一株降低生物胺的霍氏糖多孢菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株降低生物胺的霍氏糖多孢菌及其应用，属于食品发酵技术领域。

背景技术

黄酒历史文化悠久，是世界三大发酵酒之一，其风味独特、酒精度低且营养价值高，广受消费者喜爱。黄酒中含有丰富的蛋白质、氨基酸、活性肽、酚类、低聚糖、维生素、矿物质及γ-氨基丁酸，具有抗衰老、降血压、降胆固醇和免疫调节等生理功效。但在黄酒复杂的生产工艺及其开放的发酵体系中含有丰富的微生物，其中一些微生物能够产生氨基酸脱羧酶，氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下脱羧基转化为生物胺，摄入高含量的生物胺会对人体带来不利影响。

生物胺是一种非挥发性的低分子量的含氮有机碱，主要由微生物的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧而生成。生物胺在自然界中可以由微生物、植物和动物代谢产生，其分布广泛，可通过食品摄入体内。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，过量生物胺的摄入则会引起动脉、血管和微血管的扩大，导致腹泻、头痛、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应，甚至会导致死亡。目前，控制食品中生物胺的方法主要有生产工艺优化和选择合适的储藏条件、减少发酵体系中产生物胺的微生物或控制产胺微生物产胺和添加生物胺降解菌株、生物胺降解酶等。其中添加生物胺降解菌株作为一种生物手段，具有高效、安全、环保的优点，被越来越多黄酒企业和消费者所接受。

现有技术中具有降解生物胺作用的菌株种类较少且效果较差。因此，筛选具有高效降解生物胺菌株对于丰富生物胺降解菌株的微生物菌种库，提升发酵食品的品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决现有传统发酵食品和烟草制品中生物胺含量较高的问题，提供性能优良的菌株S.hordei F2004应用于黄酒、卷烟、酱油、鱼露、豆瓣酱、辣椒酱等发酵食品的生产过程进行生物强化，以降低传统发酵食品和烟草制品中的生物胺含量，提升传统发酵食品和烟草制品的品质。

本发明的第一个目的是提供一株具有较强生物胺降解能力的霍氏糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei)F2004，所述霍氏糖多孢菌已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021002。

本发明的霍氏糖多孢菌F2004，具有如下优良的性能：

(1)应用于食品发酵体系，不会影响到食品的正常发酵；

(2)发酵产品中生物胺产生量小于10mg/L，生物胺检出量极少；

(3)对色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺均有降解作用；

(4)可以适用于黄酒、白酒、豆瓣酱、酱油发酵和卷烟生产，并且具有降生物胺的能力。

本发明的第二个目的是提供含有所述霍氏糖多孢菌F2004的发酵剂。

在一种实施方式中，所述发酵剂中霍氏糖多孢菌F2004的含量≥1×10

在一种实施方式中，所述微生物菌剂含有霍氏糖多孢菌F2004菌体的活细胞、冷冻干燥得到的干菌体、固定化的细胞、液体菌剂、固体菌剂，或者以其他任何形式存在的霍氏糖多孢菌F2004菌株。

在一种实施方式中，所述发酵剂还含有其它类型的细菌或真菌。

在一种实施方式中，所述发酵剂还含有酵母或曲霉。

本发明的第三个目的是提供所述霍氏糖多孢菌F2004或其代谢物在发酵领域降低生物胺含量方面的应用。

在一种实施方式中，所述代谢物包括但不限于霍氏糖多孢菌F2004发酵后去除了菌体细胞的上清液。

在一种实施方式中，所述代谢物的制备方法为：将糖多孢菌S.hordei F2004以5×10

在一种实施方式中，所述发酵领域包括制备发酵食品、饮品或调味品。

在一种实施方式中，所述饮品为酒精饮品，包括但不限于黄酒或白酒。

在一种实施方式中，所述调味品包括但不限于酱油或鱼露。

在一种实施方式中，所述应用是将霍氏糖多孢菌F2004加入至酱醪中，于14～16℃发酵一段时间后，加入酒母继续发酵。

在一种实施方式中，所述应用是将霍氏糖多孢菌F2004以5×10

在一种实施方式中，所述应用是将霍氏糖多孢菌F2004加入至种曲中，再用含霍氏糖多孢菌F2004的种曲发酵豆瓣酱。

本发明提供所述霍氏糖多孢菌F2004在降低烟丝中生物胺含量方面的应用。

在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺。

本发明还提供所述霍氏糖多孢菌F2004在制备发酵食品、饮品或烟草方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的菌株应用于食品发酵体系，不会阻碍食品的正常发酵；

(2)本发明的菌株应用于卷烟生产中，不会降低卷烟的糖类物质和蛋白质含量；

(3)霍氏糖多孢菌F2004的生物胺产生量小于10mg/L，生物胺检出量极少，基本不产生生物胺。S.hordei F2004对色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的降解率分别为63.47％、80.86％、79.72％、65.1％、70.92％、47.72％、68.28％、78.21％，对总生物胺的降解率达到69.51％。

(4)该糖多孢菌具有降生物胺效果，将其应用于黄酒发酵中，添加S.hordei F2004发酵的黄酒，比对照组降低了16.01％；将其应用于酱油生产中，添加S.hordei F2004发酵的酱油，比对照组降低了24.98％；将其应用于卷烟发酵中，添加S.hordei F2004发酵的卷烟，比对照组降低了30.27％；将其应用于鱼露发酵中，添加S.hordei F2004发酵的鱼露，比对照组降低了26.29％；将其应用于豆瓣酱发酵中，添加S.hordei F2004发酵的豆瓣酱，比对照组降低了27.79％；将其应用于辣椒酱发酵中，添加S.hordei F2004发酵的辣椒酱，比对照组降低了29.29％。

生物材料保藏

霍氏糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei)F2004，分类学命名为霍氏糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei)F2004，所述霍氏糖多孢菌已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2021002。

附图说明

图1为糖多孢菌S.hordei F2004的菌落形态图。

图2为糖多孢菌S.hordei F2004的系统发育树。

图3为黄酒发酵过程中理化指标的变化；(A)酒精度；(B)还原糖；(C)可滴定酸；(D)氨基酸态氮。

具体实施方式

黄酒理化指标的检测：酒精度、氨基酸态氮和总酸的测定按照GB/T 13662-2018进行测定。还原糖含量测定采用DNS方法。生物胺含量采用高效液相(HPLC)进行检测。

烟丝理化指标的检测：烟丝中总糖和还原糖用索莫季法，总氮采用改良基耶达法。

生物胺含量测定方法：准确量取1mL待测液于15mL离心管中，加入1mL饱和NaHCO

实施例1：霍氏糖多孢菌的筛选及鉴定

(1)样品的采集及预处理

麦曲样品采自浙江省绍兴市某黄酒厂，采集的麦曲置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取5g麦曲于50mL离心管中，添加30mL蒸馏水放入30℃摇床培养箱中培养30min。

(2)菌株的平板筛选

高氏一号固体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2-7.4(25℃)。

取悬浮液梯度稀释10

(3)菌株鉴定

提取筛选菌株的基因组，并对筛选菌株进行16S rDNA扩增测序。

PCR扩增引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGY-TACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR扩增体系(50μL)为：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上下引物各1μL，模板1μL，加无菌水22μL补充至50μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸8min。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并送交基因测序公司测序，根据返回的测序结果(SEQ ID NO.1所示)通过NCBI官网进行BLAST序列比对，用所得的16S rDNA序列进行BLAST比对，并进行了系统发育分析，结果如图2所示，菌株F2004的核苷酸序列与数据库中序列同源性最高的糖多孢菌S.hordei(GenBank序列号：NR_104988.1)的同源相似性达在99％以上。菌株F2004菌落形态为圆形，菌落为淡黄色，菌落凸起、难挑起。菌株F2004的生理生化特征如表1所示，菌株F2004可降解腺嘌呤、酪蛋白、七叶苷、淀粉、酪氨酸等物质，在20℃～60℃下可生长，与Saccharopolyspora hordei特征一致，将上述菌株命名为糖多孢菌S.hordei F2004。

同一批次筛选还获得另一株与之特征类似的糖多孢菌S.hordei F2001，在下述实施例中作为对照菌株。

表1 S.hordei F2004生理生化鉴定部分实验结果

注：-代表阴性结果，+代表阳性结果

(4)菌株生物胺代谢能力的分析

菌种活化：将保藏的糖多孢菌S.hordei F2004接种到高氏一号液体培养基中，接种量5％，30℃摇床培养48h，得一级种子液。将活化的菌株接种到高氏一号液体培养基中，接种量5％，摇床培养48h，转速150r/min，温度30℃，得二级种子液。

样品预处理：将二级种子液接于添加有氨基酸和生物胺的高氏一号液体培养基中，接种量5％，37℃摇床培养5d，12000r/min离心5min收集上清液。

S.hordei F2004的色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺产生量分别为1.32mg/L、1.99mg/L、0.90mg/L、0.00mg/L、0.39mg/L、0.52mg/L、0.91mg/L、0.63mg/L，总生物胺产量小于10mg/L，生物胺检出量极少，基本不产生生物胺。S.hordei F2004对8种生物胺都有较强的降解能力，对色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的降解率分别为63.47％、80.86％、79.72％、65.1％、70.92％、47.72％、68.28％、78.21％，对总生物胺的降解率达到69.51％。按相同方法检测糖多孢菌S.hordei F2001对生物胺的降解能力，结果显示，糖多孢菌S.hordei F2001对色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的降解率分别为1.37％、2.56％、3.29％、0.00％、0.00％、4.59％、7.24％、6.32％。

实施例2：糖多孢菌S.hordei F2004在黄酒发酵中的应用

(1)纯种糖多孢菌麦曲的制备：

破碎小麦为每粒3～5片，使麦粒组织破碎，淀粉外露，加入35～40％的清水，搅拌充分后静置30min，使其充分均匀的吸收水分，后于121℃灭菌30min。灭菌后小麦降温至室温后，接种糖多孢菌菌液，使接种后的菌液浓度为10

(2)不同麦曲用于黄酒发酵：

本实施例所选取的传统黄酒发酵的实验组原料配比如表2所示，对照组将表2中的纯种糖多孢菌麦曲替换为工厂用生麦曲(麦子自然发酵，添加量为11.8％)、工厂用熟麦曲(黄曲霉SU-16纯种麦曲，添加量为1.8％)。

表2原料配比表(实验组)

按照如下方法进行黄酒发酵：

a)酵母活化培养：将甘油保藏管的酵母菌，在无菌操作台进行转接到YPD培养基中，30℃，150r/min条件下培养24h，使酵母菌的数量达10

b)酒母的制作：取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g生麦曲，1.1‰的糖化酶(按酶活单位计，终浓度为3×10

c)按照传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵。前5d为前酵阶段，温度控制在28-30℃，发酵5d，前5d每天开耙不少于1次，头耙时间8-10h；后酵阶段，温度为13-15℃，每天搅拌开耙1次，持续发酵10-15d。

黄酒发酵过程中理化指标的变化：为了进一步验证糖多孢菌在黄酒发酵中的作用，对比了使用传统麦曲和纯种糖多孢菌麦曲所酿造黄酒发酵过程中理化指标(酒精度，还原糖，可滴定酸和氨基酸态氮)的变化。结果如图3所示，使用纯种糖多孢菌麦曲所酿造的黄酒酒精度、还原糖、总酸和氨基酸态氮的含量均符合黄酒国标的标准，说明糖多孢菌S.hordei F2004对黄酒发酵过程中重要理化指标影响不大，发酵正常。

(3)糖多孢菌S.hordei F2004降生物胺效果分析：所得产品用高效液相法检测黄酒中生物胺含量，结果如表3所示，添加S.hordei F2004的样品组相比较对照组降低了16.01％。

表3糖多孢菌与酿酒酵母共酵酿造黄酒生物胺含量

注：ND表示未检测到

实施例3：糖多孢菌S.hordei F2004应用于酱油中降低生物胺含量

(1)豆粕和小麦按1:1比例混匀，蒸熟；

(2)酒母制作：将10

(3)酱醅发酵：按照5‰-10‰的比例向步骤(2)的酒母中加入菌液浓度为10

(4)发酵结束后的将酱醪进行板框压榨，去除酱醅。压榨结束后进行硅藻土过滤和膜过滤，去除沉淀。过滤澄清的酱油经过巴氏灭菌后进行灌装。

对照组将糖多孢菌S.hordei F2004替换为S.hordei F2001，其余步骤保持不变。

对糖多孢菌S.hordei F2004降生物胺效果分析，添加S.hordei F2004的发酵产品中的生物胺含量相较于对照组降低了24.98％。S.hordei F2001在培养基环境下具有降解生物胺的能力，但是在发酵食品中的降解作用微小。

实施例4：糖多孢菌S.hordei F2004应用于卷烟中降低生物胺含量

将糖多孢菌S.hordei F2004发酵液上清液加入至卷烟制作中：以添加无菌水为对照，将糖多孢菌S.hordei F2004以5×10

表4烟丝化学成分

对糖多孢菌S.hordei F2004降生物胺效果分析：添加S.hordei F2004的样品组相比较对照组降低了30.27％。

实施例5：糖多孢菌S.hordei F2004应用于发酵鱼露中降低生物胺含量

鱼露按照以下工艺流程进行生产，即：原料鱼和盐混合(3:1或2:1)→加10000U/g的蛋白酶在60℃下水解12h→接种10

对照组将糖多孢菌S.hordei F2004替换为S.hordei F2001，其余步骤保持不变。

对糖多孢菌S.hordei F2004降生物胺效果分析，添加S.hordei F2004的发酵产品中的生物胺含量相较于对照组降低了26.29％。

实施例6：糖多孢菌S.hordei F2004应用于豆瓣酱中降低生物胺含量

将S.hordei F2004加入至豆瓣酱发酵中：

(1)种曲的制备：将米曲霉菌和S.hordei F2004接种到麦麸培养基上，使接种后的菌浓分别高于10

(2)蚕豆曲的制备：脱壳的干蚕豆瓣，加水浸泡1-2h。将浸泡好的湿蚕豆瓣沥干，放入蒸锅中先蒸30min，后焖10mim后出锅。蒸豆瓣出锅后，在无菌条件下，将其晾干表面水分，与一定比例的灭菌后的面粉和种曲(蚕豆：面粉：种曲比例＝100:10:2)混合均匀。

(3)蚕豆曲与180g/L的盐水按1：1.2的质量比混合，置于密闭容器中发酵30d，每日翻酱1次。

对照组将糖多孢菌S.hordei F2004替换为S.hordei F2001，其余步骤保持不变。

测定豆瓣酱中生物胺含量，添加S.hordei F2004的豆瓣酱产品中的生物胺含量相较于对照组降低了27.79％。

实施例7：糖多孢菌S.hordei F2004应用于辣椒酱中降低生物胺含量

辣椒酱按照以下工艺流程进行生产，即：选取优质辣椒清洗、打浆→加入食盐、糖、生姜、大蒜等配料(食盐、糖、生姜、大蒜的加入量分别为原料重量的12％、5％、1％、15％)→接种植物乳杆菌、糖多孢菌S.hordei F2004(菌体数量之比为1:1，接种量为5％，接种的菌液浓度分别为10

对照组将糖多孢菌S.hordei F2004替换为S.hordei F2001，其余步骤保持不变。

对糖多孢菌S.hordei F2004降生物胺效果分析，添加S.hordei F2004的辣椒酱产品中的生物胺含量相较于对照组降低了29.29％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

江南大学（绍兴）产业技术研究院

浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司

<120> 一株降低生物胺的霍氏糖多孢菌及其应用

<130> BAA201688A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1457

<212> DNA

<213> Saccharopolyspora hordei

<400> 1

tgaacggaaa cggctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgctga agcggtgctt 60

gcaccgtgga tgagtggcga acgggtgagt aacacgtggg taatctgccc tgcactctgg 120

gataagccct ggaaacgggg tctaataccg gatatgacat cgtgccgcat ggtgtggtgt 180

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aaagtcggta acacccgaag cccatggccc aaccggtttt ccggggggag tggtcgaagg 1440

tggactggcg atgaacg 1457