一种咪唑-4-甲酸乙酯纯度的HPLC检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药物的分析检测方法，特别涉及一种咪唑-4-甲酸乙酯及其纯度的测定方法。

背景技术

咪唑-4-甲酸乙酯，又名咪唑酸酯，它属于咪唑系列的一种常用医药中间体，可作为合成大多数原料药的关键起始物料。

英文名称为Ethyl imidazole-4-carboxylate，化学名称即咪唑-4-甲酸乙酯，分子式为C

依据源头控制、过程控制理念，咪唑-4-甲酸乙酯作为原料药制备的关键起始物料，也需建立有效的检测方法实行严格控制。经检索，目前未见咪唑-4-甲酸乙酯的纯度检测方法的相关专利或公开文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种咪唑-4-甲酸乙酯的纯度检测方法，该方法专属性强，线性良好，重复性佳，稳定性较好，可应用于咪唑-4-甲酸乙酯纯度控制。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种咪唑-4-甲酸乙酯纯度的HPLC检测方法，所述咪唑-4-甲酸乙酯化学名称为咪唑-4-甲酸乙酯，分子式为C

控制的已知杂质M02结构式为

采用反相高效液相色谱法，使用紫外检测器，HPLC检测条件如下：色谱柱：AgilentPoroshell 120 Bonus RP，100*4.6mm，2.7μm，亲水性C18色谱柱，柱温为30℃，常规温度，适用于大多数仪器；流动相：水相：20mM乙酸铵溶于0.05% H

（1）取咪唑-4-甲酸乙酯、已知杂质M02用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含咪唑-4-甲酸乙酯 1.0mg、已知杂质M02 0.01mg的系统适用性溶液；

（2）取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含1.0mg咪唑-4-甲酸乙酯的供试品溶液；

（3）取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含0.0005mg咪唑-4-甲酸乙酯的定量限溶液；

（4）取5μl系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，完成咪唑-4-甲酸乙酯的纯度的检测。

进一步，所述的梯度洗脱为先用5%乙腈洗脱1 min，再将乙腈梯度升高至70%，时间11 min，再用70%乙腈冲洗3 min，最后用0.1min回调至起始比例5%乙腈，并平衡5 min。

本发明的有益效果是：本发明采用RP亲水性色谱柱，常规C18柱，在市场上简单易得；流动相水相为20mM乙酸铵溶于0.05% H

附图说明

图1为本发明实施案例专属性叠图；

图2为本发明对比例1样品溶液在安捷伦EC-C18/CS-C18/PFP/Bonus-RP色谱柱筛选叠图；

图3为本发明对比例2样品溶液和M02溶液在20mM乙酸铵缓冲液的HPLC图；

图4为本发明对比例2样品溶液和M02溶液在20mM乙酸铵溶于0.1%磷酸水溶液的HPLC图；

图5为本发明对比例2样品溶液和M02溶液在20mM乙酸铵溶于0.01%磷酸水溶液的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明对色谱柱、流动相进行筛选，最终本实施案例色谱条件能将其与纯度有效分离，建立的检测方法将分析时间控制在20分钟内，主成分及纯度与其相邻峰的分离度均≥5.7，方法专属性好，灵敏度高，线性良好，重复性佳，有一定的溶液稳定性，方法准确可靠，达到上述发明目的。

具体HPLC检测色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Poroshell 120 Bonus RP，100*4.6mm，2.7μm，亲水性色谱柱，柱温为30℃。

流动相：水相：20mM乙酸铵溶于0.05% H

洗脱程序：梯度洗脱，先用5%乙腈洗脱1 min，再将乙腈梯度升高至70%，时间11min，再用70%乙腈冲洗3 min，最后用0.1min回调至起始比例5%乙腈，并平衡5 min；

检测波长：210nm。

包括以下步骤：

（1）取咪唑-4-甲酸乙酯、已知杂质M02用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含咪唑-4-甲酸乙酯 1.0mg、已知杂质M02 0.01mg的系统适用性溶液。

（2）取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含1.0mg咪唑-4-甲酸乙酯的供试品溶液。

（3）取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含0.0005mg咪唑-4-甲酸乙酯的定量限溶液。

（4）取5μl系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，完成咪唑-4-甲酸乙酯的纯度的检测。

按照上述实验条件进行预验证考察，具体实施如下：

（1）专属性考察：取稀释剂和上述步骤1的系统适用性溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成专属性的考察。

结果如图1所示：咪唑-4-甲酸乙酯和M02与相邻峰完全基线分离，分离度≥5.7，且空白对咪唑-4-甲酸乙酯与已知杂质M02均无干扰，咪唑-4-甲酸乙酯的光谱纯度1000，专属性好。

（2）灵敏度考察：取咪唑-4-甲酸乙酯和已知杂质M02用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，定量稀释制成每1ml稀释剂含咪唑-4-甲酸乙酯0.0005mg、含M02 0.0005mg的混合定量限溶液，取5μl定量限溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，完成灵敏度的考察。

结果：咪唑-4-甲酸乙酯和M02的S/N≥16，满足接受标准（S/N≥10）。

（3）线性考察：取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，并定量稀释制成一系列的在样品浓度0.05%～120%水平的线性溶液。取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，完成线性的考察。

结果：线性方程为Y=135.9909X-0.0558相关系数=1.0000；截距b与100X时Y的比值=0.04%，线性关系良好。

（4）重复性：取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml稀释剂含咪唑-4-甲酸乙酯 1.0mg的供试品溶液；平行配制3份。

结果：3份样品溶液咪唑-4-甲酸乙酯 %Area的RSD=0.0%，杂质（包括检出的已知杂质和未知杂质）%Area的RSD≤7%，重复性佳。

（5）溶液稳定性：取咪唑-4-甲酸乙酯用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml稀释剂含咪唑-4-甲酸乙酯 1.0mg的供试品溶液，室温放置13.7h后，重新进样。

结果：样品溶液室温放置13.7小时内，咪唑-4-甲酸乙酯峰%Area与0h比值=100%，各杂质%Area与0h相比，绝对差值≤0.04%，且无新增杂质产生，因此，样品溶液在室温放置至少13.7h内稳定。

从上述数据表明，本发明方法准确可靠，可用于咪唑-4-甲酸乙酯纯度的检测。

对比例1

色谱柱筛选，HPLC检测色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18/CS-C18/PFP/Bonus-RP四大柱尺寸均为100*4.6mm，2.7μm进行筛选,，柱温为30℃。

流动相：水相：0.1%甲酸水溶液，有机相：乙腈；流速为1.0 ml/min。

洗脱程序：梯度洗脱，先用10%乙腈洗脱1 min，再将乙腈梯度升高至90%，时间7min，再用90%乙腈冲洗2 min，最后用0.1min回调至起始比例10%乙腈，并平衡5 min。

检测波长：220nm、254nm。

包括以下步骤：

（1）取咪唑-4-甲酸乙酯样品用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml稀释剂含样品1.0mg的样品溶液。

（2）取5μl样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，完成咪唑-4-甲酸乙酯纯度方法的开发。

结果如图2所示：保留差、响应差。

对比例2

流动相体系优化，HPLC检测色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Poroshell 120 PFP 100*4.6mm，2.7μm，柱温30℃。

流动相1：水相：20mM乙酸铵缓冲液，有机相：乙腈。

流动相2：水相：20mM乙酸铵缓冲液溶于0.1%磷酸水溶液，有机相：乙腈。

流动相3：水相：20mM乙酸铵缓冲液溶于0.01%磷酸水溶液，有机相：乙腈。

流速：1.0ml/min。

洗脱程序：梯度洗脱，先用10%乙腈洗脱1 min，再将乙腈梯度升高至90%，时间7min，再用90%乙腈冲洗2 min，最后用0.1min回调至起始比例10%乙腈，并平衡5 min。

检测波长：220nm。

包括以下步骤：

（1）取咪唑-4-甲酸乙酯样品、M02用50%乙腈水溶液作为稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml稀释剂含样品1.0mg的样品溶液。

（2）取5μl样品溶液、M02溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，完成咪唑-4-甲酸乙酯纯度方法的开发。

结果如图3、4、5所示：磷酸添加量的不同，对咪唑-4-甲酸乙酯和M02分离度影响显著。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以进行多种变化、修改、替换和变型，这些都属于本发明的保护范围。