甘松新酮作为铁死亡诱导剂的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种铁死亡诱导剂，尤其是一种基于中药活性成分的铁死亡诱导剂。

背景技术

中药是通过我国几千年来临床实践积累的宝贵财富，由于其天然的来源和潜在的有益功效，中药及其有效成分被广泛应用于解决人类健康问题。随着现代研究的深入，中药活性成分引起了广泛关注。

铁死亡是2012年定义的一种非凋亡性受调节细胞死亡过程，包括由铁离子或含铁酶催化的细胞脂质过氧化物的累积。在此过程中，多种诱导剂破坏细胞氧化还原平衡，产生大量脂质过氧化产物，最终引发细胞死亡。在形态学、生物化学和遗传学方面，铁死亡与细胞凋亡、坏死、自噬依赖性细胞死亡等受调节细胞死亡过程有很大不同。越来越多的研究表明，铁死亡诱导剂可以作为新型的传染病治疗药物和肝病治疗药物。

目前，临床上尚无特异有效的抗纤维化治疗方法，主要通过治疗引起肝损伤的基础疾病来缓解肝损伤和炎症，并对肝纤维化进行防治。近期的研究表明，通过激活铁死亡清除肝星形细胞，具有作为新型肝纤维化治疗策略的潜力，越来越多的体内和体外证据表明，铁死亡诱导剂可以有效抑制肝纤维化的发展；另外，抗生素的滥用是全球面临的共同问题，抗生素类药物的滥用促进各类耐药问题的产生，使得部分传染类疾病变得更加难以治疗。目前有研究表明，铁死亡诱导剂可以诱导胞内细菌发生铁死亡，协助巨噬细胞抑制细胞内细菌生长繁殖。

发现和证明中药活性成分诱导铁死亡的活性，可以为中药成分更广泛的应用提供新的作用模式和理论支持，为临床用药和辅助用药提供新的方案。越来越多的研究开始关注到将安全高效的中药活性成分和其作用机制联系起来，用以开发安全高效的药物，为中药及中药活性成分的应用提供可行的方案。

发明内容

基于以上，本发明提供了一种中药成分作为铁死亡诱导剂的应用。

本发明第一方面的技术目的是提供甘松新酮作为铁死亡诱导剂的应用。

在以上应用中，甘松新酮作为铁死亡诱导剂的唯一活性成分。

本发明第二方面的技术目的是提供甘松新酮在制备铁死亡诱导剂药物上的应用。

在以上应用中，甘松新酮作为铁死亡诱导剂药物的唯一活性成分。

进一步的，所述药物还包括药用辅料。所述药物为口服给药制剂、注射给药制剂、粘膜给药制剂或经皮给药制剂。所述药物为片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、胶囊剂、混悬剂、口服液、贴剂、凝胶剂等。

本发明第三方面的技术目的是提供一种铁死亡诱导剂，其组分包括甘松新酮，且以甘松新酮作为唯一活性成分。

本发明第四方面的技术目的是提供甘松新酮在制备抗纤维化药物中的应用。

在以上应用中，所述抗纤维化包括抗肝脏纤维化。

实施本发明实施例，将具有如下有益效果：

本发明提供了中药成分甘松新酮作为铁死亡诱导剂的应用，证明甘松新酮作为唯一活性成分具有诱导细胞铁死亡的活性，为甘松新酮更广泛的应用提供理论支持，为甘松新酮的临床用药和辅助用药提供新的思路，为各种与铁死亡相关的疾病开发更安全有效的药物奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

其中：

图1为不同浓度的甘松新酮作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活率曲线图；

图2为甘松新酮与空白对照组分别作用于人纤维肉瘤HT-1080细胞系在不同时间下的光学显微镜照片；

图3为空白对照组、甘松新酮组、甘松新酮和铁死亡抑制剂Lip-1组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活比率图；

图4为空白对照组、甘松新酮组、甘松新酮和铁螯合剂DFO组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活比率图；

图5为空白对照组、甘松新酮组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞内铁浓度示意图；

图6为甘松新酮及各对照组作用于人纤维肉瘤细胞系2小时后的细胞内脂质过氧化物流式细胞术检测图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是：人纤维肉瘤细胞系HT-1080，是一种研究铁死亡表型和机制的重要细胞模型，是定义和研究铁死亡机制的最初也是最常用的细胞模型，因此在本案的实施例中，使用此细胞模型对甘松新酮引起细胞铁死亡的机理进行了验证。

以下实施例中使用的细胞系：HT-1080细胞，培养基体系用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，于37℃，5％CO

以下实施例中使用的药物，甘松新酮，由成都普思生物有限公司提供，产品批号：PS010660。准确称量甘松新酮，以二甲亚砜溶解，配成甘松新酮浓度为100mM的储备液，在-80℃下保存，使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度。

实施例1

甘松新酮对人纤维肉瘤细胞的作用测试

(1)MTS实验

本实施例采用MTS法，评价了甘松新酮对HT-1080细胞增殖的抑制作用。MTS方法是一种利用四唑盐化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2氢-四唑，内盐；MTS)被活细胞还原生成甲臜，甲臜的吸光值大小与活细胞数量、代谢活性呈正相关，以MTS为底物生成的甲臜最大吸光值位于490nm，颜色较深，灵敏度高，便于检测。

实验过程如下：取对数生长期的HT-1080细胞，贴壁生长细胞用胰酶0.05％(购自gibco公司)，消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，用完全细胞培养基重悬细胞，按8000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃，5％CO

结果：图1为不同浓度的甘松新酮作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活率曲线图。MTS实验检测存活细胞比率，由图1可知，在大于100μM浓度下，甘松新酮组存活的细胞比率显著少于空白对照组，存活细胞比率随甘松新酮浓度增加而减少，说明甘松新酮具有抑制HT-1080细胞增殖的活性。

(2)细胞形态观察

甘松新酮处理细胞步骤与上述MTS实验相同，每孔加入含有0.7mM甘松新酮的培养基，以加入不含甘松新酮的培养基100μL作为空白对照，于37℃，5％CO

结果：图2为甘松新酮与空白对照组作用于人纤维肉瘤HT-1080细胞系在不同时间下的光学显微镜照片。由图2可知，空白对照组细胞健康，甘松新酮组随着给药时间的增加，死亡细胞增多，2小时后细胞略有死亡，4小时后细胞半数死亡，8小时后细胞多数死亡。说明采用甘松新酮给药处理，能迅速诱导HT-1080细胞死亡。

实施例2

甘松新酮诱导人纤维肉瘤细胞发生铁死亡的测试

(1)铁死亡抑制剂Lip-1阻断甘松新酮引起的人纤维肉瘤细胞死亡

细胞死亡有多种类型，例如：凋亡、坏死、铁死亡等等。Lip-1(Liproxstatin-1)是一种特异性的铁死亡抑制剂，通过捕获自由基，阻断脂质过氧化，特异性抑制由脂质过氧化引发的细胞死亡，即铁死亡。实施例1表明甘松新酮引起人纤维肉瘤细胞HT-1080细胞死亡，在使用甘松新酮处理细胞时，同时加入铁死亡抑制剂Lip-1，如果能阻止或减少细胞死亡，则说明甘松新酮引起肿瘤细胞死亡的类型是铁死亡。

实验过程如下：取对数生长期的HT-1080细胞，贴壁生长细胞用胰酶0.05％(购自gibco公司)，消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，用完全细胞培养基重悬细胞，按8000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃，5％CO

结果：图3为空白对照组、甘松新酮组、甘松新酮和铁死亡抑制剂Lip-1组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活比率图。MTS实验检测存活细胞比率，由图3可知，甘松新酮组存活的细胞比率显著少于空白对照组，而甘松新酮和铁死亡抑制剂Lip-1组细胞的存活率显著高于甘松新酮组。此结果表明铁死亡抑制剂Lip-1能阻止甘松新酮引起的细胞死亡，说明甘松新酮引起的肿瘤细胞死亡类型是铁死亡。

(2)铁螯合剂减少甘松新酮引起的人纤维肉瘤细胞死亡

铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡方式，具有特异性的生物化学特征，包括但不限于细胞内的铁水平升高、脂质过氧化物累积。甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate，DFO)是一种铁螯合剂，可以通过与铁离子生成铁胺复合物，阻止铁离子参与多种代谢过程，降低细胞内的游离铁水平，阻止或减少铁死亡的发生。在使用甘松新酮处理细胞时，同时加入铁螯合剂DFO，如果能阻止或减少甘松新酮引发的细胞死亡，则说明甘松新酮引起肿瘤细胞死亡的类型是铁死亡。

实验过程如下：取对数生长期的HT-1080细胞，贴壁生长细胞用胰酶0.05％(购自gibco公司)，消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，用完全细胞培养基重悬细胞，按8000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃，5％CO

结果：图4为空白对照组、甘松新酮组、甘松新酮和铁螯合剂DFO组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞存活比率图。MTS实验检测存活细胞比率，由图4可知，甘松新酮组存活的细胞比率显著少于空白对照组，而甘松新酮和铁螯合剂DFO组细胞的存活率显著高于甘松新酮组，铁螯合剂DFO几乎能完全阻止甘松新酮引起的细胞死亡。此结果显示铁螯合剂DFO能阻止甘松新酮引起的细胞死亡，说明甘松新酮引起的肿瘤细胞死亡类型是铁死亡。

(3)甘松新酮使人纤维肉瘤细胞发生铁累积

铁死亡的生物化学特征之一是细胞内的铁水平升高，细胞内的铁元素水平有多种测量方式，其中电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-massspectrometry，ICP-MS)是一种高灵敏的无机元素分析测试技术。在使用甘松新酮处理细胞时，如果细胞内的铁水平升高，则可辅助证明甘松新酮引起肿瘤细胞死亡的类型是铁死亡。

实验过程如下：取对数生长期的HT-1080细胞，贴壁生长细胞用胰酶0.05％(购自gibco公司)，消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，用完全细胞培养基重悬细胞，按每毫升80000个接种于15cm细胞培养皿，每孔20mL，于37℃，5％ CO

结果：图5为空白对照组、甘松新酮组作用于人纤维肉瘤细胞系24小时后的细胞内铁浓度示意图，ICP-MS检测样品中的铁浓度，并计算出每十万个细胞中的铁含量，由图5可知，甘松新酮组的铁浓度显著高于空白对照组。此结果显示甘松新酮能引起的细胞内铁浓度升高，说明甘松新酮引起的肿瘤细胞死亡类型是铁死亡。

(4)甘松新酮使人纤维肉瘤细胞发生脂质过氧化

581/591C11可用于检测细胞内和细胞膜中的活性氧，是一种公认的脂质过氧化物检测探针。染料的多不饱和丁间二烯基被脂质过氧化物氧化后会导致荧光发射峰从～590nm偏移至～510nm。在使用甘松新酮处理细胞时，如果细胞内的脂质过氧化物水平升高，通过流式细胞术可以观察到～510nm吸收峰向右偏移，则可以辅助证明甘松新酮引起肿瘤细胞死亡的类型是铁死亡。

实验过程如下：取对数生长期的HT-1080细胞，贴壁生长细胞用胰酶0.05％(购自gibco公司)，消化1～2分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，用完全细胞培养基重悬细胞，按每毫升80000个接种于六孔板，每孔2mL，于37℃，5％ CO

结果：图6为甘松新酮及各对照组作用于人纤维肉瘤细胞系2小时后的细胞内脂质过氧化物流式细胞术检测图，由图6可知，甘松新酮组的脂质过氧化显著高于空白对照组。此结果显示甘松新酮能引起的细胞内脂质过氧化，甘松新酮和Lip-1组、甘松新酮和DFO组相比于甘松新酮组，吸收峰明显左移，说明铁死亡抑制剂和铁螯合剂能部分阻止甘松新酮引起的脂质过氧化，此结果证明甘松新酮能诱导铁死亡。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。