流动池系统和装置

交叉引用

本申请要求于2020年6月10日提交的美国临时申请63/037,558号的权益，其通过引用整体并入本文。

序列表

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背景技术

流动池装置广泛用于化学和生物技术应用中。特别是在下一代测序(NGS)系统中，这样的装置用于固定来源于生物样品的模板核酸分子，然后引入重复的边合成边测序试剂流以将标记的核苷酸连接到模板序列中的特定位置。对一系列标记信号进行检测和解码，以揭示模板分子的核苷酸序列，例如，附接于流动池内表面的固定化或扩增的核酸模板分子。

NGS流动池可以是由平坦表面基底和其他流动池部件制造的多层结构(参见，例如，美国专利申请公开号2018/0178215A1)，其然后通过机械、化学或激光键合技术结合以形成流体流动通道。这样的流动池需要昂贵的多步骤、精确的制造技术来实现所需的设计规格。另一方面，廉价和现成的单内腔(流动通道)毛细管可具有多种尺寸和形状，但通常不适合于容易处理和与应用如NGS所需的试剂之间的重复转换兼容。

发明内容

本文公开的方面提供了核酸测序方法，所述方法包括：(a)使引发的核酸序列与聚合酶和一个或多个核苷酸部分在足以在所述聚合酶、所述一个或多个核苷酸部分和所述引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将所述一个或多个核苷酸部分掺入所述引发的核酸序列的条件下接触，其中所述引发的核酸序列来源于患有或疑似患有由严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒或其变体引起的疾病或病症的对象的样品；以及(b)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。在一些实施方案中，所述方法还包括：重复(a)至(b)以鉴定所述引发的核酸序列中的连续核苷酸。在一些实施方案中，所述方法还包括：基于所述鉴定的连续核苷酸，确定所述样品含有编码所述SARS-CoV-2的信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，所述方法还包括：扩增从所述样品核酸序列获得的核酸序列；以及在足以产生所述引发的核酸序列的条件下，使所述核酸序列和与所述核酸序列的至少一部分互补的引物序列接触。在一些实施方案中，所述扩增包括进行滚环扩增。在一些实施方案中，所述多个核苷酸部分与聚合物-核苷酸组合物中的聚合物核偶联。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与两种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与三种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与四种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触，并且其中所述多种所述类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触，并且其中所述多种所述类型中的每一种包括不同的可检测标记。在一些实施方案中，所述聚合物-核苷酸偶联物包括与所述聚合物核偶联的可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，所述聚合物核包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素和葡聚糖的聚合物。在一些实施方案中，所述检测所述结合复合物是荧光测量。在一些实施方案中，方法还包括：使未标记的核苷酸与所述引发的核酸序列在足以进行引物延伸反应的条件下接触，由此所述未标记的核苷酸被掺入到所述引发的核酸序列中。在一些实施方案中，所述未标记的核苷酸包括在所述未标记的核苷酸的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述阻断基团包括3'-O-甲基核苷酸、或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基，或其衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸部分包括在所述一个或多个核苷酸部分的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述阻断基团包括3'-O-甲基核苷酸、或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基，或其衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸部分不包括在所述一个或多个核苷酸部分的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述条件包括存在锶离子、镁离子、钙离子或其任何组合。在一些实施方案中，所述条件包括在约25℃至约62℃范围内的温度。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约1纳摩尔(nM)的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约500皮摩尔(pM)的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约50pM的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，所述引发的核酸序列与包括亲水性聚合物涂层的表面偶联。在一些实施方案中，所述表面包括流动池的一个或多个内表面。在一些实施方案中，所述流动池的所述一个或多个内表面是所述流动池内的毛细管的内表面。在一些实施方案中，所述表面包括所述流动池的两个或更多个内表面。在一些实施方案中，所述流动池的所述两个或更多个内表面是所述流动池内的毛细管的两个或更多个内表面。在一些实施方案中，所述引发的核酸序列以大于或等于约4,000个引发的环状核酸序列/微米(μm)

本文公开的方面提供了系统，其包括：一个或多个计算机处理器，其被单独地或共同地编程以实现一种方法，所述方法包括：(i)使引发的核酸序列与聚合酶和一个或多个核苷酸部分在足以在所述聚合酶、所述一个或多个核苷酸部分和所述引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将所述一个或多个核苷酸部分掺入所述引发的核酸序列的条件下接触，其中所述引发的核酸序列来源于患有或疑似患有由严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒或其变体引起的疾病或病症的对象的样品；以及(ii)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。在一些实施方案中，系统还包括：表面，所述表面包括(i)与其偶联的所述引发的核酸序列，和(ii)亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物层包括聚合物，所述聚合物包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素或葡聚糖，或其组合的聚合物。在一些实施方案中，所述表面包括流动池的一个或多个内表面。在一些实施方案中，所述流动池的所述一个或多个内表面是所述流动池内的毛细管的内表面。在一些实施方案中，所述表面包括所述流动池的两个或更多个内表面。在一些实施方案中，所述流动池的所述两个或更多个内表面是所述流动池内的毛细管的两个或更多个内表面。在一些实施方案中，系统还包括成像模块，所述成像模块包括一个或多个光源、一个或多个光学组件和一个或多个图像传感器，其中所述成像模块可操作地连接至表面，所述表面包括与其偶联的所述引发的核酸序列，用于检测所述结合复合物。在一些实施方案中，系统还包括流体学模块，所述流体学模块被配置为使所述引发的核酸序列与所述聚合酶和所述一个或多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，所述方法还包括：重复(a)至(b)以鉴定所述引发的核酸序列中的连续核苷酸。在一些实施方案中，所述方法还包括：基于所述鉴定的连续核苷酸，确定所述样品含有编码所述SARS-CoV-2的信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，所述方法还包括：扩增核酸序列；以及在足以产生所述引发的核酸序列的条件下，使所述核酸序列和与所述核酸序列的至少一部分互补的引物序列接触。在一些实施方案中，所述多个核苷酸部分与聚合物-核苷酸组合物中的聚合物核偶联。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与两种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与三种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与四种或更多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触，并且其中所述多种所述类型的所述聚合物-核苷酸偶联物中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使所述引发的核酸序列与多种类型的所述聚合物-核苷酸偶联物接触，并且其中所述多种所述类型的所述聚合物-核苷酸偶联物中的每一种包括不同的可检测标记。在一些实施方案中，所述聚合物-核苷酸组合物包括与所述聚合物核偶联的可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，所述聚合物核包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素和葡聚糖的聚合物。在一些实施方案中，所述检测所述结合复合物是荧光测量。在一些实施方案中，所述方法还包括：使未标记的核苷酸与所述引发的核酸序列在足以进行引物延伸反应的条件下接触，由此所述未标记的核苷酸被掺入到所述引发的核酸序列中。在一些实施方案中，所述未标记的核苷酸包括在所述未标记的核苷酸的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述阻断基团包括3'-O-甲基核苷酸、或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基，或其衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸部分包括在所述一个或多个核苷酸部分的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述阻断基团包括3'-O-甲基核苷酸、或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基，或其衍生物。在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸部分不包括在所述一个或多个核苷酸部分的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述条件包括存在锶离子、镁离子、钙离子或其任何组合。在一些实施方案中，所述条件包括在约25℃至约62℃范围内的温度。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约1纳摩尔(nM)的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约500皮摩尔(pM)的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，(a)中的接触包括使包括浓度至多或等于约50pM的所述引发的核酸序列的流体组合物与所述聚合酶和所述多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，所述引发的核酸序列以大于或等于约4,000个引发的环状核酸序列/微米(μm)

本文公开的方面提供了试剂盒，其包括：(a)聚合物-核苷酸组合物，其包括聚合物核和与其偶联的多个核苷酸部分；以及(b)说明书，其用于通过以下方法鉴定来源于患有或疑似患有由严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒或其变体引起的疾病或病症的对象的样品的引发的核酸序列中的核苷酸：(i)在足以在所述聚合物-核苷酸组合物的一个或多个核苷酸部分和所述引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将所述一个或多个核苷酸部分掺入所述引发的核酸序列的条件下，使引发的核酸序列与所述聚合物-核苷酸组合物接触；以及(ii)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒还包括：表面，所述表面包括(i)与其偶联的所述引发的核酸序列，和(ii)亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物层包括聚合物，所述聚合物包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素或葡聚糖，或其组合的聚合物。在一些实施方案中，所述表面包括流动池的一个或多个内表面。在一些实施方案中，所述说明书还包括重复(i)至(ii)以鉴定所述引发的核酸序列中的连续核苷酸的说明书。在一些实施方案中，所述说明书还包括用于以下操作的说明书：扩增来源于所述样品的核酸序列；以及在足以产生所述引发的核酸序列的条件下，使所述核酸序列和与所述核酸序列的至少一部分互补的引物序列接触。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括至少两种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括至少三种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括至少四种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括多种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物，并且其中所述多种所述类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括多种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物，并且其中所述多种所述类型中的每一种包括不同的可检测标记。在一些实施方案中，所述聚合物-核苷酸组合物包括与所述聚合物核偶联的可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，所述聚合物核包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素和葡聚糖的聚合物。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个未标记的核苷酸，所述未标记的核苷酸包括在所述一个或多个未标记的核苷酸的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，所述阻断基团包括3'-O-甲基核苷酸、或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基，或其衍生物。在一些实施方案中，试剂盒还包括缓冲体系，所述缓冲体系包括锶离子、镁离子、钙离子或其任何组合。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒或其变体由与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有大于或等于约90％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒或其变体由与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有约90％到约99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒或其变体由SEQ ID NO：1-4中的任一个提供的核酸序列编码。

本文公开的方面提供了系统，其包括一个或多个计算机处理器，所述计算机处理器被单独或共同编程以实现处理患有或疑似患有由严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒引起的2019冠状病毒病(COVID-19)的对象的样品的方法，所述方法包括：(a)提供包括两个或更多个微流体通道的核酸测序流动池，其中所述两个或更多个微流体通道中的至少一个包括表面，所述表面包括固定于其上的核酸序列，其中所述核酸序列来源于患有或疑似患有所述COVID-19的所述对象的所述样品；(b)使所述核酸序列与具有与所述核酸序列的互补性的引物接触，以产生引发的核酸序列；(c)使用至少(i)聚合酶和(ii)具有多个可检测标记的多个核碱基使所述引发的核酸序列进行引物延伸反应；(d)在进行所述引物延伸反应时，使用检测器检测来自所述多个可检测标记的至少一个子集的多个信号；以及(e)使用(d)中检测的所述多个信号产生测序数据；(f)使用一个或多个逻辑电路使用并行处理来处理所述测序数据以鉴定所述核酸序列；(g)使用(f)中鉴定的所述核酸序列确定所述样品含有编码所述SARS-CoV-2的信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中，所述多个可检测标记包括多个荧光团。在一些实施方案中，所述使用(d)中检测的所述多个信号鉴定所述核酸序列包括使用荧光成像系统对所述两个或更多个微流体通道的第一表面和轴向位移的第二表面成像。在一些实施方案中，方法在(a)之前还包括：(h)将包括浓度至多或等于约1纳摩尔(nM)，至多或等于约500皮摩尔(pM)，或至多或等于约50pM的所述核酸序列的流体组合物引入与所述聚合酶和多个核苷酸部分接触。在一些实施方案中，方法在(a)之前还包括：(i)将所述核酸序列的至少一部分与接枝到所述表面的寡核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述核酸测序流动池在(c)之前负载有所述流体组合物。在一些实施方案中，所述核酸序列以包括至少4,000个分子/平方微米(μ

援引并入

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指出通过引用以其整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间存在冲突的情况下，以本文中的术语为准。

附图说明

在所附权利要求中具体阐述了本文中本发明概念的一些新颖特征。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图将获得对本发明概念的特征和优点的更好理解，在说明性实施方案中利用了本发明的原理，在附图中：

图1示出了具有2个流体接头的单个毛细管流动池的一个实施方案。

图2示出了包括底座、流体接头和两个毛细管的流动池盒的一个实施方案。

图3示出了系统的一个实施方案，该系统包括连接到各个流体流动控制部件的单个毛细管流动池，其中单个毛细管与安装在显微镜载物台上或安装在用于各种成像应用的定制成像仪器中兼容。

图4示出了系统的一个实施方案，该系统包括具有集成隔膜阀的毛细管流动池盒，以最小化死体积并保存某些关键试剂。

图5示出了系统的一个实施方案，该系统包括毛细管流动池、显微镜装置和温度控制机构。

图6示出了通过使用与流动池盒接触放置的金属板对毛细管流动池进行温度控制的一个非限制性实例。

图7示出了包括非接触式热控制机构的毛细管流动池的温度控制的一种非限制性方法。

图8示出了毛细管内腔中的簇扩增的可视化。

图9A-图9C示出了流动池装置制备的非限制性实例：图9A显示了一片式玻璃流动池的制备；图9B示出了两片式玻璃流动池的制备；并且图9C示出了三片式玻璃流动池的制备。

图10A-图10C示出了玻璃流动池设计的非限制性实例：图10A示出了一片式玻璃流动池设计；图10B示出了两片式玻璃流动池设计；图10C示出了三片式玻璃流动池设计。

图11示意性地描绘了示例性计算机控制系统。

图12根据本文的一些实施方案描绘了聚合物-核苷酸偶联物或多价结合复合物。

图13A-图13B示出了SARS-CoV-2病毒基因组的检测。图13A：添加1000万(估计)SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝，在2.29％的读段中产生可鉴定的SARS CoV-2序列(运行P1-SI284，条纹条)。添加100万(估计)SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝，在0.97％的读段中产生可鉴定的SARS CoV-2序列(运行P1-SI294，条纹条)。缺乏SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝的样品没有显示任何SARS CoV-2序列。图13B显示了在相同测序试验中鉴定的SARSCoV-2基因组的覆盖。X轴：SARS CoV-2基因组内的位置。Y轴：每个给定位置的读段数。

图14A-图14C示出了通过靶富集的COVID变体检测测定：图14A显示了制备用于测序的病毒RNA的常规市售工作流程。图14B显示了市售可获得的SARS CoV-2基因组已知变体的合成DNA拷贝的突变(顶部)和近似片段边界(底部)的位置。图14C显示了使用目前描述的系统和方法的测序数据(SARS CoV-2基因组中的位置(X轴)与序列读段#(Y轴)的图)。顶部，“对照2参考：”原始SARS CoV-2参考株。中间，“对照14参考：”B.1.1.7株。底部：已知突变在B.1.1.7株基因组中的位置。标明了内参序列中鉴定的突变位置的位置。

具体实施方式

本文描述了用于对核酸测序的新型流动池装置和系统。本文描述的装置和系统可实现试剂的更有效使用并有助于降低DNA测序过程的成本和时间。该装置和系统可利用市售的现成毛细管或具有选定通道图案的微米级或纳米级流控芯片。本文描述的流动池装置和系统适用于快速DNA测序，并且与其他DNA测序技术相比，可以帮助实现更有效地使用昂贵的试剂并减少样品预处理和复制所需的时间量。结果是一种更快且成本有效的测序方法。

I.方法

在一些实施方案中，本文公开了使用本公开的流动池装置来鉴定病原体如病毒的序列的方法。在一些实施方案中，病毒是严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)或其变体。在一些实施方案中，方法包括从病原体衍生的核酸制备核酸序列文库。在一些实施方案中，方法包括检测从对象获得的生物样品中的病原体序列。在一些实施方案中，进行本文所述的方法以诊断对象中与病原体相关的疾病或病症，或提供与疾病或病症相关的对象的预后(例如，鉴定感染，或由感染引起的疾病的严重形式的可能性)。在一些实施方案中，本文公开的方法用于追踪对象群体中的病原体感染，例如，在特定的地理位置。

A.获得核酸

在一些实施方案中，本文公开了获得核酸的方法。在一些实施方案中，核酸获自生物样品。在一些实施方案中，核酸来源于本文所述的病原体。在一些实施方案中，生物样品获自患有或疑似患有与本文所述的病原体感染相关的疾病或病症的对象。

1.病原体

本文所述的核酸包括来源于人，动物或植物的病原体的核酸部分，病原体例如真菌、细菌、古细菌、真核寄生虫、原生动物或病毒、包括但不限于线状病毒、冠状病毒、腺病毒、逆转录病毒、毒素等。在一些实施方案中，这样的病原体天然存在。在一些实施方案中，可以合成这样的病原体。

在一些实施方案中，具有本公开内容考虑的核酸组分的此类病毒包括但不限于埃博拉病毒、马尔堡病毒、其他线状病毒、α冠状病毒(例如229E和NL63)、β冠状病毒(例如OC43和HKU1)、其他冠状病毒、例如MERS-CoV、SARS-COV、2019-nCoV、严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)和轻度呼吸道疾病(HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1)、逆转录病毒(例如人免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒)、腺病毒、流感病毒(包括H1N1和H5N1亚型、但考虑流感病毒的所有亚型和组合)、痘病毒、疱疹病毒等。

在一些实施方案中，病毒包括冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒可以是α冠状病毒或β冠状病毒。在一些实施方案中，这样的α冠状病毒是包括229E和NL63的冠状病毒的四个属(α、β、γ或δ)中的第一个的成员。在一些实施方案中，这样的β冠状病毒是冠状病毒的四个属(α、β、γ和δ)的成员，包括OC43、HKU1、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒或中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒。在一些实施方案中，所述SARS冠状病毒是SARS-CoV、SARS-CoV-2或其变体。在一些实施方案中，MERS冠状病毒是MERS-CoV或其变体。在一些实施方案中，SARS冠状病毒引起疾病或病症，例如2019冠状病毒病(COVID-19)或变体。

在一些实施方案中，冠状病毒可以选自：α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒和γ冠状病毒。α冠状病毒的实例可包括但不限于蝙蝠冠状病毒CDPHE15、蝙蝠冠状病毒HKU10、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、小型蝙蝠冠状病毒1、小型蝙蝠冠状病毒HKU8、水貂冠状病毒1、猪流行性腹泻病毒、菊头蝠冠状病毒HKU2和黄蝠冠状病毒512。β冠状病毒的实例可包括但不限于β冠状病毒1、刺猬冠状病毒1、人冠状病毒HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒、鼠冠状病毒、伏翼蝙蝠冠状病毒HKU5、果蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、扁颅蝠冠状病毒HKU4。δ冠状病毒的实例可包括，但不限于，夜莺冠状病毒HKU11、黑水鸡冠状病毒HKU21、冠状病毒HKU15、文鸟冠状病毒HKU13、夜鹭冠状病毒HKU19、画眉冠状病毒HKU12、绣眼鸟冠状病毒(white-eye coronavirus)HKU16、野鸭冠状病毒HKU20。γ冠状病毒的实例可包括，但不限于，禽冠状病毒、白鲸冠状病毒SW1。冠状病毒的其他实例可包括MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2。在一些实施方案中，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，所述冠状病毒2019(COVID-19)由SARS-CoV-2病毒或其变体引起。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒或变体由SEQ ID NO：1-4中的任一个提供的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ ID NO：1-4中的任一个具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ ID NO：1具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ ID NO：2具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ ID NO：3具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，冠状病毒(或其变体)由与SEQ IDNO：4具有至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。

表1.病原体序列

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在一些实施方案中，这样的病原体是来源于植物、动物、细菌或古细菌的病毒。本文考虑的其他病毒包括但不限于包括植物花叶病毒(番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒)的核酸组分的病毒和与常见动物疾病相关的病毒，包括狂犬病病毒。类似地，在本公开内容中作为核酸考虑的是类病毒和亚病毒病原体，例如丁型肝炎RNA、柑桔裂皮类病毒、金鱼花潜隐类病毒(columnea latent viroid)、辣椒小果类病毒(pepper chat fruitviroid)、马铃薯纺锤形块茎类病毒、番茄萎黄矮化类病毒、椰子死亡类病毒和番茄顶缩类病毒(tomato apical stunt viroid)等。

在一些实施方案中，病原体是包括RNA病毒或DNA病毒的病毒。在一些实施方案中，这样的RNA或DNA病毒是单链或双链的。在一些实施方案中，RNA或DNA病毒是负义或正义病毒。

在一些实施方案中，这样的病原体是包括单链DNA(ssDNA)的病毒。这种包括单链DNA的病毒来源于指环病毒科、虹彩病毒科(Bacillariodnaviridae)、双DNA病毒科、环病毒科、双生病毒科、小病毒科、微病毒科、纳米病毒科、细小病毒科和螺旋病毒科。

在一些实施方案中，这样的病原体是包括双链DNA(dsDNA)的病毒。这种包括双链DNA的病毒来源于腺病毒科、异疱疹病毒科、瓶状病毒科(ampullaviridae)、囊泡病毒科、非洲猪瘟病毒科(Asfaviridae)、杆状病毒科、双尾病毒科、卡氏噬菌体科(Clavaviridae)、被脂病毒科、小纺锤形噬菌体科、球状病毒科、滴状病毒科、疱疹病毒科、唾液腺肥大病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科、脂毛噬菌体科、软体动物疱疹病毒科、马赛病毒科(Marseilleviridae)、拟菌病毒科、肌病毒科、线头病毒科(Nimaviridae)、潘多拉病毒科(Pandoraviridae)、乳头瘤病毒科、藻类脱氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、短尾噬菌体科、多DNA病毒、多瘤病毒科、痘病毒科、古噬菌体科、长尾噬菌体科、复层病毒科、球脂病毒科等。

在一些实施方案中，这样的病原体是包括ssDNA和dsDNA区域的病毒。这种包括ssDNA和ds DNA区的病毒来源于包括西班牙盐盒菌多形性病毒1、波多黎各盐几何形菌多形性病毒1、盐红菌多形性病毒1、盐红菌多形性病毒2、盐红菌多形性病毒3、盐红菌多形性病毒6等的嗜盐菌多形病毒家族。

在一些实施方案中，病原体是包括双链RNA(dsRNA)的病毒。这种包括双链RNA的病毒来源于包括双RNA病毒科、金色病毒科、囊病毒科、内源核糖核酸病毒科、减毒病毒科、巨大双分核糖核酸病毒科(Megavirnaviridae)、分体病毒科、小双节RNA病毒、呼肠孤病毒科、轮状病毒、全病毒科等的家族。

在一些实施方案中，这样的病原体是包括负义RNA的病毒。这种包括负义RNA病毒的病毒来源于沙粒病毒科、玻那病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、Nyamiviridae、蛇形病毒科、正黏病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科等的家族。

在一些实施方案中，这样的病原体是包括正义RNA的病毒。这种包括正义RNA的病毒来源于甲型线形病毒科、Alphatetraviridae、Alvernaviridae、动脉炎病毒科、星状病毒科、杆菌状核糖核酸病毒科、乙型线形病毒科、雀麦花叶病毒科、杯状病毒科、嵌杯病毒科(Carmotetraviridae)、修道院病毒科、冠状病毒科、二顺反子病毒科、足病毒科、丙型线形病毒科、传染性软化病毒科、光滑病毒科、黄症病毒科、Marnaviridae、海洋病毒科、裸露核糖核酸病毒科、野田病毒科、Permutotetraviridae、微小核糖核酸病毒科、马铃薯Y病毒科、杆状套病毒科、伴生豇豆病毒科、披衣病毒科、番茄丛矮病毒科、芜菁发黄镶嵌病毒科、帚状病毒科等的家族。

B.制备核酸文库

在一些实施方案中，本文公开了制备来源于本文公开的病原体的核酸分子的核酸文库的方法。在一些实施方案中，方法包括以下中的一种或多种：使核酸分子片段化，将片段化的核酸分子固定至本文所述的表面(例如，低非特异性结合表面)，并扩增表面结合的片段化的核酸分子。在一些实施方案中，片段化的核酸分子是环化的。在这样的实施方案中，使用滚环扩增来扩增环化的核酸分子。在一些实施方案中，固定片段化的核酸分子在环化之前或之后进行。在一些实施方案中，将片段化的核酸分子固定在表面上包括将片段化的核酸分子与表面结合的捕获核酸分子偶联，例如，通过杂交。在一些实施方案中，方法还包括使与环化核酸分子或其衍生物(例如，扩增子)的至少一部分互补的引物序列与其接触以形成用于测序反应的引发的核酸模板。

1.将核酸分子片段化

在一些实施方案中，本文提供了用于将已经获得的核酸片段化的方法。在一些实施方案中，片段化包括剪切、超声处理、限制性酶切、序列特异性核酸内切酶处理、序列非依赖性核酸内切酶处理和化学酶切以及其他剪切方法中的至少一种。各种剪切选择包括声剪切、点-槽剪切(point-sink shearing)和针剪切。在一些步骤中，限制性酶切是核酸分子的有意的序列特异性断裂。限制性酶切的一种类型是基于酶的处理，其通过同时切割双链核酸分子的两条链，或通过在双链核酸分子的每条链上产生切口以产生双链核酸分子断裂来断裂双链核酸分子。一种类型的超声处理通过暴露于短时间的超声处理而使核酸分子经受声空化和流体动力剪切。作为剪切的一种类型，声剪切将高频声能波传输到核酸分子。作为另一种类型的剪切，点-槽剪切使用注射泵，通过推动核酸文库通过小的突然收缩来产生流体动力剪切力。作为另一种类型的剪切，针剪切通过使DNA文库通过小规格针而产生剪切力。片段化后，一些双链核酸片段含有具有至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600bp或更多的核酸序列区域。在一些情况下，在片段化后，一些双链核酸片段含有小于约20的核酸序列区域。

在一些实施方案中，片段化还包括末端修复、黏性末端产生和突出端产生。一种类型的突出端生成包括5'端生成。一种类型的突出端生成包括3'端生成。一些步骤，例如末端修复、黏性末端产生或突出端产生在管中进行。用含有双链核酸片段、末端修复缓冲液和末端修复酶的溶液进行一些步骤，例如末端修复、黏性末端产生或突出端产生。

2.将片段化的核酸分子固定到表面

在一些实施方案中，本文提供了将片段化的核酸分子固定至本文所述表面的方法。在一些实施方案中，表面是低非特异性结合表面，例如亲水性表面。在一些实施方案中，固定包括使表面结合的捕获核酸分子与片段化的核酸分子的至少一部分(用作测序反应的模板)杂交。

捕获核酸分子：通常，一层或多层低非特异性结合材料中的至少一层可包括用于共价或非共价连接核酸分子的官能团，例如，接头或引物序列，或者至少一层可以在其沉积在支持体表面上时已经包括共价或非共价连接的核酸接头或引物序列。在一些情况下，栓系至至少一个第三层的聚合物分子的核酸接头或引物序列可以分布在遍及该层的多个深度处。

在一些情况下，核酸接头或引物分子与溶液中的聚合物共价偶联，即，在将聚合物偶联或沉积在表面上之前。在一些情况下，核酸接头或引物分子在其已偶联至或沉积于表面上之后共价偶联至聚合物。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包括多个共价连接的寡核苷酸接头或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水性聚合物包括多个共价连接的接头或引物分子。

在一些情况下，核酸接头或引物分子可使用多种合适的偶联化学中的任一种与一层或多层亲水性聚合物偶联。例如，寡核苷酸接头或引物序列可包括与胺基、羧基、硫醇基等反应的部分。可使用的合适的胺反应性共轭化学的实例包括但不限于涉及异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯基团的反应。合适的羧基反应性偶联化学的实例包括但不限于涉及碳二亚胺化合物例如水溶性EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·HCL)的反应。合适的巯基反应性偶联化学物质的实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。

一种或多种类型的核酸分子可以附着或栓系于支持体表面。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸接头或引物可包括间隔序列，用于与接头连接的模板文库核酸序列杂交的接头序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物、分子条形码序列或其任何组合。在一些情况下，可以将1个引物或接头序列栓系表面的至少一个层上。在一些情况下，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个不同的引物或接头序列可以栓系到表面的至少一个层上。

在一些情况下，栓系的核酸接头或引物序列的长度可以在约10个核苷酸至约100个核苷酸的范围内。在一些情况下，栓系的寡核苷酸接头或引物序列的长度可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸。在一些情况下，栓系的寡核苷酸接头或引物序列的长度可以是至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个核苷酸。在本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成包括在本公开内容内的范围，例如，在一些情况下，栓系的寡核苷酸接头或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。在一个实例中，栓系的寡核苷酸接头或引物序列的长度可具有此范围内的任何值，例如，约24个核苷酸。

在一些情况下，本公开的低结合支持体表面上的引物的所得表面密度可在约100个引物分子/μm

如上所列的局部密度不排除整个表面上的密度变化，使得表面可包括具有例如，500,000/μm

在一些情况下，栓系接头或引物序列可包括经设计以促进在低结合支持体上进行的核酸扩增的特异性和效率的修饰。例如，在一些情况下，引物可包括聚合酶终止点，使得表面偶联点和修饰位点之间的引物序列的延伸总是单链形式，并且在一些解旋酶依赖性等温扩增方法中充当5'至3'解旋酶的负载位点。可用于产生聚合酶终止点的引物修饰的其他实例包括但不限于将PEG链插入引物主链中朝向5'端的两个核苷酸之间，插入脱碱基核苷酸(即，既不具有嘌呤也不具有嘧啶碱基的核苷酸)或可被解旋酶绕过的损伤位点。

如将在以下实施方案中进一步讨论的，当使用给定的扩增方法时，可能期望改变栓系的寡核苷酸接头或引物在支持体表面上的表面密度或连接的接头或引物离开支持体表面的间距(例如，通过改变用于将接头或引物连接至表面的接头分子的长度)以“调节”支持体以获得最佳性能。如下所述，调节栓系的寡核苷酸接头或引物的表面密度可以影响在支持体上观察到的特异性或非特异性扩增的水平，其方式根据选择的扩增方法而变化。在一些情况下，栓系的核酸接头或引物的表面密度可以通过调节用于产生支持体表面的分子组分的比例来改变。例如，在使用核酸引物-PEG偶联物来产生低结合支持体的外层的情况下，寡核苷酸引物-PEG偶联物与非偶联的PEG分子的比率可以变化。然后可使用多种技术中的任一种来估计或测量栓系引物分子的所得表面密度。实例包括但不限于使用放射性同位素标记和计数方法，可裂解分子的共价偶联，可裂解分子包括可从限定区域的支持体表面裂解的光学可检测标签(例如，荧光标签)，收集在固定体积的适当溶剂中，然后通过将荧光信号与已知光学标签浓度的校准溶液的荧光信号进行比较来定量。或使用荧光成像技术，条件是注意标记反应条件和图像获取设置以确保荧光信号与表面上荧光团的数量线性相关(例如，表面上不存在荧光团的显著自猝灭)。

在一些情况下，本公开的低结合支持体表面上的核酸接头或引物的所得表面密度可以在约100个引物分子/μm

在一些实施方案中，文库中的核酸与表面(例如，低非特异性结合表面)偶联。在一些实施方案中，通过核酸分子的区域和与表面偶联的捕获分子的区域之间的杂交进行偶联。除非另有说明，杂交可以在任何长度的核酸之间发生，并且杂交的核酸可以采取许多结构形式中的一种或组合，包括但不限于：B-型、A-型、Z-型、茎环、假结或由两个或更多个单链核酸之间的碱基配对相互作用形成的其他杂交结构。在一些实施方案中，杂交发生在任何长度的两个单链核酸之间。在一些实施方案中，杂交发生在单链线性核酸和单链线性核酸之间。在一些实施方案中，杂交发生在单链线性核酸和单链环化核酸之间。在一些实施方案中，杂交发生在单链环化核酸和单链环化核酸之间。在一些实施方案中，杂交发生在DNA分子和DNA分子之间。在一些实施方案中，杂交发生在DNA分子和RNA分子之间。在一些实施方案中，杂交发生在RNA分子和RNA分子之间。在一些实施方案中，杂交发生在DNA分子和DNA/RNA杂交分子之间。在一些实施方案中，杂交发生在RNA分子和DNA/RNA杂交分子之间。在一些实施方案中，杂交发生在DNA/RNA杂交分子和DNA/RNA杂交分子之间。

在一些实施方案中，文库的核酸分子通过核酸分子的核酸序列和与表面偶联的一个或多个捕获核酸分子之间的杂交与表面偶联。在一些实施方案中，一种或多种捕获核酸分子是本文所述的夹板核酸分子，并且在本文所述的连接酶或其催化活性部分的存在下促进核酸分子在表面上的环化。

在一些实施方案中，一个或多个捕获核酸分子(在此称为表面结合引物)与核酸分子的一个或多个接头杂交，例如含有本文公开的索引序列的接头。在一些实施方案中，索引序列是可用作独特索引序列对的8至10个核苷酸的任何独特序列。

核酸分子与低结合支持体的杂交：在本公开内容的一些方面，描述了杂交缓冲液制剂，其与公开的低结合支持体组合，提供改善的杂交速率，杂交特异性(或严格性)和杂交效率(或产率)。如本文所用，杂交特异性是通常栓系接头序列，引物序列或寡核苷酸序列与完全互补序列正确杂交的能力的量度，而杂交效率是通常与互补序列杂交的总可用栓系接头序列，引物序列或寡核苷酸序列的百分比的量度。

通过优化与所公开的低结合性表面一起使用的杂交缓冲液制剂可以实现提高的杂交特异性或效率，这将在下面的实施方案中更详细地讨论。可以调节以实现改善的性能的杂交缓冲液组分的实例包括但不限于缓冲液类型、有机溶剂混合物、缓冲液pH、缓冲液粘度、洗涤剂和两性离子组分、离子强度(包括调节一价和二价离子浓度)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、BSA、聚(乙二醇)、硫酸葡聚糖、甜菜碱、其他添加剂等。

作为非限制性实例，用于配制杂交缓冲液的合适缓冲液可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、乙酸盐、Tris、TAPS、MOPS、PIPES、HEPES、MES等。合适缓冲液的选择通常取决于杂交缓冲液的目标pH。通常，缓冲溶液的合适pH可以是约pH4至约pH 8.4。在一些实施方案中，缓冲液pH可以是至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.2、至少6.4、至少6.6、至少6.8、至少7.0、至少7.2、至少7.4、至少7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.2或至少8.4。在一些实施方案中，缓冲液pH可以是至多8.4、至多8.2、至多8.0、至多7.8、至多7.6、至多7.4、至多7.2、至多7.0、至多6.8、至多6.6、至多6.4、至多6.2、至多6.0、至多5.5、至多5.0、至多4.5或至多4.0。本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，合适的pH可以是约6.4至约7.2。缓冲液pH可具有此范围内的任何值，例如，约7.25。

适用于杂交缓冲液制剂的去污剂包括但不限于两性离子去污剂(例如，1-十二烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、3-(4-叔丁基-1-吡啶)-1-丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸盐、ASB-C80、C7BzO、CHAPS、CHAPS水合物、CHAPSO、DDMAB、二甲基乙基铵丙烷磺酸盐、N,N-二甲基十二烷胺N-氧化物、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐或N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐)，和阴离子、阳离子和非离子去污剂。非离子去污剂的实例包括聚(氧乙烯)醚和相关聚合物(例如，

单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生比现有杂交方案快约2×至约20×的相对杂交速率。在一些情况下，相对杂交速率可以是现有杂交方案的至少2×、至少3×、至少4×、至少5×、至少6×、至少7×、至少8×、至少9×、至少10×、至少12×、至少14×、至少16×、至少18×、至少20×、至少25×、至少30×或至少40×。

在一些情况下，单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生小于60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的总杂交反应时间(即，达到杂交反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)，用于任何这些完成度量。

在一些情况下，与现有杂交方案相比，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生改善的杂交特异性。在一些情况下，可实现的杂交特异性优于10个杂交事件中的1个错配碱基、20个杂交事件中的1个错配碱基、30个杂交事件中的1个错配碱基、40个杂交事件中的1个错配碱基、50个杂交事件中的1个错配碱基、75个杂交事件中的1个错配碱基、100个杂交事件中的1个错配碱基、200个杂交事件中的1个错配碱基、300个杂交事件中的1个错配碱基、400个杂交事件中的1个错配碱基、500个杂交事件中的1个错配碱基、600个杂交事件中的1个错配碱基、700个杂交事件中的1个错配碱基、800个杂交事件中的1个错配碱基、900个杂交事件中的1个错配碱基、1,000个杂交事件中的1个错配碱基、2,000个杂交事件中的1个错配碱基、3,000个杂交事件中的1个错配碱基、4,000个杂交事件中的1个错配碱基、5,000个杂交事件中的1个错配碱基、6,000个杂交事件中的1个错配碱基、7,000个杂交事件中的1个错配碱基、8,000个杂交事件中的1个碱基错配、9,000个杂交事件中的1个碱基错配、或在10,000个杂交事件中的1个碱基错配。

在一些情况下，与现有杂交方案相比，单独使用所公开的低结合支持体或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生改善的杂交效率(例如，支持体表面上与靶寡核苷酸序列成功杂交的可用寡核苷酸引物的部分)。在一些情况下，对于以下指定的任何输入靶寡核苷酸浓度和以上指定的任何杂交反应时间，可实现的杂交效率优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些情况下，例如，其中杂交效率小于100％，与支持体表面杂交的靶核酸序列的所得表面密度可小于表面上寡核苷酸接头或引物序列的表面密度。

在一些情况下，使用现有杂交(或扩增)方案或优化的杂交(或扩增)方案将所公开的低结合支持体用于核酸杂交(或扩增)应用可导致对与支持体表面接触的靶(或样品)核酸分子的输入浓度的要求降低。例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以约10pM至约1μM范围内的浓度(即，在退火或扩增之前)与支持体表面接触。在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以至少10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM、至少50pM、至少100pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少600pM、至少700pM、至少800pM、至少900pM、至少1nM、至少10nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少50nM、至少60nM、至少70nM、至少80nM、至少90nM、至少100nM、至少200nM、至少300nM、至少400nM、至少500nM、至少600nM、至少700nM、至少800nM、至少900nM或至少1μM的浓度施用。在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以至多1μM、至多900nM、至多800nm、至多700nM、至多600nM、至多500nM、至多400nM、至多300nM、至多200nM、至多100nM、至多90nM、至多80nM、至多70nM、至多60nM、至多50nM、至多40nM、至多30nM、至多20nM、至多10nM、至多1nM、至多900pM、至多800pM、至多700pM、至多600pM、至多500pM、至多400pM、至多300pM、至多200pM、至多100pM、至多90pM、至多80pM、至多70pM、至多60pM、至多50pM、至多40pM、至多30pM、至多20pM或至多10pM的浓度施用。本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以约90pM至约200nM范围内的浓度施用。在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以具有该范围内的任何值(例如，约855nM)的浓度施用。

在一些情况下，单独或与优化的杂交缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何随后的固相或克隆扩增反应之前)为约0.0001个靶寡核苷酸分子/μm

换言之，在一些情况下，所公开的低结合支持体单独或与优化的杂交缓冲液制剂组合使用可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何随后的固相或克隆扩增反应之前)为约100个杂交的靶寡核苷酸分子/mm

在一些情况下，杂交到寡核苷酸接头或连接到低结合支持体表面的引物分子的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度可以在约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb的范围内。在一些情况下，靶寡核苷酸分子可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少0.6kb、至少0.7kb、至少0.8kb、至少0.9kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb或至少40kb的长度，或本文所述范围所跨越的任何中间值，例如，至少0.85kb的长度。

在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括单链或双链多聚体核酸分子，其还包括规则出现的单体单元的重复序列。在一些情况下，单链或双链多聚体核酸分子可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、或至少20kb、至少30kb、或至少40kb的长度，或本文所述范围所跨越的任何中间值，例如，约2.45kb的长度。

在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括单链或双链多聚体核酸分子，单链或双链多聚体核酸分子包括约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95和至少100。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3或至多2。本段中的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是约4至约60。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可具有该范围内的任何值，例如，约17。因此，在一些情况下，就支持体表面每单位面积的靶序列拷贝数而言，杂交的靶序列的表面密度可超过寡核苷酸引物的表面密度，即使杂交效率低于100％。

i.固定化靶核酸的扩增

在一些实施方案中，本文提供了扩增核酸分子的方法。在一些实施方案中，这样的扩增在溶液中进行。在一些实施方案中，这样的施用在表面上进行。在一些实施方案中，在对核酸分子或其衍生物测序之前进行扩增。

核酸表面扩增(NASA)：如本文所用，短语“核酸表面扩增”(NASA)可与短语“固相核酸扩增”(或简称为“固相扩增”)互换使用。在本公开的一些方面，描述了核酸扩增制剂，其与所公开的低结合支持体组合提供了改善的扩增速率，扩增特异性和扩增效率。如本文所用，特异性扩增是指扩增共价或非共价栓系到固相支持体上的模板文库寡核苷酸链。如本文所用，非特异性扩增是指引物-二聚体或其他非模板核酸的扩增。如本文所用，扩增效率是支持体表面上在给定扩增循环或扩增反应期间成功扩增的栓系寡核苷酸的百分比的量度。在本文公开的表面上进行的核酸扩增可获得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％、如98％或99％的扩增效率。

多种热循环或等温核酸扩增方案中的任一种可与所公开的低结合支持体一起使用。可与所公开的低结合支持体一起使用的核酸扩增方法的实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增、环对环扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增或单链结合(SSB)蛋白依赖性扩增。

通常，扩增速率、扩增特异性和扩增效率的改进可以单独使用公开的低结合支持体或与扩增反应组分的制剂组合使用来实现。除了包括核苷酸、一种或多种聚合酶、解旋酶、单链结合蛋白等(或其任何组合)之外，可以以多种方式调节扩增反应混合物以实现改善的性能，包括但不限于选择缓冲液类型、缓冲液pH、有机溶剂混合物、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括调节单价和二价离子浓度)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、BSA、聚(乙二醇)、硫酸葡聚糖、甜菜碱、其他添加剂等。

与使用现有支持体和扩增方案获得的扩增速率相比，单独使用公开的低结合支持体或与优化的扩增反应制剂组合使用公开的低结合支持体可产生增加的扩增速率。在一些情况下，可以实现的相对扩增速率可以是至少2×、至少3×、至少4×、至少5×、至少6×、至少7×、至少8×、至少9×、至少10×、至少12×、至少14×、至少16×、至少18×、或至少20×、其上述任何扩增方法的现有支持体和扩增方案。

在一些情况下，所公开的低结合支持体单独使用或与优化的缓冲液制剂组合使用可产生小于180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、1分钟、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒的总扩增反应时间(即，达到扩增反应的90％、95％、98％或99％完成所需的时间)，用于任何这些完成度量。

本文公开的一些低结合支持体表面表现出至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1的荧光团如Cy3的特异性结合与非特异性结合的比率，或本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面表现出荧光团如Cy3的特异性与非特异性荧光信号的比率为至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1、或大于100:1，或本文范围内的任何中间值。

在一些情况下，单独使用或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可实现不超过60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟的更快扩增反应时间(即，达到扩增反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。类似地，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可使扩增反应在一些情况下在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或不超过30个循环内完成。

在一些情况下，与使用现有支持体和扩增方案获得的结果相比，单独使用所公开的低结合支持体或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生增加的特异性扩增或减少的非特异性扩增。在一些情况下，可实现的特异性扩增与非特异性扩增的所得比率为至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1或1,000:1。

在一些情况下，与使用现有支持体和扩增方案获得的扩增效率相比，单独使用低结合支持体或与优化的扩增反应制剂组合使用低结合支持体可产生增加的扩增效率。在一些情况下，可以实现的扩增效率在以上指定的扩增反应时间的任一个中优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。

在一些情况下，与附着于低结合支持体表面的寡核苷酸接头或引物分子杂交的克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度可以在约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb的范围内。在一些情况下，克隆扩增的靶寡核苷酸分子可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、或至少20kb的长度、或本文所述范围所跨越的任何中间值，例如，至少0.85kb的长度。

在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括单链或双链多聚体核酸分子，其还包括规则出现的单体单元的重复序列。在一些情况下，克隆扩增的单链或双链多聚体核酸分子可以是至少0.1kb的长度、至少0.2kb的长度、至少0.3kb的长度、至少0.4kb的长度、至少0.5kb的长度、至少1kb的长度、至少2kb的长度、至少3kb的长度、至少4kb的长度、至少5kb的长度、至少6kb的长度、至少7kb的长度、至少8kb的长度、至少9kb的长度、至少10kb的长度、至少15kb的长度、或至少20kb的长度，或本文所述范围所跨越的任何中间值，例如，约2.45kb的长度。

在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括单链或双链多聚体核酸分子，单链或双链多聚体核酸分子包括约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95和至少100。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3或至多2。本段中的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是约4至约60。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可具有该范围内的任何值，例如，约12。因此，在一些情况下，即使杂交或扩增效率低于100％，以支持体表面每单位面积靶序列的拷贝数表示的克隆扩增的靶序列的表面密度也可能超过寡核苷酸引物的表面密度。

在一些情况下，与使用现有支持体和扩增方案获得的克隆拷贝数相比，单独使用所公开的低结合支持体或与优化的扩增反应制剂组合使用可产生增加的克隆拷贝数。在一些情况下，例如，其中克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子包括单体靶序列的串联的多聚体重复序列，克隆拷贝数可以显著小于使用现有支持体和扩增方案获得的克隆拷贝数。因此，在一些情况下，克隆拷贝数可在每个扩增群体约1个分子至约100,000个分子(例如，靶序列分子)的范围内。在一些情况下，克隆拷贝数可以是每个扩增群体至少1、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000或至少100,000个分子。在一些情况下，克隆拷贝数可以是每个扩增群体至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,000、至多8,000、至多7,000、至多6,000、至多5,000、至多4,000、至多3,000、至多2,000、至多1,000、至多500、至多100、至多50、至多10、至多5或至多1个分子。本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，克隆拷贝数可以在约2,000个分子至约9,000个分子的范围内。在一些情况下，克隆拷贝数可具有该范围内的任何值，例如，在一些情况下约2,220个分子，或在其他情况下约2个分子。

如上所述，在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括单体靶序列的连接的多聚体重复序列。在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包括多个分子，每个分子包括单个单体靶序列。因此，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合支持体可导致靶序列拷贝的表面密度为约100个靶序列拷贝/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度为约100个分子/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度为约100个分子/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合支持体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸集落(或簇)的表面密度为约100个集落/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合支持体可产生来源于扩增和标记的核酸群体的信号(例如，荧光信号)，其具有不大于50％，诸如50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或小于5％的变异系数。

类似地，在一些情况下，将优化的扩增反应制剂与所公开的低结合支持体组合使用产生来源于核酸群体的信号，该信号具有不大于50％，例如50％、40％、30％、20％、10％或小于10％的变异系数。

在一些情况下，如本文所公开的支持体表面和方法允许在升高的延伸温度下扩增，如在15℃、20℃、25℃、30℃、40℃或更高、或例如在约21℃或23℃下。

在一些情况下，使用本文公开的支持体表面和方法能够简化扩增反应。例如，在一些情况下，使用不超过1、2、3、4或5个离散试剂进行扩增反应。

在一些情况下，如本文所公开的支持体表面和方法的使用使得能够在扩增期间使用简化的温度曲线，使得反应在从15℃、20℃、25℃、30℃或40℃的低温到40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或大于80℃的高温(例如，20℃到65℃的范围)的温度下进行。

还改进了扩增反应，使得较低量的模板(例如，靶或样品分子)足以在表面上产生可辨别的信号，例如1pM、2pM、5pM、10pM、15pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM、1,000pM、2,000pM、3,000pM、4,000pM、5,000pM、6,000pM、7,000pM、8,000pM、9,000pM、10,000pM或大于10,000pM的样品，例如500nM。在一个例子中，约100pM的输入足以产生用于可靠信号确定的信号。

C.鉴定核酸序列

在一些实施方案中，本文公开了鉴定本文公开的病原体的核酸序列的方法。在一些实施方案中，病原体是严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，鉴定核酸序列包括测序。在一些实施方案中，鉴定核酸序列包括靶向富集病原体基因组的区域，例如使用对病原体基因组内的区域特异的一组核酸探针。在一些实施方案中，鉴定病原体的完整基因组。在一些实施方案中，在冠状病毒的情况下，鉴定基因组的区域。在一些实施方案中，编码冠状病毒结构蛋白的区域包括刺突糖蛋白、核衣壳蛋白、包膜糖蛋白或膜糖蛋白或其组合。

1.核酸测序

在一些实施方案中，本文提供了用于进行本文所述的核酸文库(例如，环化的核酸分子及其衍生物)的核酸测序的方法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，测序包括使用酶以5'至3'方向将标记的核苷酸顺序添加至生长的核酸，其中生长的核酸与固定在表面上的靶核酸互补。在一些实施方案中，标记的核苷酸可以用荧光标记、生物素、本文所述的其他标记或其任何组合来标记。当生长的核酸顺序地掺入标记的核苷酸时，可以例如通过荧光成像检测标记，从而确定核苷酸的碱基同一性。在一些实施方案中，酶是聚合酶、连接酶或本文公开的另一种酶。

在一个示例方法中，通过组合本文公开的一些方法，碱基识别(base-calling)信号强度被显着地提高。在该方法中，来源于本文公开的病原体(例如，SARS-CoV-2)的靶核酸被环化并固定在表面上。在一些实施方案中，靶核酸通过与表面结合引物杂交而固定，表面结合引物通过本文公开的合适机制(例如，硅烷化学)附着于表面。在表面环化的情况下，在一些实施方案中，表面结合的引物可以是夹板核酸分子，其被设计为在本文所述的连接酶的存在下促进线性靶核酸的环化。在溶液内环化的情况下，在一些实施方案中，环化的靶核酸通过与表面结合的引物杂交而结合至表面，该表面结合的引物含有与存在于环化的靶核酸中的索引序列互补的核酸序列(使用本文的方法引入)。在一些实施方案中，使用环化核酸作为模板进行滚环扩增以在表面上产生包括环状核酸模板的多个拷贝的扩增子。在一些实施方案中，拷贝是包括相同序列(靶核酸序列)的多个拷贝的多联体。在一些实施方案中，那些扩增子(在本文中称为靶核酸的“衍生物”)是线性的。在一些实施方案中，引物序列与环化核酸或其衍生物杂交以形成用于测序反应的引发的核酸模板。测序(例如，碱基识别)通过将聚合酶和标记的核苷酸或核苷酸部分引入到引发的模板而开始，其中聚合酶识别引发的模板的引物并与引发的模板可逆地结合。在一些实施方案中，核苷酸被直接标记(例如，如在核苷酸的碱基处)。在一些实施方案中，核苷酸未被标记。在一些实施方案中，核苷酸部分偶联至被标记的聚合物核(例如，核苷酸-聚合物偶联物)。在一些实施方案中，照射标记以产生光学检测的信号。在一些实施方案中，洗去标记的核苷酸或核苷酸部分，并将未标记的核苷酸dNTP引入系统。在一些实施方案中，引发的模板被封端，从而防止标记的核苷酸或核苷酸部分的掺入。在这样的实施方案中，在洗去标记的核苷酸或核苷酸部分后进行去封闭步骤以允许掺入未标记的核苷酸。引发的模板和核苷酸dNTP在聚合酶的活性位点附近结合在一起，聚合酶催化将核苷酸dNTP添加到与引发的模板互补的生长链中的反应，结束一轮碱基识别过程。在一些实施方案中，dNTP在其糖的3'位用阻断基团修饰。在一些实施方案中，阻断基团包括3'-O-叠氮基、3'-O-叠氮甲基、3'-O-烷基羟氨基、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基或3'-O-氨基或其衍生物。通过重复碱基识别过程，可以确定环状核酸或其衍生物的完整序列。

在一些实施方案中，环化，固定化和扩增之间的顺序可以以任何顺序进行，例如：环化、固定化，然后扩增；环化、扩增，然后固定化；固定化、环化，然后扩增；固定化、扩增，然后环化；扩增、环化，然后固定化；或扩增、固定化，然后环化。

在一些实施方案中，可将接头或引物并入靶核酸的序列中作为方法中的额外步骤，在非限制性实例中，诸如：固定化、接头或引物掺入、环化，然后扩增。在一些实施方案中，可将接头或引物并入靶核酸的序列中作为方法中的额外步骤，在非限制性实例中，诸如：固定化、环化、接头或引物掺入，然后扩增。

多价结合或掺入组合物。本文公开了制备多价结合或掺入组合物的方法，所述方法包括：a)聚合物核；和b)与聚合物核连接的两个或更多个核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分；其中接头的长度取决于与聚合物核连接的核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分。本文还公开了制备多价结合组合物的方法，所述方法包括：a)聚合物-核苷酸偶联物的混合物，其中每个聚合物-核苷酸偶联物包括：i)聚合物核；和ii)连接至聚合物核的两个或更多个核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分，其中接头的长度取决于连接至聚合物核的核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分；并且其中混合物包括具有至少两种不同类型的连接的核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分的聚合物-核苷酸偶联物。在一些实施方案中，聚合物核包括具有多个分支的聚合物，并且两个或更多个核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物部分连接至所述分支。在一些实施方案中，聚合物具有星形，梳形、交联、瓶刷或树枝状大分子构型。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸偶联物包括一个或多个结合基团，结合基团选自抗生物素蛋白、生物素、亲和标签及其组合。在一些实施方案中，聚合物核包括支链聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸偶联物包括封端的核苷酸部分。在一些实施方案中，封端的核苷酸是3'-O-叠氮基甲基核苷酸、3'-O-甲基核苷酸或3'-O-烷基羟胺核苷酸。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸偶联物还包括一种或多种荧光标记。

本文公开了制备多价结合组合物和分析核酸分子的方法，包括测序或其他生物测定应用。可通过增加核苷酸的有效浓度来影响核苷酸与酶(例如，聚合酶)或酶复合物的结合或并入的增加。增加可以通过增加游离溶液中核苷酸的浓度，或通过增加邻近相关结合或掺入位点的核苷酸的量来实现。该增加还可以通过将核苷酸的数目物理限制在有限的体积中从而导致浓度的局部增加来实现，并且这样的结构因此可以结合或掺入结合或掺入位点，其具有比用未偶联的，未栓系的或以其他方式不受限制的单个核苷酸所观察到的更高的表观亲合力。实现这种限制的一种非限制性机制是通过提供多价结合或掺入组合物，其中多个核苷酸与颗粒如聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、胶束、脂质体、微粒、纳米颗粒、量子点或其他合适的颗粒结合。

本文公开的多价结合或掺入组合物可包括至少一种颗粒-核苷酸偶联物，如图12所示，并且颗粒-核苷酸偶联物具有附着于颗粒的相同核苷酸的多个拷贝。当核苷酸与靶核酸互补时，颗粒-核苷酸偶联物与聚合酶和靶核酸形成结合或掺入复合物，并且结合或掺入复合物表现出比使用单个未偶联或未栓系的核苷酸形成的结合或掺入复合物增加的稳定性和更长的持续时间。多价结合组合物的核苷酸部分中的每一个可结合至已引发的靶核酸分子的互补N+1核苷酸，从而形成包括两个或更多个靶核酸分子，两个或更多个聚合酶(或其他酶)分子和多价结合组合物(例如，聚合物-核苷酸偶联物)的多价结合复合物。多价结合组合物的核苷酸部分中的每一个可结合至已引发的靶核酸分子的互补N核苷酸，从而形成包括两个或更多个靶核酸分子，两个或更多个聚合酶(或其他酶)分子和多价结合组合物(例如，聚合物-核苷酸偶联物)的多价结合复合物。在掺入将复制链延长1个碱基的经修饰的可逆封端的核苷酸之前，核苷酸可从该结合的复合物探察互补碱基。此外，有可能设想用结合的复合物探询N核苷酸，用可逆终止的核苷酸向前步进，随后探测N+1碱基以进行解封闭前后。可以执行错误检查和通过读取两次询问来提高碱基识别的总准确度。与现有方法的重要区别因素是用于查询匹配碱基的结合，而步进或掺入操作用于在伸长的链上向前移动。

多价结合或掺入组合物可用于将可检测信号定位于生物化学相互作用的活性区域，如蛋白质-核酸相互作用的位点、核酸杂交反应、或酶反应，如聚合酶反应。例如，本文所述的多价结合或掺入组合物可用于鉴定聚合酶反应期间延伸核酸链中碱基掺入的位点，并为测序和基于阵列的应用提供碱基辨别。当核苷酸与靶核酸互补时，在多价结合或掺入组合物中靶核酸与核苷酸之间增加的结合或掺入提供了增强的信号，这极大地提高了碱基识别的准确度并缩短了成像时间。

此外，制备和使用多价结合组合物的方法允许来源于给定序列的测序信号在含有靶序列的多个拷贝的簇区域内产生。掺入多拷贝靶序列的测序方法的优点在于，由于在限定区域内存在多个同时的测序反应，可以扩增信号，每个测序反应提供其自身的信号。由于来源于大量正确碱基识别的信号可压倒来源于较少数量的跳过或不正确碱基识别的信号，因此提供了用于减少定相误差或改善测序反应中的读取长度的方法，所以在限定区域内存在多个信号减少任何单个跳过循环的影响。

在一些实施方案中，制备和使用本文公开的所述多价结合组合物的方法导致以下中的一种或多种：(i)与常规核酸扩增和测序方法相比，更强的信号以获得更好的碱基识别准确度；ii)允许序列特异性信号与背景信号的更大区别；(iii)减少对起始材料的量的要求，(iv)增加测序速率和缩短测序时间；(v)减少定相误差，和(vi)改善测序反应中的读长。

本公开提供了使用包括颗粒(例如，纳米颗粒或聚合物核)的组合物的方法，所述颗粒包括多种酶或蛋白结合或掺入基底，其中酶或蛋白结合或掺入基底与一种或多种酶或蛋白结合以形成一种或多种结合或掺入复合物(例如，多价结合或掺入复合物)，并且其中所述结合或掺入可通过观察一种或多种结合或掺入复合物的位置、存在、或持续性来监测或鉴定。在一些实施方案中，所述颗粒可包括聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、脂质体、胶束、纳米颗粒或量子点。在一些实施方案中，所述基底可包括核苷酸、核苷、核苷酸类似物或核苷类似物。在一些实施方案中，酶或蛋白质结合或掺入基底可包括可与聚合酶结合的试剂。在一些实施方案中，酶或蛋白质可包括聚合酶。在一些实施方案中，所述观察一种或多种结合或掺入复合物的位置、存在或持续性可包括荧光检测。

在一些实施方案中，本公开提供了包括如本文所公开的多个不同颗粒的组合物，其中每个颗粒包括单一类型的核苷或核苷类似物，并且其中每个核苷或核苷类似物与可检测地不同发射或激发波长的荧光标记相关联。在一些实施方案中，本公开提供了使用所述组合物的方法，组合物在颗粒上还包括一种或多种标记物，例如，荧光标记物。在一些实施方案中，本公开提供所述组合物，其中组合物包括栓系至颗粒的至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20个或多于20个栓系核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物。在一些实施方案中，本公开提供了使用所述组合物的方法，其中核苷或核苷类似物以0.001至1,000,000/μm

在一些聚合物-核苷酸偶联物中，聚合物核可以具有对应于1K Da、2K Da、3K Da、4K Da、5K Da、10K Da、15K Da、20K Da、30K Da、50K Da、80K Da、100K Da，或由前述中任意两个限定的范围内的任何值的表观分子量的大小。聚合物的表观分子量可以由代表性数量的亚单元的已知分子量计算，如通过尺寸排阻色谱法测定，如通过质谱法测定，或如通过任何其他方法测定。

在一些支化聚合物中，支链可具有对应于1K Da、2K Da、3K Da、4K Da、5K Da、10KDa、15K Da、20K Da、30K Da、50K Da、80K Da、100K Da或前述中任意两个限定的范围内的任何值的表观分子量的大小。聚合物的表观分子量可以由代表性数量的亚单元的已知分子量计算，如通过尺寸排阻色谱法测定，如通过质谱法测定，或如通过任何其他方法测定。聚合物可具有多个分支。聚合物中支链的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、12、16、24、32、64、128或更多，或落入由这些值中的任何两个限定的范围内的数目。

对于包括例如，包括4、8、16、32或64个分支的分支PEG的分支聚合物的聚合物-核苷酸偶联物，聚合物核苷酸偶联物可具有连接至PEG分支末端的核苷酸，使得每个末端具有连接至其的0、1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸。在一个非限制性实例中，3至128个PEG臂的支化PEG聚合物可具有连接至聚合物分支的末端的一个或多个核苷酸，使得每个末端具有连接至其的0、1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有偶数个臂。在一些实施方案中，支化聚合物或树枝状大分子具有奇数个臂。

在一些情况下，接头(例如，PEG接头)的长度可以在约1nm至约1,000nm的范围内。在一些情况下、接头的长度可以是至少1nm、至少10nm、至少25nm、至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm、至少600nm、至少700nm、至少800nm、至少900nm或至少1,000nm。在一些情况下，接头的长度可以在本段中的任何两个值之间。例如，在一些情况下，接头的长度可以在约75nm至约400nm的范围内。在一些情况下，接头的长度可以具有在本段中的值的范围内的任何值，例如，834nm。

在一些情况下，接头的长度对于不同的核苷酸(包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、核苷酸类似物(包括脱氧核糖核苷酸类似物和核糖核苷酸类似物)、核苷(包括脱氧核糖核苷或核糖核苷)或核苷类似物(包括脱氧核糖核苷类似物或核糖核苷类似物)是不同的。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，脱氧腺苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，脱氧鸟苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，胸苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，脱氧尿苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，脱氧胞苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，腺苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物中的一种包括例如，鸟苷，并且接头的长度在1nm与1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，5-甲基-尿苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，尿苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。在一些情况下，核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物之一包括例如，胞苷，并且接头的长度在1nm和1,000nm之间。

在聚合物-核苷酸偶联物中，聚合物的每个分支或分支的子集可具有与其连接的包括核苷酸的部分(例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤残基或其衍生物或模拟物)，并且部分能够结合或掺入聚合酶、逆转录酶或其他核苷酸结合或掺入结构域。任选地，所述部分能够在聚合酶反应期间掺入到延伸的核酸链中。在一些情况下，部分可被封端，使得其在聚合酶反应期间不能掺入到延伸的核酸链中。在一些其他情况下，所述部分可以被可逆地封端，使得它不能在聚合酶反应期间掺入到延伸的核酸链中，直到这种封端被去除，此后所述部分然后能够在聚合酶反应期间掺入到延伸的核酸链中。

核苷酸可以通过核苷酸的5'端偶联至聚合物分支。在一些情况下，可以修饰核苷酸以便在聚合酶反应期间抑制或防止核苷酸掺入到延伸的核酸链中。作为实例，核苷酸可包括3'脱氧核糖核苷酸，3'叠氮核苷酸，3'-甲基叠氮核苷酸，或本领域已知或可能已知的其他此类核苷酸，以便在聚合酶反应期间不能掺入到延伸的核酸链中。在一些实施方案中，核苷酸可包括3'-O-叠氮基、3'-O-叠氮甲基、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-烷基羟氨基或3'-O-苄基。在一些实施方案中，核苷酸缺乏3'羟基。

聚合物还可以在每个分支或分支的子集中具有结合或并入部分。结合或掺入部分的一些实例包括但不限于生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素等、多组氨酸结构域、互补配对核酸结构域、G-四重峰形成核酸结构域、钙调蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素酶、麦芽糖、蔗糖、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽、O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、苄基鸟嘌呤及其衍生物、苄基半胱氨酸及其衍生物、抗体、表位、蛋白A、蛋白G。结合或掺入部分可以是本领域已知的任何相互作用分子或其片段，以结合或促进蛋白质之间，蛋白质和配体之间，蛋白质和核酸之间，核酸之间或小分子相互作用结构域或部分之间的相互作用。

不希望受任何特定理论的束缚，已观察到本文公开的多价结合组合物与聚合酶核苷酸复合物缔合，以便以时间依赖性的速率形成三元结合复合物，尽管基本上比游离溶液中的核苷酸可获得的缔合速率慢。因此，开启速率(K

在一些情况下，使用所公开的颗粒-核苷酸或聚合物-核苷酸偶联物形成的多价结合复合物的持续时间在非去稳定条件下可以在约0.1秒至约600秒的范围内。在一些情况下，持续时间可以是至少0.1秒、至少1秒、至少2秒、至少3秒、至少4秒、至少5秒、至少6秒、至少7秒、至少8秒、至少9秒、至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少120秒、至少180秒、至少240秒、至少300秒、至少360秒、至少420秒、至少480秒、至少540秒、或至少600秒。在某些情况下，持续时间可以在本段中指定的任何两个值之间变化。例如，在一些情况下，持续时间可以在约10秒至约360秒的范围内。在一些情况下，持续时间可以具有在本段中指定的值的范围内的任何值，例如，78秒。

在各种实施方案中，适用于本文的结合或掺入相互作用的聚合酶可包括本领域已知或可能已知的任何聚合酶。合适的聚合酶的实例可包括但不限于：Klenow DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq聚合酶)、KlenTaq聚合酶和噬菌体T7 DNA聚合酶；人α、δ和εDNA聚合酶；噬菌体聚合酶如T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶，强烈火球菌DNA聚合酶(Pfu聚合酶)；枯草芽孢杆菌DNA聚合酶III，和大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和ε；9度N聚合酶，逆转录酶如HIV M型或O型逆转录酶、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶、或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、或端粒酶。DNA聚合酶的其他非限制性实例可包括来源于各种古细菌属的那些，如气火菌属、Archaeglobus、除硫球菌属、火棒菌属、火球菌属、火叶菌属、嗜热菌、葡萄热菌属、施铁特菌属、硫化叶菌属、高温球菌属和火山鬃菌属等或其变体，包括聚合酶如Vent

当聚合物-核苷酸偶联物上的核苷酸与靶核酸互补时，三元复合物具有比非互补核苷酸更长的存留时间。当聚合物-核苷酸偶联物上的核苷酸与靶核酸互补时，三元复合物还具有比未偶联或栓系的互补核苷酸更长的存留时间。例如，在一些实施方案中，所述三元复合物可具有小于1s、大于1s、大于2s、大于3s、大于5s、大于10s、大于15s、大于20s、大于30s、大于60s、大于120s、大于360s，大于3600s或更大的持续时间，或在由这些值中的任何两个或更多个限定的范围内的持续时间。

例如，通过观察结合复合物的开始或持续时间，例如通过观察来源于结合复合物的标记组分的信号，可以测量持续时间。例如，标记的核苷酸或包括一个或多个核苷酸的标记的试剂可以存在于结合复合物中，从而允许在结合复合物的存留期间检测来源于标记的信号。

已经观察到，用不同的盐或离子可实现不同范围的存留时间，这表明例如在镁离子(Mg

可以通过改变缓冲液条件来控制三元复合物的解离。在成像操作之后，使用具有增加的盐含量的缓冲液来引起三元复合物的解离，使得标记的聚合物-核苷酸偶联物可以被洗出，从而提供信号可以被衰减或终止的机制，例如在一个测序循环与下一个测序循环之间的过渡中。在一些实施方案中，这种解离可以通过用缺乏金属或辅因子的缓冲液洗涤络合物来实现。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可包括一种或多种组合物以维持pH控制。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可包括一种或多种一价阳离子，例如钠。在一些实施方案中，洗涤缓冲液缺少或基本上缺少二价阳离子，例如，没有或基本上没有锶、钙、镁或锰。在一些实施方案中，洗涤缓冲液还包括螯合剂，例如，EDTA、EGTA、次氮基三乙酸、聚组氨酸、咪唑等。在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以将环境的pH保持在与结合的复合物相同的水平。在一些实施方案中，相对于结合的复合物所见的水平，洗涤缓冲液可以升高或降低环境的pH。在一些实施方案中，pH可以在2-4、2-7、5-8、7-9、7-10的范围内，或低于2，或高于10，或由本文提供的任何两个值限定的范围内。

特定离子的加入可影响聚合酶与引发的靶核酸的结合，三元复合物的形成，三元复合物的解离，或例如在聚合酶反应期间将一个或多个核苷酸掺入到延伸的核酸中。在一些实施方案中，相关阴离子可包括氯离子、乙酸根、葡糖酸根、硫酸根、磷酸根等。在一些实施方案中，可通过添加一种或多种酸，碱或盐(诸如NiCl

本公开考虑将包括至少一种颗粒-核苷酸偶联物的多价结合或掺入组合物与一种或多种聚合酶接触。接触可以任选地在一种或多种靶核酸的存在下进行。在一些实施方案中，所述靶核酸是单链核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是引发的单链核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是双链核酸。在一些实施方案中，所述接触包括使多价结合或掺入组合物与一种聚合酶接触。在一些实施方案中，所述接触包括使包括一种或多种核苷酸的所述组合物与多种聚合酶接触。聚合酶可以与单个核酸分子结合。

靶核酸可以指具有一个或多个核酸分子的靶核酸样品。在一些实施方案中，靶核酸可包括多个核酸分子。在一些实施方案中，靶核酸可包括两个或更多个核酸分子。在一些实施方案中，靶核酸可包括具有相同序列的两个或更多个核酸分子。

靶核酸和多价结合组合物之间的结合可以在聚合酶的存在下提供，聚合酶已无催化活性。在一个实施方案中，可以通过突变使聚合酶失去催化活性。在一个实施方案中，聚合酶可以通过化学修饰而变得无催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可以通过不存在基底、离子或辅因子而变得无催化活性。在一些实施方案中，聚合酶可能由于不存在镁离子而变得无催化活性。

靶核酸和多价结合组合物之间的结合在聚合酶的存在下发生，其中结合溶液，反应溶液或缓冲液缺乏镁或锰。或者，靶核酸与多价结合组合物之间的结合在聚合酶存在下发生，其中结合溶液、反应溶液或缓冲液包括钙或锶。

当使用无催化活性的聚合酶帮助核酸与多价结合组合物相互作用时，所述组合物和所述聚合酶之间的相互作用使三元复合物稳定，从而使复合物可通过荧光或通过本文公开的或本领域已知的其他方法检测。在检测三元结合复合物之前，可以任选地洗去未结合的聚合物-核苷酸偶联物。

使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸偶联物在含有钙或镁之一或含有钙和镁两者的溶液中接触。或者，使一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸偶联物在缺乏钙或镁之一或缺乏钙或镁两者的溶液中接触，并且在单独的操作中，不考虑操作的顺序，向溶液中加入钙或镁之一或钙和镁两者。在一些实施方案中，一种或多种核酸与本文公开的聚合物-核苷酸偶联物在缺乏锶的溶液中接触，并且包括在单独的操作中，不考虑操作的顺序，向溶液中加入锶。

如本文所用，如果荧光来源于与表面退火或以其他方式栓系的荧光团，例如通过具有与表面上的寡核苷酸的相应片段反向互补的区域并与所述相应区段退火的核酸，则荧光是“特异性的”。该荧光与由未通过这种退火过程栓系于表面的荧光团产生的荧光形成对比，或者在一些情况下与表面的背景荧光形成对比。

配对末端测序。在一些实施方案中，配对末端测序允许通过从靶双链核酸分子的5'至3'双链(有义和反义)测序对核酸分子的两端进行测序，这提高了测序准确度。靶双链核酸分子的正向和反向链可以同时测序，从而与顺序测序正向和反向链的常规测序技术相比，将测序反应的速度降低一半。这可以通过在已知的阵列或表面上空间分离正向和反向链来实现。以这种方式，与正向链已知接近的相应反向核酸分子可被鉴定为例如同时测序。

本文公开了用于对含有靶双链核酸分子的正向和反向链的环状核酸分子进行配对末端测序的方法和系统。可以使用本文所述方法生成靶核酸分子的文库。在一些实施方案中，环状核酸分子是包括正向和反向链的单一测序模板，并且其可包括引物附着位点，允许同时测序(通过使用相同或不同的引物)或顺序测序(例如通过对正向和反向链使用不同的引物)。

所公开的确定靶核酸序列的方法包括：a)使包括待测序的模板链和待延伸的引物链的双链或部分双链靶核酸分子与一种或多种所公开的核酸结合组合物接触；和b)检测核酸结合组合物与核酸分子的结合，从而确定所述一种或多种核酸结合组合物中的一种在所述核酸分子上的存在以及待掺入互补链中的下一个核苷酸(即，N+1或末端核苷酸)的同一性。

测序方法可还包括将N+1或末端核苷酸掺入引物链，然后重复接触，检测和掺入操作一次或多次另外的迭代，从而确定核酸分子模板链的序列。在检测三元结合复合物的操作之后，在进行另一轮分析之前，引发的靶核酸的引发的链延伸一个碱基。可以使用与多价结合组合物中的聚合物连接的偶联的核苷酸或使用在多价结合组合物被去除后提供的未偶联的或未栓系的游离核苷酸来延伸引发的靶核酸。

由于链上的封端核苷酸或使用无催化活性的聚合酶，可以阻止或抑制引发的靶核酸的延伸。当聚合物-核苷酸偶联物中的核苷酸具有阻止核酸延伸的阻断基团时，可以通过从所述核苷酸去除阻断基团(例如通过从其聚合物、支化聚合物、树枝状大分子、颗粒等上分离所述核苷酸)来实现核苷酸的掺入。当由于使用无催化活性的聚合酶而抑制引发的靶核酸的延伸时，可通过提供辅因子或激活因子如金属离子来实现核苷酸的掺入。

用于测序的多价结合组合物的使用有效地缩短了测序时间。包括接触，检测和掺入操作的测序反应循环在约5分钟至约60分钟的总时间内进行。在一些情况下，测序反应循环在至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟内进行。在一些情况下，测序反应循环在至多60分钟、至多50分钟、至多40分钟、至多30分钟、至多20分钟、至多10分钟或至多5分钟内进行。本段中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，测序反应循环可以在约10分钟至约30分钟的总时间范围内进行。在一些情况下，测序循环时间可以具有该范围内的任何值，例如，约16分钟。

在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法将在测序运行的过程中提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％正确的平均碱基识别准确度。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的组合物和方法将提供每1,000个碱基、10,0000个碱基、25,000个碱基、50,000个碱基、75,000个碱基或100,000个碱基的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％正确的平均碱基识别准确度。

用于测序的多价结合组合物的使用提供了更准确的碱基读出。所公开的用于核酸测序的方法将提供在约20至约50范围内的测序运行中碱基识别准确度的平均Q评分。在一些情况下，平均Q评分为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些情况下，平均Q评分可具有此范围内的任何值，例如，约32。

在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于30的Q评分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于35的Q评分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于40的Q评分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于45的Q评分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％将提供大于50的Q评分。

2.检测方法

支持体表面的荧光成像：所公开的固相核酸扩增反应制剂和低结合支持体可用于多种核酸分析应用中的任一种，例如，核酸碱基辨别、核酸碱基分类、核酸碱基识别、核酸检测应用、核酸测序应用和基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合支持体上进行的杂交，扩增或测序反应。

可以使用多个荧光团、荧光成像技术和荧光成像仪器中的任一种来进行荧光成像。可使用(例如，通过与核苷酸、寡核苷酸或蛋白质偶联)的合适荧光染料的实例包括但不限于荧光素、罗丹明、香豆素、花菁及其衍生物、包括花菁衍生物花菁染料-3(Cy3)、花菁染料-5(Cy5)、花菁染料-7(Cy7)等。可使用的荧光成像技术的实例包括但不限于宽场荧光显微镜成像，荧光共焦成像，双光子荧光等。可以使用的荧光成像仪器的实例包括但不限于配备有图像传感器或相机的荧光显微镜、宽场荧光显微镜、共焦荧光显微镜、双光子荧光显微镜、或包括合适选择的光源、透镜、反射镜、棱镜、二向色反射器、光圈和图像传感器或相机等的定制仪器。装配用于获取所公开的低结合支持体表面和杂交于其上的靶核酸序列的克隆扩增集落(或簇)的图像的荧光显微镜的非限制性实例是Olympus IX83倒置荧光显微镜，其装配有：20×，0.75NA，532nm光源，针对532nm长通激发和Cy3荧光发射滤光器优化的带通和二向色镜滤光器组，Semrock 532nm二向色反射器，和相机(Andor sCMOS，Zyla 4.2)其中调节激发光强度以避免信号饱和。通常，在支持体表面浸入缓冲液(例如，25mM ACES，pH7.4缓冲液)中，同时获取图像。

在一些情况下，可以使用荧光成像技术评估使用所公开的反应制剂和低结合支持体的核酸杂交或扩增反应的性能，其中图像的对比度噪声比(CNR)提供了评估支持体上的扩增特异性和非特异性结合的关键度量。CNR通常定义为：CNR＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是对特定感兴趣区域(ROI)中的特定特征(衍射点，DLS)周围的间质区域测量的信号。虽然信噪比(SNR)通常被认为是总信号质量的基准，但是可以看出，在需要快速图像捕获的应用(例如，可以实现最小化循环时间的测序应用)中，改善的CNR可以提供优于作为信号质量基准的SNR的显著优点，如下面的示例所示。在高CNR下，达到准确辨别(并因此在测序应用的情况下达到准确碱基识别)所需的成像时间可显著减少，即使CNR有适度改进。

在大多数基于组合的测序(ensemble-based sequencing)方法中，背景项被测量为与‘间质’区域相关联的信号。除了“间质”背景(B

如将在以下实施方案中证明的，在本公开的低结合性基底上实现核酸扩增可通过减少非特异性结合来减少B

在一些实施方案中，利用本文公开的组合物和方法的测序方法可并入能够碱基识别以揭示靶核酸序列的检测方法。在一些实施方案中，这些检测方法可包括用于核酸检测和/或核酸测序的任何方法。在一些实施方案中，本文描述的系统用于执行碱基识别过程。在一些实施方案中，所述检测方法可包括例如，荧光检测、比色检测、发光(例如生物发光的化学发光)检测、干涉检测、基于共振的检测例如拉曼检测、基于自旋共振的检测、基于NMR的检测等、以及其他方法例如，电检测例如基于电容的检测、基于阻抗的检测、或电化学检测例如，由化学反应产生或在化学反应内产生的电子的检测、或电检测例如，阻抗测量与其他例如，光学测量的组合中的一种或多种。

在掺入核苷酸残基之前，同时或之后实现三元复合物的检测。在一些实施方案中，引发的靶核酸可包括具有用于连接聚合酶或核酸结合部分的多个引发位置的靶核酸。在一些实施方案中，多个聚合酶可以附着于单个靶核酸分子，例如在靶核酸分子内的多个位点。在一些实施方案中，多种聚合酶可与本文公开的包括多种核苷酸的多价结合组合物结合。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是链置换合成、滚环扩增、多个拷贝的查询序列的连接或融合，或本领域已知或本文其他地方公开的其他此类方法的产物，以产生包括多个拷贝的相同序列的核酸分子。因此，在一些实施方案中，可以在靶核酸内的多个相同或基本相同的位置连接多个聚合酶，靶核酸包括查询序列的多个相同或基本相同的拷贝。在一些实施方案中，所述多种聚合酶然后可以参与与一种或多种多价结合复合物的相互作用；然而，在一些实施方案中，靶核酸内的结合位点的数目为至少两个，并且存在于颗粒-核苷酸偶联物如聚合物-核苷酸偶联物上的核苷酸或基底部分的数目也大于或等于两个。

提供与其他元件组合的多价结合组合物可能是有利的，例如提供优化的信号，例如，提供核酸序列中特定位置的核苷酸的鉴定。在一些实施方案中，本文公开的组合物与提供低背景结合或低水平的蛋白质结合的表面组合提供，特别是亲水性或聚合物涂覆的表面。代表性的表面可以在例如，美国专利申请16/363,842号中找到，其全部内容通过引用结合于此。

D.应用

本文描述了分析来源于例如，流动池中扩增的核酸阵列或来源于固定化核酸阵列的大量不同核酸序列的方法。本文所述的方法还可用于例如，用于比较基因组学的测序、追踪基因表达、微RNA序列分析、表观基因组学以及适体和噬菌体展示文库表征和其他测序应用。本文的方法包括光学、机械、流体、热、电和计算装置/方面的各种组合。由包括流动池装置，盒和系统的方法赋予的优点包括但不限于：(i)降低的装置和系统制造复杂性和成本，(ii)显著降低的消耗成本(例如，与当前可用的核酸测序系统的消耗成本相比)，(iii)与流动池表面官能化方法的相容性，(iv)当与微流体组件(例如，注射泵和隔膜阀等)组合时的灵活的流量控制，和(v)灵活的系统吞吐量。

1.病原体相关疾病的诊断或预后

在一些实施方案中，本文公开了用于诊断或预后与本文公开的病原体感染相关或由其引起的疾病或病症的系统，试剂盒和方法，其至少部分地基于来源于本文所述病原体的核酸序列的鉴定。例如，本文所述的系统、试剂盒和方法可用于诊断或预测由病毒感染引起的疾病或病症，例如严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒或其变体。

在一些实施方案中，对象表现出包括以下的体征或症状：发烧、寒战、咳嗽、呼吸短促或呼吸困难、疲劳、胸部持续疼痛或压力、不能醒来或保持清醒、皮肤、嘴唇或甲床发白、发灰或发青、肌肉或身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、充血或流涕、恶心、呕吐或腹泻或其任何组合。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括：(a)提供从疑似患有与病原体感染相关的疾病或病症的对象获得的生物样品；(b)测序来源于生物样品的遗传信息；(c)从遗传信息鉴定来源于病原体的核酸序列；和(d)诊断患有与病原体感染相关的疾病或病症的对象。

在一些实施方案中，生物样品获自本文所述的对象。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、非人灵长类动物或农场动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象表现出与本文公开的疾病或病症相关的症状(例如，发热、寒战、咳嗽、呼吸短促或呼吸困难、疲劳、胸部持续疼痛或压力、不能醒来或保持清醒、皮肤、嘴唇或甲床发白、发灰或发青、肌肉或身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、充血或流涕、恶心、呕吐或腹泻、瘀点或其任何组合)。在一些实施方案中，对象至少10岁。在一些实施方案中，对象至少55岁。在一些实施方案中，对象为0-10、11-19、20-39、40-59、60-75或76-100岁。在一些实施方案中，对象具有影响本文所述的疾病预后的前提条件。在一些实施方案中，前提条件包括肥胖症、糖尿病、凝血障碍、并发呼吸病症(例如，支气管炎或肺炎)、癌症、免疫缺陷障碍或病症(包括治疗性或医学诱导的免疫缺陷，诸如在移植或癌症疗法之后)，或其任何组合。

在一些实施方案中，生物样品包括血液、血清、血浆、汗液、毛发、眼泪、尿液、粪便、粘液(包括鼻、肺、胃或泌尿生殖粘液)、脑脊液、淋巴液、唾液或本文公开的任何其他生物样品。在一些实施方案中，生物样品直接或间接从对象获得。

在一些实施方案中，使用本文所述的方法、试剂盒或系统进行遗传信息的测序。在非限制性实例中，遗传信息可如下测序：(a)在足以在聚合酶，一个或多个核苷酸部分和引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将一个或多个核苷酸部分掺入引发的核酸序列的条件下，使来源于获自对象的生物样品的引发的核酸序列与聚合酶和一个或多个核苷酸部分接触，其中对象患有或疑似患有由本文公开的病原体引起的疾病或病症；以及(b)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。在一些实施方案中，病原体是严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒或其变体。

在一些实施方案中，诊断对象包括诊断患有由病原体感染引起的疾病或病症的对象。在一些实施方案中，疾病或病症由2019冠状病毒病(COVID-19)引起。在一些实施方案中，诊断包括诊断疾病的严重性，例如通过定量生物样品中病原体的相对量或持续性。在一些实施方案中，感染阶段可通过本文所述的系统的方法预测。

2.病原体追踪

本文所述的方法、系统和试剂盒可用于检测新的病原体感染和/或至少部分基于本文公开的病原体的核酸序列的鉴定使感染的进一步传播最小化。迫切而未满足的需求是追踪病原体感染的传播，特别是那些未检测到传播的病原体，例如SARS-CoV-2病毒。SARS-CoV-2感染的每个阶段的持续时间和严重程度至少部分取决于感染被控制得多快，考虑到大量感染SARS-CoV-2的人没有表现出症状，这是特别具有挑战性的。

在一些实施方案中，本文所述的方法、系统和试剂盒可用于监测地理空间内由本文公开的病原体(例如，SARS-CoV-2)引起的感染的出现或传播。在一些实施方案中，地理空间包括村庄或城镇。在一些实施方案中，地理空间包括农村或城市区域。在一些实施方案中，地理空间包括城市，国家、州或国家。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括：(a)提供从多个对象获得的多个生物样品；(b)测序来源于多个生物样品的遗传信息；(c)从遗传信息鉴定来源于病原体的核酸序列；以及(d)将核酸序列的存在与病原体引起的感染的出现或传播相关联。

在一些实施方案中，多个生物样品获自本文所述的多个对象。在一些实施方案中，多个对象是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、非人灵长类动物或农场动物。在一些实施方案中，多个对象是人。在一些实施方案中，多个对象表现出与本文公开的疾病或病症相关的症状(例如，发热、寒战、咳嗽、呼吸短促或呼吸困难、疲劳、胸部持续疼痛或压力、不能醒来或保持清醒、皮肤、嘴唇或甲床发白、发灰或发青、肌肉或身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、充血或流涕、恶心、呕吐或腹泻、瘀点或其任何组合)。在一些实施方案中，对象至少10岁。在一些实施方案中，对象至少55岁。在一些实施方案中，对象为0-10、11-19、20-39、40-59、60-75或76-100岁。在一些实施方案中，对象具有影响本文所述的疾病预后的前提条件。在一些实施方案中，前提条件包括肥胖症、糖尿病、凝血障碍、并发呼吸病症(例如，支气管炎或肺炎)、癌症、免疫缺陷障碍或病症(包括治疗性或医学诱导的免疫缺陷，诸如在移植或癌症疗法之后)，或其任何组合。

在一些实施方案中，生物样品包括血液、血清、血浆、汗液、毛发、眼泪、尿液、粪便、粘液(包括鼻、肺、胃或泌尿生殖粘液)、脑脊液、淋巴液、唾液或本文公开的任何其他生物样品。在一些实施方案中，生物样品直接或间接从对象获得。

在一些实施方案中，(d)中的关联包括将对象引导至自我隔离的或联系的医学专业人员，医师。如果该方法显示阳性测试结果，医学专业人员可以进一步进行PCR测试以确认病原体的感染原因。阴性测试，如果对象没有本文公开的症状，则使对象极不可能被感染。然而，对象需要继续遵循标准预防策略。

在一些实施方案中，检测病原体感染并使感染的进一步传播最小化包括诊断患有由病原体感染引起的疾病或病症的对象。在一些实施方案中，疾病或病症由2019冠状病毒病(COVID-19)引起。在一些实施方案中，检测病原体感染和最小化感染的进一步传播包括诊断疾病的严重性，例如通过定量生物样品中病原体的相对量或持续性。在一些实施方案中，感染阶段可通过本文所述的系统的方法预测。

II.系统

在一些实施方案中，本文公开了用于从来源于本文所述病原体的核酸分子制备核酸文库，或鉴定核酸分子的核酸序列，或两者的系统。在一些实施方案中，该系统包括用于执行本文所公开的方法的一个或多个处理器或计算机。在一些实施方案中，系统还包括表面(例如，流动池装置内的表面)、流体学系统或模块(例如，用于将试剂递送至表面)、或光学系统(例如，用于使表面成像)，或其组合。在一些实施方案中，病原体是SARS-CoV-2或其变体。

A.表面

本文所述的通道和毛细管的内表面可以用包括低非特异性结合表面组合物的组合物接枝或涂布，组合物能够改善核酸杂交和扩增性能。

在一些情况下，本公开的亲水性低结合支持体表面可表现出具有小于50度的任何值的水接触角。

所公开的低结合支持体，任选地与所公开的杂交或扩增方案组合使用，产生表现出以下特性的固相反应：(i)蛋白质和其他反应组分的可忽略的非特异性结合(因此使基底背景最小化)，(ii)可忽略的非特异性核酸扩增产物，和(iii)提供可调的核酸扩增反应。尽管本文主要在核酸杂交、扩增和测序测定的上下文中进行了描述，但所公开的低结合支持体可用于多种其他生物测定形式中的任一种，包括但不限于夹心免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。

在一些情况下，公开的低非特异性结合表面的荧光图像当用于核酸杂交或扩增应用以产生杂交或克隆扩增的核酸分子(例如，已经用荧光团直接或间接标记的核酸分子)的簇时，表现出至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比度噪声比(CNR)。

为了缩放引物表面密度并增加亲水性或两性表面的附加维度，已经开发了包括PEG和其他亲水性聚合物的多层涂层的基底。通过使用包括但不限于下述聚合物/共聚物材料的亲水性和两性表面分层方法，可以显著增加表面上的引物负载密度。PEG包被方法使用单层引物沉积，其通常被报道用于单分子应用，但对于核酸扩增应用不产生高拷贝数。如本文所述，“分层”可以使用与任何相容的聚合物或单体亚单元的交联方法来实现，使得包括两个或更多个高度交联的层的表面可以顺序地构建。合适的聚合物的实例包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸和聚赖氨酸与PEG的共聚物。在一些情况下，不同的层可通过多种偶联反应中的任一种彼此连接，偶联反应包括但不限于生物素-抗生蛋白链菌素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应和带正电荷的聚合物与带负电荷的聚合物之间的离子相互作用。在一些情况下，高引物密度材料可在溶液中构建，随后在多次操作中在表面上成层。

所公开的通道和毛细管的内表面可包括基底(或支持体结构)，一层或多层共价或非共价连接的低结合性化学修饰层(例如，硅烷层)，聚合物膜，以及一种或多种共价或非共价连接的引物序列，引物序列可以用于将单链模板寡核苷酸栓系到支持体表面。在一些情况下，表面的配方，例如，一个或多个层的化学组成，用于使一个或多个层与支持体表面交联或彼此交联的偶联化学，以及层的总数可以变化，使得蛋白质、核酸分子和其他杂交和扩增反应组分与支持体表面的非特异性结合相对于可比较的单层被最小化或减少。通常，可以改变表面的配方，使得支持体表面上的非特异性杂交相对于可比较的单层被最小化或减少。可以改变表面的配方，使得支持体表面上的非特异性扩增相对于可比较的单层被最小化或减少。可以改变表面的配方，使得支持体表面上的比扩增速率或产率最大化。在本文公开的一些情况下，在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或超过30个扩增循环中实现适于检测的扩增水平。

通常，施加到毛细管或通道内腔表面的一个或多个表面改性层或聚合物层中的至少一层可包括用于共价或非共价连接寡核苷酸接头或引物序列的官能团，或者至少一层可以在其接枝到或沉积在支持体表面上时已经包括共价或非共价连接的寡核苷酸接头或引物序列。在一些方面，毛细管或微流体通道包括针对原核基因组序列的寡核苷酸群体。在一些方面，毛细管或微流体通道包括针对转录组测序的寡核苷酸群体。

一种或多种类型的寡核苷酸引物可以附着或栓系于支持体表面。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸接头或引物可包括间隔序列，用于与接头连接的模板文库核酸序列杂交的接头序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物、分子条形码序列或其任何组合。

用于本文公开的目的的表面改性包括使表面对许多化学基团(-R)(包括胺)具有反应性。当在合适的基底上制备时，这些反应性表面可以在室温下长期储存例如，至少3个月或更长。这些表面可以进一步用R-PEG和R-引物寡聚物接枝，用于核酸的表面扩增，如本文别处所述。塑料表面，例如环烯烃聚合物(COP)，可以使用许多方法中的任何一种来改性。例如，它们可以用Ti:Sapphire激光烧蚀、UV介导的乙二醇甲基丙烯酸酯光接枝、等离子体处理或机械搅拌(例如，喷砂或抛光等)以产生可对许多化学基团如胺保持反应性数月的亲水性表面。然后这些基团可以允许钝化聚合物如PEG，或生物分子如DNA或蛋白质的偶联，而不损失生物化学活性。例如，DNA引物寡聚物的附着允许DNA在钝化塑料表面上扩增，同时使蛋白质、荧光团分子或其他疏水分子的非特异性吸附最小化。

另外，表面改性可与例如，激光印刷或UV掩蔽组合以产生图案化表面。这允许DNA寡聚物、蛋白质或其他部分的图案化附着，提供基于表面的酶活性、结合、检测或加工。例如，DNA寡聚物可用于扩增图案化特征内的DNA或以图案化方式捕获扩增的长DNA多联体。在一些实施方案中，可以在能够与基于溶液的基底反应的图案化区域中产生酶岛。因为塑料表面特别适合于这些处理模式，所以在本文考虑的一些实施方案中，塑料表面可被认为是特别有利的。

此外，塑料可被注塑、压花或3D打印以形成任何形状，包括微流体装置，比玻璃基底容易得多，并且因此可用于产生用于以多种构型结合和分析生物样品的表面，例如，用于生物标记物检测或DNA测序的样品-结果微流体芯片。

可以制备具有胺-引物和胺-PEG的亲水化和胺反应性环烯烃聚合物表面，并且其支持滚环扩增。当用荧光团标记的引物探测时，或当通过聚合酶将标记的dNTP添加到杂交的引物中时，观察到DNA扩增子的亮点，其表现出大于100的信噪比，具有极低的背景，表明高度特异性扩增，和超低水平的蛋白质和疏水性荧光团结合，其是高准确度检测系统如基于荧光的DNA测序仪的标志。

塑料表面：可制造基底或支持体结构的材料的实例包括(但不限于)玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)或其任何组合。考虑玻璃和塑料基底的各种组合物。

基底或支持体结构可以呈现为多种几何形状和尺寸中的任一种，并且可包括多种材料中的任一种。例如，在一些情况下，基底或支持体结构可以是局部平坦的(例如，包括显微镜载玻片或显微镜载玻片的表面)。总体上，基底或支持体结构可以是圆柱形的(例如，包括毛细管或毛细管的内表面)、球形的(例如，包括无孔珠粒的外表面)、或不规则的(例如，包括不规则形状的无孔珠粒或颗粒的外表面)。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或支持体结构的表面可以是固体、无孔表面。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或支持体结构的表面可以是多孔的，使得本文所述的涂层穿透多孔表面，并且在其上进行的核酸杂交和扩增反应可以在孔内发生。

包括一个或多个化学改性层(例如，低非特异性结合聚合物层)的基底或支持体结构可以是独立的或整合到另一结构或组件中。例如，在一些情况下，基底或支持体结构可包括集成或组装的微流体流动池内的一个或多个表面。基底或支持体结构可包括微孔板形式内的一个或多个表面，例如，微孔板中的孔的底表面。如上所述，在一些实施方案中，基底或支持体结构可包括毛细管的内表面(例如内腔表面)。在替代实施方案中，基底或支持体结构可包括蚀刻到平面芯片中的毛细管的内表面(例如内腔表面)。

化学改性层可以均匀地施加在基底或支持体结构的整个表面上。或者，基底或支持体结构的表面可以是非均匀分布的或图案化的，使得化学改性层被限制在基底的一个或多个离散区域。例如，可使用光刻技术图案化基底表面以在表面上产生化学改性区域的有序阵列或随机图案。可替代地或组合地，基底表面可以使用例如，接触印刷或喷墨印刷技术图案化。在一些情况下，化学改性的离散区域的有序阵列或随机图案可包括至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域，或本文范围内的任何中间数。

为了获得低的非特异性结合表面(本文中也称为“低结合”或“钝化”表面)，亲水性聚合物可以非特异性地吸附或共价接枝到基底或支持体表面上。使用聚(乙二醇)(PEG、也称为聚(环氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素、葡聚糖或具有使用例如，硅烷化学连接到表面的不同分子量和端基的其他亲水性聚合物进行钝化。远离表面的端基可包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。在一些情况下，可在表面上沉积两层或更多层亲水性聚合物，例如，线性聚合物、支化聚合物或多支化聚合物。在一些情况下，两个或更多个层可彼此共价偶联或内部交联以改善所得表面的稳定性。在一些情况下，具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物(或其他生物分子，例如，酶或抗体)可以以各种表面密度栓系于所得表面层。在一些情况下，例如，可以改变表面官能团密度和寡核苷酸浓度以靶向某一引物密度范围。另外，可以通过用携带相同官能团的其他分子稀释寡核苷酸来控制引物密度。例如，胺标记的寡核苷酸可以在与NHS-酯包被的表面的反应中用胺标记的聚(乙二醇)稀释以降低引物密度。在杂交区域和表面附着官能团之间具有不同长度接头的引物也可用于控制表面密度。合适的接头的实例包括在引物的5'端的聚-T和聚-A链(例如，0至20个碱基)、PEG接头(例如，3至20个单体单元)和碳链(例如，C6、C12、C18等)。为了测量引物密度，可以将荧光标记的引物栓系到表面，然后将荧光读数与已知浓度的染料溶液的荧光读数进行比较。

在一些实施方案中，亲水性聚合物可以是交联聚合物。在一些实施方案中，交联聚合物可包括与另一类型的聚合物交联的一种类型的聚合物。交联聚合物的实例可包括与另一种聚合物交联的聚(乙二醇)，另一种聚合物选自聚(环氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素、葡聚糖或其他亲水性聚合物。在一些实施方案中，交联聚合物可以是与聚丙烯酰胺交联的聚(乙二醇)。

微流体芯片或毛细管壁上的一个或多个毛细管或通道的内表面可表现出蛋白质和其他扩增反应试剂或组分的低非特异性结合，以及对重复暴露于不同溶剂、温度变化、化学吸附如低pH或长期储存的改进的稳定性。

所公开的低非特异性结合支持体包括一个或多个聚合物涂层，例如，PEG聚合物膜，其使蛋白质和标记的核苷酸与固相支持体的非特异性结合最小化。改进的核酸杂交和扩增速率和特异性的随后证明可通过本公开的以下附加方面中的一个或多个实现：(i)引物设计(序列或修饰)，(ii)固相支持体上栓系引物密度的控制，(iii)固相支持体的表面组成，(iv)固相支持体的表面聚合物密度，(v)在扩增之前和期间使用改进的杂交条件，或(vi)使用减少非特异性引物扩增或增加模板扩增效率的改进的扩增制剂。

所公开的低非特异性结合支持体以及相关的杂交和扩增方法的优点为任何测序系统赋予了以下额外优点中的一个或多个：(i)减少的流体洗涤时间(由于减少的非特异性结合，和因此更快的测序循环时间)，(ii)减少的成像时间(和因此更快的测定读出和测序循环的周转时间)，(iii)减少的总工作流时间要求(由于减少的循环时间)，(iv)减少的检测仪器成本(由于CNR的改进)，(v)改进的读数(碱基识别)准确度(由于CNR的改进)，(vi)改进的试剂稳定性和减少的试剂使用要求(和因此减少的试剂成本)，和(vii)由于核酸扩增失败，较少的运行时间失败。

用于表面生物测定(例如，基因分型和测序测定)的低结合亲水性表面(多层或单层)通过使用以下的任何组合来产生。在一些实施方案中，进行基因分型测定。在这些实施方案中，流动池装置的内表面涂覆有至少一种寡核苷酸或核酸分子类型。在某些情况下，多个每种寡核苷酸分子类型位于表面的至少一个离散的和空间索引的区域内，在那里它被固定。每种寡核苷酸分子类型或探针类型可包括基因座特异性引物或等位基因特异性引物。在某些情况下，寡核苷酸分子类型的阵列(每个在离散的和空间索引的区域)与包括不同核酸模板类型(也称为靶)和聚合酶的混合物接触以形成复合物。在一些情况下，核酸模板与荧光标记结合。在一些情况下，荧光标记与聚合物核偶联，其中标记的核可以与核酸模板类型结合。非共价键可用于将标记的聚合物核与核酸模板结合。接触表面后，将混合物洗去，用另一种溶液替换并用荧光成像仪成像。当在表面固定的含有基因座或等位基因的探针和互补核酸模板之间进行阳性匹配时，离散区域可以在背景之上显示荧光信号。在某些情况下，显示探针-靶标匹配的每个离散区域通过荧光发射识别并与背景比较。在某些情况下，对比度噪声比(CNR)达到大于20的值。因此，离散和空间索引位置之间的阳性匹配可以鉴定在产生核酸模板的多重样品中存在的特定基因座或等位基因的存在。

极性质子溶剂、极性非质子溶剂、非极性溶剂或其组合可用于在基底表面上沉积或偶联直链或多支链亲水性聚合物亚单元。一些多支链亲水性聚合物亚单元可含有官能端基，以促进与其他聚合物亚单元的共价偶联或非共价结合相互作用。合适的官能端基的实例包括生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、酯化合物、叠氮化物、炔烃、马来酰亚胺、硫醇和硅烷基团。

经由改性的偶联化学/溶剂/缓冲体系通过随后的分层添加偶联的直链、支链或多支链聚合物亚单位的任何组合，偶联化学/溶剂/缓冲体系可包括具有正交末端偶联化学的个别亚单位或任何相应组合，使得所得表面为亲水性的且展现蛋白质和其他分子测定组分的低非特异性结合。在一些情况下，本公开的亲水性官能化基底表面表现出不超过35度的接触角测量值。

随后的生物分子(例如，蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸或细胞的生物分子)通过多种单独偶联化学中的任一种或其任何组合附着在低结合/亲水性基底上。可以使用可以含有任何比例的以下组分的溶剂混合物进行层沉积或偶联反应：乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、DMSO、DMF、H

所公开的低非特异性结合支持体和相关的核酸杂交和扩增方法可用于分析来源于多种不同细胞，组织或其他类型样品的核酸分子。例如，可以从来源于真核生物(例如动物、植物、真菌、原生生物)，古细菌或真细菌的细胞或包括一种或多种类型细胞的组织样品中提取核酸。在一些情况下，核酸可以从原核或真核细胞中提取，例如粘附或非粘附真核细胞。核酸从例如，原代或无限增殖化啮齿动物、猪、猫、犬、牛、马、灵长类或人细胞系中不同地提取。核酸可以从多种不同细胞，器官或组织类型(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子、或来源于心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠或小肠的细胞)中的任一种提取。可以从正常或健康细胞中提取核酸。或者或组合地，从患病细胞如癌细胞或从感染宿主的致病细胞提取酸。一些核酸可以从细胞类型的不同子集中提取，例如，免疫细胞(如T细胞、细胞毒性(杀伤)T细胞、辅助T细胞、αβT细胞、γδT细胞、T细胞祖细胞、B细胞、B细胞祖细胞、淋巴干细胞、骨髓祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、天然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞或其任意组合)、未分化的人干细胞、已被诱导分化的人干细胞、稀有细胞(例如，循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养层细胞)。其他单元也被考虑并与本文的公开内容一致。

作为本文公开的表面钝化技术的结果，蛋白质，核酸和其他生物分子不“粘附”到基底上，即它们表现出低的非特异性结合。以下示出了使用具有不同玻璃制备条件的标准单层表面制备的实施方案。已被钝化以实现蛋白质和核酸的超低非特异性结合的亲水性表面需要新的反应条件以改善引物沉积反应效率、杂交性能和诱导有效扩增。所有这些方法都需要寡核苷酸附着和随后的蛋白结合以及递送到低结合表面。如下所述，新的引物表面偶联制剂(Cy3寡核苷酸接枝滴定)和所得超低非特异性背景(使用红色和绿色荧光染料进行的NSB功能测试)的组合产生证明所公开方法的生存力的结果。本文公开的一些表面表现出至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1的荧光团如Cy3的特异性(例如，与栓系引物或探针杂交)与非特异性结合(例如，B

接枝低非特异性结合层：用于将第一化学改性层接枝到流动池(毛细管或通道)的内表面上的连接化学通常取决于制造支持体的材料和层的化学性质。在一些情况下，第一层可以共价连接到支持体表面。在一些情况下，第一层可以非共价连接，例如，通过表面和第一层的分子组分之间的非共价相互作用如静电相互作用、氢键或范德华相互作用吸附到表面上。在任一情况下，可在附接或沉积第一层之前处理基底表面。可使用多种表面制备技术中的任一种来清洁或处理支持体表面。例如，可以使用食人鱼溶液(Piranha solution)(硫酸(H

硅烷化学物质构成用于共价改性玻璃或硅表面上的硅烷醇基团以连接更多反应性官能团(例如，胺或羧基)的一种非限制性方法，反应性官能团然后可用于将接头分子(例如，各种长度的线性烃分子，如C6、C12、C18烃，或线性聚(乙二醇)(PEG)分子)或层分子(例如，支化PEG分子或其他聚合物)偶联至表面。可用于产生任何所公开的低结合支持体表面的合适硅烷的实例包括但不限于(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、各种PEG-硅烷(例如，包括1K、2K、5K、10K、20K等的分子量)、氨基-PEG硅烷(即，包括游离氨基官能团)、马来酰亚胺-PEG硅烷、生物素-PEG硅烷等。

多种分子中的任一种，包括但不限于氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物，或其组合可用于在支持体表面上产生一个或多个化学改性层，其中所用组分的选择可变化以改变支持体表面的一种或多种性质，例如，官能团或栓系的寡核苷酸引物的表面密度、支持体表面的亲水性/疏水性、或支持体表面的三维性质(即“厚度”)。可用于在任何所公开的支持体表面中产生一层或多层低非特异性结合材料的聚合物的实例包括但不限于各种分子量和支化结构的聚(乙二醇)(PEG)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物或其任何组合。可用于将一层或多层材料(例如，聚合物层)接枝到支持体表面或使层彼此交联的偶联化学物质的实例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变体)、his标签-Ni/NTA偶联化学物质、甲氧基醚偶联化学物质、羧酸酯偶联化学物质、胺偶联化学物质、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。

多层表面的一个或多个层可包括支化聚合物或可以是线性的。合适的支化聚合物的实例包括但不限于支化PEG、支化聚(乙烯醇)(支化PVA)、支化聚(乙烯基吡啶)、支化聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化PVP)、支化聚(丙烯酸)(支化PAA)、支化聚丙烯酰胺、支化聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支化PNIPAM)、支化聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化PMA)、支化聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化PHEMA)、支化聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支化POEGMA)、支化聚谷氨酸(支化PGA)、支化聚赖氨酸、支化聚葡糖苷和葡聚糖。

在一些情况下，用于产生本文所公开的多层表面中的任一个的一个或多个层的支化聚合物可包括至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。分子通常表现出“2的幂”数的分支，例如2、4、8、16、32、64或128个分支。

在一些实例中，PEG多层包括PEG-胺-APTES上的PEG(8臂、16臂、8臂)。对于暴露于8μM引物的PEG-胺-APTES上的3层多臂PEG(8臂、16臂、8臂)和(8臂、64臂、8臂)，观察到相似的浓度，并且使用星形PEG-胺代替16臂和64臂的3层多臂PEG(8臂、8臂、8臂)。还考虑了具有相当的第一、第二和第三PEG层的PEG多层。

用于产生本文所公开的任何多层表面的一个或多个层的直链，支链或多支链聚合物可具有至少500、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少7,500、至少10,000、至少12,500、至少15,000、至少17,500、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、或至少50,000道尔顿的分子量。在一些情况下，用于产生本文所公开的任何多层表面的一个或多个层的直链、支链或多支链聚合物可具有至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多17,500、至多15,000、至多12,500、至多10,000、至多7,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3,500、至多3,000、至多2,500、至多2,000、至多1,500、至多1,000或至多500道尔顿的分子量。本段中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性，支化或多支化聚合物的分子量可以是约1,500至约20,000道尔顿。在另一种情况下，用于产生本文所公开的任何多层表面的一个或多个层的直链，支链或多支链聚合物的分子量可具有在此范围内的任何值，例如，约1,260道尔顿。

在一些情况下，其中多层表面的至少一个层包括支化聚合物，被沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可在每分子约一个共价键和约每分子32个共价键的范围内。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与先前层的分子之间的共价键的数目可以是每分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30、或至少32个、或多于32个共价键。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可以是至多32、至多30、至多28、至多26、至多24、至多22、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2、或至多1。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，新层的支化聚合物分子与先前层的分子之间的共价键的数目可以在约4至约16的范围内。新层的支化聚合物分子与先前层的分子之间的共价键的数目可具有此范围内的任何值，例如，在一些情况下为约11，或在其他情况下为约4.6的平均数。

在材料层与支持体表面偶联之后保留的任何反应性官能团可以任选地通过使用高产率偶联化学使小的惰性分子偶联来封端。例如，在使用胺偶联化学将新材料层连接到先前层的情况下，任何残留的胺基团可随后通过与小氨基酸如甘氨酸偶联而乙酰化或失活。

沉积在所公开的低结合支持体的表面上的低非特异性粘合材料(例如，亲水性聚合物材料)的层数可以是1至约10。在一些情况下，层数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些情况下，层数可以是至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1。在本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，层的数目可以在约2至约4的范围内。在一些情况下，所有的层可包括相同的材料。在一些情况下，每层可包括不同的材料。在一些情况下，多个层可包括多种材料。在一些情况下，至少一层可包括支化聚合物。在一些情况下，所有层可包括支化聚合物。

在一些情况下，可使用极性质子溶剂，极性非质子溶剂，非极性溶剂或其任何组合将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上或与基底表面偶联。在一些情况下，用于层沉积或偶联的溶剂可包括醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等)、另一种有机溶剂(例如，乙腈、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等)、水、水性缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)等)或其任何组合。在一些情况下，所使用的溶剂混合物的有机组分可包括总量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或跨越或邻近本文范围的任何百分比，余量由水或水性缓冲溶液组成。在一些情况下，所使用的溶剂混合物的水性组分可包括总量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或跨越或邻近本文范围的任何百分比，余量由有机溶剂组成。所用溶剂混合物的pH可以小于5、5、5、5、6、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、或大于10，或跨越或邻近本文所述范围的任何值。

在一些情况下，可以使用有机溶剂的混合物将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上或偶联至基底表面，其中至少一种组分的介电常数小于40并且构成总混合物体积的至少50％。在一些情况下，至少一个组分的介电常数可小于10、小于20、小于30、小于40。在一些情况下，至少一种组分占总混合物体积的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。

正如指出的，本公开的低非特异性结合支持体表现出用于固相核酸扩增的杂交或扩增制剂的蛋白质，核酸和其他组分的降低的非特异性结合。可以定性或定量评估给定支持体表面表现出的非特异性结合的程度。例如，在一些情况下，在标准化的一组条件下将表面暴露于荧光染料(例如，Cy3、Cy5等)，荧光标记的核苷酸，荧光标记的寡核苷酸或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，随后进行指定的冲洗方案和荧光成像，可以用作用于比较包括不同表面制剂的支持体上的非特异性结合的定性工具。在一些情况下，在一组标准化条件下将表面暴露于荧光染料、荧光标记的核苷酸、荧光标记的寡核苷酸或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)。随后，指定的冲洗方案和荧光成像可用作定量工具，用于比较包括不同表面制剂的支持体上的非特异性结合，条件是注意确保荧光成像在荧光信号与支持体表面上的荧光团数量线性相关(或以可预测的方式相关)的条件下(例如，在荧光团的信号饱和或自猝灭不是问题的条件下)进行，并且使用合适的校准标准。在一些情况下，其他技术例如，放射性同位素标记和计数方法可用于定量评估本公开的不同支持体表面制剂表现出非特异性结合的程度。

正如指出的，在一些情况下，所公开的低结合支持体表现出的非特异性结合的程度可以使用用于使表面与标记的蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素、DNA聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(SSB)等、或其任何组合)、标记的核苷酸、标记的寡核苷酸等在一组标准化的孵育和冲洗条件下接触的标准化方案来评估。随后检测保留在表面上的标记物的量并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较。在一些情况下，标记可包括荧光标记。在一些情况下，标记可包括放射性同位素。在一些情况下，标记可包括任何其他可检测的标记。在一些情况下，给定支持体表面制剂表现出的非特异性结合的程度因此可以根据每单位面积非特异性结合的蛋白质分子(或其他分子)的数目来评估。在一些情况下，本公开的低结合支持体可表现出小于0.001个分子/μm

与本文公开内容一致的低背景表面可表现出至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1的特异性染料附着(例如，Cy3附着)与非特异性染料吸附(例如，Cy3染料吸附)比率，或每分子非特异性吸附多于50个附着的特异性染料分子。类似地，当经受激发能量时，与本文公开内容一致的，荧光团例如，Cy3已连接至其上的低背景表面可表现出至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1或大于50:1的特异性荧光信号(例如，由连接至表面的Cy3标记的寡核苷酸产生)与非特异性吸附染料荧光信号的比率。

在一些情况下，所公开的支持体表面的亲水性程度(或与水溶液的“润湿性”)可以例如，通过测量水接触角来评估，其中将小水滴置于表面上并且使用例如，光学张力计测量其与表面的接触角。在一些情况下，可以确定静态接触角。在一些情况下，可以确定前进接触角或后退接触角。在一些情况下，本文所公开的亲水性低结合支持体表面的水接触角可在约0度至约50度的范围内。在一些情况下，本文所公开的亲水性低结合支持体表面的水接触角可不超过50度、45度、40度、35度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不大于该范围内的任何值，例如，不大于40度。在一些情况下，本公开的给定亲水性低结合支持体表面可表现出具有在该范围内的任何值，例如，约27度的水接触角。

在一些情况下，本文公开的亲水性表面有助于减少生物测定的洗涤时间，这通常是由于生物分子与低结合性表面的非特异性结合减少。在一些情况下，可以在少于60、50、40、30、20、15、10或少于10秒内进行足够的洗涤操作。例如，在一些情况下，可以在小于30秒内进行足够的洗涤操作。

2.流动池

在一些实施方案中，本文提供了具有内表面的流动池(例如，毛细管流动池或微流体芯片流动池装置和盒)，在内表面上可以使用本文公开的方法进行用于鉴定核酸序列的反应。许多“第二代”和“第三代”测序技术利用大规模平行，循环阵列方法进行边合成边测序(SBS)，其中对栓系于固相支持体的单链模板寡核苷酸序列的准确解码依赖于成功地对由聚合酶向互补寡核苷酸链逐步添加A、G、C和T核苷酸而产生的信号进行分类。这些方法需要用固定长度的已知接头序列修饰寡核苷酸模板，通过与已知序列的表面栓系探针杂交将其固定到随机或图案化阵列中的固相支持体(例如，所公开的毛细管或微流体芯片流动池装置和盒的内腔表面)上，已知序列与接头序列的序列互补，然后通过使用例如荧光标记的核苷酸的一系列循环的单碱基添加引物延伸反应进行探测以鉴定模板寡核苷酸中碱基序列。因此，这些方法需要使用小型化的流体学系统，其提供对试剂引入到其中进行测序反应的流动池的定时的准确，可再现的控制，以及小体积以最小化昂贵试剂的消耗。

现有的市售NGS流动池由玻璃层构成，玻璃层已被蚀刻，研磨或通过其他方法加工以满足成像、冷却或其他要求所需的严格尺寸公差。当流动池用作耗材时，其制造所需的昂贵的制造工艺导致每个测序运行的成本太高而不能使科学家和医学专业人员在研究和临床空间中常规地获得测序。

本文描述了由现成的、一次性的、单内腔(例如，单流体流动通道)毛细管构造的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒，其还可包括流体接头、盒底座、一个或多个集成的流体流动控制部件，或其任何组合。本文还公开了基于毛细管流动池的系统，其可包括一个或多个毛细管流动池装置、一个或多个毛细管流动池盒、流体流动控制器模块、温度控制模块、成像模块或其任何组合。

一些公开的毛细管流动池装置，盒和系统的设计特征包括，但不限于，(i)单一流动通道构造，(ii)试剂流之间的密封，可靠和重复的切换，其可以用简单的负载/卸载机构实现，使得系统和毛细管之间的流体接口可靠地密封，促进毛细管替换和系统再使用，并且使得能够准确控制反应条件如温度和pH，(iii)包括多个流动通道的可替换的单流体流动通道装置或毛细管流动池盒，其可互换使用以提供灵活的系统吞吐量，和(iv)与多种检测方法如荧光成像的兼容性。

虽然所公开的单流动池装置和系统，毛细管流动池盒，基于毛细管流动池的系统，微流体芯片流动池装置和微流体芯片流动池系统主要在它们用于核酸测序应用的上下文中描述，但是所公开的装置和系统的各个方面不仅可以应用于核酸测序，而且可以应用于任何其他类型的化学分析、生物化学分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用。应当理解，所公开的装置和系统的不同方面可以单独地，共同地或彼此组合地理解。

本公开提供了一种低成本流动池结构，其包括低成本玻璃或聚合物毛细管或微流体通道、流体学接头和盒底座。利用以横截面几何形状挤出的玻璃或聚合物毛细管消除了对多种高准确度和昂贵的玻璃制造工艺的需要。坚固地限制毛细管或通道的取向并使用模制塑料或弹性体部件提供方便的流体连接进一步降低成本。激光键合聚合物盒底座的部件提供了密封毛细管或微流体通道并在结构上稳定毛细管或通道和流动池盒而不需要使用紧固件或粘合剂的快速和有效的方法。

流动池装置和系统的应用：本文所述的流动池装置和系统可用于多种应用，例如测序分析，以改善昂贵试剂的有效使用。例如，对核酸样品和第二核酸样品测序的方法可包括将多个寡核苷酸递送至至少部分透明的腔室的内表面；将第一核酸样品递送至内表面；通过第一通道将多种非特异性试剂递送至内表面；将特定试剂通过第二通道递送至内表面，其中第二通道具有比第一通道更低的体积；使至少部分透明的腔室的内表面上的测序反应可视化；以及在第二测序反应之前更换该至少部分透明的腔室。在一些方面，使气流流过至少部分透明的表面的外表面。在一些方面，方法可包括选择多个寡核苷酸以对真核基因组测序。在一些方面，方法可包括选择预制管作为至少部分透明的腔室。在一些方面，方法可包括选择多个寡核苷酸以测序原核生物基因组。在一些方面，方法可包括选择多个寡核苷酸以测序转录组。在一些方面，方法可包括选择毛细管作为至少部分透明的腔室。在一些方面，方法可包括选择微流体芯片作为至少部分透明的腔室。

所描述的系统还可以用于减少测序反应中使用的试剂的方法中，包括在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中第一储器和第二储器中的每一个流体连接至中心区域，并且其中中心区域包括用于测序反应的表面；以及将第一试剂和第二试剂顺序地引入流动池装置的中心区域，其中从第一储器流动到中心区域的入口的第一试剂的体积小于从第二储器流动到中心区域的第二试剂的体积。

系统的另外用途是增加试剂在测序反应中的有效使用的方法，所述方法包括：在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中第一储器和第二储器各自与中心区域流体性偶联，并且其中中心区域包括用于测序反应的表面；以及将从第一储器流向中心区域的入口的第一试剂的体积保持为小于从第二储器流向中心区域的第二试剂的体积。

通常，第一试剂比第二试剂更昂贵。在一些方面，第一试剂包括聚合酶，核苷酸和核苷酸类似物。

流动池装置：在此公开了流动装置，该流动装置包括第一储器，其容纳第一溶液并且具有入口端和出口端，其中第一试剂在第一储器中从入口端流动至出口端；第二储器，其容纳第二溶液并且具有入口端和出口端，其中第二试剂在第二储器中从入口端流向出口端；中心区域，其具有一个入口端，该入口端通过至少一个阀流体联接到该第一储器的出口端和该第二储器的出口端上。在流动池装置中，从第一储器的出口流到中心区域的入口的第一溶液的体积小于从第二储器的出口流到中心区域的入口的第二溶液的体积。

装置中的储器可用于容纳不同的试剂。在一些方面，容纳在第一储器中的第一溶液不同于容纳在第二储器中的第二溶液。第二溶液包括至少一种在中心区域发生的多个反应共有的试剂。在一些方面，第二溶液包括溶剂、聚合酶和dNTP。在一些方面，第二溶液包括低成本试剂。在一些方面，第一储器通过第一阀流体联接到中心区域，并且第二储器通过第二阀流体联接到中心区域。阀可以是隔膜阀或其他合适的阀。

流动池装置的设计可以实现比其他测序装置更有效地使用反应试剂，特别是对于在各种测序操作中使用的昂贵试剂。在一些方面，第一溶液包括试剂，第二溶液包括试剂，并且第一溶液中的试剂比第二溶液中的试剂更昂贵。在一些方面，第一溶液包括反应特异性试剂，第二溶液包括中心区域中发生的所有反应共有的非特异性试剂，并且其中反应特异性试剂比非特异性试剂更昂贵。在一些方面，第一储器靠近中心区域的入口定位，以减少用于递送第一溶液的死体积。在一些方面，第一储器比第二储器更靠近中心区域的入口。在一些方面，反应特异性试剂被配置为紧邻第二隔膜阀，以便相对于将多种非特异性试剂从多个储器递送至第一隔膜阀而减少死体积。

制造微流体芯片的方法：微流体芯片可以通过微制造工艺的组合来制造。本文所述的制造微流体芯片的方法包括提供表面；以及在表面上形成至少一个通道。该制造方法还可包括提供具有至少第一平坦表面的第一基底，其中该第一表面具有多个通道；提供具有至少第二平坦表面的第二基底；以及将第一基底的第一平坦表面结合到第二基底的第二平坦表面。在一些情况下，第一表面上的通道具有开放的顶侧和封闭的底侧，并且第二表面通过通道的底侧键合到第一表面，因此使通道的开放的顶侧不受影响。在一些情况下，本文所述的方法还包括提供具有第三平坦表面的第三基底，并通过通道的开口顶侧将第三表面键合到第一表面。键合条件可包括例如，加热基底，或将粘合剂施加到第一或第二基底的平坦表面之一上。

因为装置是微制造的，所以将基于它们与微制造技术，例如，光刻、湿化学蚀刻、激光烧蚀、激光照射、空气磨蚀技术、注射成型、压花和其他技术的相容性来选择基底材料。通常还选择基底材料，使其与微流体装置可暴露的全部条件范围相容，包括极端的pH、温度、盐浓度和施加照明或电场。因此，在一些方面中，基底材料可包括硅基基底，例如硼硅酸盐玻璃、石英以及其他基底材料。

在另外的方面，基底材料将包括聚合物材料，例如，塑料，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(TEFLON

使用上述微制造技术将微流体装置的通道或腔室制造到第一基底的上表面中，作为微尺度通道(例如，凹槽、凹痕)。第一基底包括具有第一平坦表面的顶侧和底侧。在根据本文所述方法制备的微流体装置中，在第一平坦表面上形成多个通道(例如，凹槽或凹痕)。在一些情况下，形成于第一平坦表面中(在添加第二基底之前)的通道(例如，凹槽或凹痕)具有底部和侧壁，其中顶部保持开放。在一些情况下，第一平坦表面中的通道(例如，凹槽或凹痕)(在添加第二基底之前)具有底壁和侧壁，且顶部保持封闭。在一些情况下，第一平坦表面中的通道(例如，凹槽或凹痕)(在添加第二基底之前)具有侧壁且不具有顶表面或底表面。

当第一基底的第一平坦表面被放置成与第二基底的平坦表面接触并键合到第二基底的平坦表面时，第二基底可以覆盖或密封第一基底的表面中的凹槽或凹痕，以在这两个部件的接口处形成装置的通道或腔室(例如，内部部分)。

在将第一基底接合到第二基底之后，可以进一步将结构放置成与第三基底接触并键合到第三基底。第三将第三基底放置成与第一基底的不与第二基底接触的一侧接触。在一些实施方案中，第一基底放置在第二基底和第三基底之间。在一些实施方案中，第二基底和第三基底可以覆盖或密封第一基底上的凹槽、凹痕或孔口，以在这些部件的接口处形成装置的通道或腔室(例如，内部部分)。

装置可以具有开口，这些开口被定向成使得它们与在该装置的内部部分中从这些凹槽或凹痕形成的这些通道或腔室中的至少一者连通。在一些实施方案中，开口形成在第一基底上。在一些实施方案中，开口形成在第一和第二基底上。在一些实施方案中，开口形成在第一、第二和第三基底上。在一些实施方案中，开口位于装置的顶侧。在一些实施方案中，开口位于装置的底侧。在一些实施方案中，开口位于装置的第一或第二端，并且通道沿着从第一端到第二端的方向延伸。

基底可键合在一起的条件通常是广泛理解的，并且基底的这种粘合通常通过许多方法中的任一种来进行，方法可以根据所用基底材料的性质而变化。例如，基底的热键合可应用于许多基底材料，包括例如，玻璃或二氧化硅基基底，以及聚合物基基底。这种热键合包括在升高的温度条件下和在一些情况下施加外部压力的条件下将待键合的基底配合在一起。准确的温度和压力通常将根据所使用的基底材料的性质而变化。

例如，对于硅基基底材料，即玻璃(硼硅酸盐玻璃、Pyrex

另一方面，热粘合的聚合物基底将利用比二氧化硅基基底更低的温度或压力，以防止基底的过度熔融或变形，例如，装置的内部部分(即通道或腔室)变平。通常，用于键合聚合物基底的这种升高的温度将为约80℃至约200℃，取决于所用的聚合物材料。在另一个实例中，用于键合聚合物基底的这种升高的温度可以在约90℃和150℃之间变化。由于键合聚合物基底所需的温度显著降低，因此这种键合可以在不需要如在粘结二氧化硅基基底中使用的高温烘箱的情况下进行。这允许在单个集成键合系统内结合热源，如下面更详细地描述的。

粘合剂也可用于根据方法将基底键合在一起，方法包括在待键合的基底之间施加粘合剂层并将它们压在一起直至粘合剂凝固。根据这些方法可以使用多种粘合剂，包括例如，可商购的UV可固化粘合剂。根据本发明的概念，也可使用其他方法将基底键合在一起，包括例如，声学或超声焊接和聚合物部件的溶剂焊接。

一次将制造多个微流体芯片或装置。例如，聚合物基底可以冲压或模塑成大的可分离的片材，其可以配合和键合在一起。然后可以将单独的装置或键合的基底与较大的片分离。类似地，对于基于二氧化硅的基底，可由较大基底晶圆或板制造个别装置，从而允许制造工艺的较高处理量。具体地，可以将多个通道结构制造成第一基底晶圆或板，然后用第二基底晶圆或板覆盖，并且任选地进一步用第三基底晶圆或板覆盖。然后通过锯切，划线和断裂等从较大的基底分割得到的多个装置。

如上所述，顶部或第二基底覆盖在底部或第一基底上以密封各个通道和腔室。在执行根据本发明构思的方法的键合过程中，使用真空执行第一和第二基底的键合，以保持两个基底表面最佳接触。特别地，通过使底部基底的平坦表面与顶部基底的平坦表面配合，并通过穿过顶部基底设置的孔施加真空，底部基底可以保持与顶部基底的最佳接触。通过将顶部基底放置在真空吸盘上来对顶部基底中的孔施加真空，其包括具有集成真空源的安装台或表面。在二氧化硅基基底的情况下，使键合的基底经受升高的温度以产生初始键合，使得键合的基底然后可以转移到退火炉中，而没有相对于彼此的任何移动。

用于与本文所述设备结合的替代键合系统包括例如，粘合剂分配系统，用于在基底的两个平坦表面之间施加粘合剂层。这可以通过在接合基底之前施加粘合剂层，或通过在邻接基底的一个边缘放置一定量的粘合剂，并允许两个接合基底的芯吸作用将粘合剂抽吸穿过两个基底之间的空间来实现。

在某些实施方案中，整个键合系统可包括用于将顶部和底部基底放置在安装表面上并将其对准以用于后续键合的可自动化系统。这样的系统包括用于相对于彼此移动安装表面或一个或多个顶部和底部基底的平移系统。例如，机器人系统可用于将顶部和底部基底中的每一个依次提升、平移和放置在安装台上和对准结构内。在键合过程之后，这样的系统还可以从安装表面移除成品，并且在将另外的基底放置在其上用于键合之前，将这些配合的基底转移到随后的操作，例如，分离操作，用于硅基基底的退火炉等。

在一些情况下，微流体芯片的制造包括两层或更多层基底的分层或层压，以便生产芯片。例如，在微流体装置中，该装置的微流体元件通过激光照射、蚀刻或以其他方式在第一基底的表面中制造特征来制造。然后将第二基底层压或键合到第一基底的表面以密封这些特征并提供装置的流体元件，例如，流体通道。

中心区域：中心区域可包括具有一个或多个微流体通道的毛细管或微流体芯片。在一些实施方案中，毛细管是现成产品。毛细管或微流体芯片也可以从装置中移除。在一些实施方案中，毛细管或微流体通道包括针对真核基因组序列的寡核苷酸群体。在一些实施方案中，中心区域中的毛细管或微流体通道可以是可移除的。

流动池装置或系统的中心区域可包括具有至少一个栓系其上的寡核苷酸的表面。在一些实施方案中，表面可以是微流体通道或毛细管的内表面。在一些方面，表面是局部平坦的表面。在一些实施方案中，寡核苷酸直接栓系至表面。在一些实施方案中，寡核苷酸通过中间分子栓系至表面。

栓系到中心区域内表面的寡核苷酸可包括结合不同靶的片段。在一些情况下，寡核苷酸表现出与真核基因组核酸区段特异性杂交的区段。在一些情况下，寡核苷酸表现出与原核基因组核酸区段特异性杂交的区段。在一些情况下，寡核苷酸表现出与病毒核酸区段特异性杂交的区段。在一些情况下，寡核苷酸表现出与转录组核酸区段特异性杂交的区段。

当中心区域包括具有一个或多个栓系于其上的寡核苷酸的表面时，可基于所进行的测序类型调节中心区域的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对真核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对原核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对转录组测序的内部体积。例如，在一些实施方案中，该中心区域的内部体积可包括小于0.05μl、在0.05μl与0.1μl之间、在0.05μl与0.2μl之间、在0.05μl与0.5μl之间、在0.05μl与0.8μl之间、在0.05μl与1μl之间、在0.05μl与1.2μl之间、在0.05μl与1.5μl之间、在0.1μl与1.5μl之间、在0.2μl与1.5μl之间、在0.5μl与1.5μl之间、在0.8μl与1.5μl之间、在1μl和1.5μl之间、在1.2μl和1.5μl之间、或大于1.5μl，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于0.5μl、在0.5μl与1μl之间、在0.5μl与2μl之间、在0.5μl与5μl之间、在0.5μl与8μl之间、在0.5μl与10μl之间、在0.5μl与12μl之间、在0.5μl与15μl之间、在1μl与15μl之间、在2μl与15μl之间、在5μl与15μl之间、在8μl与15μl之间、在10μl与15μl之间、在12μl与15μl之间、或大于15μl，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于5μl、在5μl与10μl之间、在5μl与20μl之间、在5μl与500μl之间、在5μl与80μl之间、在5μl与100μl之间、在5μl与120μl之间、在5μl与150μl之间、在10μl与150μl之间、在20μl与150μl之间、在50μl与150μl之间、在80μl与150μl之间、在100μl与150μl之间、在120μl与150μl之间、或大于150μl，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于50μl、在50μl与100μl之间、在50μl与200μl之间、在50μl与500μl之间、在50μl与800μl之间、在50μl与1000μl之间、在50μl与1200μl之间、在50μl与1500μl之间、在100μl与1500μl之间、在200μl与1500μl之间、在500μl与1500μl之间、在800μl与1500μl之间、在1000μl与1500μl之间、在1200μl与1500μl之间、或大于1500μl，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于500μl、在500μl与1000μl之间、在500μl与2000μl之间、在500μl与5ml之间、在500μl与8ml之间、在500μl与10ml之间、在500μl与12ml之间、在500μl与15ml之间、在1ml与15ml之间、在2ml与15ml之间、在5ml与15ml之间、在8ml与15ml之间、在10ml与15ml之间、在12ml与15ml之间、或大于15ml，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，该中心区域的内部体积可包括小于5ml、在5ml与10ml之间、在5ml与20ml之间、在5ml与50ml之间、在5ml与80ml之间、在5ml与100ml之间、在5ml与120ml之间、在5ml与150ml之间、在10ml与150ml之间、在20ml与150ml之间、在50ml与150ml之间、在80ml与150ml之间、在100ml与150ml之间、在120ml与150ml之间、或大于150ml，或由前述任意两个限定的范围的体积。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统包括流动池装置或系统的阵列或集合、流动池装置或系统包括多个离散的毛细管、微流体通道、流体通道、腔室或管腔区域，其中组合的内部体积是，包括或包括本文公开的范围内的一个或多个值。

毛细管流动池装置：本文公开了单个毛细管流动池装置，其包括单个毛细管和附接到毛细管的一端或两端的一个或两个流体接头，其中毛细管提供具有指定横截面积和长度的流体流动通道，且其中流体接头被配置为与标准管配合以提供与外部流体流动控制系统的方便的，可互换的流体连接。

图1示出了单个玻璃毛细管流动池装置的一个非限制性示例，其包括设计成与标准OD流体管路配合的两个流体接头-一个固定到玻璃毛细管片的每一端。流体接头可以使用多种技术中的任何一种连接到毛细管，技术包括但不限于压配合、粘合剂黏合、溶剂黏合、激光焊接等，或其任何组合。

通常，在所公开的流动池装置(和将在下面描述的流动池盒)中使用的毛细管将具有至少一个内部的，轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)，其在毛细管的整个长度上延伸。在一些方面，毛细管可具有两个、三个、四个、五个或多于五个内部轴向对准的流体流动通道(或“内腔”)。

单个毛细管(或其内腔)的许多指定横截面几何形状与本文的公开内容一致，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些方面，单个毛细管(或其内腔)可具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸(例如，如果内腔是圆形的直径，或者如果内腔是正方形或矩形的对角线)可以在约10μm至约10mm的范围内。在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm、或至多10μm。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一个可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以在约100μm至约500μm的范围内。在另一方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可具有在此范围内的任何值，例如，约124μm。

用于制造所公开的单个毛细管流动池装置或流动池盒的一个或多个毛细管的长度可以在约5mm至约5cm或更大的范围内。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm或至少5cm。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以是至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。本段中描述的任何下限和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如，在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以是约1.5cm至约2.5cm。在另一种情况下，一个或多个毛细管的长度可以具有该范围内的任何值，例如，约1.85cm。在一些情况下，装置或盒可包括多个长度相同的两个或更多个毛细管。在一些情况下，装置或盒可包括多个长度不同的两个或更多个毛细管。

在一些情况下，毛细管具有约或准确地50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400或500μm的间隙高度，或落入由此限定的范围内的任何值。在一些实施方案中，毛细管具有约50μm-200μm、50μm-150μm的间隙高度，或相当的间隙高度。用于构造所公开的单个毛细管流动池装置或毛细管流动池盒的毛细管可由多种材料中的任一种制造，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、熔融二氧化硅(石英)、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚二甲硅氧烷(PDMS)等)、聚醚酰亚胺(PEI)和全氟弹性体(FFKM)作为更化学惰性的替代物。就成本和相容性而言，PEI介于聚碳酸酯和PEEK之间。FFKM也称为Kalrez或其任何组合。

用于构造所公开的单个毛细管流动池装置或毛细管流动池盒的毛细管可以使用多种技术中的任一种来制造，其中制造技术的选择通常取决于所使用的材料的选择，反之亦然。合适的毛细管制造技术的实例包括但不限于挤出、拉伸、精密计算机数控(CNC)加工和钻孔、激光烧蚀等。装置可以是浇注模制的或注射模制的，以制造适应单片流动池的任何三维结构。

提供精密毛细管的商业供应商的实例包括Accu-Glass(St.Louis，MO；精密玻璃毛细管)，Polymicro Technologies(Phoenix，AZ；精密玻璃和熔融二氧化硅毛细管)，Friedrich&Dimmock,Inc.(Millville，NJ；定制精密玻璃毛细管)，和Drummond Scientific(Broomall，PA；OEM玻璃和塑料毛细管)。

微流体芯片流动池装置：本文还公开了流动池装置，流动池装置包括一个或多个微流体芯片和固定到微流体芯片的一端或两端的一个或两个流体接头，其中微流体芯片提供具有特定横截面积和长度的一个或多个流体流动通道，并且其中流体接头被配置为与微流体芯片配合以提供与外部流体流动控制系统的方便的，可互换的流体连接。

微流体芯片流动池装置的非限制性实例包括两个流体接头-一个固定到微流体芯片的每一端(例如，微流体通道的入口)。可以使用多种技术中的任何一种将流体接头附接到芯片或通道，这些技术包括但不限于压配合、粘合剂黏合、溶剂黏合、激光焊接等，或其任何组合。在一些情况下，芯片上的微流体通道的入口或出口是芯片顶表面上的孔口，并且流体接头可以附着或耦合到微流体芯片的入口和出口。

当中心区域包括微流体芯片时，在所公开的流动池装置中使用的芯片微流体芯片将具有至少一个具有一个或多个通道的单层。在一些方面，微流体芯片具有键合在一起以形成一个或多个通道的两层。在一些方面，微流体芯片可包括键合在一起以形成一个或多个通道的三层。在一些实施方案中，微流体通道具有开口顶部。在一些实施方案中，微流体通道位于顶层和底层之间。

通常，在所公开的流动池装置(和下面将描述的流动池盒)中使用的微流体芯片将具有至少一个内部的，轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)，其沿着芯片的全长或部分长度延伸。在一些方面，微流体芯片可具有两个、三个、四个、五个或多于五个内部轴向对齐的微流体通道(或“内腔”)。微流体通道可以分成多个框架。

单个通道的多个指定横截面几何形状与本文的公开内容一致，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些方面，通道可具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。

用于构造所公开的流动池装置或流动池盒的微流体芯片可由多种材料中的任一种制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、石英、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚二甲硅氧烷(PDMS)等)、聚醚酰亚胺(PEI)和全氟弹性体(FFKM)作为更化学惰性的替代物。在一些实施方案中，微流体芯片包括石英。在一些实施方案中，微流体芯片包括硼硅酸盐玻璃。

用于构造流动池装置或流动池盒的微流体芯片可以使用多种技术中的任一种来制造，其中制造技术的选择通常取决于所使用的材料的选择，反之亦然。芯片上的微流体通道可以使用适于在表面上形成微结构或微图案的技术来构造。在某些方面，通道通过激光照射形成。在某些方面，微流体通道由聚焦飞秒激光辐射形成。在某些方面，微流体通道通过蚀刻形成，包括但不限于化学或激光蚀刻。

当通过蚀刻在微流体芯片上形成微流体通道时，微流体芯片将包括至少一个蚀刻层。在一些方面，微流体芯片可包括一个非蚀刻层和一个非蚀刻层，其中蚀刻层键合到非蚀刻层，使得非蚀刻层形成通道的底层或覆盖层。在一些方面，微流体芯片可包括一个非蚀刻层和两个非蚀刻层，并且其中蚀刻层位于两个非蚀刻层之间。

本文所述的芯片包括蚀刻在芯片表面上的一个或多个微流体通道。微流体通道被限定为具有至少一个<1nm至1000μm的最小尺寸的流体导管。微流体通道可以通过几种不同的方法制造，例如，激光辐射(例如飞秒激光辐射)，光刻，化学蚀刻和任何其他合适的方法。芯片表面上的通道可以通过选择性图案化和等离子体或化学蚀刻来产生。通道可以是开放的，或者它们可以被顶部上的共形沉积膜或层密封以在芯片中产生表面下或掩埋的通道。在一些实施方案中，通过去除芯片上的牺牲层来产生通道。方法不需要蚀刻掉大块晶圆。相反，通道位于晶圆的表面上。直接光刻的例子包括电子束直接写入和聚焦离子束研磨。

微流体通道系统与成像系统耦合以捕获或检测DNA碱基的信号。在玻璃或硅基底上制造的微流体通道系统具有<1nm至1000μm数量级的通道高度和宽度。例如，在一些实施方案中，通道可以具有1-50μm、1-100μm、1-150μm、1-200μm、1-250μm、1-300μm、50-100μm、50-200μm、或50-300μm、或大于300μm的深度，或由这些值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，通道可以具有3mm或更大的深度。在一些实施方案中，通道可以具有30mm或更大的深度。在一些实施方案中，通道可以具有小于0.1mm、在0.1mm与0.5mm之间、在0.1mm与1mm之间、在0.1mm与5mm之间、在0.1mm与10mm之间、在0.1mm与25mm之间、在0.1mm与50mm之间、在0.1mm与100mm之间、在0.1mm与150mm之间、在0.1mm与200mm之间、在0.1mm与250mm之间、在1mm与5mm之间、在1mm与10mm之间、在1mm与25mm之间、在1mm与50mm之间、在1mm与100mm之间、在1mm与150mm之间、在1mm与200mm之间、在1mm与250mm之间、在5mm与10mm之间、在5mm与25mm之间、在5mm与50mm之间、在5mm与100mm之间、在5mm与150mm之间、在5mm与200mm之间、在1mm与250mm之间、或大于250mm，或由这些值中的任何两个限定的范围的长度。在一些实施方案中，通道可以具有2m或更大的长度。在一些实施方案中，通道可以具有20m或更大的长度。在一些实施方案中，通道可以具有小于0.1mm、在0.1mm与0.5mm之间、在0.1mm与1mm之间、在0.1mm与5mm之间、在0.1mm与10mm之间、在0.1mm与15mm之间、在0.1mm与20mm之间、在0.1mm与25mm之间、在0.1mm与30mm之间、在0.1mm与50mm之间、或大于50mm的宽度，或由这些值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，通道可以具有500mm或更大的宽度。在一些实施方案中，通道可以具有5m或更大的宽度。通道长度可以在微米范围内。

用于制造所公开装置的毛细管或微流体芯片的一种或多种材料通常是光学透明的，以便于与光谱或基于成像的检测技术一起使用。整个毛细管是光学透明的。或者，毛细管的一部分(例如，光学透明的“窗口”)可以是光学透明的。在一些情况下，整个微流体芯片将是光学透明的。在一些情况下，微流体芯片的一部分(例如，光学透明的“窗口”)可以是光学透明的。

如上所述，连接到本文公开的流动池装置和盒的毛细管或微流体通道的流体接头被设计成与标准OD聚合物或玻璃流体管道或微流体通道匹配。如图1所示，流体接头的一端可设计成与具有特定尺寸和截面几何形状的毛细管配合，而另一端可设计成与具有相同或不同尺寸和截面几何形状的流体管配合。接头可以使用多种合适的技术(例如，挤出成型、注射成型、模压成型、精密CNC加工等)和材料(例如、玻璃、熔融二氧化硅、陶瓷、金属、聚二甲硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等)中的任一种来制造，其中制造技术的选择通常取决于所使用的材料的选择，反之亦然。

表面涂层：微流体芯片上的一个或多个毛细管或通道的内表面(或毛细管内腔的表面)通常使用多种表面改性技术或聚合物涂层中的任一种来涂覆。

合适的表面改性或包被技术的实例包括但不限于使用硅烷化学物质(例如，氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、三乙氧基硅烷、二乙氧基二甲基硅烷和其他直链、支链或环状硅烷)将官能团或分子共价连接到毛细管内腔表面、共价或非共价连接的聚合物层(例如，链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸、聚丙烯酰胺、聚赖氨酸共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(POEGMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和聚赖氨酸共聚物的层)或其任何组合。

可用于将一层或多层材料(例如，聚合物层)接枝到支持体表面或使层彼此交联的偶联化学物质的实例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变体)，his标签-Ni/NTA偶联化学物质、甲氧基醚偶联化学物质、羧酸酯偶联化学物质、胺偶联化学物质、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷化学物质。

内部或内腔表面上的聚合物层或其他化学层的层数可以是1至约10或大于10。在一些情况下，层数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些情况下，层数可以是至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1。在本段落中描述的任何下限和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，层的数目可以在约2至约4的范围内。在一些情况下，所有的层可包括相同的材料。在一些情况下，每层可包括不同的材料。在一些情况下，多个层可包括多种材料。

在另一种情况下，可以将一层或多层涂层材料施加到微流体芯片上的毛细管内腔表面或通道的内表面，其中选择层的数量或每层的材料组成以调节毛细管或通道腔的一种或多种表面性质，如美国专利申请16/363,842号中指出的。

可调节的表面性质的实例包括但不限于表面亲水性/疏水性、总涂层厚度、化学活性官能团的表面密度、接枝连接分子或寡核苷酸引物的表面密度等。在一些情况下，调节毛细管或通道内腔的一种或多种表面性质以例如，(i)提供非常低的蛋白质，寡核苷酸，荧光团和化学或生物分析应用(包括固相核酸扩增或测序应用)的其他分子组分的非特异性结合，(ii)提供改进的固相核酸杂交特异性和效率，和(iii)提供改进的固相核酸扩增速率，特异性和效率。

一个或多个表面改性或聚合物层可以通过在用于它们的预期应用之前使一种或多种合适的化学偶联或包被试剂流过毛细管或通道来施加。可以将一种或多种包被试剂加入到所用的缓冲液中，例如，核酸杂交、扩增反应或测序反应，以提供毛细管内腔表面的动态包被。

毛细管流动池盒：本文还公开了毛细管流动池盒，其可包括一个、两个或更多个毛细管以产生独立的流动通道。图2提供了毛细管流动池盒的非限制性实例，该毛细管流动池盒包括两个玻璃毛细管、流体接头(在该实例中每个毛细管两个)和与毛细管或流体接头配合的盒底座，使得毛细管相对于盒保持在固定的取向。在一些情况下，流体接头可以与盒底座集成。在一些情况下，盒可包括与毛细管或毛细管流体接头配合的附加接头。在一些情况下，毛细管永久地安装在盒中。在一些情况下，盒底座设计成允许流动池盒的一个或多个毛细管可互换地移除和更换。例如，在一些情况下，盒底座可包括铰接的“蛤壳”构造，其允许盒底座打开，从而可移除和更换一个或多个毛细管。在一些情况下，盒底座被配置为安装在例如，显微镜系统的载物台上或仪器系统的盒保持器内。

本公开的毛细管流动池盒可包括单个毛细管。在一些情况下，本公开的毛细管流动池盒可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或多于20个毛细管。流动池盒的一个或多个毛细管可具有如上所述针对单个毛细管流动池装置的任何几何形状、尺寸、材料组成或涂层。类似地，用于盒中的单个毛细管的流体接头(例如，每个毛细管两个流体接头)可以具有如上所述用于单个毛细管流动池装置的任何几何形状、尺寸和材料组成，除了在一些情况下流体接头可以直接与盒底座集成，如图2所示。在一些情况下，盒可包括附加的接头(即，除了流体接头之外)，其与毛细管或流体接头配合并有助于将毛细管定位在盒内。这些接头可以使用与上述流体接头相同的制造技术和材料来构造。

在一些实施方案中，根据本公开的一个或多个装置可包括在总体上面向流动通道内部的取向上的第一表面，其中所述表面还可以包括如在此别处公开的聚合物涂层，并且其中所述表面还可以包括一种或多种寡核苷酸，如捕获寡核苷酸、接头寡核苷酸，或如本文公开的任何其他寡核苷酸。在一些实施方案中，所述装置还可包括第二表面，其取向通常面向流动通道的内部并且还通常面向或平行于第一表面，其中所述表面还可包括如本文别处公开的聚合物涂层，并且其中所述表面还可包括一种或多种寡核苷酸，如捕获寡核苷酸、接头寡核苷酸或如本文公开的任何其他寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开的装置可包括在总体上面向该流动通道的内部的取向上的第一表面，在总体上面向该流动通道的内部并且进一步总体上面向或平行于该第一表面的取向上的第二表面，总体上面向第二流动通道的内部的第三表面，以及总体上面向该第二流动通道的内部并且总体上与该第三表面相对或平行的第四表面；其中所述第二和第三表面可以位于或附着到通常平面的基底的相对侧上，基底可以是反射、透明或半透明基底。在一些实施方案中，流动池内的一个或多个成像表面可位于流动池的中心内，或位于流动池的两个子单元或子部分之间的划分内，或作为流动池的两个子单元或子部分之间的划分的一部分，其中所述流动池可包括顶表面和底表面，顶表面和底表面中的一者或两者可对可利用的此类检测模式透明；并且其中包括寡核苷酸或多核苷酸或一个或多个聚合物涂层的表面可以放置或插入在流动池的内腔中。在一些实施方案中，所述顶表面或底表面不包括附着的寡核苷酸或多核苷酸。在一些实施方案中，所述顶表面或所述底表面可包括附着的寡核苷酸或多核苷酸。在一些实施方案中，顶表面或底表面可包括附着的寡核苷酸或多核苷酸。置于或插入流动池内腔内的一个或多个表面可以位于或附着在通常平面的基底的一侧，相对侧或两侧上，基底可以是反射、透明或半透明基底。在一些实施方案中，如本文别处提供的或如本领域中另外使用的光学设备用于提供第一表面、第二表面、第三表面、第四表面、置于流动池内腔内的表面，或本文提供的可含有附着于其上的一种或多种寡核苷酸或多核苷酸的任何其他表面的图像。

微流体芯片流动池盒：本文还公开了可具有多个独立流动通道的微流体通道流动池盒。微流体芯片流动池盒的非限制性实例包括具有在芯片上形成的两个或更多个平行玻璃通道的芯片、耦合到芯片的流体接头和与芯片或流体接头配合的盒底座，使得芯片相对于盒以固定取向放置。在一些情况下，流体接头可以与盒底座集成。在一些情况下，盒可包括与芯片或流体接头配合的附加接头。在一些情况下，芯片永久地安装在盒中。在一些情况下，盒底座设计成允许流动池盒的一个或多个芯片可互换地移除和替换。例如，在一些情况下，盒底座可包括铰接的“蛤壳”构造，其允许盒底座打开，从而可移除和更换一个或多个毛细管。在一些情况下，盒底座被配置为安装在例如，显微镜系统的载物台上或仪器系统的盒保持器内。即使在非限制性实施方案中描述了一个芯片，但是应当理解，在微流体通道流动池盒中可以使用多于一个芯片。

本发明的流动池盒可包括单个微流体芯片或多个微流体芯片。在一些情况下，本公开的流动池盒可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个微流体芯片。在一些情况下，微流体芯片可具有一个通道。在一些情况下，微流体芯片可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个通道。流动池盒的一个或多个芯片可具有如上所述针对单个微流体芯片流动池装置的任何几何形状、尺寸、材料组成或涂层。类似地，用于盒中的单个芯片的流体接头(例如，每个毛细管两个流体接头)可以具有如上所述用于单个微流体芯片流动池装置的任何几何形状、尺寸和材料组成，除了在一些情况下流体接头可以直接与盒底座集成。在一些情况下，盒可包括与芯片或流体接头配合并有助于将芯片定位在盒内的附加接头(即，除了流体接头之外)。这些接头可以使用与上述流体接头相同的制造技术和材料来构造。

盒底座(或“外壳”)可由金属或聚合物材料制成，例如铝、阳极化铝、聚碳酸酯(PC)、丙烯酸(PMMA)或Ultem(PEI)，而其他材料也与本公开一致。外壳可以使用CNC机加工或模制技术来制造，并且设计成使得一个，两个或多于两个毛细管在固定的取向上被底座约束以产生独立的流动通道。毛细管可使用例如，压缩配合设计或通过与由硅酮或含氟弹性体制成的可压缩接头配合而安装在底座中。在一些情况下，盒底座的两个或更多个部件(例如，上半部和下半部)使用例如，螺钉、夹子、夹具或其他紧固件组装，使得两个半部是可分离的。在一些情况下，盒底座的两个或更多个部件使用例如，粘合剂、溶剂黏合或激光焊接来组装，使得两个或更多个部件永久地附接。

本公开的一些流动池盒还包括与盒集成的附加部件，以为特定应用提供增强的性能。可以集成到盒中的附加部件的示例包括但不限于流体流动控制部件(例如，微型阀、微型泵、混合歧管等)、温度控制部件(例如，电阻加热元件、用作热源或散热器的金属板、用于加热或冷却的压电(珀尔帖)装置、温度传感器)、或光学部件(例如，光学透镜、窗、滤光器、反射镜、棱镜、光纤、发光二极管(LED)，或可共同用于促进一个或多个毛细管流动通道的光谱测量或成像的其他微型光源。

系统和系统组件：本文公开的流动池装置和流动池盒可用作设计用于各种化学分析、生物化学分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的系统的组件。通常，这样的系统可包括一个或多个流体流动控制模块、温度控制模块、光谱测量或成像模块、和处理器或计算机，以及本文所述的单个毛细管流动池装置和毛细管流动池盒或微流体芯片流动池装置和流动池盒中的一个或多个。

本文公开的系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个单个毛细管流动池装置或毛细管流动池盒。在一些情况下，单个毛细管流动池装置或毛细管流动池盒可以是所公开的系统的可拆卸的、可更换的部件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置或毛细管流动池盒可以是所公开系统的一次性或可消耗部件。本文公开的系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个单个微流体通道流动池装置或微流体通道流动池盒。在一些情况下，单个微流体通道流动池装置或微流体通道流动池盒可以是所公开的系统的可移除，可交换的部件。在一些情况下，流动池装置或流动池盒可以是所公开系统的一次性或可消耗部件。

图3示出了简单系统的一个实施方案，该系统包括连接到各个流体流动控制部件的单个毛细管流动池，其中单个毛细管是光学可接近的并且与安装在显微镜载物台上或者安装在用于各种成像应用的定制成像仪器中兼容。多个试剂储存器与单个毛细管流动池装置的入口端流体耦合，其中在任何给定时间点流过毛细管的试剂通过可编程旋转阀的效用来控制，该可编程旋转阀允许用户控制试剂流动的定时和持续时间。在该非限制性示例中，通过使用可编程注射泵来控制流体流动，可编程注射泵提供对体积流体流动和流体流速的准确控制和定时。

图4示出了系统的一个实施方案，该系统包括具有集成隔膜阀的毛细管流动池盒，以最小化死体积并保存某些关键试剂。将微型隔膜阀集成到盒中允许阀定位在毛细管入口附近，由此使装置内的死体积最小化并减少昂贵试剂的消耗。阀和其他流体控制部件在毛细管流动池盒内的集成还允许更大的流体流动控制功能被结合到盒设计中。

图5示出了与显微镜装置结合使用的基于毛细管流动池盒的流体学系统的示例，其中盒结合或配合有温度控制部件，例如金属板，其与盒内的毛细管接触并用作热源/散热器。显微镜装置包括照明系统(例如，包括作为光源的激光器、LED、卤素灯等)、物镜、成像系统(例如，CMOS或CCD相机)和相对于光学系统移动盒的平移台，该平移台允许例如，在台移动时获取毛细管流动池的不同区域的荧光或明场图像。

图6示出了通过使用与流动池盒接触放置的金属板对流动池(例如，毛细管或微流体通道流动池)进行温度控制的一个非限制性实例。在一些情况下，金属板可以与盒底座集成。在一些情况下，可使用珀尔帖或电阻加热器控制金属板的温度。

图7示出了用于包括非接触式热控制机构的流动池(例如，毛细管或微流体通道流动池)的温度控制的一种非限制性方法。在该方法中，使用空气温度控制系统将温度控制空气流引导通过流动池盒(例如，朝向单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。空气温度控制系统包括热交换器，例如，电阻加热器线圈、连接到珀尔帖装置的散热片等，其能够加热或冷却空气并将其保持在恒定的，用户指定的温度。空气温度控制系统还包括空气递送装置，例如风扇，其将加热或冷却的空气流引导到毛细管流动池盒。在一些情况下，空气温度控制系统可以被设定为恒定温度T

流体流动控制模块：通常，所公开的仪器系统将提供用于将样品或试剂递送至连接至系统的一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)的流体流动控制能力。试剂和缓冲剂可储存在瓶、试剂和缓冲剂盒或其他合适的容器中，容器通过管道和阀歧管连接到流动池入口。所公开的系统还可包括处理过的样品和废物储器，其形式为瓶、盒或其他合适的容器，用于收集毛细管流动池装置或毛细管流动池盒下游的流体。在一些实施方案中，流体流动控制(或“流体学”)模块可以提供不同源(例如，位于仪器中的样品或试剂储存器或瓶)与中心区域(例如，毛细管或微流体通道)入口之间的流动的可编程切换。在一些实施方案中，流体流动控制模块可以在中心区域(例如，毛细管或微流体通道)出口与连接到系统的不同收集点(例如，经处理的储样瓶、废物储集器等)之间的流动的可编程切换。在一些情况下，样品、试剂或缓冲液可以储存在整合到流动池盒本身中的储器内。在一些情况下，处理过的样品，用过的试剂或使用过的缓冲液可以储存在整合到流动池盒本身中的储器中。

通过使用泵(或的流体流动的控制将通过使用泵(或其他流体致动机构)和阀(例如，可编程泵和阀)来执行。合适的泵的实例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。合适的阀的实例包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。在一些实施方案中，通过向试剂和缓冲液容器的一个或多个入口，或向并入流动池盒(例如，毛细管或微流体通道流动池盒)的入口施加正气动压力的效用，可以控制通过系统的流体流动。在一些实施方案中，可以通过在废物储器的一个或多个出口处或在并入流动池盒(例如，毛细管或微流体通道流动池盒)中的一个或多个出口处抽真空的效用来控制通过系统的流体流动。

在一些情况下，在测定或分析过程中的不同点处使用不同模式的流体流动控制，例如，正向流动(相对于给定毛细管流动池装置的入口和出口)、反向流动、振荡或脉动流动、或其组合。在一些应用中，例如，在测定洗涤/冲洗操作期间，可以施加振荡或脉动流，以促进一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，单个毛细管流动池装置或盒和微流体芯片流动池装置或盒)内的流体的完全和有效交换。

类似地，在一些情况下，可以在测定或分析过程工作流程中的不同点处利用不同的流体流速，例如，在一些情况下，体积流速可以从-100ml/sec变化到+100ml/sec。在一些实施方案中，体积流速的绝对值可以是至少0.001ml/sec、至少0.01ml/sec、至少0.1ml/sec、至少1ml/sec、至少10ml/sec或至少100ml/sec。在一些实施方案中，体积流速的绝对值可以是至多100ml/sec、至多10ml/sec、至多1ml/sec、至多0.1ml/sec、至多0.01ml/sec或至多0.001ml/sec。在给定时间点的体积流速可以具有该范围内的任何值，例如，2.5ml/sec的正向流速，-0.05ml/sec的反向流速，或0ml/sec的值(即，停止流速)。

温度控制模块：如上所述，在一些情况下，所公开的系统将包括温度控制功能，用于促进测定或分析结果的准确度和再现性。可并入仪器系统(或毛细管流动池盒)设计中的温度控制组件的实例包括(但不限于)电阻加热元件、红外光源、珀尔帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻器、热电偶等。在一些情况下，温度控制模块(或“温度控制器”)可在执行特定化验或分析操作之前的指定可调节时间提供可编程温度变化。在一些情况下，温度控制器可以在指定的时间间隔内提供可编程的温度变化。在一些实施方案中，温度控制器可以进一步提供在两个或更多个设定温度之间以指定频率和升温速率的温度循环，使得可以进行扩增反应的热循环。

B.检测系统

光谱或成像模块可包括例如，配备有CCD相机的CMOS的显微镜。在一些情况下，光谱学或成像模块可包括例如，被配置为执行感兴趣的特定光谱学或成像技术的定制仪器。通常，与成像模块相关联的硬件可包括光源、检测器和其他光学部件，以及处理器或计算机。

光源：多种光源中的任一种可用于提供成像光或激发光，包括但不限于钨灯、钨-卤素灯、弧光灯、激光器、发光二极管(LED)或激光二极管。在一些情况下，一个或多个光源和附加光学部件(例如，透镜、滤光器、光圈、膜片、反射镜等)的组合可以被配置为照明系统(或子系统)。

检测器：多种图像传感器中的任一种可用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列，电荷耦合装置(CCD)相机或互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。如本文所用，“成像传感器”可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多情况下，一个或多个图像传感器和附加光学部件(例如，透镜、滤光器、光圈、膜片、反射镜等)的组合可以被配置为成像系统(或子系统)。在一些情况下，例如，在通过系统而不是成像执行光谱测量的情况下，合适的检测器可包括但不限于光电二极管，雪崩光电二极管和光电倍增管。

其他光学部件：光谱测量或成像模块的硬件部件还可包括用于操纵、成形、过滤或聚焦通过系统的光束的各种光学部件。合适的光学部件的实例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、光圈、衍射光栅、彩色玻璃滤光器、长通滤光器、短通滤光器、带通滤光器、窄带干涉滤光器、宽带干涉滤光器、二向色反射器、光纤、光波导等。在一些情况下，光谱测量或成像模块还可包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，用于相对于照明或检测/成像子系统移动毛细管流动池装置和盒，反之亦然。

光谱或成像模块：如上所述，在一些情况下，所公开的系统将包括光学成像或其他光谱测量能力。例如，可以实现各种成像模式中的任何一种，包括但不限于亮场、暗场、荧光、发光或磷光成像。在一些实施方案中，中心区域包括允许中心区域的至少一部分被照明和成像的窗口。在一些实施方案中，毛细管包括允许毛细管的至少一部分被照射和成像的窗口。在一些实施方案中，微流体芯片包括允许芯片通道的至少一部分被照射和成像的窗口。

在一些实施方案中，可以执行单波长激发和发射荧光成像。在一些实施方案中，可执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)荧光成像。在一些实例中，成像模块被配置为获取视频图像。成像模式的选择可能影响流动池装置或流动池盒的设计，因为毛细管或盒的全部或一部分在感兴趣的光谱范围内可以是光学透明的。在一些情况下，毛细管流动池盒内的多个毛细管可以在单个图像内整体成像。在一些实施方案中，毛细管流动池盒内的单个毛细管或毛细管子集或其部分可以在单个图像内成像。在一些实施方案中，一系列图像可以被“平铺”以产生盒内的一个、两个、若干个或全部多个毛细管的单个高分辨率图像。在一些情况下，微流体芯片内的多个通道可以在单个图像内整体成像。在一些实施方案中，微流体芯片内的单个通道或通道子集或其部分可在单个图像内成像。在一些实施方案中，一系列图像可以被“平铺”以产生盒内的一个、两个、若干个或全部多个毛细管或微流体通道的单个高分辨率图像。

全内反射：在一些情况下，光学模块或子系统可以被设计成使用流动池装置和盒中的毛细管或微流体通道的光学透明壁的全部或一部分作为波导，用于经由全内反射将激发光递送到毛细管或通道内腔。当入射激发光以大于临界角(由毛细管或通道壁材料和毛细管或通道内的水性缓冲液的相对折射率确定)的相对于表面法线的角度撞击毛细管或通道内腔的表面时，在表面处发生全内反射，并且光沿着毛细管或通道的长度传播通过毛细管或通道壁。全内反射在内腔表面产生倏逝波，该倏逝波穿透内腔内部极短的距离，并且该倏逝波可用于选择性地激发表面的荧光团，例如，已通过固相引物延伸反应由聚合酶掺入到生长的寡核苷酸中的标记核苷酸。

计算机控制系统。本公开提供了被编程或以其他方式配置以实施本文提供的方法的计算机系统，方法例如用于核酸测序、存储参考核酸序列、进行序列分析或如本文所述比较样品和参考核酸序列的方法。图11中示出了这种计算机系统的示例。如图11所示，计算机系统1001包括中央处理单元(CPU，此处也称为“处理器”和“计算机处理器”)1005，其可以是单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1001还包括存储器或存储位置1010(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1015(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1020(例如，网络接头)、以及外围设备1025，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储或电子显示接头。存储器1010、存储单元1015、接口1020和外围设备1025通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU 1005通信。存储单元1015可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1001可以借助于通信接口1020可操作地耦合到计算机网络(“网络”)1030。网络1030可以是因特网，因特网或外联网，或与因特网通信的内联网或外联网。在一些情况下，网络1030是电信或数据网络。网络1030可包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，例如云计算。在一些情况下，借助于计算机系统1001，网络1030可以实现对等网络，该对等网络可以使耦合到计算机系统1001的设备能够表现为客户端或服务器。

CPU 1005可以执行机器可读指令序列，其可包括在程序或软件中。指令可存储在存储器位置(例如存储器1010)中。由CPU 1005执行的操作的示例可包括提取、解码、执行和回写。

存储单元1015可以存储文件，如驱动器、库和保存的程序。存储单元1015可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1001可包括在计算机系统1001外部的一个或多个附加数据存储单元，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1001通信的远程服务器上。

计算机系统1001可以通过网络1030与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1001可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。

可以通过存储在计算机系统1001的电子存储位置(例如，存储器1010或电子存储单元1015)上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现如本文所述的方法。可以以软件的形式提供机器可执行或机器可读代码。在使用期间，代码可由处理器1005执行。在一些情况下，可从存储单元1015中检索代码并将其存储在存储器1010上以供处理器1005随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元1015，并且将机器可执行指令存储在存储器1010上。

代码可以被预编译和配置为与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间被编译。代码可以以编程语言提供，该编程语言可以被选择为使得该代码能够以预编译或编译时的方式执行。

本文提供的系统的各方面，诸如计算机系统1001，可以在编程中实现。该技术的各个方面可以被认为是以机器(或处理器)可执行代码或相关联的数据的形式的“产品”或“制品”，该机器可执行代码或相关联的数据在一种类型的机器可读介质上携带或体现。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘的电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机，处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联的模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这种通信例如，可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光、电和电磁波，例如通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路在本地设备之间的物理接口上使用的。承载这种波的物理元件，例如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限制为非暂时性的，有形的“存储”介质，诸如计算机或机器的术语“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如，光盘或磁盘，诸如可用于实现图中所示的数据库等的任何计算机等中的任何存储设备。易失性存储介质包括动态存储器，例如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包含包括计算机系统内的总线的线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号，或者声波或光波的形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。计算机可读介质的常见形式因此包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输这种载波的电缆或链路、或计算机可从其读取编程代码或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带到处理器以供执行。计算机系统1001可包括电子显示器1035或与电子显示器1035通信、电子显示器1035包括用户接口(UI)，用于提供例如，耦合到计算机系统1001的核酸测序仪器的输出或读出。这种读出可包括核酸测序读出，例如包括给定核酸样品的核酸碱基序列。UI还可用于显示利用这种读出的分析结果。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。电子显示器1035可以是计算机监视器，或电容或电阻触摸屏。

成像处理软件：在一些情况下，系统还可包括计算机(或处理器)和包括用于提供图像处理和分析能力的代码的计算机可读介质。可由软件提供的图像处理和分析能力的实例包括但不限于手动，半自动或全自动图像曝光调整(例如，白平衡、对比度调整、信号平均和其他降噪能力等)、自动边缘检测和对象识别(例如，用于识别毛细管流动池装置的内腔表面上的荧光标记的寡核苷酸的克隆扩增簇)、自动统计分析(例如，用于确定毛细管内腔表面的每单位面积上识别的寡核苷酸的克隆扩增簇的数目)，或用于核酸测序应用中的自动核苷酸碱基识别)和手动测量能力(例如，用于测量簇或其他对象之间的距离等)。任选地，仪器控制和图像处理/分析软件可以作为单独的软件模块来编写。在一些实施方案中，仪器控制和图像处理/分析软件可以结合到集成封装中。

系统控制软件：在一些情况下，该系统可包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于提供用户界面以及手动、半自动或全自动控制所有系统功能的代码，例如，控制流体学模块、温度控制模块或光谱学或成像模块，以及其他数据分析和显示选项。系统计算机或处理器可以是系统的集成部件(例如，嵌入在仪器内的微处理器或母板)，或者可以是独立模块，例如，主机计算机、个人计算机或膝上型计算机。由系统控制软件提供的流体控制功能的实例包括但不限于体积流体流量、流体流速、样品和试剂添加的定时和持续时间、缓冲液添加和冲洗操作。由系统控制软件提供的温度控制功能的实例包括但不限于指定温度设定点和控制温度变化的定时、持续时间和斜坡率。由系统控制软件提供的光谱测量或成像控制功能的实例包括但不限于自动聚焦能力、照明或激发光曝光时间和强度的控制、图像获取速率的控制、曝光时间和数据存储选项。

处理器和计算机：在一些情况下，所公开的系统可包括一个或多个处理器或计算机。处理器可以是硬件处理器，例如中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、通用处理单元或计算平台。处理器可包括各种合适的集成电路，微处理器、逻辑装置、现场可编程门阵列(FPGA)等中的任何一种。在一些情况下，处理器可以是单核或多核处理器，或者多个处理器可以配置用于并行处理。尽管参考处理器来描述本发明，但其他类型的集成电路和逻辑装置也是适用的。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。

处理器或CPU可以执行一系列机器可读指令，这些指令可包括在程序或软件中。指令可存储在存储器位置中。可将指令引导到CPU，其可随后编程或以其他方式配置CPU以实现，例如，本发明的系统控制方法。由CPU执行的操作的示例可包括提取、解码、执行和写回。

一些处理器是计算机系统的处理单元。计算机系统可以实现基于云的数据存储或计算。在一些情况下，计算机系统可以借助于通信接口可操作地耦合到计算机网络(“网络”)。网络可以是互联网、内联网、外联网、内联网或与互联网通信的外联网、或局域网(LAN)。在一些情况下，网络是电信或数据网络。网络可包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，例如基于云的计算。

计算机系统还可包括计算机存储器或存储位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)，电子存储单元(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络接头)，以及外围设备(例如，高速缓存)、其他存储单元、数据存储单元或电子显示接头。在一些情况下，通信接口可以允许计算机与一个或多个附加设备通信。计算机能够从耦合的设备接收输入数据用于分析。存储器单元、存储单元、通信接口和外围设备可以通过通信总线(实线)与处理器或CPU通信，例如可以结合到主板中。存储器或存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。存储器或存储单元可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储器或存储单元可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。

如本文所述的系统控制、图像处理或数据分析方法可通过存储在计算机系统的电子存储位置(例如存储器或电子存储单元)中的机器可执行代码来实现。可以以软件的形式提供机器可执行或机器可读代码。在使用期间，代码可由处理器执行。在一些情况下，可以从存储单元中检索代码，并将其存储在存储器中，以备处理器访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元，并且将机器可执行指令存储在存储器中。

在一些情况下，本公开的系统控制，图像处理或数据分析方法可以通过一个或多个算法来实现。算法可以在中央处理单元执行时通过软件来实现。

III.用于检测病原性核酸的试剂盒

在一些实施方案中，本文公开了使用本文公开的组合物、方法或系统制备核酸测序文库的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的组合物，例如用于使核酸分子环化或在环化后对核酸分子测序的试剂和基底。

试剂盒可包括酶、核酸、核苷酸、具有官能化表面的支持体或指令。在一些实施方案中，酶可以是连接酶、蛋白酶、转座酶、本文所述的任何一种酶及其组合。在一些实施方案中，核酸可以是寡核苷酸、夹板寡核苷酸、本文所述的任何寡核苷酸或核酸，或其任何组合。在一些实施方案中，核苷酸可包括具有封闭部分的核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸可包括聚合物-核苷酸偶联物。在一些实施方案中，核苷酸可包括检测部分。在一些实施方案中，具有官能化表面的支持体可包括用于支持体的塑料、金属、玻璃或其任何组合。在一些实施方案中，具有官能化表面的支持体可包括用于官能化的亲水性、疏水性、聚合性、引发的或其任何组合。

在一些实施方案中，说明书可包括对使单链核酸、单链DNA、单链RNA、双链核酸、双链DNA、双链RNA或本文所述的任何核酸及其组合环化的方法的描述。在一些实施方案中，说明书可还包括在环化之前，环化同时或环化之后连接核酸接头或引物的方法的描述。在一些实施方案中，说明书还可以包括用于处理来源于生物来源的遗传物质的说明书。在一些实施方案中，说明书可包括检测核酸序列的描述。在一些实施方案中，这些说明书可包括用于规划多个阶段的描述，每个阶段采用本文描述的方法之一。例如，这样的描述的一个实施方案可以描述以下操作：将单链RNA片段化为多个较短的靶单链RNA，将扩增接头序列附接至多个靶单链RNA中的每一个的5'端和3'端两者，将夹板核酸识别序列附接至多个靶单链RNA中的每一个的5'端和3'端两者，用酶进行夹板连接以将多个靶RNA环化，扩增多个靶环化RNA，将多个靶环化RNA固定到亲水性表面上，然后用标记的核苷酸测定表面上的靶环化RNA的序列。在另一个实例中，这样的描述的一个实施方案可以描述以下步骤：将双链DNA断裂成多个靶单链DNA，将扩增接头序列附接至多个靶单链DNA中的每一个的5'端和3'端两者，将固定化接头序列附接至多个靶单链DNA中的每一个的5'端和3'端两者，将多个靶单链DNA固定化至表面。将夹板核酸识别序列的5'端和3'端连接到多个靶单链DNA的每一个上，用酶进行夹板连接以环化多个靶DNA，滚环扩增多个靶环化DNA，然后用标记的核苷酸测定表面上靶环化DNA的序列。本文描述的实施方案不是限制性示例。

在一些实施方案中，本文公开了使用本文公开的组合物、方法或系统进行核酸测序的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的组合物，例如用于使用本文公开的组合物、方法或系统进行核酸测序的试剂和基底。

试剂盒可包括聚合物-核苷酸组合物、核酸、核苷酸、表面、缓冲体系或说明书。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸组合物可包括聚合物核和与其偶联的多个核苷酸部分。在一些实施方案中，表面可包括与其偶联的引发的核酸序列和亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物层包括聚合物，所述聚合物包括选自聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素或葡聚糖，或其组合的聚合物。在一些实施方案中，表面可包括流动池的一个或多个内表面。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括至少两种类型的核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括至少三种类型的核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括至少四种类型的核苷酸-聚合物偶联物。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括多种类型的核苷酸-聚合物偶联物，并且其中多种类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括多种类型的核苷酸-聚合物偶联物，并且其中多种类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括多种类型的核苷酸-聚合物偶联物，并且其中多种类型中的每一种包括偶联至聚合物核的不同的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记包括荧光标记。在一些实施方案中，聚合物核可包括选自以下的聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一个或多个未标记的核苷酸，一个或多个未标记的核苷酸包括在一个或多个未标记的核苷酸的糖的3'位的阻断基团。在一些实施方案中，阻断基团可包括3'-O-甲基核苷酸或3'-O-烷基羟胺核苷酸、3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-硫代磷酸酯基、3'-O-丙二酰基、3'-O-苄基、3'-O-氨基或其衍生物。在一些实施方案中，缓冲体系可包括锶离子、镁离子、钙离子或其任何组合。在一些实施方案中，试剂盒可包括说明书，说明书包括通过以下鉴定来源于患有或疑似患有由SARS-CoV-2病毒或其变体引起的疾病或病症的对象的样品的引发的核酸序列中的核苷酸描述，(i)在足以在聚合物-核苷酸组合物的一个或多个核苷酸部分和引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将一个或多个核苷酸部分掺入所述引发的核酸序列的条件下，使引发的核酸序列与聚合物-核苷酸组合物接触；以及(ii)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。在一些实施方案中，说明书还可包括重复(i)和(ii)以鉴定引发的核酸序列中的连续核苷酸的说明书。在一些实施方案中，说明书还可包括用于扩增来源于样品的核酸序列并在足以产生引发的核酸序列的条件下使核酸序列和与核酸序列的至少一部分互补的引物序列接触的说明书。

IV.编号的实施方案

实施方案1.本文公开的实施方案包括处理患有或疑似患有由严重呼吸综合征2(SARS-CoV-2)病毒引起的2019冠状病毒病(COVID-19)的对象的样品的方法，所述方法包括：(a)提供包括两个或更多个微流体通道的核酸测序流动池，其中，所述两个或更多个微流体通道中的至少一个包括表面，所述表面包括固定于其上的核酸序列，其中，所述核酸序列来源于患有或疑似患有所述COVID-19的所述对象的所述样品；(b)使所述核酸序列与具有与所述核酸序列的互补性的引物接触，以产生引发的核酸序列；(c)使用至少(i)聚合酶和(ii)具有多个可检测标记的多个核碱基使所述引发的核酸序列进行引物延伸反应；(d)在进行所述引物延伸反应时，使用检测器检测来自所述多个可检测标记的至少一个子集的多个信号；和(e)使用(d)中检测的所述多个信号产生测序数据；(f)使用一个或多个逻辑电路使用并行处理来处理所述测序数据以鉴定所述核酸序列；(g)使用(f)中鉴定的所述核酸序列确定所述样品含有编码所述SARS-CoV-2的信使核糖核酸(mRNA)分子。实施方案2.根据实施方案1的方法，其中所述多个可检测标记包括多个荧光团。实施方案3.根据实施方案1或2的方法，使用(d)中检测的所述多个信号鉴定所述核酸序列包括使用荧光成像系统对所述两个或更多个微流体通道的第一表面和轴向位移的第二表面成像。实施方案4.根据实施方案1的方法，还包括，在(a)之前：(h)将包括浓度至多或等于约1纳摩尔(nM)、至多或等于约500皮摩尔(pM)，或至多或等于约50pM的所述核酸序列的流体组合物引入与所述聚合酶和多个核苷酸部分接触。实施方案5.根据实施方案1的方法，还包括，在(a)之前：(i)将所述核酸序列的至少一部分与接枝到所述表面的寡核苷酸的至少一部分杂交。实施方案6.根据实施方案1的方法，其中所述核酸测序流动池在(c)之前负载有所述流体组合物。实施方案7.根据实施方案5-6中任一项的方法，所述核酸序列以包括至少4,000个分子/平方微米(μ

实施方案23.根据实施方案22的流动池装置，其中所述装置涉及流动池装置，其包括：框架；容纳与流动池相容的多个反应共用的试剂的多个储器；容纳反应特异性试剂的单个储器；可移除毛细管，其具有：1)第一隔膜阀，其门控来源于多个储器的多种非特异性试剂的吸入，和2)第二隔膜阀，其门控来源于源储器的单一试剂的吸入，源储器紧邻第二隔膜阀。

实施方案24.根据实施方案21-22中任一项的流动池装置，其中所述装置涉及流动池装置，其包括：火焰工件；容纳与流动池相容的多个反应共用的试剂的多个储器；容纳反应特异性试剂的单个储器；可移除或不可移除的毛细管，其具有：1)第一隔膜阀，其门控来源于多个储器的多种非特异性试剂的吸入；2)第二隔膜阀，其门控来源于源储器的单一试剂的吸入，源储器紧邻第二隔膜阀；以及3)任选地，安装实施方案，其中毛细管经由索引安装介质固定/安装到玻璃基底。

实施方案25.根据实施方案22-24中任一项的流动池装置，其中所述装置涉及流动池装置，其包括：a)一个或多个毛细管，其中一个或多个毛细管是可更换的；b)两个或更多个流体接头，两个或更多个流体接头附接到一个或多个毛细管并且被配置为与管道配合，管道在一个或多个毛细管中的每一个与流动池装置外部的流体控制系统之间提供流体连通；以及c)任选地，盒，其被配置为与一个或多个毛细管匹配，使得一个或多个毛细管被保持在相对于盒的固定取向，并且其中两个或更多个流体接头与盒集成，任选地，安装根据实施方案，其中毛细管经由索引安装介质被固定/安装到玻璃基底。

实施方案26.本文公开的一个根据实施方案是对核酸样品和第二核酸样品测序的方法，所述方法包括：将多个寡核苷酸递送至至少部分透明的腔室的内表面；将第一核酸样品递送至内表面；通过第一通道将多种非特异性试剂递送至内表面；将特定试剂通过第二通道递送至内表面，其中第二通道具有比第一通道更低的体积；使至少部分透明的腔室的内表面上的测序反应可视化；以及在第二测序反应之前更换该至少部分透明的腔室。

实施方案27.根据实施方案26的方法，其中所述方法涉及还原测序反应中使用的试剂，包括：在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中第一储器和第二储器中的每一个流体连接至中心区域，并且其中所述中心区域包括用于所述测序反应的表面；以及将所述第一试剂和所述第二试剂顺序地引入流动池装置的中心区域，其中从所述第一储器流到所述中心区域的入口的所述第一试剂的体积小于从所述第二储器流到所述中心区域的所述第二试剂的体积。

实施方案28.根据实施方案26或27中任一项的方法，其中所述方法涉及增加试剂在测序反应中的有效使用，包括：在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中所述第一储器和所述第二储器中的每一个流体联接至中心区域，并且其中所述中心区域包括用于所述测序反应的表面；以及将从所述第一储器流向所述中心区域的入口的所述第一试剂的体积保持为小于从第二储器流向中心区域的第二试剂的体积。

实施方案29.根据实施方案27-28中任一项的方法，所述第一试剂比第二试剂更昂贵。实施方案30.根据实施方案27-29中任一项的方法，其中第一试剂包括聚合酶，核苷酸和核苷酸类似物。

实施方案31.本文公开的实施方案是检测病原体的方法，所述方法包括使样品与一种或多种结合部分接触，其中所述结合部分固定在流动池的一个或多个表面上，所述表面包括一层或多层亲水性涂层，从而固定所述样品的一种或多种核酸组分用于分析。实施方案32.根据实施方案30的方法，其中其他情况涉及其中一种或多种核酸组分包括病毒核酸的方法。

实施方案33.根据实施方案31的方法包括使样品与一种或多种寡核苷酸接触，寡核苷酸栓系到包括一层或多层亲水性涂层的流动池的所述内表面，并且其中所述一种或多种寡核苷酸表现出与病毒核酸区段特异性杂交的区段。

实施方案34.根据实施方案33的方法包括一个或多个核酸测序操作，其中所述测序操作包括通过结合操作的测序或其中所述测序操作包括边合成边测序的操作。

实施方案35.根据实施方案31的方法，还包括核酸扩增操作，其中所述扩增操作在一个或多个流动池的表面上进行。

实施方案36.根据实施方案31的方法，其还包括使栓系寡核苷酸与病毒核酸杂交，所述方法还包括检测操作，其中所述检测操作是荧光检测操作。

实施方案37.根据实施方案31的方法，还包括使核酸与荧光标记接触。

实施方案38.本文公开了包括一个或多个计算机处理器的系统，计算机处理器被单独或共同编程以实施包括本文公开的任何根据实施方案的核酸结合或掺入组合物或本文公开的任何根据实施方案的试剂的方法。实施方案39.根据实施方案38的系统，其中所述系统被配置为迭代地执行栓系的，引发的核酸分子与所述核酸结合或掺入组合物或所述试剂的顺序接触；以及用于检测所公开的核酸结合或掺入组合物与所述一种或多种引发的核酸分子的结合或掺入。

实施方案40.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独地或共同地编程以实现一种方法，该方法包括：i)使包括栓系于基底表面的靶核酸序列的多个拷贝的基底与包括聚合酶和与所述靶核酸序列的一个或多个区域互补的一个或多个引物核酸序列的试剂接触，以形成引发的靶核酸序列；ii)使所述基底表面与包括聚合物核苷酸偶联物的试剂在足以允许在所述聚合物-核苷酸偶联物与所述引发的靶核酸序列的两个或更多个拷贝之间形成多价结合复合物的条件下接触，其中所述聚合物-核苷酸偶联物包括已知核苷酸部分和可检测标记的两个或更多个拷贝；iii)获取并处理所述基底表面的图像以检测所述多价结合复合物，从而确定所述靶核酸序列中核苷酸的同一性。实施方案41.根据实施方案40的系统，其还包括流体学模块，流体学模块被配置为将一系列试剂以指定序列且以指定时间间隔递送到所述基底表面。实施方案42.根据实施方案40的系统，其还包括被配置为获取所述基底表面的图像的成像模块。实施方案43.根据实施方案40的系统，其包括一个或多个单独或共同编程以实施方法的计算机处理器，其中将(ii)和(iii)重复两次或多次，从而确定所述靶核酸序列中一系列两个或更多个核苷酸的同一性。实施方案44.根据实施方案40或43中任一项的系统，其中系列操作还包括使所述多价结合复合物不稳定的解离操作，所述解离操作能够去除所述聚合物-核苷酸偶联物。实施方案45.根据实施方案40、43或44中任一项的系统，其中系列操作还包括延伸操作，以将与靶核酸序列的下一个碱基互补的核苷酸掺入所述两个或更多个引物核酸分子中。实施方案46.根据实施方案45的系统，其中延伸与所述解离操作同时发生或在所述解离操作之后发生。实施方案47.根据实施方案40的系统，其中可检测标记包括荧光团并且图像包括荧光图像。实施方案48.根据实施方案47的系统，其中当荧光团是花菁染料3(Cy3)时，所述多价结合复合物在所述基底表面上的荧光图像具有大于20的对比度噪声比，并且当所述表面浸没在25mMACES，pH 7.4缓冲液中时，使用配备有20×物镜，NA＝0.75，优化用于532nm光的二向色镜，优化用于花菁染料-3发射的带通滤光器和相机的倒置荧光显微镜在非信号饱和条件下获取图像。实施方案49.根据实施方案40-48中任一项的系统，其中一系列操作在少于60分钟内完成。实施方案50.根据实施方案40-48中任一项的系统，其中一系列操作在少于30分钟内完成。实施方案51.根据实施方案40-48中任一项的系统，其中一系列操作在少于10分钟内完成。实施方案52.根据实施方案40-51中任一项的系统，其中碱基识别的准确度的特征在于对于所确定的核苷酸同一性的至少80％，Q评分大于25。实施方案53.根据实施方案40-51中任一项的系统，其中碱基识别的准确度的特征在于对于所确定的核苷酸同一性的至少80％，Q评分大于30。实施方案54.根据实施方案40-51中任一项的系统，其中碱基识别的准确度的特征在于对于所确定的核苷酸同一性的至少80％，Q评分大于40。

实施方案55.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独地或共同地编程以实现一种方法，该方法包括：将多个寡核苷酸递送至至少部分透明的腔室的内表面；将第一核酸样品递送至所述内表面；通过第一通道将多种非特异性试剂递送至所述内表面；将特定试剂通过第二通道递送至所述内表面，其中所述第二通道具有比第一通道更低的体积；使至少部分透明的腔室的所述内表面上的测序反应可视化；以及在第二测序反应之前更换该至少部分透明的腔室。

实施方案56.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独地或共同地编程以实现一种方法，该方法包括：在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中所述第一储器和所述第二储器中的每一个流体联接至中心区域，并且其中所述中心区域包括用于测序反应的表面；以及顺序地将所述第一试剂和所述第二试剂引入所述流动池装置的中心区域，其中从所述第一储器流到所述中心区域的入口的所述第一试剂的体积小于从所述第二储器流到所述中心区域的所述第二试剂的体积。

实施方案57.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独地或共同地编程以实现一种方法，该方法包括：在第一储器中提供第一试剂；在第一第二储器中提供第二试剂，其中所述第一储器和所述第二储器中的每一个流体联接至中心区域，并且其中所述中心区域包括用于所述测序反应的表面；以及将从所述第一储器流向所述中心区域的入口的所述第一试剂的体积保持为小于从所述第二储器流向所述中心区域的所述第二试剂的体积。

实施方案58.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，计算机处理器被单独或共同编程以实施其中第一试剂比第二试剂更昂贵的方法。实施方案59.根据实施方案58的系统，实施其中所述第一试剂包括聚合酶、核苷酸和核苷酸类似物的方法。

实施方案60.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其单独或共同编程以实施检测病原体的方法，该方法包括使样品与一个或多个结合部分接触，其中所述结合部分固定在流动池的一个或多个表面上，所述表面包括一层或多层亲水性涂层，从而固定所述样品的一个或多个核酸组分用于分析。实施方案61.根据实施方案60的系统，其实施其中一种或多种核酸组分包括病毒核酸的方法。

实施方案62.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独或共同编程以实施检测病原体的方法，该方法包括使样品与栓系至流动池的内表面的一个或多个寡核苷酸接触，流动池包括一层或多层亲水性涂层，并且其中一个或多个寡核苷酸表现出与病毒核酸区段特异性杂交的区段。实施方案63.根据实施方案62的系统，实施包括一种或多种核酸测序操作的方法，其中所述测序操作包括通过结合操作的测序或其中所述测序操作包括边合成边测序的操作。

实施方案63.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，计算机处理器被单独或共同编程以实施包括核酸扩增操作的方法，其中所述扩增操作在一个或多个流动池的表面上进行。

实施方案64.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，其被单独或共同编程以实施包括使栓系的寡核苷酸与病毒核酸杂交的方法，该方法还包括检测操作，其中所述检测操作是荧光检测操作。

实施方案65.本文公开的实施方案是包括一个或多个计算机处理器的系统，计算机处理器被单独或共同编程以实施包括使核酸与荧光标记接触的方法。

实施方案66.本文公开的实施方案是用于执行本文公开的任何方法的系统；其中所述方法可包括使用本文公开的任何组合物；或本文公开的任何试剂；一种或多种缓冲液，和任选地栓系或附着至固相支持体的一种或多种核酸分子，其中所述系统被配置为迭代地执行所述核酸分子与所述组合物或所述试剂的顺序接触；以及用于检测核酸结合或掺入组合物与一种或多种核酸分子的结合或掺入。

实施方案67.本文公开的实施方案是使用本文公开的组合物，方法或系统制备核酸测序文库的试剂盒。实施方案68.根据实施方案67的试剂盒，其中所述试剂盒包括本文所述的组合物，例如用于使核酸分子环化或在环化后对核酸分子测序的试剂和基底。实施方案69.根据实施方案67-68中任一项的试剂盒，其包括核酸，核苷酸，具有官能化表面的支持体或说明书。实施方案70.根据实施方案69的试剂盒，其中酶可以是连接酶、蛋白酶、转座酶、本文所述的酶中的任一种以及它们的组合。实施方案71.根据实施方案69的试剂盒，其中核苷酸可包括具有封闭部分的核苷酸。实施方案72.根据实施方案69的试剂盒，其中所述核苷酸可包括聚合物-核苷酸偶联物。实施方案73.根据实施方案69的试剂盒，其中所述核苷酸可包括检测部分。实施方案74.根据实施方案69的试剂盒，具有官能化表面的所述支持体可包括用于支持体的塑料、金属、玻璃或其任何组合。实施方案75.根据实施方案69中任一项的试剂盒，其中具有官能化表面的所述支持体可包括亲水性的、疏水性的、聚合物的、引发的或其任何组合用于官能化。实施方案76.根据实施方案69的试剂盒，其中所述说明书可包括关于使单链核酸、单链DNA、单链RNA、双链核酸、双链DNA、双链RNA或本文所述的任何核酸及其组合环化的方法的说明书。实施方案77.根据实施方案69的试剂盒，其中说明书还包括在环化之前，与环化同时或在环化之后连接核酸接头或引物的方法的说明书。实施方案78.根据实施方案69的试剂盒，其中说明书还可包括用于加工来源于生物来源的遗传物质的说明书。实施方案79.根据实施方案69的试剂盒，其中说明书可包括用于检测核酸序列的说明书。实施方案80.根据实施方案69的试剂盒，其中说明书可包括用于计划多个阶段的说明书，每个阶段采用本文描述的方法之一。实施方案81.例如，这样的描述的一个实施方案可以描述以下操作：将单链RNA片段化为多个较短的靶单链RNA，将扩增接头序列附接至多个靶单链RNA中的每一个的5'端和3'端两者，将夹板核酸识别序列附接至多个靶单链RNA中的每一个的5'端和3'端两者，用酶进行夹板连接以将多个靶RNA环化，扩增多个靶环化RNA，将多个靶环化RNA固定到亲水性表面上，然后用标记的核苷酸测定表面上的靶环化RNA的序列。实施方案82.在另一个实例中，这样的描述的一个实施方案可以描述以下步骤：将双链DNA断裂成多个靶单链DNA，将扩增接头序列附接至多个靶单链DNA中的每一个的5'端和3'端两者，将固定化接头序列附接至多个靶单链DNA中的每一个的5'端和3'端两者，将多个靶单链DNA固定化至表面。将夹板核酸识别序列的5'端和3'端连接到多个靶单链DNA的每一个上，用酶进行夹板连接以环化多个靶DNA，滚环扩增多个靶环化DNA，然后用标记的核苷酸测定表面上靶环化DNA的序列。本文描述的实施方案不是限制性示例。

实施方案83.本文公开了使用本文公开的组合物、方法或系统进行核酸测序的试剂盒。实施方案84.根据实施方案84的试剂盒，其还包括本文所述的组合物，例如用于使用本文公开的组合物、方法或系统进行核酸测序的试剂和基底。

实施方案85.根据实施方案67-68中任一项的试剂盒，其包括聚合物-核苷酸组合物、核酸、核苷酸、表面、缓冲体系或说明书。实施方案86.根据实施方案85的试剂盒，其中所述聚合物-核苷酸组合物可包括聚合物核和与其偶联的多个核苷酸部分。实施方案87.根据实施方案85的试剂盒，其中所述表面可包括与其偶联的所述引发的核酸序列和亲水性聚合物层。实施方案88.

根据实施方案85的试剂盒，所述表面可包括流动池的一个或多个内表面。实施方案88.根据实施方案85的试剂盒，其还包括至少两种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物。实施方案89.根据实施方案85的试剂盒，其还包括至少三种类型的核苷酸-聚合物偶联物。实施方案90.根据实施方案85的试剂盒，其还包括至少四种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物。实施方案91.根据实施方案85的试剂盒，其还包括多种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物，并且其中多种类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。实施方案92.根据实施方案85的试剂盒，其还包括多种类型的所述核苷酸-聚合物偶联物，并且其中所述多种类型中的每一种包括具有不同核碱基的核苷酸部分。实施方案93.根据实施方案85的试剂盒，其还包括多种类型的核苷酸-聚合物偶联物，并且其中所述多种类型中的每一种包括偶联至聚合物核的不同的可检测标记。实施方案94.根据实施方案93的试剂盒，其中所述可检测标记包括荧光标记。实施方案95.根据实施方案85的试剂盒，其还包括一个或多个未标记的核苷酸，一个或多个未标记的核苷酸包括在一个或多个未标记的核苷酸的糖的3'位的阻断基团。

实施方案96.根据实施方案85的试剂盒，其中所述说明书包括通过以下鉴定来源于患有或疑似患有由SARS-CoV-2病毒或其变体引起的疾病或病症的对象的样品的引发的核酸序列的核苷酸描述，(i)在足以在聚合物-核苷酸组合物的一个或多个核苷酸部分与引发的核酸序列的核苷酸之间形成结合复合物而不将一个或多个核苷酸部分掺入所述引发的核酸序列的条件下，使引发的核酸序列与聚合物-核苷酸组合物接触；以及(ii)检测所述结合复合物以鉴定所述引发的核酸序列中的所述核苷酸。实施方案97.根据实施方案96的试剂盒，其中所述说明书还包括重复(i)和(ii)以鉴定所述引发的核酸序列中的连续核苷酸的描述。实施方案98.根据实施方案96至97中任一项的试剂盒，其中所述说明书还包括用于扩增来源于样品的核酸序列并使核酸序列和与核酸序列的至少一部分互补的引物序列在足以产生所述引发的核酸序列的条件下接触的描述。

V.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”，除非另有说明。

如本文所用，术语“约”数字是指数字加上或减去数字的10％。当在范围的上下文中使用时，术语“约”是指范围减去其最低值的10％并加上其最大值的10％。

如本文所用，在系列的上下文中短语“中的至少一个”包括单独或在一些情况下与未列出的组分组合的列表，该列表包括系列的单个成员、系列的两个成员，直至并包括系列的所有成员。

如本文所用，“核酸”(也称为“多核苷酸”、“寡核苷酸”、核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))是通过共价核苷间键连接的两个或更多个核苷酸的线性聚合物，或其变体或功能片段。在核酸的天然存在的实例中，核苷间键是磷酸二酯键。然而，其他实例任选地包括其他核苷间键，如硫代磷酸酯键，并且可包括或不包括磷酸酯基团。核酸包括双链和单链DNA、以及双链和单链RNA、DNA/RNA杂合体、肽-核酸(PNA)、PNA与DNA或RNA之间的杂合体，并且还可包括其他类型的核酸修饰。

核酸可以任选地附接至一个或多个非核苷酸部分，如标记物和其他小分子、大分子(如蛋白质、脂质、糖等)、以及固相或半固相支持体，例如通过与核酸的5’或3'端的共价或非共价键联。标记包括可使用多种检测方法中的任一种检测的任何部分，并因此使得附着的寡核苷酸或核酸可类似地检测。一些标记发射可光学检测或可见的电磁辐射。可替代地或组合地，一些标记包括使标记的寡核苷酸或核酸在质谱数据中可见的质量标签，或使标记的寡核苷酸或核酸可通过电流测定法或伏安法检测的氧化还原标签。一些标记包括磁性标签，其促进标记的寡核苷酸或核酸的分离或纯化。核苷酸或多核苷酸通常不附着于标记，并且寡核苷酸或核酸的存在被直接检测。

如本文所用，“核苷酸”是指核苷酸、核苷或其类似物。核苷酸是指天然存在的和化学修饰的核苷酸，并且可包括但不限于核苷、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、蛋白质-核酸残基或衍生物。核苷酸的实例包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或其残基；脱氧腺嘌呤、脱氧胸腺嘧啶、脱氧尿嘧啶、脱氧胞嘧啶、脱氧鸟嘌呤或其残基；腺嘌呤PNA、胸腺嘧啶PNA、尿嘧啶PNA、胞嘧啶PNA、鸟嘌呤PNA或其残基或等同物、嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷(例如，含有2-脱氧-D-核糖的脱氧核糖核苷或含有D-核糖的核糖核苷)。在一些情况下，核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷(例如，含有2-脱氧-D-核糖的脱氧核糖核苷或含有D-核糖的核糖核苷)。其他核苷酸类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸等。

如本文所用，“互补”是指配体分子与其受体的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，受体及其配体可描述为互补的，此外，接触表面特征彼此互补。

如本文所用，“支链聚合物”是指具有有助于偶联生物活性分子(诸如核苷酸)的多个官能团的聚合物，并且官能团可在聚合物的侧链上或直接附接到聚合物的中心核或中心主链。支化聚合物可具有线性主链，其中一个或多个官能团离开主链用于偶联。支化聚合物也可以是具有一个或多个侧链的聚合物，其中侧链具有适于偶联的位点。官能团的实例包括但不限于羟基、酯、胺、碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰肼、硫醇、链烷酸、酰基卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸酯和三氟乙基磺酸酯(tresylate)。

如本文所用，“聚合酶”是指含有核苷酸结合部分并有助于在靶核酸和互补核苷酸之间形成结合复合物的酶。聚合酶可具有一种或多种活性，包括但不限于碱基类似物检测活性、DNA聚合活性、逆转录酶活性、DNA结合或掺入、链置换活性和核苷酸结合或掺入和识别。聚合酶可包括无催化活性的聚合酶、催化活性的聚合酶、逆转录酶和其他含有核苷酸结合或掺入部分的酶。

如本文所用，“持续时间”是指在靶核酸，聚合酶，偶联的或非偶联的核苷酸之间形成的结合复合物保持稳定而没有任何结合组分从结合复合物解离的时间长度。持续时间表示结合复合物的稳定性和结合相互作用的强度。可以通过观察结合复合物的开始或持续时间，例如通过观察来源于结合复合物的标记组分的信号来测量余辉时间。例如，标记的核苷酸或包括一个或多个核苷酸的标记的试剂可以存在于结合复合物中，从而允许在结合复合物的存留期间检测来源于标记的信号。标记的一个非限制性实例是荧光标记。

如本文所用，术语“同源的”、“同源性”或“百分比同源性”当在本文中用于描述氨基酸序列或核酸序列时，相对于参考序列，可以使用由Karlin和Altschul(《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-2268，1990描述的，在《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:5873-5877，1993)中修改的公式确定。这种公式被结合到Altschul等人(《分子生物学杂志》(J Mol Biol.)1990年10月5日；215(3):403-10；《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)1997年9月1日；25(17):3389-402)的局部序列排比搜索基本工具(BLAST)程序中。在本申请的申请日之前，可以使用最近版本的BLAST确定序列的同源性百分比。在本申请的申请日之前，可以使用最近版本的BLAST确定序列的同一性百分比。

实施例

提供这些实施例仅用于说明目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1

在毛细管内建立核酸簇并进行荧光成像。具有毛细管的流动装置用于测试。所得到的簇图像在图8中示出。该图示出了如本文所公开的毛细管系统的内腔内的簇可以被可靠地放大和可视化。

实施例2

使用如图9所示的操作之一，流动池装置可以由一层、两层或三层玻璃构成。在图9中，流动池装置可以由一层、两层或三层玻璃制成。玻璃可以是石英或硼硅酸盐玻璃。图9A-9C示出了利用诸如聚焦飞秒激光辐射(1片)或激光玻璃键合(2片或3片构造)的技术在晶圆级制造这种装置的方法。

在图9A中，用激光(例如，飞秒激光辐射)处理晶圆的第一层以烧蚀晶圆材料并提供图案化表面。图案化表面可以是表面上的多个通道，例如每个晶圆12个通道。晶圆的直径为210mm。然后可将处理过的晶圆放置在支持体板上以形成可用于引导流体流过特定方向的通道。

在图9B中，具有图案化表面的第一层晶圆可被放置成与第二层晶圆接触并键合到第二层晶圆。可以使用激光玻璃键合技术进行键合。第二层可覆盖或密封具有图案化表面的晶圆上的凹槽、凹痕或孔口，以在这些组件的接口处形成装置的通道或腔室(例如，内部部分)。然后可以将具有两层晶圆的键合结构放置在支持体板上。图案化表面可以是表面上的多个通道，例如每个晶圆12个通道。晶圆可以具有210mm的直径。

在图9C中，可以将具有图案化表面的第一层晶圆放置成与一侧上的第二层晶圆接触并键合到其上，并且可以将第三层晶圆键合到另一侧上的第一晶圆层上，使得第一晶圆层位于第二和第三层晶圆之间。可以使用激光玻璃键合技术进行键合。晶圆的第二层和第三层可以覆盖或密封具有图案化表面的晶圆上的凹槽、凹痕或孔口，以形成装置的通道或腔室(例如，内部部分)。然后可以将具有三层晶圆的键合结构放置在支持体板上。图案化表面可以是表面上的多个通道，例如每个晶圆12个通道。晶圆可以具有210mm的直径。

实施例3

图10A示出了一片式玻璃流动池设计。在这种设计中，可以使用聚焦飞秒激光辐射方法制造流动通道和入口出口孔。在流动池上有两个通道/泳道，每个通道有2行，每行26帧。通道可具有约100μm的深度。通道1具有入口孔A1和出口孔A2，通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池还可以具有1D线性和人类可读代码，并且任选地具有2D矩阵代码。

图10B示出了两片式玻璃流动池。在这种设计中，可以使用聚焦飞秒激光辐射或化学蚀刻技术制造流动通道以及入口和出口孔。这两片可以用激光玻璃键合技术键合在一起。入口孔和出口孔可定位在结构的顶层上，并以这样的方式定向，使得它们与形成在装置的内部部分中的至少一个通道或腔室连通。池上有两个通道，每个通道有2行，每行有26帧。通道可具有约100μm的深度。通道1具有入口孔A1和出口孔A2，通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池还可以具有1D线性和人类可读代码，并且任选地具有2D矩阵代码。

图10C示出了三片式玻璃流动池。在这种设计中，可以使用聚焦飞秒激光辐射或化学蚀刻技术制造流动通道以及入口和出口孔。这三片可以用激光玻璃键合技术键合在一起。第一层晶圆可以任选地具有图案化的表面，并且可以在一侧键合到第二层晶圆，并且第三层晶圆可以在另一侧键合到第一晶圆层，使得第一晶圆层位于第二和第三层晶圆之间。入口孔和出口孔可定位在结构的顶层上，并以这样的方式定向，使得它们与形成在装置的内部部分中的至少一个通道或腔室连通。池上有两个通道，每个通道有2行，每行有26帧。通道可具有约100μm的深度。通道1具有入口孔A1和出口孔A2，通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池还可以具有1D线性和人类可读代码，并且任选地具有2D矩阵代码。

实施例4

通过用KOH洗涤所制备的玻璃通道，随后用乙醇清洗并在65℃下硅烷化30分钟来涂覆流动池。用EDC-NHS活化通道表面30分钟。然后通过与5μm引物孵育20分钟接枝引物，然后用30μm PEG-NH2钝化。

按照实施例4的方法制备多层表面，其中在PEG钝化后，在加入PEG-NH2后，使多臂PEG-NHS流过通道，任选地接着用PEG-NHS进行另一次孵育，和任选地用多臂PEG-NH2进行另一次孵育。对于这些表面，可以在任何操作中接枝引物，特别是在加入多臂PEG-NH2之后。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。可以理解，在实施本发明时，可以以任何组合方式采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同项。

实施例5

制备核酸测序文库以测序SARS CoV-2。通过使用市售试剂盒从人细胞系分离和纯化核糖核酸来制备核酸测序文库。将合成的SARS CoV-2基因组RNA以与临床样品中预期的水平相当的水平加入到特定样品中。将PhiX174基因组DNA加入到最终样品中作为对照。

实施例6

对SARS CoV-2核酸文库进行测序。如图13A和B所示，通过各种方法对添加或不添加SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝制备的核酸文库进行测序。每个文库包括作为对照的phiX174基因组DNA。如图13A所示，添加1000万(估计)SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝在2.29％的读段中产生了可鉴定的SARS CoV-2序列(运行P1-SI284，条纹条)。添加100万(估计)SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝，在0.97％的读段中产生可鉴定的SARS CoV-2序列(运行P1-SI294，条纹条)。在两种情况下，SARS CoV-2序列数据的回收与添加到样品中的SARS CoV-2基因组的合成DNA拷贝的量的预期值相当。如图13B所示获得了SARS CoV-2基因组的完全覆盖，其显示在SARS CoV-2基因组的每个位置(X轴)鉴定了大量的读段(Y轴)。

实施例7

进行了SARS CoV-2的靶向富集。使用如图14A所示的常规工作流程，使用实施例6所描述的已知的SARS CoV-2变体(如图14B所示)的合成DNA拷贝的内参制备用于测序的样品。图14A显示了制备用于测序的病毒RNA的常规市售工作流程。图14B显示了市售可获得的SARS CoV-2基因组已知变体的合成DNA拷贝的突变(顶部)和近似片段边界(底部)的位置。根据实施例6，将SARS CoV-2基因组的已知变体的合成DNA拷贝掺入测序反应中，产生其中检测到来源于循环SARS CoV-2株的所有临床显著突变的序列。图14C示出了使用当前描述的系统和方法的测序数据。顶部，“对照2参考：”原始SARS CoV-2参考株。中间，“对照14参考：”B.1.1.7株。底部：已知突变在B.1.1.7株基因组中的位置。