用于预防或治疗肌肉疾病的包含昔康类化合物的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防、缓和或治疗肌肉疾病的组合物，包含昔康类化合物。

背景技术

肌肉在例如能量代谢和运动表现等身体功能中发挥重要作用，并且可能会由于多种因素受到损伤或减弱，例如衰老导致的少肌症、营养失衡或缺乏锻炼导致的肌肉萎缩、其它疾病(例如癌症)和衰老。

少肌症是一种损伤肌肉的主要疾病，是因衰老导致骨骼肌肌肉质量减少而引起肌肉强度下降的疾病。少肌症的最大特征是肌肉质量的减少，肌肉纤维的类型也可能变化。I型肌肉纤维和II型肌肉纤维以相似的比例随着衰老减少，但是在少肌症患者中，I型肌肉纤维的厚度减少得更为明显。据报道，这种少肌症导致老年人肌肉无力和功能受损(Roubenoff R.,Can.J.Appl.Physiol.26,78-89,2001)。

此外，肌肉萎缩是由营养缺乏或长期不使用肌肉引起的，出现于当蛋白质合成和降解的正常平衡被打破从而肌肉中的蛋白质降解时。

正在开发用于从根本上治疗这些肌肉疾病的多种治疗方法，特别是已经提出了利用通过促进从干细胞分化肌肉细胞来强化肌肉或增强肌肉再生的机制的治疗方法。由于这些方法可以从根本上治疗肌肉疾病，因此需要研究能够从根本上治疗肌肉疾病的多种治疗剂。

本发明的发明人从多种化合物对通过上述作用而具有缓和肌肉疾病作用的化合物进行了研究，从而完成了本发明。

发明内容

[技术问题]

本发明的发明人发现了昔康类化合物促进成肌细胞的分化、改善肌肉能量代谢以强化肌肉强度，特别是对于肌肉疾病(例如肌肉营养不良)具有治疗作用，从而完成了本发明。

本发明旨在提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，包含昔康类化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个目的是提供用于预防或缓和肌肉疾病的保健功能性食品组合物，包含昔康类化合物或其食品学上可接受的盐。

本发明的另一个目的是提供一种用于强化肌肉强度的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强运动表现的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于促进肌肉干细胞分化的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于肌肉再生的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于增加肌肉质量的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种饲料添加剂组合物，包含昔康类化合物。

[技术方案]

本发明的一个方面提供一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，包含昔康类化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的另一方面提供一种用于预防或缓和肌肉疾病的保健功能性食品组合物，包含昔康类化合物或其食品学上可接受的盐。

本发明的另一个方面提供一种用于强化肌肉强度的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个方面提供一种用于增强运动表现的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个方面提供一种用于促进肌肉干细胞分化的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个方面提供一种用于增加肌肉质量的组合物，包含昔康类化合物。

本发明的另一个方面提供一种饲料添加剂组合物，包含昔康类化合物。

[技术效果]

本发明是一种用于预防、缓和或治疗肌肉疾病的组合物，包含昔康类化合物。由于该组合物通过促进成肌细胞的分化和再生肌肉纤维的作用增加肌肉质量从而强化肌肉强度并且具有对多种肌肉疾病的治疗作用，因此该组合物可以用作药物组合物或保健功能性食品组合物。

附图说明

图1示出了确认昔康类化合物对成肌细胞分化的作用和比较当用每种化合物处理成肌细胞Myo和eMHC的相对表达水平的结果。

图2示出了显示根据美洛昔康施用浓度的成肌细胞(C2C12)分化程度的结果。

图3示出了确认根据美洛昔康施用浓度的成肌细胞分化标志物MHC的表达水平的结果。

图4a和图4b示出了确认根据17岁龄人肌肉干细胞中美洛昔康施用的成肌细胞分化标志物MHC的表达水平的结果；并且图5a和图5b示出了确认根据66岁龄人肌肉干细胞中美洛昔康施用的MHC的表达水平的结果。

图6a示出了确认美洛昔康施用后体重的变化的结果；并且图6b示出了确认美洛昔康施用后通过后肢肌肉(TA、EDL、SOL、GAS)重量的变化而增加肌肉质量的作用的结果。

图7a示出了确认根据美洛昔康施用的体重的变化的结果；并且图7b示出了确认除骨骼肌外其它器官重量的变化的结果。

图8a和8b示出了通过H&E染色确认当分别在向已经由CTX诱导了肌肉损伤的小鼠模型施用美洛昔康的第4、7和12天的肌肉再生和肌肉纤维尺寸的结果。

图9a示出了确认当向已经由CTX诱导了肌肉损伤的小鼠模型施用美洛昔康的肌肉纤维类型的相对表达水平的结果；图9b示出了确认肌肉纤维横截面积的尺寸的结果；并且图9c示出了确认表达类型(MHCII类型)的面积的结果。

图10示出了肌肉纤维的横截面积(图10a)和相对百分比(图10b)，当向已经由CTX诱导了肌肉损伤的小鼠模型施用美洛昔康，在该肌肉纤维中肌肉的代谢酶(糖酵解酶)GPDH被激活。

图11示出了当向已经由CTX诱导了肌肉损伤的小鼠模型施用美洛昔康，抓握强度测试和运动表现测试的结果。

图12示出了比较当向28月龄小鼠施用美洛昔康，体重和血糖(图12a)以及后肢肌肉重量(图12b)的变化的结果。

图13示出了比较当向28月龄小鼠施用美洛昔康，肌肉纤维类型的相对表达水平的结果。

图14示出了比较当向28月龄小鼠施用美洛昔康，通过转棒测试的运动表现的变化的结果。

图15示出了比较当向14月龄中年小鼠施用美洛昔康，体重和抓握强度(图15a)以及运动表现(图15b)的变化的结果。

图16示出了比较当向4月龄幼年小鼠施用美洛昔康，体重(图16a)和摄入量(图16b)的变化的结果；并且图17示出了抓握强度和运动表现(图17a)以及与体重相比的肌肉质量(图17b)的变化。

具体实施方式

本发明涉及一种用于预防或治疗肌肉疾病的药物组合物，包含昔康类化合物或其药学上可接受的盐。

本发明涉及一种用于预防或缓和肌肉疾病的保健功能性食品组合物，包含昔康类化合物或其食品学上可接受的盐。

本发明涉及一种用于强化肌肉强度的组合物，包含昔康类化合物。

本发明涉及一种用于增强运动表现的组合物，包含昔康类化合物。

本发明涉及一种用于促进肌肉干细胞分化的组合物，包含昔康类化合物。

本发明涉及一种用于肌肉再生的组合物，包含昔康类化合物。

本发明涉及一种用于增加肌肉质量的组合物，包含昔康类化合物。

本发明涉及一种饲料添加剂组合物，包含昔康类化合物。

下面将详细介绍本发明。

作为本发明的一个方面，本发明可以包含昔康类化合物和其药学上可接受的盐。本发明的昔康化合物(昔康类化合物)是一种广泛用作非甾体抗炎剂的化合物，更具体地，可以包括氯诺昔康、吡罗昔康、替诺昔康、安吡昔康

[式1]

[式2]

[式3]

[式4]

作为本发明的一个方面，本发明的昔康类化合物具有预防或治疗由衰老、肌肉功能障碍、肌肉消耗、肌肉退化或肌肉损伤引起肌肉疾病的作用。“肌肉疾病”是指由于衰老或疾病导致的肌肉损伤或丧失使肌肉强度量减弱的状态，其可以由多种原因引起，包括遗传倾向、年龄相关疾病例如高血压、糖耐量受损、糖尿病、肥胖症、血脂异常、动脉粥样硬化和心血管疾病；慢性疾病例如癌症、自身免疫疾病、传染病、AIDS、慢性炎症性疾病、关节炎、营养不良、肾脏疾病、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、佝偻病、慢性腰痛、外周神经受损、中枢神经受损和化学损伤；由于例如骨折和外伤的原因或长期卧床休息导致的运动能力丧失；和衰老。

虽然不限于此，肌肉疾病包括选自由以下组成的组中的一种或多种肌肉疾病：弛缓、肌肉萎缩、肌肉退化、肌强直、肌萎缩性硬化、重症肌无力、恶病质和老年性少肌症，具体地，由老年性肌肉萎缩或癌症引起的肌肉相关疾病，更具体地，老年性肌肉萎缩或由癌症引起的肌肉萎缩、肌肉退化、肌强直、肌萎缩性硬化、重症肌无力、恶病质、老年性少肌症和肌肉丧失。因此，在一方面中，肌肉疾病是指选自由以下组成的组的疾病：弛缓、肌肉萎缩、肌肉退化、肌强直、肌萎缩性硬化、重症肌无力、恶病质和少肌症。

在本发明中，对肌肉疾病的预防性、治疗性或缓和性作用可能是由于促进了成肌细胞分化。在本发明的一个实施方案中，确认了昔康类化合物促进了成肌细胞的分化。“成肌细胞分化”是指单核成肌细胞通过融合形成多核肌管的过程，处于形成肌管的分化阶段的细胞可以用标志物(例如Pax7-、MyoD+和MyoG)来区分。在形成肌管的分化的早期的细胞中，肌源性转录因子(例如MyoD)的表达增加，并且MyoG在中期增加。在分化的晚期，肌球蛋白重链(MHC)的表达增加。在本发明的实施方案中，确认了用昔康类化合物美洛昔康治疗时MHC和成肌素的表达增加。

本发明的昔康类化合物可以改善运动表现。“运动表现”是指利用肌肉强度进行运动的能力，此时，肌肉强度可以通过增加肌肉质量、肌肉耐力和氧化性肌肉质量和通过改善肌肉恢复和肌肉内能量平衡来改善，并且也可以通过减少肌肉内疲劳物质等来得以增强。本发明的昔康类化合物具有通过上述列出的对于肌肉的多种作用来增强运动表现的作用。关于上述作用，在本发明的一个实施方案中，确认了施用美洛昔康的组中的实际肌肉强度和运动表现有所增加。

也就是说，本发明的昔康类化合物具有改善肌肉功能的作用(例如增加肌肉质量、改善肌肉强度和增加肌肉恢复)，并且可以具有对肌肉相关疾病的预防性、治疗性和缓和性作用。

本发明的昔康类化合物可以通过受损小鼠中的肌肉再生而具有对肌肉疾病的预防性、治疗性和缓和性作用。在本发明的实施方案中，确认了向肌肉损伤小鼠模型(CTX-受损)施用美洛昔康的作用。结果确认了与对照组相比肌肉质量增加，并且在观察当施用美洛昔康的肌肉和肌肉纤维再生的程度时，确认了肌肉和肌肉纤维再生得更密集。此外，当施用昔康类化合物(例如美洛昔康)，确认了与对照组相比II型肌肉纤维(MHC II型)的比例极大地增加。此外，不仅在由CTX损伤的肌肉中，而且在由衰老损伤或减弱的小鼠的肌肉组织中，都可以存在通过促进肌肉干细胞的分化、增加肌肉纤维尺寸和增加肌肉质量的作用来改善肌肉强度和运动表现的作用。

此外，本发明的昔康类化合物可以具有通过不仅使由肌肉疾病或衰老损伤的肌肉再生，而且在正常肌肉中使肌肉再生并且使肌肉质量增加的作用来增加肌肉强度和改善肌肉功能的作用。在本发明的实施方案中，在幼年小鼠(14月龄和4月龄)中确认了分化肌肉干细胞和增加肌肉质量的作用，并且确认了当即使在幼年肌肉中长时间施用美洛昔康，也会有增加肌肉强度和改善运动表现的作用。

本发明的组合物可以用于多种用途例如药物、保健功能性食品、功能性食品、动物饲料和细胞培养组合物，并且可以促进成肌细胞分化或增加肌肉中线粒体活性，从而对肌肉疾病具有预防性、缓和性或治疗性作用。

说明书中所用术语“预防”是指能够通过施用根据本发明的药物组合物而抑制或延迟肌肉疾病的发作的所有行为。

说明书中所用术语“治疗”是指通过施用本发明的药物组合物而使症状缓和或有益地变化的所有行为。

本发明的药物组合物在根据常规方法配制成口服剂型(例如散剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂)、外用制剂、栓剂和无菌注射溶液剂的形式后使用，并且进一步包含剂型所需的载体或辅料。除了活性成分外，还可以进一步包括药学上可接受的载体、辅料和稀释剂，包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁和矿物油。在配制时，使用稀释剂或辅料，例如常用的填充剂、增量剂

例如，用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且通过将提取物或化合物与至少一种辅料(例如棉

用于肠胃外施用的剂型包括灭菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和栓剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射酯(例如油酸乙酯)。作为用于栓剂的基质，可以使用Witepsol、Macrogol、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯脂、甘油、明胶等。

本发明的药物组合物可以根据所需方法经口或经肠胃外(静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用，剂量取决于患者的状况和体重、疾病程度、药物类型以及施用途径和时间，并且可以由本领域技术人员选择适当形式。

本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指适用于医学治疗的合理量，其是足以治疗疾病的量，其中标准可以根据患者的疾病、疾病严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗周期、同时使用的成分和其它因素来确定。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。通过考虑上述所有因素，可以将剂量确定为能够使副作用最小的水平，这是本领域技术人员可以容易地确定的。具体地，药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、体重、疾病程度、性别等而不同，通常以每1kg体重0.001至150mg、优选0.01至50mg、更优选0.01至5mg的量每天或隔天施用，每天1至3次。然而，这只是示例性的，可以根据需要对剂量进行不同设置。

此外，本发明的组合物可以是食品或保健功能性食品，特别地，“保健功能性食品”是指根据保健功能性食品法第6727号规定使用对人体有用的功能性原料或组分制造和加工的食品，其中“功能性”是指为了获得针对保健目的的有用效果的目的的摄入，例如针对人体的结构和功能或生理功能调节营养剂。

可以将本发明的食品或保健功能性食品制造或加工成药学施用形式(例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、混悬剂、乳剂和糖浆剂)或者保健功能性食品(例如茶包、浸出茶

本发明的食品或保健功能性食品组合物可以用作食品添加剂，并且可以单独或与其它成分组合而商用。此外，可以包含营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂和增强剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精和用于碳酸饮料的碳酸化剂。上述成分可以单独或组合使用，并且可以以合适量组合使用。

作为本发明的实施方案，本发明涉及一种用于强化肌肉强度的组合物，包含昔康类化合物。

“强化肌肉强度”是指增强体能表现、增强最大耐力、增加肌肉质量、增强肌肉恢复、降低肌肉疲劳、改善能量平衡或其组合的效果。该组合物可以通过使成肌细胞分化为肌肉细胞的能力而增加肌肉质量来增加总肌肉质量，并且可以增强最大耐力，从而增强体能表现并降低肌肉疲劳。此外，由于肌肉细胞可以被快速替代，所以肌肉损伤可以快速愈合。此外，本发明的用于强化肌肉强度的组合物可以以食品组合物或食品添加剂的形式制备，特别地，可以以保健食品组合物的形式制备。该食品组合物如上所述。因此，本发明的用于强化肌肉强度的组合物可以以补充剂的形式使用，不仅用于衰老导致的肌肉丧失，还用于普通人的肌肉再生和肌肉强化。

作为本发明的另一个方面，本发明涉及一种包括昔康类化合物的饲料或饲料添加剂组合物。

在本发明中，“饲料”是指提供维持动物生命所需的有机或无机营养剂的物质。该饲料可以包含动物(例如家畜)所需的营养剂(例如能量、蛋白质、脂质、维生素和矿物质)，并且可以包含植物饲料(例如谷物、根茎和果实、食品加工副产物、藻类、纤维、油、淀粉、瓜类和谷物副产物)或者动物饲料(例如蛋白质、无机物、油、油脂和单细胞蛋白)，但不限于此。

在本发明中，“饲料添加剂”是指添加到饲料中以改善动物的生产率或健康的物质，在这种情况下，为了促进生长和预防疾病的目的，饲料添加剂可以还包含氨基酸、维生素、酶、调味剂、硅酸盐、缓冲剂、提取物、低聚糖等，但不限于此。

[发明的模式]

以下，将对实施方案进行详细描述以具体描述本说明书。然而，根据本说明书的实施方案可以被修改为多种不同形式，并且不能将本说明书的范围解释为仅局限于以下描述的实施例。提供本说明书中描述的实施例用于向本领域普通技术人员更完整地解释本说明书。

<实施例1>分离和培养肌肉细胞

C2C12是一种从C3H种活体小鼠获得的成肌细胞系，被广泛用于对肌肉细胞分化的研究中。将C2C12细胞分别培养于常规细胞培养用培养基和分化培养基中。将补充有10％胎牛血清的DMEM用作普通细胞培养用培养基(即生长培养基(GM))，并且将含有2％马血清的DMEM用作分化培养基(DM)。

此外，从MyoSite购买分离自17和66岁龄高加索男性腹直肌的人肌肉干细胞(skMDC人骨骼肌细胞(标准捐献者)，货号：SK-1111)并使用。

<实施例2>制备肌肉受损(CTX-受损)小鼠模型

使用30只5月龄C57BL/6雄性小鼠作为实验动物。分配5只动物(实验动物的每只动物具有相似体重)，以分为对照组(未对其施用美洛昔康)和实验组(对其施用美洛昔康)。以0.02mg/kg的剂量向实验组小鼠经口施用美洛昔康7天。然后，将50μL 20μM心脏毒素(CTX)直接注射至胫骨前肌(TA)肌肉以诱导肌肉损伤，并且经口施用美洛昔康21天。

<实验实施例1>成肌细胞分化的增强作用的确认

1-1.小鼠肌肉干细胞分化的增强作用

将实施例1的C2C12细胞系接种至细胞培养用培养基并且在DMEM培养基中培养24小时，然后用昔康类化合物美洛昔康(F03)、氯诺昔康(F03-1)、吡罗昔康(F03-2)和替诺昔康(F03-3)处理分化培养基，以分析分化标志物肌细胞生成素和肌球蛋白重链(MHC)的相对表达水平。收集实施例1中被诱导分化的C2C12细胞后，通过加入裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％ Triton X，蛋白酶抑制剂)对其进行裂解，对细胞溶解样品进行定量，然后将等量的蛋白质进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。该膜用5％脱脂奶封闭，并且用TTBS(0.03％吐温20，2.42g Tris，9g NaCl，pH7.4 1L)洗涤。加入以1:500稀释在含有5％BSA的TTBS中的分化标志物MHC(肌球蛋白重链)一抗，使其在4℃反应过夜。然后，加入以1:5000稀释在含有5％脱脂奶的TTBS中的二抗，使其在室温反应，然后加入增强的化学发光溶液(ECL，Pierce)。然后，将膜曝光于X射线胶片上以确认蛋白质表达水平。

结果，如图1所示，确认了与对照组(DMSO)相比，当用昔康类化合物处理，成肌细胞的分化标志物的相对表达水平增加。

在上述化合物中，分别以1、10、100、1000和10000nM的不同浓度的美洛昔康处理C2C12细胞，诱导分化3天，每隔一天更换一次培养基。分化后，在显微镜下观察细胞，并将细胞破碎并使用分化标志物细胞生成素和MHC抗体进行蛋白质印迹分析。用1×PBS洗涤C2C12细胞，在室温用4％多聚甲醛固定，然后在加入渗透缓冲液后使其在室温反应。反应用含有5％山羊血清的PBST(封闭缓冲液)和含有0.05％的吐温20的PBS进行，以抑制非特异性抗体结合。加入肌球蛋白重链(MHC)的一抗后，使所得混合物在室温反应。加入以1:5000稀释在封闭缓冲液中的二抗，使其在室温反应，涂封片溶液(40％在DW中的甘油)并固定后，在荧光显微镜下拍摄图像以分析结果。

结果，如图2所示，在用高浓度美洛昔康处理的成肌细胞中清楚地观察到MHC，并且如图3所示，确认了表达水平也有所增加。

1-2.人肌肉干细胞分化的增强作用

进行了实验以确认美洛昔康是否具有促进人肌肉干细胞分化的作用。

从MyoSite购买分离自17和66岁龄高加索男性腹直肌的人肌肉干细胞(skMDC人骨骼肌细胞(标准捐献者)，货号：SK-1111)并使用。将人肌肉干细胞接种至细胞培养用培养基中并且培养24小时。然后用昔康类化合物美洛昔康(1μM)处理分化培养基，并且诱导分化为肌肉纤维，持续4天。通过肌肉纤维标志物MHC免疫染色测量分化为肌肉纤维的程度。分化通过肌肉纤维直径进行分析。

结果，如图4所示，在提取自17岁龄受试者的肌肉干细胞的情况中，确认了肌管直径增加。如图5所示，在提取自66岁龄受试者的肌肉干细胞的情况中，确认了表达和肌管直径都增加。

<实验实施例2>肌肉损伤小鼠模型中肌肉恢复作用的确认

2-1.肌肉损伤小鼠模型中增加肌肉质量的作用

通过使用CTX-受损小鼠模型进行了实验以确认肌肉恢复作用。在CTX受损后施用美洛昔康21天后，测量并比较后肢的肌肉组织，胫骨前肌(TA)、伸趾长肌(EDL)、比目鱼肌(Sol)和腓肠肌(Gas)中每一种的重量，并且结果是，确认了与对照组相比，肌肉质量分别在TA中增加了5.8％、在EDL中增加了14.1％、在Gas中增加了5.4％并且在Sol中增加了3.4％(图6)。这些结果与相同周期过程中体重和其它器官重量的微小变化的结果(图7)形成对比，表明美洛昔康特异性地增加骨骼肌的量。

2-2.肌肉损伤小鼠模型中肌肉再生和增加肌肉纤维尺寸的作用

对于CTX-受损小鼠模型，为了确认美洛昔康对肌肉再生和增加肌肉纤维尺寸的作用，使用分离自每只实验动物的组织的TA肌肉进行苏木精&伊红染色(H&E染色)。将用4％多聚甲醛固定的冷冻切片用苏木精染色并用伊红染色以进行复染，并用封片溶液固定，然后在光学显微镜下观察。如图8所示，确认了从肌肉损伤后恢复的第4天、第7天和第21天的肌肉恢复和肌肉纤维尺寸的增加。

此外，为了另外确认增加的肌肉类型，比较了有关肌肉类型的mRNA的相对表达水平。结果，如图9所示，确认了与对照组相比，施用美洛昔康组中的II型肌肉纤维的量显著增加，尤其是在损伤后第21天。

此外，为了分析肌肉纤维尺寸，使用层粘连蛋白抗体对TA肌肉组织进行免疫组织化学染色，并在荧光显微镜下观察该组织，如图9底部的照片所示，可以看到通过层粘连蛋白染色显示的肌肉纤维的横截面积(CSA)增加，并且观察到表达MHC的代谢性肌肉纤维的CSA更大。由此，确认了增加的肌肉纤维和由此导致的肌肉质量的增加是由于代谢性肌肉纤维的直径和百分比的增加引起的。

2-3.肌肉损伤小鼠模型的肌肉中的代谢性酶活性的增加

在受损后第21天向CTX-受损小鼠模型施用美洛昔康，以确认施用组中增加肌肉线粒体中糖酵解酶活性的作用。

α-磷酸甘油是甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的底物，将其加入分离自实验动物的组织的TA肌肉切片，并根据GPDH的活性确认了肌肉纤维的颜色变化。用Aquatex(默克)固定变化的肌肉切片并在显微镜下观察。结果，如图10所示，在美洛昔康施用组的情况中，确认了代谢性肌肉纤维尺寸增加(左)，并且确认了肌肉纤维(其中GPDH被激活)的百分比高于对照组。从上述结果可以看出通过施用美洛昔康，肌肉中代谢酶的活性有所增加。

2-4肌肉损伤小鼠模型中增加肌肉强度和运动表现的作用

在诱导CTX-受损后第21天，为了确认美洛昔康施用组和对照组的肌肉强度和运动表现，进行了用于评估肌肉强度和运动表现的实验。为了确认施用组和对照组的肌肉强度，进行了抓握强度测试。使用由BIOSEB制造的小鼠抓握强度测试仪进行了抓握强度测试。将小鼠放置在连接至能够监测力的强度的仪器面板的铁丝网上，并且在拉住小鼠尾巴的同时测量小鼠抓握铁丝网的力。将通过连续四次重复测量获得的测量值的平均值除以体重。结果，如图11所示，确认了与对照组相比，美洛昔康施用组中肌肉强度增加了约21.9％，并且用于评估运动表现的实验也确认了美洛昔康施用组中运动表现增加了高达72.3％。为了确认施用组和对照组的运动表现进行了转棒测试。在转棒测试中，使用由Ugo Basile制造的小鼠用转棒装置进行测量。测量直到小鼠从旋转转棒掉落的距离。转棒测试的测量在适应性训练后进行，适应性训练以8rpm持续5分钟、以10rpm持续3分钟和以13rpm持续1分钟进行，持续2天。匀速转棒测试中，以13rpm进行测量直到小鼠掉落，并且在加速转棒测试中，以40秒内从5rpm加速至18rpm进行测量。在这两项实验中，都基于高达500秒的最大值进行测量，实验在500秒时停止。

<实验实施例3>长期美洛昔康施用后按照年龄增加肌肉质量和运动表现的作用的确认

3-1.衰老小鼠中肌肉质量、肌肉类型和运动表现的变化

向24月龄小鼠施用美洛昔康4个月后，通过测量重量来分析后肢肌肉质量和骨骼肌肌肉质量的变化，并进行比较。结果，如图12所示，确认了后肢肌肉和EDL肌肉(下图)的肌肉质量增加，表明与整体重量增加相比，肌肉质量以相对更高的比例增加(上图)。

此外，确认了所表达的肌肉类型的mRNA的相对表达水平，并且如图13所示，美洛昔康施用组中Myh II型肌肉纤维的表达比例显著增加。也就是说，确认了施用美洛昔康的衰老小鼠中肌肉质量和代谢性肌肉纤维的百分比增加。

此外，为了确认美洛昔康施用组和对照组的运动表现的变化，使用转棒装置进行了运动表现测试。结果，如图14所示，确认了与对照组相比，美洛昔康施用组的运动表现增加了超过50％。同时，确认了不仅在衰老小鼠中而且在7月龄小鼠中增加运动表现的作用。因此，确认了不仅在衰老肌肉中而且在正常肌肉中都存在由美洛昔康引起的改善运动表现的作用。

3-2.小鼠(4月龄)中肌肉强度和运动表现的变化

为了测量在相对幼年小鼠中由施用美洛昔康引起的肌肉强度和运动表现的变化，进行了实验。在诱导CTX-受损后的第21天，进行了用于测量美洛昔康施用组和对照组的肌肉强度的抓握强度测试和用于确认运动表现的实验。使用由BIOSEB制造的小鼠抓握强度测试仪进行了抓握强度测试。将小鼠放置在连接至能够监测力的强度的仪器面板的铁丝网上，在拉住小鼠尾巴的同时测量小鼠抓握铁丝网的力。将通过连续重四次复测量获得的测量值的平均值除以体重。结果，如图15所示，确认了与对照组相比，美洛昔康施用组中的肌肉强度增加了约21.9％，并且用于评估运动表现的实验也确认了美洛昔康施用组中的运动表现增加了高达72.3％。

3-3.长期施用后正常小鼠(4月龄)中肌肉强度和运动表现的变化

用4月龄的正常小鼠进行了实验以观察长期美洛昔康施用后的肌肉强度和运动表现的变化。首先，向正常小鼠施用美洛昔康2个月后，作为将体重变化与未施用组的体重变化进行比较的结果，没有观察到显著变化(图16a)，并且没有观察到摄入量的变化(图16b)。为了确认施用组和对照组的运动表现，进行了抓握强度测试和跑步机测试。在跑步机测试中，通过使用由哥伦布仪器公司

在前文中，本发明已经就其优选实施方案进行了描述。本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解，本发明可以在不脱离本发明基本特征的情况下以修改后的形式实施。因此，应从说明性的观点而不是限制性的观点来考虑所公开的实施方案。本发明的范围在权利要求书中而不是前述说明书中指出，等同范围内的所有不同将被解释为包括在本发明中。