用于检测大青褶伞的引物对、试剂盒及其应用

技术领域

本公开属于生物检测技术领域，具体地，本公开涉及用于检测大青褶伞的引物对、用于检测大青褶伞的试剂盒、检测大青褶伞的方法及其应用。

背景技术

大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)是一种大型真菌，又称为青褶伞、铅绿褶菇、绿褶菇等，隶属于蘑菇科(Agaricaceae)、青褶伞属(Chlorophyllum)、青褶伞组(sect.Chlorophyllum)。全世界共记载并被承认的青褶伞属的种类超过20种，是温带和亚热带地区常见的野生大型真菌类群之一。在中国，目前共报道青褶伞属有8种，其中毒蘑菇4种，均可造成胃肠炎型(gastroenteritis)中毒，分别为球盖青褶伞(C.globosum(Mossebo)Vellinga)、变红青褶伞(C.hortense(Murrill)Vellinga)、大青褶伞(C.molybdites(G.Mey.)Massee)和乳头青褶伞(C.neomastoideum(Hongo)Vellinga)；食用菌1种，为陀螺青褶伞(C.agaricoides(Czern.)Vellinga)。

大青褶伞分布广泛，亚洲、北美洲、南美洲、大洋洲、非洲和欧洲都有分布，群生或散生于阔叶树林地上、林缘草地上。该种常见于菜地里，路边草地、荒地，锯末堆上，在城市常见于公园内，小区草坪上。它是离人群最近的毒蘑菇种类。

大青褶伞可引起胃肠炎型中毒，其毒素是一种被称为molybdophyllysin(的蛋白，该蛋白经腹腔注射可在3h内引起小鼠腹腔大量出血而死亡。大青褶伞也引起人类中毒。大青褶伞是最常被人误食的毒蘑菇之一。

目前，大青褶伞的鉴别多为形态学鉴别或利用色谱法进行毒性成分检测，然而，形态学鉴别非专业人士难以掌握，色谱法较为复杂且耗时较长。

发明内容

本公开的目的在于提供一种用于检测大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)的引物对，以快速准确地检测大青褶伞。

第一方面，本公开提供了一种用于检测大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)的引物对，所述引物对包括：

SEQ ID NO:1所示的上游引物CM-F，和

SEQ ID NO:2所示的下游引物CM-R。

在一些实施方式中，所述引物对以大青褶伞的总DNA为模板，通过PCR扩增对大青褶伞进行检测。

第二方面，本公开提供了一种用于检测大青褶伞的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面提供的引物对。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针。

在一些实施方式中，所述探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一些实施方式中，所述探针具有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在一些实施方式中，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM基团、VIC基团、JOE基团和HEX基团；

所述荧光淬灭基团选自TAMAR基团、BHQ1基团、BHQ2基团和MGB基团。

在一些实施方式中，所述荧光报告基团为FAM基团，所述荧光淬灭基团为MGB基团。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

在一些实施方式中，所述阴性对照品为不含有大青褶伞的基因组DNA，阳性对照品为含有大青褶伞的基因组DNA。

第三方面，本公开提供了一种检测大青褶伞的方法，所述方法包括：

1)以待测样品的总DNA为模板，利用第一方面提供的引物对或第二方面提供的试剂盒进行PCR扩增。

在一些实施方式中，所述PCR扩增的退火温度为58～62℃。

在一些实施方式中，所述方法还包括：2)判断所述待测样品中是否含有大青褶伞。

在一些实施方式中，步骤2)为判断所述待测样品中是否含有大青褶伞阴性对照品的Ct值大于或等于第一阈值，且阳性对照品的Ct值小于或等于第二阈值，则所述检测结果有效；

如果所述待测样品的Ct值≥所述第一阈值，则所述待测样品中不含有大青褶伞；

如果所述待测样品的Ct值≤所述第二阈值，则所述待测样品中含有大青褶伞；

如果所述待测样品的Ct值大于所述第二阈值且小于所述第一阈值，则重复步骤1)和步骤2)，如果所述待测样品的Ct值＜所述第一阈值，则所述待测样品含有大青褶伞。

在一些实施方式中，所述第一阈值可以为40，所述第二阈值可以为36。

第四方面，本公开提供了第一方面提供的引物对或第二方面提供的试剂盒在检测大青褶伞中的应用。

本公开提供的用于检测大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)的引物对，能够快速准确地检测大青褶伞。

附图说明

图1是实施例一中的大青褶伞的荧光PCR扩增曲线图。

图2是实施例二中的荧光定量PCR扩增曲线图。

图3是实施例二中根据不同浓度DNA的荧光PCR结果绘制的标准曲线图。

图中，曲线7为2.5×10

图4是实施例三中的大青褶伞、球盖青褶伞、变红青褶伞、长柄大环柄菇的荧光PCR扩增曲线图。图中，1号为大青褶伞样品的荧光曲线，2号为球盖青褶伞样品的荧光曲线，3号为变红青褶伞样品的荧光曲线，4号为长柄大环柄菇样品的荧光曲线。

图5是实施例四中的荧光定量PCR扩增曲线图。图中，曲线1为大青褶伞引物检测大青褶伞样品的荧光曲线，曲线2为大青褶伞引物检测球盖青褶伞样品的荧光曲线，曲线3为大青褶伞引物检测变红青褶伞样品的荧光曲线，曲线4亚稀褶红菇引物检测大青褶伞样品的荧光曲线，曲线5为亚稀褶红菇引物检测球盖青褶伞样品的荧光曲线，曲线6为亚稀褶红菇引物检测变红青褶伞样品的荧光曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本公开，并不局限于所述最佳实施方式，不对本公开的内容和保护范围构成限制，任何人在本公开的启示下或是将本公开与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本公开相同或相近似的产品，均落在本公开的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本公开实施例中涉及的生物材料样品来源如下：

大青褶伞样品：采自浙江金华长山乡，经形态学和分子学鉴定为大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)；

球盖青褶伞样品：采自广东深圳罗湖区，经形态学和分子学鉴定为球盖青褶伞(Chlorophyllum globosum)；

变红青褶伞样品：采自贵州仁怀市，经形态学和分子学鉴定为变红青褶伞(Chlorophyllum hortense)；

长柄大环柄菇样品：采自云南保山昌宁县，经形态学和分子学鉴定为长柄大环柄菇(Macrolepiota dolichaula)。

实施例

实施例一.检测方法及检测结果判定

1、引物、探针合成

利用GenBank数据库(https.//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找大青褶伞(Chlorophyllum molybdites(G.Mey.)Massee)的特异序列，确定使用ITS1基因，其GenBankAccession登录号为MT357082.1，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。

实时荧光PCR检测大青褶伞成分的引物序列为：

上游引物CM-F：5'-CCTGTGCACCACTTGTAGTCTTTG-3(SEQ ID NO:1)；

下游引物CM-R：5'-TCCTCACATCCGGGAGAATTC-3(SEQ ID NO:2)。

实时荧光PCR检测大青褶伞成分的荧光探针序列为：5'-TCTGAGAGAGTGGCTG-3'(SEQ ID NO:3)。该荧光探针的5'端为FAM标记，3'端为MGB标记。

2、样品DNA的提取与纯化

(1)取0.5g大青褶伞样品，粉碎后放入50ml离心管中；

(2)加入10mL预热的CTAB抽提裂解缓冲液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μLRNaseA、200μLβ-巯基乙醇)，振荡悬浮后于65℃温浴1h，期间不断晃动，冷却至室温后，5000g离心10min；

(3)取上清950μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(体积比24：1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；

(4)取上清750μL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(体积比24：1)轻柔混匀静置5min，12000rpm离心15min；

(5)取上清500μL加入1.5mL离心管中，加入300μL异丙醇，50μL乙酸钾溶液，轻轻颠倒混匀，室温静置，12000rpm离心，弃上清；

(6)加入1.0mL 70％乙醇溶液，将沉淀悬浮浸泡，并将离心管倾斜，轻轻转动数圈后室温静置2min，12000rpm离心10min，弃上清，如沉淀多重复此步骤一次；

(7)小心弃去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100μL ddH20，65℃溶解DNA，得样品DNA。

3、构建检测体系

(1)样品测定

将上游引物、下游引物和探针分别稀释至10μmol/L，按照如下操作配制反应体系：

在实时荧光PCR反应管中加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5-10s，然后将加好样的反应管放入实时荧光检测系统内，选择FAM作为报告基团，反应程序如下：

a：95℃10min；

b：95℃15s；

c：60℃20s，采集荧光信号；其中，a循环1个反应，b-c循环40个反应。检测所得大青褶伞样品的特异性荧光曲线如图1所示。

(2)空白对照：以ddH2O为模板，重复操作(1)，进行实时荧光PCR反应。

(3)阴性对照：以双蒸水为模板，重复操作(1)，进行实时荧光PCR反应。

(4)阳性对照：以含大青褶伞成分的基因组DNA为模板，重复操作(1)，进行实时荧光反应。

4、结果判定

若空白对照品荧光通道检测Ct值大于或等于40，阴性对照荧光通道检测Ct值大于或等于40，阳性对照荧光通道检测Ct值小于或等于36，则判定空白对照品、阴性对照品和阳性对照品的检测结果成立，则所述样品DNA的检测结果有效；

若样品DNA的荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且Ct值≥40，则判定样品中未检出大青褶伞成分；

若样品DNA的荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且Ct值≤36，则判定样品中检出大青褶伞成分；

若样品DNA的荧光通道检测到的扩增曲线呈S型，且36＜Ct值＜40，则重新提取样品DNA并复检，若复检得到的扩增曲线呈S型，且Ct值＜40，则判定样品中检出大青褶伞成分，否则判定样品中未检出大青褶伞成分。

实施例二.最低检出限验证

评估用检测样本：利用实施例1操作2中制备的样品DNA，配制浓度为2.5×10

按照实施例1的检测方法分别对各浓度的评估用模板进行检测，每个浓度梯度重复检测5次，取均值作为最后的检测结果，如表1和图2所示，绘制标准曲线如图3所示。

表1最低检出限验证实验结果

注：“+”代表阳性，n/5代表检出率为5次重复n次检出

由表1和图2可以看出，本公开的引物对，在大青褶伞靶基因的浓度为2.5×10

实施例三.引物对的特异性验证

选择球盖青褶伞、变红青褶伞、长柄大环柄菇等，易与大青褶伞混淆的蘑菇样品作为特异性评估样品。应用本公开提供的引物对，按照实施例1的检测方法检测上述特异性评估样品，检测结果如图4所示。

由图4可以看出，在空白对照、阴性对照和阳性对照均成立的条件下，特异性评估样品的检测结果中均未出现非特异性的荧光信号，表明本公开的引物对能准确地区分大青褶伞与其他蘑菇，具有较好的特异性。

实施例四.平行引物验证

实时荧光PCR检测大青褶伞成分的引物序列为：

上游引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

下游引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实时荧光PCR检测大青褶伞成分的荧光探针序列如SEQ ID NO:3所示。该荧光探针的5'端为FAM标记，3'端为MGB标记。

亚稀褶红菇(Russula subnigricans)的序列(GenBank登录号：EF534351)的引物作为对照引物。

实时荧光PCR检测亚稀褶红菇成分的引物序列为：

上游引物：5'-GATGAAGAACGCAGCGAAAT-3'(SEQ ID NO:4)

下游引物：5'-TTCACGACACTCAAACGGG-3'(SEQ ID NO:5)

实时荧光PCR检测亚稀褶红菇成分的荧光探针序列为5'-CAATTCACATTACGTATCG-3'(SEQ ID NO:6)。该荧光探针的5'端为FAM标记，3'端为MGB标记。

选择上述大青褶伞的引物和探针，以及亚稀褶红菇的引物和探针对球盖青褶伞、变红青褶伞和大青褶伞进行检测。按照实施例1的检测方法检测上述特异性评估样品，检测结果如图5所示。

由图5可以看出，特异性评估样品的检测结果中均未出现非特异性的荧光信号，表明本公开的引物对能有效区分非检测目标植物，具有较好的特异性。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。