所示，点样量1-2μL时，荧光点集中，边界清晰，拖尾少，能够达到薄层色谱鉴别的要求。

通过上述薄层色谱鉴别影响因素的考察，确定样品的制备及检测过程如下：

供试品溶液：将样品磨粉，过筛30目，取药材粉末0.1g，加提取溶剂(甲醇)5mL，超声提取(功率250W，频率40kHz，温度为室温)30min，滤过，滤液用甲醇补足5mL；

检视方法：室温下，用毛细管点样1μL，以硅胶G板(烟台市江友硅胶开发有限公司)，展开剂：乙酸乙酯：甲醇：三氯甲烷：氨水：三乙胺(6：2：2：1：1)，展距7cm的条件展开，取出、晾干，置紫外灯(365nm)下检视；

判断标准：(1)当供试品溶液在与黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液相同位置有类似亮黄色荧光供试品为黄柏或黄柏酒炙品；(2)当供试品溶液在与黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液在相同水平位置有荧光斑点，且仅有一个荧光斑点时，所述样品为川黄柏或川黄柏酒炙品；当供试品溶液在与黄柏对照药材溶液和盐酸小檗碱溶液在相同水平位置有荧光斑点，且上下方向有两个荧光斑点时，所述样品为关黄柏或关黄柏酒炙品。

实施例2：薄层色谱鉴别专属性考察

对本方法的专属性进行考察，结果见图7(供试品溶液：1.黄柏1；2.酒黄柏1；3.黄柏对照药材；4.盐酸黄柏碱溶液；5.盐酸小檗碱溶液；点样量：3μL)。供试品黄柏1、酒黄柏1在与盐酸小檗碱溶液和黄柏对照药材相同的位置有相同的荧光斑点，盐酸黄柏碱无荧光斑点，且无其它干扰斑点。表明该方法专属性良好。

采用本方法对黄柏(川黄柏)和关黄柏的薄层色进行谱鉴别考察，见图13(供试品溶液：1黄柏1；2.黄柏对照药材溶液；3-5.关黄柏1-3；6.盐酸小檗碱溶液)。发现在薄层色谱图上黄柏(川黄柏)只有一个亮黄色荧光斑点，而关黄柏为上下两个亮黄色荧光点，所以，本薄层色谱鉴别方法还可以快速鉴别黄柏与关黄柏。

实施例3：耐用性的考察

(1)硅胶板对薄层色谱鉴别影响的考察

对三种不同厂家生产的高效薄层板和普通薄层板进行耐用性考察，见图8(供试品溶液：1.黄柏1；2.酒黄柏1；3.酒黄柏7；4.酒黄柏13；5.黄柏对照药材溶液；6.盐酸小檗碱溶液；硅胶G板：Ⅰ、烟台市江友高效板；Ⅱ、青岛海洋普通板；Ⅲ、青岛海洋高效板)，明显发现，高效板硅胶颗粒均匀且粒径小，喷涂均匀，所以分离塔板数高，所以盐酸小檗碱的荧光点相对集中，且边界清晰，更利于薄层色谱鉴别，尤其是后续的薄层扫描定量，本方法采用普通板做黄柏和酒黄柏的薄层色谱鉴别是完全可行的。

(2)温度对薄层层析影响的考察

对温度环境适用性见图9(环境温度：Ⅰ、4℃；Ⅱ、40℃；Ⅲ、室温(21℃)；供试品溶液：1.黄柏1；2.酒黄柏1；3.酒黄柏7；4.酒黄柏13；5.黄柏对照药材溶液；6.盐酸小檗碱溶液)。4℃(冰箱)和21℃(室温)条件下，小檗碱荧光点大小稳定，相对集中，边界清晰且展距相当，在40℃(水浴)条件下，展距有所增长，但影响较小，荧光点有较明显变化，荧光点面积约为4℃(冰箱)时的两倍，但边界清晰，对黄柏和酒黄柏的薄层色谱鉴别未产生影响。

实施例4：样品的薄层层析检测

(1)应用2020年版《中国药典》薄层色谱方法鉴别十五批黄柏饮片

供试品溶液1-15：黄柏1-15；16.黄柏对照药材溶液；17.盐酸黄柏碱溶液；18.盐酸小檗碱溶液。

按2020年版《中国药典》

(2)应用本薄层色谱方法鉴别十五批黄柏饮片

供试品溶液1-15：黄柏1-15；16.黄柏对照药材溶液；17.盐酸小檗碱溶液；18.盐酸黄柏碱溶液。

按本方法制备供试品溶液，再取盐酸小檗碱溶液和盐酸黄柏碱溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验方法在365nm紫外灯下检视，如图11所示，与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的亮黄色荧光斑点，斑点集中、均匀，边界清晰，溶剂前沿和荧光点无肉眼可见漂移。本方法可以很好的进行黄柏的薄层色谱鉴别检测。

(3)应用本方法薄层色谱鉴别十五批酒黄柏饮片

供试品溶液1-15：酒黄柏1-15；16.黄柏对照药材溶液；17.盐酸小檗碱溶液；18.盐酸黄柏碱溶液。

同法步骤(2)制备溶液、层析和检视。如图12所示，在供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的亮黄色荧光斑点，斑点集中、均匀，边界清晰，溶剂前沿和荧光点无漂移，由于黄柏酒炙过程中小檗碱的量有不同程度的减少，相同提取方法和薄层色谱鉴别方法下，酒黄柏的荧光点就黄柏偏小，本方法可以很好的进行酒黄柏的薄层色谱鉴别检测。

(4)本薄层层析方法检测黄柏与关黄柏

供试品溶液：1.黄柏1；2.黄柏对照药材溶液；3-5.关黄柏1-3；6.盐酸小檗碱溶液。

同法步骤(2)制备溶液、层析和检视。如图13所示，关黄柏薄层色谱图为上下两个亮黄色荧光点，上面的亮黄色荧光点为小檗碱，下面的亮黄色荧光点极有可能为巴马丁，有待后续研究，本薄层色谱鉴别方法可以快速鉴别黄柏与关黄柏。

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本发明提供了一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。