基于sanger测序的SMA检测方法

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，特别是涉及基于sanger测序的SMA检测方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA）又称为“进行性脊肌萎缩症”，是常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，特征为脊髓前角细胞变性，导致对称性肌无力和萎缩。该疾病是最常见的常染色体隐性遗传疾病之一，是导致儿童死亡的最常见遗传原因，在6000–10,000例活产中会发生1例，在亚洲人群中发病率为1：8009，携带率为1：48。

该疾病根据发病年龄的不同可分为，SMA 0型、SMA I型、SMA II型、SMA III型、SMAIV型。SMA 0型，患病婴儿在子宫内活动减少，出生时有严重的肌无力，肌张力低下和呼吸窘迫等症状。SMA I型，在6个月之前发病，平均发病年龄为2.5个月，主要临床表现为近端对称肌肉无力、缺乏运动发育、深层腱反射减弱或缺失以及肌张力差。婴儿可能会有头部控制能力，但很快又消失。SMA II型，发病年龄为6-12个月之间，平均发病年龄为8.3个月，主要临床表现为不能独立站立或行走、手部震颤，深肌腱反射减弱至消失。SMA III型（也称为Kugelberg-Welander病），发病年龄在18个月以后，患者可以独立行走，但多数人会逐渐丧失这种能力，该类型患者心脏和认知功能通常正常。SMA IV型，通常在生命的第二个或第三个十年出现肌肉无力，心脏、认知功能及预期寿命是正常的，SMA IV是最不常见的SMA形式，仅影响不到5％的SMA患者。

现在技术中有多种检测SMA（脊髓性肌萎缩症）的遗传学方法，如多重链接探针扩增（MLPA）、实时定量基因扩增荧光检测系统（qPCR）、聚合酶链反应-限制性酶片段长度多态性（PCR-RFLP）等，这些检测方法存在流程上比较繁琐、或是检测成本比较昂贵、或是需要等待凑样本检测，检测周期长等问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短、检测结果准确度高的基于sanger测序的SMA检测方法。

本发明所采用的技术方案是：基于sanger测序的SMA检测方法，包括如下步骤，

a、取待检测样本DNA，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位；

b、获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后的核苷酸序列；

c、利用Primer Premier 5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组；

d、对待检测样本DNA进行PCR扩增；

e、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；

f、将步骤e中的测序结果进行比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者；

对上述技术方案的进一步改进为，步骤a中，对染色体位的明确通过查阅ClinVar数据库获知。

对上述技术方案的进一步改进为，步骤b中，通过UCSC数据库，获取的核苷酸序列为待检测样本SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列。

对上述技术方案的进一步改进为，步骤c中，sanger引物组为

F(正向）：5’-TGTCTTGTGAAACAAAATGCTTT-3’

R(反向）：5’-TGCTGGTCTGCCTACTAGTGATA-3’。

对上述技术方案的进一步改进为，步骤e中，通过Bio-Trace-ABIF软件得到待检测样本的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间。

对上述技术方案的进一步改进为，步骤f中，若第480号碱基显示T单峰，则待检测样本为exon7纯合缺失的SMA患者；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.8-1.2时，待检测样本为正常人群；若第480号碱基显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.1-0.6时，待检测样本为exon7杂合缺失的SMA患者。

对上述技术方案的进一步改进为，还包括对检测结果进行验证，所述验证方法为MLPA验证。

本发明的有益效果为：

一方面，在进行SMA检测时，主要针对SMN1基因，这是由于 SMA是由位于染色体5q13上的存活运动神经元（SMN）基因的缺失或突变引起的，该基因存在两个几乎相同的拷贝，即SMN1和SMN2。SMN1基因和SMN2基因高度同源，SMN1和SMN2基因在DNA水平上只有5个碱基不同。在编码区只有2个碱基不同，其中7号外显子中第480号碱基（以下简称c.480）最关键。大约95%-98%的SMA患者是由SMN1基因的外显子7号和或8的纯合缺失所致，约2%-5%的SMA患者是由SMN1基因位点变异的纯合或与7号外显子的缺失组成复合杂合所致，而SMN2的缺失并不会引起SMA。针对SMN1基因7号外显子纯合缺失、杂合缺失检测，可以有效区分SMA患者、携带者与正常人群。第二方面，利用SMN1和SMN2基因在第7号外显子上第480号核苷酸序列不同，如图1所示，SMN1基因c.480为C碱基，SMN2基因c.480为T碱基。第三方面，采用自主设计引物，使得引物序列可以同时匹配到SMN1和SMN2基因的 c.480左右区域。通过sanger测序，结合c.480峰图从而分析结果。第四方面，为了更精准识别SMA携带者与正常人群，本发明首创采用c.480号碱基CT峰高信号值比值来识别是否存在SMN1基因exon7杂合缺失。采用回溯分析方法：已用MLPA方法明确的30个正常人群与30个SMA exon7杂合缺失携带者，通过自主设计的引物，进行sanger测序。将sanger测序的信号通过Bio-Trace-ABIF软件，识别出c.480号碱基C/T峰高值。通过正常人群与携带者c.480号碱基C/T峰高比值统计学分析，明确正常人群的SMN1基因c.480号碱基C/T比值范围区间为：0.8-1.2；而SMA携带者（携带SMN1基因 exon7杂合缺失）c.480号碱基C/T比值范围区间为：0.1-0.6。第五方面，本发明操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短，可为SMA疾病分子诊断提供更合适的检测策略。

附图说明

图1 为SMN1和SMN2基因在第7号外显子上第480号核苷酸序列对比图；

图2 为本发明的检测原理图；

图3为本发明的实施例的实验流程图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步的说明。

如图1所示，为本发明的检测原理图。

基于sanger测序的SMA检测方法，包括如下步骤，

a、取待检测样本DNA，查阅ClinVar数据库，明确其SMN1基因第7号外显子第480号碱基染色体位【chr5:70247773（GRCh37）】；

b、通过UCSC数据库，获取待检测样本DNA的SMN1基因第480号碱基位置前后500bp的核苷酸序列；

c、利用Primer Premier 5软件，针对步骤b中获得的核苷酸序列设计sanger引物组，

F(正向）：5’-TGTCTTGTGAAACAAAATGCTTT-3’

R(反向）：5’-TGCTGGTCTGCCTACTAGTGATA-3’；

d、对待检测样本DNA进行PCR扩增；

e、对d的产物进行sanger测序，得到待检测样本DNA的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间；通过Bio-Trace-ABIF软件得到待检测样本的SMN1基因第7号外显子第480号碱基C/T比值范围区间。

f、测试结果比对，以确定待检测样本是否为SMA携带者；若c.480显示T单峰，则待检测样本为exon7纯合缺失的SMA患者；若c.480显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.8-1.2时，待检测样本为正常人群；若c.480显示CT单峰，且C/T峰高比值为0.1-0.6时，待检测样本为exon7杂合缺失的SMA患者。

最后对检测结果进行验证，验证方法为MLPA验证。

实施例：疑似SMA检测

样本A和B为一对夫妻样本，曾生下样本C和样本D疑似SMA患者的姐弟、一位健康儿子样本E。现来做SMN1基因分子诊断。

提取这个家系的DNA，按照附图3所示的实施例的试验流程图和表1所示的扩增程序，得到扩增产物。

将这个家系的扩增产物进行Sanger测序。表2是这个家系的c.480碱基位置峰图统计表。

从以上该家系c.480碱基位置峰图统计表可分析出：

A样本:c.480位置为CT双峰，C/T峰高比值为0.5；B样本:c.480位置为CT双峰，C/T峰高比值为0.3；C样本:c.480位置为T单峰；D样本:c.480位置为T单峰；E样本：:c.480位置为CT双峰，C/T峰高比值为0.9。

即这个家系的分析结果如表3实施例样本分析结果统计表所示：

同时采用另外多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probeamplification ,MLPA）方法，进行验证测试，测试结果如表4所示：

通过表3和表4的结果比较，本发明的检测方法与MLPA方法一致性到达100%，本发明操作流程简便、检测成本低廉、无需凑样、检测周期短、检测结果准确度高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。