一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法

技术领域

本发明具体涉及一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

糖皮质激素是机体内极为重要的一类调节分子，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，其受体的缺失对生理和情绪有负面影响，因此，糖皮质激素受体缺失的突变体是良好的抑郁症模型。

现有的哺乳动物抑郁症模型构建方法复杂，实验周期长，成本高，因此本领域亟待提出一种构建方便，成本低，能够进行高通量药物筛选的抑郁症模型，斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，具有体积小、繁殖周期快、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，因而逐渐被应用于抑郁症研究。

本发明利用斑马鱼为模型生物，通过基因敲除的方式构建缺失糖皮质激素受体的突变体斑马鱼系，该突变体是良好的抑郁症研究模型。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种斑马鱼抑郁症模型的构建方法，其通过基因敲除获得缺失糖皮质激素受体的突变体斑马鱼系，该突变体是良好的抑郁症研究模型。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计nr3c1 gRNA引物，通过RCR获得转录nr3c1 gRNA所需DNA模板；

2)利用体外转录的方法获得nr3c1 gRNA；

3)第一步得到的gRNA和Cas9蛋白共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；

4)培育nr3c1突变体斑马鱼；

5)通过行为学实验指标指示斑马鱼抑郁状态；

所述行为学实验的方法具体为：

a：新鱼缸实验：新鱼缸实验是为了测试斑马鱼对轻度应激环境的反应，单只成年雄性斑马鱼被放置在一个光线充足和内壁不透明的新鱼缸中，雄性斑马鱼的行为被一个带有视频跟踪软件的行为仪器记录下来，每个实验持续10分钟；

b：探索性行为实验：斑马鱼的位置偏好性被用于分析焦虑水平，斑马鱼的焦虑程度越高，斑马鱼就会离墙越远，当斑马鱼成熟时，斑马鱼被从熟悉的环境转移到一个具有非反射和不透明壁的新型水槽中，使用带有视频跟踪软件的行为仪器记录斑马鱼的位置，每次实验持续10分钟；

c：社会行为实验：社会行为实验是模拟社会活动的缓冲压力的实验，在这项实验中，新水缸的一面是透明的，允许nr3c1突变体斑马鱼与相邻的WT斑马鱼交流；使用带有视频跟踪软件的行为仪器记录放入新鱼缸后10分钟内的nr3c1突变体斑马鱼的运动轨迹。

进一步的，所述nr3c1突变体斑马鱼的获得方式为利用基因敲除获得的斑马鱼nr3c1突变体。

更进一步的，所述nr3c1 gRNA的获得方法为通过PCR的方式获得转录模板，通过体外转录获得nr3c1 gRNA。

一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法的用途，通过行为学指标检测斑马鱼的抑郁程度。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种如上所述的糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法，其能用于抑郁症基础研究和抗抑郁药物开发。

与现有技术相比，该方法具有简便、快速、高效，低成本，适合高通量药物筛选等优点，为抑郁症基础研究和抗抑郁药物开发提供了良好的模型。

附图说明

图1为nr3c1敲除位点示意图；

图2为nr3c1突变体突变类型示意图；

图3为nr3c1突变体Nr3c1蛋白western b l ot图；

图4为行为学新鱼缸实验图；

图5为行为学探索性行为实验图；

图6为行为学社会行为实验图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例：

参见图1-6所示，一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法，包括以下步骤：

1)设计nr3c1 gRNA引物，通过RCR获得转录nr3c1 gRNA所需DNA模板；

2)利用体外转录的方法获得nr3c1 gRNA；

3)第一步得到的gRNA和Cas9蛋白共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；

4)培育nr3c1突变体斑马鱼；

5)通过行为学实验指标指示斑马鱼抑郁状态；

所述行为学实验的方法具体为：

a：新鱼缸实验：新鱼缸实验是为了测试斑马鱼对轻度应激环境的反应，单只成年雄性斑马鱼被放置在一个光线充足和内壁不透明的新鱼缸中，雄性斑马鱼的行为被一个带有视频跟踪软件的行为仪器记录下来，每个实验持续10分钟；

b：探索性行为实验：斑马鱼的位置偏好性被用于分析焦虑水平，斑马鱼的焦虑程度越高，斑马鱼就会离墙越远，当斑马鱼成熟时，斑马鱼被从熟悉的环境转移到一个具有非反射和不透明壁的新型水槽中，使用带有视频跟踪软件的行为仪器记录斑马鱼的位置，每次实验持续10分钟；

c：社会行为实验：社会行为实验是模拟社会活动的缓冲压力的实验，在这项实验中，新水缸的一面是透明的，允许nr3c1突变体斑马鱼与相邻的WT斑马鱼交流；使用带有视频跟踪软件的行为仪器记录放入新鱼缸后10分钟内的nr3c1突变体斑马鱼的运动轨迹。

所述nr3c1突变体斑马鱼的获得方式为利用基因敲除获得的斑马鱼nr3c1突变体。

所述nr3c1 gRNA的获得方法为通过PCR的方式获得转录模板，通过体外转录获得nr3c1 gRNA。

一种糖皮质激素受体缺失的斑马鱼抑郁模型的构建方法的用途，通过行为学指标检测斑马鱼的抑郁程度。

实施例中敲除斑马鱼糖皮质激素受体nr3c1，图1为斑马鱼敲除位点选择，对应引物为，正向引物:GATCACTAATACGACTCACTATAGGAAT CGTCGCCAAAGATGGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC,反向引物：P4，PCR反应体系如下：pMD 19-T，vector：1微升，正向引物：1微升，反向引物：1微升，KOD酶缓冲液：25微升，KOD酶：1微升，dNTP:10微升，KOD酶：1微升，双蒸水：12微升，循环条件如下：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火20秒，68℃延伸20分钟，最后延伸68℃10分钟，所得产物在纯化后被用于体外转录nr3c1 gRNA。

综合图2,nr3c1 gRNA和Cas9蛋白被共同注射到一细胞期的斑马鱼胚胎中，最终获得的突变类型，综合图3，所得的突变体进一步通过Western B l ot确认了缺失完整的Nr3c1。

图4为斑马鱼新鱼缸实验，在将斑马鱼放入新水槽后的第一分钟，它们倾向于沉入水槽底部，不游泳，然而，在2、3、4和5分钟后，nr3c1突变体比对照组更不活跃，并且仍然接近水箱底部，随后，nr3c1突变体与对照组的行为逐渐一致，因此，nr3c1突变体快速适应反复压力的能力与对照组相比有所降低。

图5为斑马鱼探索性行为实验，隔离和新环境会增加凋亡压力水平，因此，当斑马鱼从最初熟悉的鱼缸转移到新鱼缸时，会表现出类似焦虑的表型，总的来说，焦虑程度较高的斑马鱼倾向于避开新鱼缸的墙壁，新的水槽被分成两个隔间(外部和内部隔间)，并记录了水槽中斑马鱼的位置变化，如图5所示，对照组的斑马鱼更有可能在墙壁附近游泳，相反，nr3c1突变体斑马鱼表现出更大的避壁倾向，更倾向于在水槽中央游泳，因此，与对照相比，nr3c1突变体斑马鱼更倾向于焦虑样表型。

图6为社会行为实验，增加斑马鱼的社交活动能够改善正常斑马鱼的焦虑样表型，然而nr3c1突变体斑马鱼倾向于游离透明壁，与对照组斑马鱼相比，在外池和内池中的时间分别明显更长和更短，泼尼松龙暴露斑马鱼体内的距离在内部时间显著更长，因此，社交活动不能改善nr3c1突变体成年雄性斑马鱼的焦虑症状，综上所述，nr3c1突变体具有典型的抑郁症症状，是良好的抑郁症模型。

实施例成功运用行为学检测技术观察到糖皮质激素受体缺失的斑马鱼对环境应激不敏感，焦虑水平高，社交行为减弱，成功构建了一种基因缺失导致的抑郁症模型模型，该方法具有简便、快速、高效，低成本，适合高通量药物筛选等优点，为抑郁症基础研究和抗抑郁药物开发提供了良好的模型。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。