一种高通量筛选聚酯降解酶的方法及其使用的化合物

技术领域

本发明属于生物与化学合成技术领域，具体涉及一种高通量筛选聚酯降解酶的方法及其使用的化合物。

背景技术

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等聚酯是目前应用最为广泛的大分子聚合物之一，常用于包装、纺织、建筑、电器等各个行业，如饮料瓶、薄膜和工程塑料等。然而，PET具有自然降解抵抗性，传统的处理方法具有二次污染、环境严苛等弊端，因此，PET在自然界中大量积累，是白色污染的重要来源。

近年来，以微生物和酶为基础的生物降解法具有环境友好性，引起了研究者的广泛关注。目前已研究发现多种聚酯降解酶，如角质酶(Cutinase)、酯酶(Esterase)、脂肪酶(Lipase)等，它们可在一定条件下将聚酯PET降解为PET的低聚物或单体；例如，Yoshida等发现了能“吃”PET的超级细菌Ideonella sakaiensis，并分离鉴定了一种新型聚酯降解酶——PETase；该酶能在30℃条件下将PET特异性的降解为MHET以及单体TPA和EG，具有很大的应用前景。已有多个实验室解析了PETase的晶体结构，并基于理性设计的方法对PETase活性口袋处设计并进行改造，获得了大量性能改善(即酶催化活性和热稳定性提高)的突变体。然而，对于PETase非表面区域或远离活性位点的区域的充分进化目前尚未见报道，原因可能是缺乏高效的筛选方法。

对硝基苯基乙酸酯(4-pNPA)可被酯酶水解为对硝基苯酚和乙酸，其中对硝基苯酚在405nm处有特征的吸收值。据此采用酯酶的模式底物—4-pNPA对PETase进行筛选。但是，由于4-pNPA与PETase分子结构相差较大，影响筛选效率和筛选准确性。目前，缺乏新型高效的聚酯(如PET)降解酶的筛选方法，阻碍了聚酯(如PET)降解酶的开发。

发明内容

本发明的目的为提供一种高通量筛选聚酯降解酶新方法，该方法适用于如脂肪酶、角质酶或PET水解酶及其突变体等聚酯降解酶的筛选。

本发明首先提供了一种可用于高通量筛选聚酯降解酶的化合物——3-羟基-4-((2-羟基乙氧基)羰基)苯甲酸，即MHET-OH，其结构式如式(I)所示：

本发明还保护MHET-OH的制备方法，可包括如下步骤：

(1)将2-羟基对苯二甲酸、浓硫酸和乙二醇，混匀；之后150℃以上(如150℃、200℃)回流8h以上(如8h、48h)；

(2)完成步骤(1)后，去除乙二醇，得到混合物；

(3)完成步骤(2)后，将所述混合物进行柱层析分离，得到MHET-OH。

上述方法中，所述去除乙二醇可通过减压蒸馏实现。

MHET-OH在筛选聚酯降解酶中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述聚酯降解酶比PETase野生型酶的酶催化活性提高和/或热稳定性提高。所述PETase野生型酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1所示。

本发明还保护一种筛选聚酯降解酶的方法，可包括如下步骤：

(a1)将聚酯降解酶、缓冲液和MHET-OH混合，得到混合液1；之后检测混合液1的荧光值的增加速率，即为A

(a2)制备待筛选聚酯降解酶；然后将待筛选聚酯降解酶、缓冲液和MHET-OH混合反应，得到混合液2；之后检测混合液2的荧光值的增加速率，即为A

(a3)比较A

上述方法中，所述聚酯降解酶可为脂肪酶、角质酶或PET水解酶。

上述方法中，所述检测混合液1的荧光值的增加速率的激发波长可为310-340nm(如310-320nm、320-340nm、310nm、320nm或340nm)、发射波长可为370-445nm(如370-400nm、400-445nm、370nm、400nm或445nm)。所述检测混合液2的荧光值的条件可与检测混合液1的荧光值的条件相同。

本发明还保护一种筛选热稳定性提高的聚酯降解酶的方法，可包括如下步骤：

(b1)制备得到聚酯降解酶，取部分聚酯降解酶加热；之后分别将等量的加热与不加热的聚酯降解酶加入MHET-OH溶液，依次得到混合液3和4；之后分别检测混合液3和4的产物量并计算酶活，分别记为A

(b2)制备得到待筛选聚酯降解酶，取部分待筛选聚酯降解酶加热，加热条件和时间与步骤(b1)中的加热条件和时间完全相同；分别将等量的加热与不加热的待筛选聚酯降解酶加入MHET-OH溶液，依次得到混合液5和6；之后分别检测混合液5和6的产物量并计算酶活，分别记为B

(b3)比较B

上述方法中，所述检测混合液3和4的产物量的激发波长可为310-340nm(如310-320nm、320-340nm、310nm、320nm或340nm)、发射波长为370-445nm(如370-400nm、400-445nm、370nm、400nm或445nm)。所述检测混合液5和6的产物量的条件可与检测混合液3和4的产物量的条件相同。

上述方法中，所述加热条件和时间可为50℃-55℃(如50℃-52℃、52℃-55℃、50℃、52℃或55℃)5min以上(如5min或10min)。

上述任一所述的方法中，所述聚酯降解酶可为PETase(即PETase野生型酶)。所述待筛选聚酯降解酶可为PETase突变体。

上述任一所述PETase野生型酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1所示。

本发明还保护一种MHET-OH衍生物，所述MHET-OH衍生物可以通过所述MHET-OH经过一步或多步酯化反应获得。

实验证明，采用本发明提供的MHET-OH高通量筛选聚酯降解酶突变体，获得的聚酯降解酶突变体V5纯酶的活性和热稳定性均明显提高。由此可见，利用MHET-OH高通量筛选聚酯降解酶具有准确度高、可靠性强的特点。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中步骤一合成的MHET-OH的

图2为实施例2中激发波长的扫描结果。

图3为实施例2中发射波长的扫描结果。

图4为实施例2中绘制的标准曲线。

图5为实施例3中聚酯降解酶PETase-WT的水解测试结果。

图6为实施例3中聚酯降解酶角质酶水解测试结果。

图7为实施例3中脂肪酶水解测试结果。

图8为实施例4中聚酯降解酶突变体V5降解PET粉末的产物检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、3-羟基-4-((2-羟基乙氧基)羰基)苯甲酸—MHET-OH的合成和鉴定

1、向圆底烧瓶中加入1.82g 2-羟基对苯二甲酸、0.5ml浓硫酸和50ml乙二醇，混匀；之后磁力搅拌下200℃回流48h。

2、完成步骤1后，减压蒸馏(目的为去除乙二醇)，得到混合物。

3、完成步骤2后，将所述混合物进行柱层析分离，得到3-羟基-4-((2-羟基乙氧基)羰基)苯甲酸，即MHET-OH。

4、利用400MHz核磁共振仪采集一维核磁谱，对MHET-OH进行鉴定。。

MHET-OH的

最终确定MHET-OH的结构式如式(I)所示：

实施例2、激发波长和发射波长的确定以及标准曲线的绘制

1、MHET-OH与水解产物2-羟基对苯二甲酸的配制

(1)将0.0182g 2-羟基对苯二甲酸(TPA-OH)溶解于10mL pH8.0、100mM PB缓冲液，充分溶解，得到浓度为10mM的TPA-OH溶液。

(2)将0.0229g MHET-OH溶解于10ml pH8.0、100mM PB缓冲液，充分溶解，得到浓度为10mM的MHET-OH溶液。

2、波长的确定

将50μL待测溶液(TPA-OH溶液或MHET-OH溶液)、100μL pH8.0、200mMPB缓冲液和50μL蒸馏水混合，之后进行全波长扫描，以确定激发波长与发射波长。

激发波长扫描结果见图2。

发射波长扫描结果见图3。

结果表明，当激发波长为320nm时，检测到TPA-OH和MHET-OH的荧光信号最强；当发射波长为370-450nm时，检测到的TPA-OH的荧光信号高于MHET-OH。其中，当激发波长为320nm、发射波长为400nm时，TPA-OH的荧光值是MHET-OH的3.3倍。

3、标准曲线的绘制

(1)将MHET-OH和TPA-OH分别按照5：0、4：1、3：2、2：3和1：4的比例混合，得到混合液。混合液中，TPA-OH终浓度分别为0mM、0.5mM、1mM、1.5mM和2mM，与其相对应的MHET-OH终浓度分别为2.5mM、2mM、1.5mM、1mM、0.5mM；MHET-OH和TPA-OH的总浓度为2.5mM。

(2)检测步骤(1)得到的混合液在激发波长为320nm、发射波长为400nm条件下的荧光信号值。

以TPA-OH的终浓度为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线见图4。结果表明，随着TPA-OH浓度的增加，荧光值也随之增加，且增加的趋势呈线性，说明该检测条件(Ex＝320nm，Em＝400nm)适用于检测TPA-OH。

实施例3、聚酯降解酶的活性检测

1、聚酯降解酶粗酶液的制备

将含有质粒的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株进行平板划线，置于37℃培养箱中过夜培养长出单克隆；将单克隆接种于3ml LB液体培养基，37℃、220rpm培养12h；然后以1％(v/v)接种量接种于15mL LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD

当质粒为质粒pET-22b(+)时，收集得到的上清液为EV上清液。

当质粒为质粒pET-22b-PETase时，收集得到的上清液为野生型PETase粗酶液，即PETase-WT粗酶液。质粒pET-22b-PETase为将质粒pET-22b(+)的限制性内切酶BstBⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为Ideonella sakaiensis来源聚酯降解酶PETase基因(参考文章Science(New York,N.Y.),2016,351(6278):1196-9.)，得到的重组质粒。质粒pET-22b-PETase表达SEQ ID NO:1所示的PETase-WT(或称为PETase野生型酶)。

当质粒为质粒pET-22b-LCC-ICCG时，收集得到的上清液为角质酶LCC-ICCG粗酶液。质粒为质粒pET-22b-LCC-ICCG为将质粒pET-22b(+)的限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为leaf-branch compost cutinase(树叶堆肥角质酶)突变体ICCG基因(参考文章Nature,2020,580(7802):216-219.)，得到的重组质粒。质粒pET-22b-LCC-ICCG表达SEQ ID NO:2所示的角质酶LCC-ICCG。

2、PETase-WT水解测试

(1)将30μL步骤1制备的PETase-WT粗酶液或EV上清液与120μL pH8.0、100mM磷酸盐缓冲液和MHET-OH混匀，得到混合液；混合液中，MHET-OH的浓度为2.5mM。

(2)检测步骤(1)得到的混合液在激发波长为320nm、发射波长为400nm条件下的荧光信号值。

部分检测结果见图5(EV为EV上清液，WT为PETase-WT粗酶液)。结果表明，酶促反应过程中，EV上清液的荧光值未增加，说明无产物生成，且背景干扰忽略不计；而PETase-WT粗酶液的荧光值呈线性增加，说明PETase-WT可降解MHET-OH，产生TPA-OH。

3、角质酶水解测试

(1)将30μL步骤1制备的角质酶LCC-ICCG粗酶液或EV上清液与120μL pH8.0、100mM磷酸盐缓冲液和MHET-OH混匀，得到混合液；混合液中，MHET-OH的浓度为2.5mM。

(2)检测步骤(1)得到的混合液在激发波长为320nm、发射波长为400nm条件下的荧光信号值。

检测结果见图6(EV为EV上清液，LCC-ICCG为角质酶LCC-ICCG粗酶液)。结果表明，在反应过程中，EV上清液无荧光值的增加，说明背景干扰可忽略不计；而角质酶LCC-ICCG粗酶液的荧光值呈线性增加，说明角质酶LCC-ICCG粗酶液对MHET-OH发生降解作用，且产物TPA-OH浓度随反应时间呈线性增加。

4、脂肪酶水解测试

实验组：

1、将10mg脂肪酶Novozym 435(诺维信，BAN118)、120μL pH8.0、100mM磷酸盐缓冲液和MHET-OH混合，得到混合体系；混合体系中，MHET-OH的浓度为2.5mM。

2、完成步骤1后，取所述混合体系，在激发波长为320nm、发射波长为400nm的条件下检测荧光信号。

对照组：

将实验组中的脂肪酶Novozym 435替换为超纯水，其它步骤均不变，作为对照组。

检测结果见图7。结果表明，对照组未发生荧光值增加现象，而实验组荧光值显著增加，说明实验组检测到产物2-羟基对苯二甲酸(TPA-OH)的生成。

由此可见，MHET-OH可被脂肪酶Novozym 435水解，并生成产物2-羟基对苯二甲酸(TPA-OH)。

实施例4、MHET-OH在高通量筛选聚酯降解酶突变体中的应用

1、聚酯降解酶突变文库的制备与培养

(1)分别根据待突变位点的碱基设计并合成引物，之后以质粒pET-22b-PETase为模板进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR程序：(1)预变性：95℃，2min；(2)变性：95℃，30s；退火：Tm-5℃，30s；延伸：72℃，6min；将该步骤循环15次；(3)终延伸：72℃，10min。

(2)完成步骤(1)后，分别将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证是否有条带；之后分别按2％的比例加入消化酶Dpn1进行消化。

(3)分别将消化后的PCR产物电转入E.coli BL21-Gold(DE3)感受态细胞中，并培养获得单克隆。用无菌牙签将单克隆挑取至含有150μL含100ng/μL氨苄青霉素的LB液体培养基的96微孔板中，置于摇床(37℃，220rpm)中培养14h后，利用复制器转接至含有200μL含100ng/μL氨苄青霉素的LB液体培养基的V底96孔板中，置于摇床(37℃，800rpm)中培养4h后，加入0.1mM IPTG并置于摇床(20℃，800rpm)中诱导表达48h；冷冻离心(4℃，4000rpm，40min)，收集粗酶液。

2、聚酯降解酶突变文库的筛选

酶催化活性通过相对酶活体现，具体检测方法为：将30μL粗酶液与120μLpH 8、100mM的PB缓冲液混合均匀后，加入50μL MHET-OH(终浓度2.5mM)，迅速置于酶标仪中(Infinite M200,TECAN,Switzerland)并在激发波长为320nm、发射波长为400nm条件下检测60min内的荧光信号(每5min读取一次荧光值)。酶活力具体计算方法为：单位时间内PETase-WT粗酶液反应体系的荧光值增加(Flu/min)记为A

热稳定性通过残余酶活体现，具体检测方法为：将上述30μL步骤1制备的粗酶液与120μL pH 8、100mM的PB缓冲液混合后，置于微孔板恒温振荡器中50℃加热一定时间后，加入50μL MHET-OH(终浓度2.5mM)混合均匀，在Ex＝320nm，Em＝400nm条件下检测产物量并计算酶活(即加热后的酶活)。PETase-WT的加热后酶活记为B

共获得8个有益突变体(酶催化活性提高和/或热稳定性提高)，即8个聚酯降解酶突变体，依次命名为V1-V8。

3、聚酯降解酶突变体摇瓶复筛鉴定

将筛选获得的8个聚酯降解酶突变体接种于3ml LB液体培养基，37℃、220rpm培养12h；然后以1％(v/v)接种量接种于15mL LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD

表1

4、聚酯降解酶突变体V5的鉴定

(1)PET粉末的制备

将PET颗粒(ALDRICH，25038-59-9)研磨粉碎，并用0.6μm的过滤筛进行过滤，收集直径小于0.6μm的PET粉末进行后续反应。

(2)聚酯降解酶突变体V5的纯化(即聚酯降解酶突变体V5纯酶的获得)

(2-1)预处理

取500mL聚酯降解酶突变体V5的粗酶液，利用浓缩泵将其浓缩至100mL；使用0.22μm的滤膜对浓缩液进行过滤，得到样品。

(2-2)柱平衡

利用Lysis buffer冲洗镍柱至基线平稳(20个柱体积)。

(2-3)上样

将步骤(2-1)得到的样品通过泵注入镍柱中，从而使样品吸附至镍柱上；随后继续用Lysis buffer平衡10个柱体积。

(2-4)洗杂

利用30mM咪唑(即12％Elution buffer)冲洗，待杂蛋白峰出现并平稳后继续用Lysis buffer平衡10个柱体积。

(2-5)洗脱目的蛋白

利用Elution buffer梯度洗脱40min，依据出峰情况收集目的蛋白，即获得聚酯降解酶突变体V5纯酶。

(2-6)验证

通过SDS-PAGE验证聚酯降解酶突变体V5纯酶的纯度。

(2-7)脱盐

利用重力柱并按照说明书指示进行脱盐并收集。

按照上述步骤，将聚酯降解酶突变体V5的粗酶液替换为PETase-WT粗酶液，其它步骤均不变，得到PETase-WT纯酶。

(3)聚酯降解酶突变体V5降解PET粉末的产物检测

(3-1)将浓度为10μg/mL的聚酯降解酶突变体V5纯酶和pH8.0、10mM PB缓冲液混合，之后以6mg PET粉末为底物并置于震荡反应器(1000rpm)中37℃或50℃反应3d，每24h取出120μL反应液。

(3-2)将步骤(3-1)得到的反应液置于100℃水浴锅加热处理10min(目的为终止反应)，0.22μm薄膜过滤(目的为除去杂质)，得到反应产物。

(3-3)采用HPLC(Ultimate 3000)在25℃、260mM条件下检测反应产物，流动相由70％buffer A(pH 7.0、20mM的磷酸缓冲液)和30％buffer B(100％乙腈)组成；流速为0.8mL/min。

按照上述步骤，将聚酯降解酶突变体V5纯酶替换为PETase-WT纯酶，其它步骤均不变。

检测结果见图8。结果表明，37℃反应时，与PETase-WT相比，聚酯降解酶突变体V5纯酶第三天的总产物释放量提高至约3.3倍；50℃反应时，与PETase-WT相比，聚酯降解酶突变体V5纯酶第三天的总产物释放量提高至约12.9倍。由此可见，聚酯降解酶突变体V5纯酶的活性和热稳定性均明显提高，这也说明利用基于MHET-OH的高通量筛选具有准确度高、可靠性强的特点。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中科院天津工业生物技术研究所

<120> 一种高通量筛选聚酯降解酶的方法及其使用的化合物

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly Gly

1 5 1015

Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr Ala

202530

Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly Pro

354045

Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly Ala

505560

Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala Ile

65707580

Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp Trp

859095

Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp Thr

100 105 110

Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met Ala

115 120 125

Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro Ile

130 135 140

Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser Met

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu Lys

165 170 175

Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser Ser

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Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile Ala

195 200 205

Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg Asn

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<211> 297

<212> PRT

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<400> 2

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1 5 1015

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180 185 190

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