用于分析病毒衣壳蛋白组成的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2018年10月25日提交的美国临时申请号62/750,583的权益，所述临时申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及使用亲水相互作用液相色谱法(HILIC)和质谱测定法确定病毒颗粒如腺相关病毒(AAV)颗粒的异质性的方法。

背景技术

基因疗法已成为遗传疾病的替代治疗。基因疗法涉及将一些遗传物质(DNA、RNA或寡核苷酸)转移到靶细胞中。实际上，目标基因(也称为转基因)必须通过携带DNA或RNA分子的载体递送至细胞。它是基于功能性基因的转移，以替代或补充缺陷型基因。转基因可通过载体递送至细胞中。递送方法根据治疗类型和待靶向的器官/组织而不同。

病毒颗粒已成为基因疗法和疾病治疗的载体。病毒载体，如基于腺相关病毒(AAV)的基因组的那些病毒载体为基因递送提供了令人兴奋的平台。目前，已经描述了12种AAV人血清型(AAV1-12)，所述人血清型中的许多具有不同的细胞和组织嗜性，从而可能为从这一病毒属生成各种不同的载体类别提供了选择。

然而，在基因疗法中采用病毒载体面临的问题之一是病毒颗粒同质性的表征。尽管经典技术(如电子显微术和DNA印迹)可表征病毒颗粒异质性(如AAV异质性和聚集)，但在涉及产生临床级病毒载体制剂时，所述技术并未提供足够的分辨率来量化同质性。强烈推荐对组成性病毒衣壳蛋白(如AAV载体的衣壳蛋白)的完整表征，包括它们的序列和翻译后修饰(PTM)，以确保产品质量和一致性。因此，需要用于确定病毒颗粒的同质性的方法。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种确定病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量的方法，其中所述方法包括：(a)对病毒颗粒的样品进行亲水相互作用液相色谱法(HILIC)，以分离所述病毒颗粒的所述病毒衣壳的所述蛋白质组分；(b)测定所述病毒衣壳的蛋白质组分的质量，以鉴定通过HILIC分离的所述蛋白质组分；以及(c)测定来自所述HILIC分离的所述病毒衣壳的所述蛋白质组分的相对丰度，从而确定病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量。

在另一方面，本发明提供了一种确定病毒颗粒衣壳中的蛋白质的异质性的方法，其中所述方法包括：(a)对所述病毒颗粒进行HILIC以分离所述病毒颗粒衣壳中的蛋白质组分；(b)测定所述蛋白质衣壳的蛋白质组分的质量；以及(c)将所述病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的测定质量与理论质量进行比较，其中所述病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的一种或多种质量与所述理论质量的偏差指示衣壳异质性。

在一些实施方案中，所述病毒颗粒包括腺相关病毒(AAV)颗粒。

在一些实施方案中，所述病毒衣壳的蛋白质组分包括所述AAV颗粒的VP1、VP2和VP3。

在一些实施方案中，所述异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短的衣壳或修饰的衣壳中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAV11衣壳、AAV 12衣壳或它们的变体。

在一些实施方案中，将VP1、VP2和VP3的质量与AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAV11衣壳、AAV 12衣壳或它们的变体中的一者或多者的理论质量进行比较。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含AAV1反向末端重复序列(ITR)、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV 12ITR。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒具有被选择用于转导受试者的肝脏细胞的衣壳血清型。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含编码异源转基因的AAV载体。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒具有衣壳血清型AAV7、AAV8或AAV9。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒具有衣壳血清型AAV9。

在一些实施方案中，所述AAV颗粒具有衣壳血清型AAV9，并且是与抗CD63抗体连接的编码溶酶体α葡糖苷酶(GAA)的病毒载体。

在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含编码异源转基因的病毒载体。

在一些实施方案中，所述病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒科：腺病毒科、细小病毒科、逆转录病毒科、杆状病毒科和疱疹病毒科。

在一些实施方案中，所述病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒属：富AT腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短浓核病毒属(Brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(Hepandensovirus)、重复浓核病毒属(Iteradensovirus)、无脊椎对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)、水貂阿留申细小病毒属(Amdoparvovirus)、禽细小病毒属(Aveparvovirus)、博卡细小病毒属(Bocaparvovirus)、Copiparvovirus、依赖细小病毒属(Dependoparvovirus)、嗜红细胞细小病毒属(Erythroparvovirus)、原细小病毒属(Protoparvovirus)、Tetraparvovirus、α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)、慢病毒属(Lentivirus)、泡沫病毒属(Spumavirus)、α杆状病毒属(Alphabaculovirus)、β杆状病毒属(Betabaculovirus)、δ杆状病毒属(Deltabaculovirus)、γ杆状病毒属(Gammabaculovirus)、传喉炎病毒属(Iltovirus)、马立克病毒属(Mardivirus)、单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)、水痘病毒属(Varicellovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)、长鼻动物病毒属(Proboscivirus)、玫瑰疱疹病毒属(Roseolovirus)、淋巴滤泡病毒属(Lymphocryptovirus)、玛卡病毒属(Macavirus)、马疱疹病毒属(Percavirus)和蛛猴疱疹病毒属(Rhadinovirus)。

在一些实施方案中，逆转录病毒科是莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德病毒(Friend virus)、鼠干细胞病毒(MSCV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人T细胞白血病病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus)、山羊关节炎-脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或猿免疫缺陷病毒(SIV)。

在一些实施方案中，所述HILIC使用包含水中的三氟乙酸的流动相A。

在一些实施方案中，所述流动相A包含约0.1％的三氟乙酸。

在一些实施方案中，所述色谱法包括包含乙腈中的三氟乙酸的流动相B。

在一些实施方案中，所述流动相B包含约0.1％的三氟乙酸。

在一些实施方案中，所述色谱法中流动相A的比例随时间推移增加。

在一些实施方案中，所述流动相A在约45分钟内从约15％增加至约100％。

附图说明

图1是庞贝病的可能治疗方案的示意性模型，所述治疗方案包括使用腺相关病毒(AAV)作为基因疗法的载体。

图2A是AAV病毒衣壳的模型。

图2B是来自AAV血清型的病毒衣壳蛋白及其近似质量的示意性图示。

图3A是来自AAV颗粒的AAV衣壳蛋白的反相TIC分离的UV迹线，其示出单独蛋白质的较差分辨率。

图3B是几种现有技术分离方法的比较，其显示较差分辨率和/或较差定量。

图4是来自AAV颗粒的AAV衣壳蛋白的亲水相互作用液相色谱法(HILIC)分离的UV迹线，其示出单独蛋白质的高分辨率和单独蛋白质的相对丰度的测定。

图5A-5D是来自AAV颗粒的AAV衣壳蛋白的质谱。

图6示出AAV9病毒颗粒的HILIC-UV分析的两条迹线以及它们的化学计量确定。

具体实施方式

在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可变化。还应了解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且并不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。任何实施方案或实施方案的特征可彼此组合，并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文中所用，术语“约”在用于提及特定引述的数值时，是指所述值可从所引述值变化不大于1％。例如，如本文中所用，表述“约100”包括99和101以及介于之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均以引用的方式整体并入本文。

本文中使用的缩写

MS/MS：串联质谱

MS：质谱

ITR：反向末端重复序列

rAAV载体：重组AAV载体

HILIC：亲水相互作用液相色谱法

GAA：溶酶体α葡糖苷酶

mAb：单克隆抗体

IgG：免疫球蛋白G

LC：轻链

HC：重链

AAV：腺相关病毒

PTM：翻译后修饰

ERT：酶替代疗法

定义

“腺相关病毒”或“AAV”：AAV是具有单链DNA、大约4.7kb的基因组、未包膜的非病原性细小病毒，并且具有二十面体构象。AAV最早于1965年被发现为腺病毒制剂的污染物。AAV属于依赖病毒属和细小病毒科，需要来自疱疹病毒或腺病毒的辅助功能进行复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV可通过整合到位于19q13.4位置的人19号染色体中来建立潜伏期。AAV基因组由两个开放阅读框(ORF)组成，对于两种AAV基因Rep和Cap中的每一者一个开放阅读框。AAV DNA末端具有145-bp的反向末端重复序列(ITR)，并且125个末端碱基是回文的，从而产生特征性的T形发夹结构。

Rep基因从启动子p5和p19转录为四种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，所述Rep蛋白在病毒的生命周期中具有重要作用。蛋白Rep78和Rep68由从启动子p5转录的mRNA编码。这些蛋白质对于病毒DNA复制、转录和对位点特异性整合的控制至关重要。两种较小的蛋白Rep52和Rep40由从启动子p19转录的mRNA产生。这些蛋白质参与用于包装和病毒整合的单链病毒基因组的形成。Cap基因编码三种病毒衣壳蛋白：VP1(735个氨基酸，约90kDa)、VP2(598个氨基酸，约72kDa)和VP3(533个氨基酸，约60kDa)，所述三种病毒衣壳蛋白形成比例为1:1:10的60个亚基的病毒衣壳(参见图2A和2B)。所述三种衣壳蛋白由从启动子p40转录的mRNA翻译。

如本文所用，术语“抗体”意指包含四个多肽链，即通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链(即，“全抗体分子”)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(“HCVR”或“V

术语抗体还涵盖“双特异性抗体”，所述双特异性抗体包括可结合至多于一种不同表位的异四聚体免疫球蛋白。包含单一重链和单一轻链以及六个CDR的双特异性抗体的一半结合至一种抗原或表位，并且所述抗体的另一半结合至不同的抗原或表位。在一些情况下，所述双特异性抗体可结合同一抗原，但结合在不同的表位或非重叠表位处。在一些情况下，双特异性抗体的两半具有相同的轻链，同时保留双重特异性。双特异性抗体总体描述于美国专利申请公布号2010/0331527(2010年12月30日)中。

术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”(或“抗体片段”)是指保留特异性地结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 241:544-546)；(vi)分离的CDR；以及(vii)scFv，其由通过合成接头连接以形成单一蛋白链的Fv片段的两个结构域VL和VH组成，其中所述VL和VH区配对以形成单价分子。术语“抗体”还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体(参见例如，Holliger等人(1993)90 PNAS U.S.A.6444-6448；和Poljak等人(1994)2Structure1121-1123)。

此外，可使用本领域公知的标准重组DNA技术获得抗体及其抗原结合片段(参见Sambrook等人，1989)。

术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)，例如在CDR中并且尤其在CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意图包括来源于另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的CDR序列移植至人FR序列上的mAb。所述术语包括在非人类哺乳动物中或非人类哺乳动物的细胞中重组产生的抗体。所述术语不意图包括从人受试者中分离或在人受试者中产生的抗体。

术语“对应”是指示位置、目的或结构的相似的相对术语。由于特定肽或蛋白质引起的质谱信号也称为对应于所述肽或蛋白质的信号。在某些实施方案中，可将特定肽序列或一组氨基酸(如蛋白质)分配给相应的肽质量。

如本文所用，术语“分离的”是指已经与生物体细胞中的其他生物组分基本分离、除了生物体细胞中的其他生物组分以外产生或从生物体细胞中的其他生物组分纯化出来的生物组分(如核酸、肽、蛋白质、脂质、病毒颗粒或代谢物)，所述组分天然地存在于所述生物体细胞中或是转基因表达的。

“质谱法”是以下方法：其中通过从样品产生气相离子来分析样品，所述气相离子然后根据它们的质荷比(m/z)进行分离并检测。从样品产生气相离子的方法包括电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、表面增强激光解吸电离(SELDI)、化学电离以及电子轰击电离(EI)。可使用任何类型的质量分析仪来完成根据离子的m/z比分离离子，所述质量分析仪包括四极质量分析仪(Q)、飞行时间(TOF)质量分析仪、扇形磁场质量分析仪、3D和线性离子阱(IT)、轨道阱质量分析仪、傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)分析仪以及它们的组合(例如，四极飞行时间分析仪或Q-TOF分析仪)。在分离之前，可对样品进行一维或多维色谱分离，例如HILIC。

串联质谱或MS/MS是将选定离子(前体离子)分解成碎片(产物离子)的技术。碎片然后揭示前体离子的化学结构的各个方面。在串联质谱法中，一旦样品被电离(例如通过ESI、MALDI、EI等)以产生离子的混合物，就选择特定质荷比(m/z)的前体离子(例如来自消化物的肽)(MS1)，然后破碎(MS2)以产生用于检测的产物离子。典型的串联MS仪器包括QqQ、QTOF和混合离子阱/FTMS等。串联质谱应用的一个实例是蛋白质鉴定。第一质量分析仪分离特定m/z值的离子，所述离子代表在引入离子源、然后从离子源中出现的许多肽中的单一种类的肽。然后将那些离子加速到含有惰性气体(如氩气)的碰撞池中，以诱导离子碎裂。这一过程被称为碰撞诱导解离(CID)或碰撞激活解离(CAD)。然后在第二质量分析仪中测量碎片离子的m/z值以获得氨基酸序列信息。根据本文公开的方法，串联质谱法可用于鉴定肽的序列，并因此鉴定全长或部分长度的蛋白质。前体离子可以许多不同的方式被激活(伴随增加内能)。碎裂模式取决于能量如何转移至前体离子、转移的能量的量以及转移的能量在内部如何分布。碰撞诱导解离和红外多光子解离是“缓慢加热”技术，所述技术提高离子的波尔兹曼温度，并且因此优先裂解最弱的键。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换地指通过肽键或肽键模拟物连接的氨基酸和/或氨基酸类似物的聚合物。二十种天然存在的氨基酸及其单字母和三字母名称如下：丙氨酸A Ala；半胱氨酸C Cys；天冬氨酸D Asp；谷氨酸E Glu；苯丙氨酸F Phe；甘氨酸G Gly；组氨酸H His；异亮氨酸I He；赖氨酸K Lys；亮氨酸L Leu；甲硫氨酸M Met；天冬酰胺N Asn；脯氨酸P Pro；谷氨酰胺Q Gln；精氨酸R Arg；丝氨酸S Ser；苏氨酸T Thr；缬氨酸V Val；色氨酸w Trp；和酪氨酸Y Tyr。

提及氨基酸的质量是指在给定同位素丰度(如天然丰度)下氨基酸的单一同位素质量或平均质量。在一些实例中，氨基酸的质量可例如通过用同位素标记氨基酸而偏斜。基于氨基酸的确切同位素组成，对于单独单一氨基酸预期氨基酸平均质量附近的一定程度的可变性。包括氨基酸的单一同位素质量和平均质量的质量可由本领域普通技术人员之一容易地获得。

类似地，提及肽或蛋白质的质量是指给定同位素丰度(如天然丰度)下肽或蛋白质的单一同位素质量或平均质量。在一些实例中，肽的质量可例如通过用同位素标记肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸而偏斜。基于肽的确切同位素组成，对于单独单一肽预期肽平均质量附近的一定程度的可变性。特定肽的质量可由本领域普通技术人员确定。

如本文所用，“载体”是指包含待在体外或体内递送至宿主细胞中的核酸的重组质粒或病毒。

如本文中所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。

或者，核酸的主链可包含合成亚基的聚合物如氨基磷酸酯，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，可通过合成互补链并在适当的条件下使所述链退火、或者通过使用DNA聚合酶与适当的引物从头合成互补链来从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链核酸。

“重组病毒载体”是指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。

“重组AAV载体(rAAV载体)”是指包含一个或多个异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述一个或多个异源序列可侧接至少一个(例如两个)AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已用合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，此类rAAV载体可复制并包装成感染性病毒颗粒。

“病毒颗粒”是指由至少一种病毒衣壳蛋白和包封的病毒基因组组成的病毒颗粒。

“异源的”意指源自基因型不同于相比较或引入或合并至其中的实体的其余部分的实体。例如，通过遗传工程化技术引入不同细胞类型中的核酸为异源核酸(并且当被表达时可编码异源多肽)。类似地，合并至病毒载体中的细胞序列(例如基因或其部分)相对于所述载体为异源核苷酸序列。

“反向末端重复”或“ITR”序列是在处于相反取向的病毒基因组末端发现的相对较短的序列。“AAV反向末端重复(ITR)”序列是大约145个核苷酸的序列，所述序列存在于单链AAV基因组的两个末端。

术语“亲水相互作用色谱法”或HILIC意图包括使用亲水性固定相和疏水性有机流动相的方法，其中亲水性化合物的保留时间比疏水性化合物更长。在某些实施方案中，所述方法利用水混溶性溶剂流动相。

如本文所用，术语“样品”是指至少包含病毒颗粒(如AAV颗粒)的分子混合物，所述病毒颗粒根据本发明方法进行操作，包括例如分离、分析、萃取、浓缩或谱分析。

如本文所用，术语“色谱表面”包括暴露于样品或分析物的表面。色谱表面可进行化学修饰、功能化或活化，或者具有微观结构，例如孔。在某些实施方案中，色谱表面可以是疏水性的、亲水性的(极性的)或离子的。在其他实施方案中，色谱表面是完全多孔的、表面多孔的或无孔的。

如本文所用，术语“色谱核心”包括色谱材料，包括但不限于呈颗粒、整料或另一种合适结构形式的有机材料(如二氧化硅)，其形成本发明的材料的内部部分。在某些方面，如本文所定义，色谱核心的表面代表色谱表面，或代表被色谱表面包裹的材料。色谱表面材料可以使得离散或明显迁移可辨别的方式设置在色谱核心上、与色谱核心键合或退火，或者可以与色谱核心的表面掺混、从而产生材料的分级且没有离散的内部核心表面的方式结合至色谱核心。在某些方面，色谱表面材料可与色谱核心的材料相同或不同，并且可表现出与色谱核心不同的物理或物理化学性质，包括但不限于孔体积、表面积、平均孔直径、碳含量或水解pH稳定性。

如本文所用，术语“亲水性的”描述对水具有亲和力、吸引水、吸附水或吸收水。

如本文所用，术语“疏水性的”描述对水缺乏亲和力、排斥水或不能吸附或吸收水。

如本文所用，“色谱法”是指分离混合物，例如含有病毒衣壳蛋白的混合物的过程。它涉及使混合物通过固定相，所述固定相使目标分子与混合物中的其他分子分离，并允许分离一种或多种目标分子。色谱分离方法的一个实例是亲水相互作用液相色谱法(HILIC)。

如本文所用，“接触”包括将溶液或固相中的至少两种物质聚集在一起，例如使色谱材料的固定相与样品(如包含病毒颗粒的样品)接触。

总体说明

庞贝病是由编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)的GAA基因中的突变引起的常染色体隐性溶酶体贮积症，所述酶是负责糖原水解为葡萄糖的溶酶体酶。GAA的缺乏导致溶酶体中的糖原累积以及心肌、骨骼肌和平滑肌以及中枢神经系统中的随后细胞功能障碍。庞贝病可在生命早期以婴儿发作性庞贝病(IOPD)出现，或稍后在儿童期至成年期以迟发性庞贝病(LOPD)出现。呼吸衰竭是两种类型的庞贝病的主要死亡原因。

当前，唯一食品和药品管理局批准的庞贝病治疗是酶替代疗法(ERT)。然而，全身施用的GAA不能穿越血脑屏障，并且因此不能治疗CNS病理和受影响的呼吸运动神经元。此外，ERT只能部分地纠正由于肌纤维中摄入低而引起的骨骼肌异常。因此，三分之二的IOPD患者最终需要呼吸机支持，并且呼吸功能不全在LOPD患者之中持续存在。

使用腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法是庞贝病的理想选择，因为它是单基因遗传病症。正在研究的策略之一是酶替代与连接抗体的组合。在一个实例中，正在开发经由基因疗法从肝脏高表达抗CD63::GAA以克服在没有内源性酶的患者中观察到的对替代酶的免疫应答(参见图1)。与所有病毒载体系统一样，重要的是确保治疗组合物含有正确量的正确形成的病毒颗粒。因此，确定病毒颗粒的化学计量和蛋白质组成非常重要。

本公开的方面涉及确定病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量的方法。在实施方案中，所述方法包括对病毒颗粒的样品进行亲水相互作用液相色谱法(HILIC)，以分离所述病毒颗粒(如需要有关衣壳的信息的目标病毒颗粒)的病毒衣壳的蛋白质组分。在实施方案中，使HILIC柱与含有病毒颗粒的样品接触。在某些实施方案中，所述方法包括测定病毒衣壳的蛋白质组分的质量，以鉴定通过HILIC、例如使用质谱技术(如本文所述的那些)分离的蛋白质组分。在实施方案中，所述方法包括计算来自所述HILIC分离的病毒衣壳的蛋白质组分的相对丰度，以例如在病毒衣壳的蛋白质组分从HILIC柱洗脱时使用所述蛋白质组分的紫外线(UV)检测来确定病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量。例如，UV峰的面积可用于确定衣壳蛋白的相对丰度，并用于计算病毒衣壳中的衣壳蛋白的化学计量(参见图4)。在另一个实例中，峰高和/或峰值UV强度用于确定相对丰度。在一些实施方案中，根据所使用的流动相确定不同蛋白质在HILIC柱上的保留时间，并且在随后的分析中，这一保留时间可用于确定蛋白质和来自病毒颗粒的蛋白质的相对丰度，而无需在每次进行化学计量的确定时确定蛋白质的质量和/或身份，例如可开发一个或多个标准值。在本公开之前，使用常规色谱技术很难分辨不同的衣壳蛋白(参见图3A和3B)。使用本文针对HILIC论述的样品条件，实现了AAV病毒颗粒的良好分离。此外，使用HILIC柱消除了对变性步骤的任何要求。在某些实施方案中，所述方法用于确定病毒颗粒的血清型。例如，每种AAV血清型的VP 1、VP2和VP3的质量是唯一的，并且可用于鉴定或区分AAV衣壳血清型。此外，可对分离的衣壳蛋白进行下游分析，如确定蛋白质序列和衣壳蛋白的翻译后修饰，例如在完整蛋白水平上进行精确质量测量。

本公开的方面涉及确定病毒颗粒的衣壳中的蛋白质组分的异质性的方法。在实施方案中，所述方法包括对所述病毒颗粒进行HILIC以分离病毒颗粒衣壳的蛋白质组分。在实施方案中，所述方法包括测定蛋白质衣壳的蛋白质组分的质量。在一些情况下，将病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的质量与病毒颗粒衣壳的理论质量进行比较。病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的一种或多种质量的偏差指示衣壳的一种或多种蛋白质是异质的(参见图5A)。相反，没有偏差将指示衣壳的蛋白质是同质的(参见图5B-5D)。在实施方案中，异质性是由于混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短的衣壳或修饰的衣壳中的一种或多种。在一些实施方案中，病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量的确定和病毒颗粒的衣壳中的蛋白组分的异质性的确定是在同一样品上进行的，例如是单次测试。

在某些实施方案中，病毒颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒，并且所公开的方法可用于确定AAV颗粒的衣壳中的蛋白质组分的化学计量和/或AAV颗粒的衣壳中的蛋白质组分的异质性。在实施方案中，蛋白衣壳的蛋白质组分包含AAV颗粒的VP1、VP2和VP3。在实施方案中，AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。在实施方案中，AAV颗粒包含编码异源转基因的AAV载体。在一些实施方案中，可将本公开的测定质量或计算质量(例如，AAV颗粒的VP1、VP2和/或VP3的测定质量或计算质量)与参考(例如一种或多种AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3的理论质量)进行比较(例如，参见图2A和2B)。参考可包括任何AAV血清型中的一者或多者的VP1、VP2和/或VP3的理论质量。例如，在一些实施方案中，将VP1、VP2和VP3的质量与AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV 10衣壳、AAV 11衣壳、AAV 12衣壳或它们的变体中的一者或多者的理论质量进行比较。在一些实施方案中，可将测定质量或计算质量(例如，AAV颗粒的VP1、VP2和/或VP3的测定质量或计算质量)与相应AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3的理论质量进行比较。

在一些实施方案中，本公开的方法可包括确定AAV颗粒的蛋白质的异质性。在一些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3的一种或多种质量(例如与参考质量，如理论质量、预测质量或预期质量)的偏差指示AAV衣壳蛋白异质性。在一些实施方案中，异质性可包括但不限于以下中的一种或多种：混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短的衣壳或修饰的衣壳。

在一些实施方案中，确定AAV颗粒的异质性的方法可包括对变性的AAV颗粒进行LC/MS(例如，如本文所述)，测定所述AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的质量，并将这些质量与AAV血清型的VP1、VP2和VP3的理论质量进行比较；以及对VP1、VP2和/或VP3的片段进行LC/MS/MS，测定所述AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的片段的质量，并将这些质量与AAV血清型的VP1、VP2和VP3的理论质量进行比较(VP1、VP2或VP3的一种或多种质量的偏差指示AAV衣壳异质性)。

在实施方案中，AAV颗粒包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳或它们的变体。

在实施方案中，将VP1、VP2和VP3的质量与AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAV11衣壳、AAV 12衣壳或它们的变体中的一者或多者的理论质量进行比较。

在实施方案中，AAV颗粒包含AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV 10ITR、AAV11 ITR或AAV12ITR。

在实施方案中，AAV颗粒具有被选择用于转导受试者的肝脏细胞的衣壳血清型。在实施方案中，AAV颗粒具有对于受试者的肝脏细胞的转导具有选择性的衣壳血清型AAV7、AAV8或AAV9。

在一些实施方案中，AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒包含编码异源转基因的AAV载体。在一些实施方案中，AAV颗粒具有衣壳血清型AAV7、AAV8或AAV9。在一些实施方案中，AAV颗粒具有衣壳血清型AAV9。在一些实施方案中，AAV颗粒具有衣壳血清型AAV9，并且是编码溶酶体α葡糖苷酶(GAA)的病毒载体，所述病毒载体与对由肌细胞表达的抗原具有特异性的抗体(例如抗CD63抗体)连接。

尽管AAV是本公开的模型病毒颗粒，但是考虑，所公开的方法可应用于对多种病毒(例如病毒科、亚科和属)进行谱分析。本公开的方法可用于例如对VP进行谱分析以监测VP表达、翻译后修饰和截短并确保VLP产生过程中的产物一致性，以确认用于衣壳蛋白工程化应用的定点诱变或结构表征，和/或监测或检测病毒颗粒或制剂的异质性。

在实施方案中，病毒载体编码异源转基因。

在实施方案中，病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒科：腺病毒科、细小病毒科、逆转录病毒科、杆状病毒科和疱疹病毒科。

在实施方案中，所述病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒属：富AT腺病毒属、禽腺病毒属、美洲白鲟腺病毒属、哺乳动物腺病毒属、唾液酸酶腺病毒属、双义浓核病毒属、短浓核病毒属、肝胰浓核病毒属、重复浓核病毒属、无脊椎无脊椎对虾浓核病毒属、水貂阿留申细小病毒属、禽细小病毒属、博卡细小病毒属、Copiparvovirus、依赖细小病毒属、嗜红细胞细小病毒属、原细小病毒属、Tetraparvovirus、α逆转录病毒属、β逆转录病毒属、δ逆转录病毒属、ε逆转录病毒属、γ逆转录病毒属、慢病毒属、泡沫病毒属、α杆状病毒属、β杆状病毒属、δ杆状病毒属、γ杆状病毒属、传喉炎病毒属、马立克病毒属、单纯疱疹病毒属、水痘病毒属、巨细胞病毒属、鼠巨细胞病毒属、长鼻动物病毒属、玫瑰疱疹病毒属、淋巴滤泡病毒属、玛卡病毒属、马疱疹病毒属和蛛猴疱疹病毒属。

在实施方案中，所述逆转录病毒科是莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人T细胞白血病病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)、维斯纳-梅迪病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或猿免疫缺陷病毒(SIV)。

亲水相互作用色谱法(HILIC)是NP-HPLC的变型，其可使用部分水性流动相进行，从而允许肽、碳水化合物、核酸和许多蛋白质的正相分离。HILIC的洗脱顺序是极性最小到极性最大，这与反相HPLC中的洗脱顺序相反。

HILIC基于分析物与固定相(例如，底物)之间的极性相互作用来分离分析物。极性分析物与极性固定相缔合并由所述极性固定相保留。吸附强度随着分析物极性的增加而增加，并且极性分析物与极性固定相(相对于流动相)之间的相互作用使洗脱时间增加。在流动相中使用更多极性溶剂将减少分析物的保留时间，而更多的疏水性溶剂倾向于增加保留时间。

各种类型的底物可用于HILIC(例如用于柱色谱法)，包括二氧化硅、氨基、酰胺、纤维素、环糊精和聚苯乙烯底物。有用的底物的实例，例如可用于柱色谱法中的底物包括：聚磺基乙基天冬酰胺(例如，来自PolyLC)；磺基甜菜碱底物，例如

在某些实施方案中，衣壳蛋白在HILIC柱上分离，且随后例如使用流动相梯度从HILIC柱洗脱以解析单独衣壳蛋白，从而纯化和或分离所述样品中的衣壳蛋白。在某些实例中，来自HILIC柱的洗脱的衣壳蛋白被分离成一个或多个级分。此类级分可用于后续分析，如MS分析。在某些实施方案中，所述方法包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的衣壳蛋白。

所用的流动相可包括有或没有离子配对剂(例如，乙腈和水)的缓冲液。离子配对剂包括甲酸酯、乙酸酯、TFA和盐。可使用缓冲液的梯度，例如，如果使用两种缓冲液，则在色谱运行过程中，在第二缓冲液的浓度或百分比增加时，第一缓冲液的浓度或百分比可降低。例如，在色谱运行过程中第一缓冲液的百分比可从约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％降低至约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％。作为另一个实例，在同一运行过程中第二缓冲液的百分比可从约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％增加至约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％。在一些实施方案中，色谱法中流动相A的比例随时间推移增加。任选地，在色谱运行结束时，第一缓冲液和第二缓冲液的浓度或百分比可返回其起始值。作为一个实例，第一缓冲液的百分比可在五个步骤中从85％到63％到59％到10％到85％变化；而在相同步骤中第二缓冲液的百分比从15％到37％到41％到90％到15％变化。百分比可作为线性梯度或以非线性(例如，逐步的)方式逐渐改变。例如，梯度可以是多相的，例如，双相的、三相的等。在优选的实施方案中，本文所述的方法使用减少的乙腈缓冲液梯度，其对应于在不使用离子配对剂的情况下增加流动相的极性。在实施方案中，所述HILIC使用包含水中的三氟乙酸的流动相A。在实施方案中，所述流动相A包含约0.1％的三氟乙酸。在实施方案中，所述色谱法包括包含乙腈中的三氟乙酸的流动相B。在实施方案中，所述流动相B包含约0.1％的三氟乙酸。

可在整个色谱运行中将柱温度保持在恒定温度，例如使用市售柱加热器。在一些实施方案中，将柱保持在介于约50℃至约70℃之间的温度，例如约50℃至约60℃、约55℃至约60℃，例如约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃。在一个实施方案中，温度是约60℃。

流动相的流速可介于约0至约100ml/min之间。对于分析目的，流速通常在0至10ml/min的范围内，对于制备型HPLC，可使用超过100ml/min的流速。例如，流速可以是约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5ml/min。替换具有相同填充量、相同长度但较小直径的色谱柱需要降低流速，以维持如在较大直径的色谱柱情况下观察到的相同保留时间和峰分辨率。优选地，在4.6×100mm，5μm柱中使用约1ml/min的流速。

运行时间可介于约15至约240分钟之间，例如，约20至约70分钟、约30至约60分钟、约40至约90分钟、约50分钟至约100分钟、约60至约120分钟、约50至80分钟。在一些实施方案中，所述流动相A在约45分钟内从约15％增加至约100％。

在一些实施方案中，所述方法包括对病毒颗粒进行液相色谱/质谱法(LC/MS)。如本领域中已知的，LC/MS利用液相色谱法进行离子的物理分离，并利用质谱法从所述离子生成质谱数据。这样的质谱数据可用于确定例如分子量或结构，通过质量、数量、纯度等鉴定颗粒。这些数据可代表所检测到的离子的性质，如随时间(例如，保留时间)推移的信号强度(例如，丰度)，或随质荷比变化的相对丰度。

在一些实施方案中，质谱法(例如，如本文所述用于LC/MS中)可指电喷雾电离质谱法(ESI-MS)。ESI-MS是本领域中已知的技术，所述技术使用电能来分析使用质谱法从溶液中衍生的离子(例如，参见Yamashita,M.和Fenn,J.B.(1984).Phys.Chem.88:4451-4459)。将离子物质(或在溶液中或在气相中离子化的中性物质)通过分散在带电液滴的气溶胶中、然后进行溶剂蒸发来从溶液转移至气相，所述溶剂蒸发减小带电液滴的大小和在溶液通过相对于地面(例如，周围室的壁)具有电压的小毛细管时来自带电液滴的样品离子喷射。通过将样品与挥发性酸和有机溶剂混合并通过带有高电压的导电针注入样品来进行ESI。从针头端喷出(或喷射)的带电液滴直接进入质谱仪，并在所述液滴飞入时通过加热和真空使其干燥。在液滴干燥后，剩余的带电分子被电磁透镜引导至质量检测器中并进行质量分析。在一个实施方案中，洗脱的样品直接从毛细管沉积到电喷雾喷嘴中，例如，毛细管充当样品负载器。在另一个实施方案中，毛细管本身充当萃取装置和电喷雾嘴两者。

对于MALDI，将分析物分子(例如蛋白质)沉积在金属靶上，并与有机基质共结晶。将样品干燥并插入质谱仪中，并且通常经由飞行时间(TOF)检测进行分析。在一个实施方案中，将洗脱的样品直接从毛细管沉积到金属靶上，例如毛细管本身充当样品负载器。在一个实施方案中，将萃取的分析物沉积在MALDI靶上，添加MALDI电离基质，并且将样品电离并例如通过TOF检测进行分析。

在一些实施方案中，使用其他电离模式，例如ESI-MS、涡轮喷雾电离质谱、纳米喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。一般来说，这些方法的优点是它们允许“即时”纯化样品并直接引入电离环境。重要的是要注意，各种电离和检测模式对所使用的解吸溶液的性质引入它们自己的约束，并且重要的是解吸溶液必须与两者相容。例如，在许多应用中，样品基质必须具有较低的离子强度，或存在于特定pH范围内，等等。在ESI中，样品中的盐可通过降低电离或堵塞喷嘴而阻止检测。通过以低盐形式提供分析物和/或通过使用挥发性盐可解决这一问题。对于MALDI，分析物应在与在靶标上点样和所用的电离基质相容的溶剂中。

在一些实施方案中，所述方法包括对本公开的病毒颗粒或对本公开的变性病毒颗粒的消化碎片进行液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS)。如本领域中已知的，LC/MS/MS(术语“液相色谱-串联质谱法”在本文中可互换使用)利用液相色谱法进行离子的物理分离，并使用质谱法从离子生成质谱数据，其中质谱法使用多级质量(例如，m/z)分离，通常通过碎裂步骤进行分离。例如，可在第一轮MS中分离出一定m/z范围内的目标离子，使其碎裂，然后在第二轮MS中基于单独m/z进一步分离。离子碎裂可包括但不限于诸如碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞解离(HCD)、电子捕获解离(ECD)或电子转移解离(ETD)的技术。

现有技术中已知多种适用于LC/MS和/或LC/MS/MS的质量分析仪，包括但不限于飞行时间(TOF)分析仪、四极质量过滤器、四极TOF(QTOF)和离子阱(例如，基于傅立叶变换的质谱仪或轨道阱(Orbitrap))。在轨道阱中，接地电位的桶状外部电极和纺锤状中心电极用于在沿着中心轴振荡的情况下将离子捕获在围绕中心电极椭圆形旋转的轨迹中，受离心力和静电力的平衡限制。此类仪器的使用采用傅立叶变换操作，以将来自图像电流检测的时域信号(例如，频率)转换为高分辨率质量测量(例如，纳米LC/MS/MS)。进一步的描述和细节可在例如Scheltema,R.A.等人(2014)Mol.Cell Proteomics 13:3698-3708；Perry,R.H.等人(2008)Mass.Spectrom.Rev.27:661-699；以及Scigelova,M.等人(2011)Mo/.CellProteomics 10:M11 1.009431中找到。

在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白的质量可例如基于LC/MS和/或LC/MS/MS数据来确定。在一些实施方案中，可例如基于LC/MS和/或LC/MS/MS数据确定AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的质量，或AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的片段的质量。从MS数据确定蛋白质质量和/或身份的多种方法是本领域已知的。例如，肽质量指纹图谱可用于基于MS数据确定蛋白质序列，或者可基于与一种或多种组成肽有关的MS/MS数据来鉴定蛋白质。当使用串联MS时，产物离子扫描可用于分析与一种或多种目标蛋白肽有关的m/z数据。然后可使用本领域已知的软件，例如，以将鉴定的峰与参考峰或已知峰匹配，以将峰分组为同位素异位体包膜，等等。可将肽质量值与已知肽序列的数据库进行比较。例如，Mascot可用于使观察到的肽与理论数据库肽匹配，例如，由将特定消化模式应用于计算机蛋白质数据库而产生。其他合适的软件可包括但不限于Proteome Discoverer、ProteinProspector、X！Tandem、Pepfinder、Bonics或MassLynx

在一些实施方案中，异源核酸可操作地连接至启动子。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、甲状腺素运载蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等人,Gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子(Kim等人,Gene,1990,91(2):217-23和Guo等人,Gene Ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，启动子包含与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子连接的人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或巨细胞病毒增强子。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。在一些实施方案中，本发明提供了重组载体，所述重组载体包含与CBA启动子可操作地连接的编码本公开的异源转基因的核酸。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、13-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFla启动子。

诱导型启动子允许调控基因表达，并且可受外源提供的化合物、环境因素如温度、或特定生理状态例如急性期的存在、细胞的特定分化状态调控或仅在复制细胞中调控。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已进行了描述了并且可由本领域技术人员容易地选择。受外源提供的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素阻抑系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，还参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导型系统(Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997))以及雷帕霉素诱导型系统(Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态)调控或仅在复制细胞中调控的那些。

在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子或其片段。当期望转基因的表达应模拟天然表达时，可使用天然启动子。当必须在时间上或发育上或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激调控转基因的表达时，可使用天然启动子。在另一实施方案中，其他天然表达控制元件如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。

在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域众所周知的。

在一些实施方案中，载体包含内含子。例如，在一些实施方案中，内含子是源自鸡β-肌动蛋白和兔β-球蛋白的嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子是小鼠微小病毒(MVM)内含子。

在一些实施方案中，载体包含聚腺苷酸化(polyA)序列。聚腺苷酸化序列的许多实例在本领域中是已知的，如牛生长激素(BGH)Poly(A)序列(参见，例如登录号EF592533)、SV40聚腺苷酸化序列和HSV TK pA聚腺苷酸化序列。

先前所呈现的实施方案中描述的实例系统、方法和动作是示例性的，并且在可选实施方案中，某些动作可按不同的顺序执行、彼此并行执行、完全省去和/或在不同的示例性实施方案之间组合，和/或某些额外的动作可以被执行，而不脱离各种实施方案的范围和精神。因此，此类替代实施方案被包括在本文描述的实施例中。

虽然在上面已经详细描述了特定的实施方案，但是所述描述仅仅是为了说明的目的。因此应了解，除非另作明确说明，否则上述许多方面不意图作为所需或必要的要素。除了上面描述的那些，对应于示例性实施方案的所公开的方面的部件或动作的修改和等效可由获得本公开的益处的本领域的普通技术人员进行，而不脱离下面的权利要求中定义的实施方案的精神和范围，所述范围被赋予最宽的解释以涵盖此类修改和等效结构。

提供以下实施例以说明某些实施方案的具体特征。然而，以下描述的特定特征不应被视为对本发明范围的限制，而应被视为本领域普通技术人员可从中认识到等效物的实施例。

实施例

提出以下实施例以为本领域普通技术人员提供如何制造并使用本发明的方法的完整公开内容和描述，但不意图限制发明人所认为的发明范围。虽然已尽力确保就所用数字(例如量、温度等)来说的准确性，但仍应考量一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，除非指示否则分子量是重均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力是大气压或接近大气压。

从完整AAV颗粒中分离衣壳蛋白

为了分离完整AAV9病毒颗粒，如下表所述，将1μL的AAV样品注入HILIC柱中。分离的结果在图4中示出。如所示，三种AAV衣壳蛋白显示彼此完全分离。

表1显示用于从完整AAV9衣壳中分离AAV9衣壳蛋白的色谱条件的总结。

表1：色谱条件的总结

与基于RP的分离相比，HILIC柱的独特保留机制在VP分离方面出人意料地更好起作用(参见图4、3A和3B)。

分离的AAV衣壳蛋白的质谱分析

本文所述方法的优点之一是不需要样品制备。将1uL的样品直接注入LC-MS中，并对所得数据进行分析。在Q-Exactive Plus质谱仪上应用以下调谐参数以进行完整质量分析：

图5A-5D示出单独衣壳蛋白的质谱。如图5A所示，VP3中存在蛋白质异质性。

如图6所示，峰高可用于确定完整AAV颗粒的化学计量。

本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些，根据前面的描述和附图，本发明的多种修改对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改意图属于所附权利要求的范围之内。