一种用于蛋白靶向运输的新型交联分子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白靶向运输技术领域，具体的涉及一种用于蛋白靶向运输的新型交联分子及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是多种细胞过程中必不可少的参与者，蛋白质疗法将蛋白质输送到细胞中以替代功能障碍的蛋白质，为癌症，炎症和溶酶体贮积病等各种疾病的药物开发提供了一种有前景的方法。蛋白质的细胞内递送也代表了用于细胞成像和诊断，基因组工程，和合成生物学的有用策略。然而，天然蛋白质大多数是膜不可渗透的，并且易于被细胞中的蛋白水解酶降解，特别是在溶酶体中。有效功能蛋白向细胞内有效传递的载体系统对于推进基于蛋白质的治疗学至关重要。

细胞内蛋白质递送在疾病治疗、基因工程以及合成生物学领域有着重要的意义。目前的蛋白质递送系统通常依赖于基因蛋白与膜穿透性标签的融合以及基于阳离子脂质体、聚合物、无机纳米材料的蛋白包封载体。但是，基因融合系统并不适用于天然的、非融合的蛋白质的递送。而纳米载体往往需要对蛋白质进行共价修饰，蛋白质的装载和溶酶体逃逸的效率较低。

针对现有蛋白运输系统效率较低、毒性较大等问题，急需发展新的基于小分子导向和调控的蛋白高效低毒运输系统。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题在于提供一种用于蛋白靶向运输的新型交联分子及其制备方法和应用，以解决现有技术中蛋白运输系统效率较低、毒性较大等问题。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的首要目的在于提供一种用于蛋白靶向运输的与蛋白交联的交联分子。

本发明是这样实现的，一种用于蛋白靶向运输的新型交联分子，为含有环辛炔衍生物基团、二硫键、酰胺键、聚乙二醇基团的分子，所述新型交联分子的化学结构式如下所示：

式(I)中，R

进一步地，所述R

进一步地，所述R

优选地，所述R

相应地，该交联分子的化学结构式分别如下(I-1)、(I-2)所示：

本发明的再一目的在于提供上述新型交联分子的制备方法。

一种用于蛋白靶向运输的新型交联分子的制备方法，包括如下步骤：

S1、将3当量的化合物1溶于12当量的溶剂1中，并在冰浴条件下加入1.2当量的碱1，冰浴反应0.5～1小时，其中，所述碱1 为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、碳酸钾中的任意一种，所述溶剂1为二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮中的任意一种；接着将1当量的对甲苯磺酰氯溶于10当量的溶剂1并加入上述体系，冰浴反应1～1.5小时，；然后转至室温反应过夜，在TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物2；

S2、将1当量的步骤S1中所得的化合物2溶于20当量的溶剂2，加入1.2当量的邻苯二甲酰亚胺，并加入1.5当量的碱2，加热反应过夜，其中，所述溶剂2为二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环中的至少任意一种，所述碱2为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、碳酸钾中的任意一种；TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物3；

S3、将1当量的步骤S2中所得的化合物3溶于50当量的溶剂3，冰浴搅拌，接着依次加入1.5当量的三苯基膦和1.5当量的四溴化碳，冰浴反应30分钟，其中，所述溶剂3为二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的任意一种；然后转至室温反应过夜，TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物4；

S4、将1.5当量的碱3溶于20当量的溶剂4，并冰浴条件下加入1.5当量的三苯甲硫醇，冰浴反应0.5～1小时，其中，所述碱3 为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾、氢化钠、甲醇钠、二异丙基氨基锂、叔丁醇钾中的任意一种，所述溶剂4为丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的任意一种；接着将1当量的步骤 S3中所得的化合物4溶于10当量的溶剂4并加入上述体系，室温反应过夜；TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物5；

S5、将1当量的步骤S4中所得的化合物5溶于20当量的溶剂5，并在冰浴条件下加入20当量的三氟乙酸，之后再加入1当量的三乙基硅烷，室温反应过夜，其中，所述溶剂5为二氯甲烷；TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物6；

S6、将1当量的步骤S5中所得的化合物6溶于10当量的溶剂6，冰浴搅拌，并加入1.2当量的碱4，其中，所述碱4为三乙胺、N,N- 二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯中的任意一种；接着将1.2当量的2,2'-二硫二吡啶溶于10当量的溶剂6并加入上述体系，室温反应过夜，其中，所述溶剂6为四氢呋喃、二氯甲烷、二氧六环中的任意一种；TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物7；

S7、将1当量的步骤S6中所得的化合物7溶于10当量的溶剂7，冰浴搅拌，并加入1当量的酸1，其中，所述溶剂7为甲醇、乙醇、叔丁醇中的任意一种，所述酸1为甲酸、乙酸、冰醋酸中的任意一种；接着将1当量的R

S8、将步骤S7所得的1当量的化合物8溶于10当量的溶剂8，冰浴搅拌，其中，所述溶剂8为甲醇、乙醇中的任意一种；接着在滴液漏斗中将4当量的盐酸甲胺与4当量的碱5溶于20当量的溶剂8 并滴入上述反应体系，室温反应过夜，其中，所述碱5为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠中的任意一种；TLC 监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物9；

S9、将1当量的步骤8中所得的化合物9溶于10当量的溶剂9，冰浴搅拌，其中，所述溶剂9为四氢呋喃、二氯甲烷、二氧六环中的任意一种；接着将1当量的化合物10溶于10当量的溶剂9并加入上述反应体系，再加入2当量的碱6，室温反应过夜，其中，所述碱6 为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯中的任意一种，所述化合物10的化学结构式为：

TLC监测反应完成后，对产物进行提纯处理，得到化合物11。

本发明的再一目的在于提供一种蛋白靶向运输系统的构建。

所述交联分子参与构建免载体蛋白靶向运输系统，与所述新型交联分子相结合的分子为含有靶向基团、PH敏感基团以及疏水碳链的叠氮基团的分子；与所述新型交联分子相结合的蛋白包括牛血清白蛋白、乙醛脱氢酶2、过氧化氢酶中的至少任意一种。

具体地，所述含有靶向基团、PH敏感基团以及疏水碳链的叠氮基团的分子的化学结构式如下所示：

式中R

所述式(I)中-N

优选地，所述含有靶向基团、PH敏感基团以及疏水碳链的叠氮基团的分子的化学结构式如下所示：

3.有益效果

(1)本发明提供的新型交联分子以聚乙二醇链为基本骨架，可提高分子的水溶性；接着在骨架两端进行衍生化，通过连接上容易被细胞内相关酶水解的基团如二硫键、酰胺键，以及连接上环辛炔衍生物结构，可与含有靶向基团、缩醛基团、疏水碳链的叠氮基团的分子通过叠氮炔环加成反应生成三氮唑结构，从而构建与蛋白相连接的交联分子。则本发明能实现对蛋白的直接修饰，构建免载体的运输系统，从而在应用时具有能提高效率，降低毒性等优点。

(2)本发明基于上述交联分子，给出了一种免载体的蛋白靶向运输的方法，构建了一种新型蛋白运输系统。应用时，首先该分子能够靶向到目标细胞即需要特定的靶头，在胞吞后通过酸性条件下缩醛结构水解释放的疏水碳链破坏溶酶体膜以实现溶酶体逃逸；进入细胞内，在谷胱甘肽的催化下掉下相应的小分子，最终能够释放出天然的蛋白质，以实现通过蛋白靶向运输治疗相关疾病的目的。则本发明适用于天然的、非融合的蛋白质的递送，且不需要对蛋白质进行共价修饰，蛋白质的装载和溶酶体逃逸的效率较高。

综上，本发明能够解决现有技术中蛋白运输系统效率较低、毒性较大等问题，适用于天然的、非融合的蛋白质的递送。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

第一，制备用于蛋白靶向运输的交联分子的一部分(I-1)，合成路线如下所示：

具体包括如下步骤：

(1)将15.3g化合物1＇(78.77mmol)溶于20ml超干二氯甲烷，冰浴下加入4.4ml三乙胺(31.66mmol)，冰浴反应30分钟；接着将5g对甲苯磺酰氯(26.23mmol)溶于20ml二氯甲烷后缓慢加入上述体系(约30分钟)，冰浴反应1小时；然后转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1：4)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物2＇，经检测，所述化合物 2＇的重量为6.5029g，产率为71.2％；

(2)取3.005g化合物2＇(8.62mmol)溶于30ml超干二甲基甲酰胺，并加入1.53g邻苯二甲酰亚胺(10.4mmol),再加入1.94 ml 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(13.0mmol)，转至90℃油浴反应过夜。TLC(纯乙酸乙酯)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物3＇，经检测，所述化合物3＇的重量为 2.0907g，产率为75％；

(3)取1.4282g化合物3＇(4.42mmol)溶于30ml超干二氯甲烷，冰浴搅拌，并加入1.74g三苯基膦(6.63mmol)，冰浴搅拌15分钟，再加入2.2g四溴化碳(6.63mmol)，冰浴反应30分钟；转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物4＇，经检测，所述化合物4＇的重量为1.4895g，产率为87.3％；

(4)将0.23g含量60％的氢化钠(5.75mmol)溶于10ml超干二甲基甲酰胺，并在冰浴条件下加入1.6g三苯甲硫醇(5.79mmol)，冰浴反应30分钟；接着取1.4895g化合物4＇(3.86mmol)溶于 10ml二甲基甲酰胺加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物5＇，经检测，所述化合物5＇的重量为1.86 g，产率为85％；

(5)取1.84g化合物5＇(3.16mmol)溶于10ml超干二氯甲烷，冰浴条件下加入10ml三氟乙酸，再加入0.5ml三乙基硅烷 (3.13mmol)，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1) 监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物6＇，经检测，所述化合物6＇的重量为0.7509g，产率为70％；

(6)将所得的0.7509g化合物6＇(2.21mmol)溶于15ml 超干二氯甲烷，冰浴搅拌，加入0.37ml三乙胺(2.66mmol)，接着将0.5849g2,2'-二硫二吡啶(2.65mmol)溶于10ml超干二氯甲烷并加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝ 1:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物7＇，经检测，所述化合物7＇的重量为0.7g，产率为70.5％；

(7)取0.65g化合物7＇(1.45mmol)溶于10ml甲醇，冰浴搅拌，加入83μL冰醋酸(1.45mmol)，接着将0.203g4-巯基苯甲醇(1.45mmol)溶于5ml甲醇并加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物8＇，经检测，所述化合物 8＇的重量为0.4g，产率为58％；

(8)取0.3536g化合物8＇(0.74mmol)溶于10ml甲醇，冰浴搅拌，在滴液漏斗中将0.2g盐酸甲胺(2.96mmol)与0.1185 g氢氧化钠(2.96mmol)溶于15ml甲醇并滴入上述反应体系，转至室温反应过夜。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10；1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物9＇，经检测，所述化合物9＇的重量为165mg，产率为64.1％；

(9)取46mg化合物9＇(0.132mmol)溶于5ml超干四氢呋喃，冰浴搅拌，将53mg化合物10＇(0.132mmol)溶于5ml超干四氢呋喃并加入上述反应体系，接着加入44μLN,N-二异丙基乙胺(0.266mmol)，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：丙酮＝1:1) 监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物 11＇，经检测，所述化合物11＇的重量为64mg，产率为76.5％。

第二，制备用于蛋白靶向运输的交联分子的另一部分(Ⅱ-1)，合成路线如下所示：

具体包括以下步骤：

(1)根据文献报道，先合成下面的化合物(In vivo delivery of transcriptionfactors with multifunctional oligonucleotides. Nat.Mater.,2015,14,701.)：

(2)将100mg化合物12(0.081mmol)溶于5mL甲醇，冰浴搅拌，并加入36mg甲醇钠(0.666mmol)，室温反应过夜。TLC(乙腈：水：三乙胺＝10:2:0.1)监测反应完成后，通过硅胶柱纯化产物，得到化合物13，经检测，所述化合物13的重量为50mg，产率为55％。

第三，将制得的化合物11＇和化合物13用于与一种模板蛋白交联，从而构建免载体蛋白靶向运输系统，合成路线如下所示：

具体包括以下步骤：

(1)取实施例1中制得的50mg化合物11＇(0.079mmol)溶于5mL二氯甲烷，冰浴搅拌，接着将氯甲酸对硝基苯酯(35mg，0.174 mmol)溶于5mL二氯甲烷并加入上述体系，最后将26μL 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(0.174mmol)加入上述体系，室温反应过夜。 TLC(石油醚：丙酮＝2:1)监测反应完成后，通过硅胶柱纯化产物，得到化合物14，经检测，所述化合物14的重量为40mg，产率为63.5％；

(2)称取104mg牛血清白蛋白溶于2.4mL 1×PBS，再将10mg 化合物14溶于400μL二甲亚砜并加入上述体系，室温反应过夜。反应结束后，将反应液用超滤管(10KD)洗6次(1×PBS溶液)，注意超滤管中二甲亚砜含量不超过5％，最后将超滤管中的溶液进行冷冻干燥，得到产物15，蛋白定量为85mg，产率为81.7％；

(3)取100mg化合物15溶于2.4mL 1×PBS，再将10mg化合物13溶于400μL二甲亚砜并加入上述体系，室温反应过夜。反应结束后，将反应液用超滤管(10KD)洗6次(1×PBS溶液)。最后将超滤管中的溶液进行冷冻干燥，得到产物16，蛋白定量为62mg，产率为77.5％。

实施例2

第一，制备用于蛋白靶向运输的交联分子的一部分(I-2)，合成路线如下所示：

具体包括以下步骤：

(1)将15.3g化合物1＇(78.77mmol)溶于20ml超干二氯甲烷，冰浴下加入5.2ml二异丙基乙胺(31.46mmol)，冰浴反应 30分钟；接着将5g对甲苯磺酰氯(26.23mmol)溶于20ml二氯甲烷后缓慢加入上述体系(约30分钟)，冰浴反应1小时；然后转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1：4)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物2＇，经检测，所述化合物2＇的重量为6.102g，产率为66.8％；

(2)取3.005g化合物2＇(8.62mmol)溶于30ml超干二甲基甲酰胺，并加入1.53g邻苯二甲酰亚胺(10.4mmol),再加入1.94 ml 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(13.0mmol)，转至90℃油浴反应过夜。TLC(纯乙酸乙酯)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物3＇，经检测，所述化合物3＇的重量为 2.0907g，产率为75％；

(3)取1.4282g化合物3＇(4.42mmol)溶于30ml超干二氯甲烷，冰浴搅拌，并加入1.74g三苯基膦(6.63mmol)，冰浴搅拌15分钟，再加入2.2g四溴化碳(6.63mmol)，冰浴反应30分钟；转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物4＇，经检测，所述化合物4＇的重量为1.4895g，产率为87.3％；

(4)将0.2804g含量60％的氢化钠(7.01mmol)溶于10ml 超干四氢呋喃，并在冰浴条件下加入1.9378g三苯甲硫醇(7.01 mmol)，冰浴反应30分钟；接着取1.8053g化合物4＇(4.674mmol) 溶于10ml四氢呋喃加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物5＇，经检测，所述化合物5＇的重量为2.6g，产率为95.6％；

(5)取1.84g化合物5＇(3.16mmol)溶于10ml超干二氯甲烷，冰浴条件下加入10ml三氟乙酸，再加入0.5ml三乙基硅烷 (3.13mmol)，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1) 监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物6＇，经检测，所述化合物6＇的重量为0.7509g，产率为70％；

(6)将所得的0.9226g化合物6＇(2.72mmol)溶于15ml 超干二氯甲烷，冰浴搅拌，加入0.54ml二异丙基乙胺(3.27mmol)，接着将0.7186g 2,2'-二硫二吡啶(3.26mmol)溶于10ml超干二氯甲烷并加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物7＇，经检测，所述化合物7＇的重量为0.6482g，产率为53.2％；

(7)取0.65g化合物7＇(1.45mmol)溶于10ml甲醇，冰浴搅拌，加入83μL冰醋酸(1.45mmol)，接着将0.203g4-巯基苯甲醇(1.45mmol)溶于5ml甲醇并加入上述体系，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物8＇，经检测，所述化合物 8＇的重量为0.4g，产率为58％；

(8)取1.1853g化合物8＇(2.48mmol)溶于20ml乙醇，冰浴搅拌，在滴液漏斗中将0.67g盐酸甲胺(9.92mmol)与0.5567 g氢氧化钾(9.92mmol)溶于30ml甲醇并滴入上述反应体系，转至室温反应过夜。TLC(二氯甲烷：甲醇＝10；1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物9＇，经检测，所述化合物9＇的重量为270mg，产率为31.3％；

(9)取100mg化合物9＇(0.288mmol)溶于5ml超干四氢呋喃，冰浴搅拌，将133mg化合物10″(0.345mmol)溶于5ml 超干四氢呋喃并加入上述反应体系，接着加入0.4mL三乙胺(2.88 mmol)，转至室温反应过夜。TLC(石油醚：丙酮＝1:1)监测反应完成后，再通过萃取，并通过硅胶柱纯化产物，得到化合物11″，经检测，所述化合物11″的重量为110mg，产率为64.4％。

第二，制备用于蛋白靶向运输的交联分子的另一部分(Ⅱ-1)，合成路线见实例1。

第三，将制得的化合物11″和化合物13用于与一种模板蛋白交联，从而构建免载体蛋白靶向运输系统，合成路线如下所示：

具体包括以下步骤：

(1)取实施例1中制得的100mg化合物11″(0.168mmol) 溶于5mL二氯甲烷，冰浴搅拌，接着将68mg氯甲酸对硝基苯酯(0.337 mmol)溶于5mL二氯甲烷并加入上述体系，最后将50μL 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(0.334mmol)加入上述体系，室温反应过夜。TLC(石油醚：丙酮＝2:1)监测反应完成后，通过硅胶柱纯化产物，得到化合物14＇，经检测，所述化合物14＇的重量为78mg，产率为61％；

(2)将100mg过氧化氢酶(CAT)溶于9mL的1x PBS缓冲液和 1mL二甲亚砜(DMSO)的混合溶液中，25℃下搅拌，将16mg的化合物14＇溶于1mL二甲亚砜(DMSO)中滴加到上述溶液，在25℃下反应过夜；反应结束后向反应混合液中加入30mL 1x PBS缓冲液稀释。然后将溶液置于透析袋(截留分子量为7000)内，用1x PBS缓冲液进行透析，透析液进行冷冻干燥，得到产物15＇，通过蛋白定量为 70mg，产率为70％；

(3)将50mg的产物15＇溶于5mL 1x PBS缓冲液中，25℃下搅拌，将8mg化合物13溶于1mL二甲亚砜中滴加到上述溶液中，在25℃下反应过夜。反应结束后向反应混合液中加入15mL 1x PBS 缓冲液稀释。然后将溶液置于透析袋(截留分子量为7000)内，用 1x PBS缓冲液进行透析，透析液进行冷冻干燥，得到产物16＇，通过蛋白定量为40mg，产率为80％。

由上述内容可知，本发明能够解决现有技术中蛋白运输系统效率较低、毒性较大等问题，适用于天然的、非融合的蛋白质的递送。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其的限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。