一种用于磁珠法血液DNA快速提取的裂解结合液、包括该裂解液的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉核酸提取试剂领域，尤其涉及一种裂解结合液及其在核酸提取中的应用。

背景技术

核酸是各类生命的最基本物质之一，不仅起着储存和传递遗传信息的作用，在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中也起着决定性的作用。

基因组DNA提取是PCR扩增、文库构建和测序工作的基础，临床工作中常用的标本包括血液、器官组织和脱落细胞、唾液和口腔拭子，其中血液样本使用最为广泛。

核酸提取的传统方法包括酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、煮沸法等。自1979年Vogelstein和Gillespie首次将玻璃纤维用于回收琼脂糖凝胶中的DNA片段以来，以固相载体为基础的新型核酸提取方法便被发展起来，包括吸附膜离心柱提取法、玻璃珠吸附法及磁珠提取法。

与吸附膜离心柱提取法相比，磁珠提取法具有良好的表面效应和体积效应，磁珠表面积激增，微球官能团密度和选择性吸附能力大大增加，导致磁珠的吸附平衡时间缩短。此外磁珠的物理和化学性质稳定，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物降解，具有一定的生物相容性，不会对生物体造成明显的伤害。

磁珠提取法提取DNA目前在临床上已得到广泛的应用。然而不同厂家的磁珠法核酸提取法其效率差别很大，存在DNA提取试剂操作方法复杂，提取用时长，获得的DNA浓度和纯度不够高的问题。此外，全血样本类型也非常复杂，干扰核酸提取的物质多，除了冷冻的全血样本外，临床新鲜全血比例也非常高，经常有报道很多市场上试剂盒对于临床新鲜全血的提取效果较差。

中国专利CN114317522A公开了一种全血液DNA提取试剂盒及核酸提取方法，包括裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液，还包括红细胞裂解液和蛋白酶K缓冲液。其方法首先使用红细胞裂解液对血液样本的红细胞裂解，然后离心留下白细胞沉淀，随后使用蛋白酶K和裂解液进行加热裂解。接着使用磁珠和无水乙醇进行结合，然后经过三次清洗，挥发除醇，最后加热洗脱。该方法步骤繁琐，无法直接对全血样本进行提取，也无法实现高通量自动化过程。

中国专利CN104017800B公开了一种全血液DNA提取试剂盒及方法。所述试剂盒包括红细胞裂解液、白细胞洗涤液、消化液、蛋白酶K、纯化液、gDNA盐析液、gDNA洗涤液及gDNA洗脱液等。该发明不仅含有红细胞裂解液，同时使用氯化锂进一步纯化。该方法能够得到高纯度的DNA，但是，操作繁琐，费时费力。

综上所述，虽然现有技术中不能提供一种快速并简便的针对全血样本的核酸提取试剂，无需蛋白酶K、红细胞裂解或离心沉淀白细胞的步骤。因此，开发一种全血样本直接裂解并且样本裂解完成后无需再额外添加结合液和磁珠，适用于冷冻全血和临床新鲜全血样本的自动化高通量的方法对未来的基因检测是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速核酸提取试剂盒，本发明所提供快速核酸提取试剂盒可以针对全血样本直接上机，操作简单、快捷，可以提取到高浓度和纯度的DNA。

为了实现本发明的上述目的，本发明在第一方面提供了一种裂解结合液，所述裂解结合液包含：马来酸钠、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、Brij 30、Gemini表面活性剂、聚丙二醇。

本发明在第二方面提供了一种核酸提取试剂盒，所述核酸试剂盒包括用于配制本发明第一方面所述的裂解结合液的裂解结合液用试剂。

本发明在第三方面提供了一种从生物样本中提取或纯化核酸的方法，所述方法采用本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述试剂盒进行提取或纯化。

本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述的试剂盒在生物样本尤其是全血样本例如冷冻全血样品或新鲜全血样品(如临床新鲜全血样本)的核酸提取中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益的技术效果：

(1)提供一种全血样本的快速核酸提取试剂盒，可以配套自动化化核酸提取仪实现快速高通量的核酸提取或纯化。

(2)本发明提供的技术方案中第二清洗液不含易挥发的乙醇或者异丙醇，无需进行醇的挥发控干，节约流程的时间，减少了气溶胶的污染。

(3)本发明提供的技术方案不含蛋白酶K，操作更为方便，成本更低。

(4)本发明提供的技术方案的裂解结合一步进行，可以直接上机操作。

(5)本发明提供的技术方案对于冷冻全血和临床新鲜全血都具有良好的提取效果。

附图说明

图1是本发明实施例2中本发明试剂盒与Qiagen公司QIAamp DNA mini Kits针对6份冷冻全血和6份临床肿瘤患者的新鲜全血的提取DNA的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

定义

在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

当本文提供值的范围时，除非另有明确说明，否则所述范围意在包括起始值和结束值，以及其间的值或值的范围。例如，“从0.2-0.5”是指0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量如0.25、0.35、0.220、0.325、0.49；其间的增量范围如0.26-0.39等诸如此类。

应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解的是，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。

除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。

“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起，以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。

在本申请中，“提取”、“分离”或“纯化”是指样本的一个或多个组分被除去或与其它样本组分分离。样本组分包含常处于通常水性溶液相中的目标核酸，其也可以包含细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质、盐离子、金属离子和其它核酸。“提取”、“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其它样本组分中至少70％或至少80％或至少90％的目标核酸。

如上所述，本发明在第一方面提供了一种裂解结合液，所述裂解结合液包含：马来酸钠、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、Brij 30、Gemini表面活性剂、聚丙二醇。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液由马来酸钠、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、Brij 30、Gemini表面活性剂、聚丙二醇和水组成。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：50-500mM(例如为60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450mM)马来酸钠、1-8M(例如为2、3、4、5、6或7)盐酸胍、1-8M(例如为2、3、4、5、6或7)高氯酸钠、50-500mM(例如为60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450mM)氯化铵、0.1-20％(例如为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10或15％)Brij30、0.2-20％(例如为0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10或15％)的Gemini表面活性剂、5-30％(例如为10、15、20或25％)的聚丙二醇，其中，所述的Brij 30、Gemini表面活性剂和聚丙二醇的浓度以质量体积百分比计。优选的是，所述裂解结合液的pH为5.0-9.0(例如为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5)。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：50-500mM马来酸钠、1-8M盐酸胍、1-8M高氯酸钠、50-500mM氯化铵、0.1-20％Brij 30、0.2-20％的Gemini表面活性剂、5-30％的聚丙二醇和余量的水。优选的是，所述裂解结合液的pH为5.0-9.0。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：50-200mM马来酸钠、1-5M盐酸胍、2-6M高氯酸钠、100-300mM氯化铵、0.5-10％Brij 30、0.5-10％的Gemini表面活性剂和10-25％的聚丙二醇。优选的是，所述裂解结合液的pH为5.5-8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：50-200mM马来酸钠、1-5M盐酸胍、2-6M高氯酸钠、100-300mM氯化铵、0.5-10％Brij 30、0.5-10％的Gemini表面活性剂、10-25％的聚丙二醇和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为5.5-8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：75-175mM马来酸钠、1.5-4.5M盐酸胍、2-5M高氯酸钠、150-250mM氯化铵、1-5％Brij 30、1-8％的Gemini表面活性剂和12.5-22.5％的聚丙二醇。优选的是，所述裂解结合液的pH为7-8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含：75-175mM马来酸钠、1.5-4.5M盐酸胍、2-5M高氯酸钠、150-250mM氯化铵、1-5％Brij 30、1-8％的Gemini表面活性剂、12.5-22.5％的聚丙二醇和余量的水。优选的是，所述裂解结合液的pH为7-8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含125mM马来酸钠、4M盐酸胍、5M高氯酸钠、200mM氯化铵、2.5％Brij 30、2.5％的Gemini表面活性剂和20％的聚丙二醇。优选的是，所述裂解结合液的pH为8.5。

在另一些优选的实施方式中，所述裂解结合液包含125mM马来酸钠、4M盐酸胍、5M高氯酸钠、200mM氯化铵、2.5％Brij 30、2.5％的Gemini表面活性剂、20％的聚丙二醇和余量的水。优选的是，所述裂解结合液的pH为8.5。

本发明的裂解结合液中，马来酸钠可以提供pH稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团的电荷状态，对DNA碱基起保护作用。

盐酸胍是破坏蛋白质三维结构的离液剂，能够快速破坏细胞膜或病毒，释放核酸，使蛋白质变性，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，可以使核酸酶活性减缩，抑制核酸酶活性。

高氯酸钠与盐酸胍类似，也是一种蛋白变性剂，同时提供了大量的一价阳离子(钠离子)建立了核酸的磷酸根与磁珠硅羟基表面的盐桥。

氯化铵协同钠离子，提供了DNA沉淀的有利条件，同时铵盐离子对于细胞的穿透性较好，可以有助于快速裂解细胞。

Brij 30(CAS：9002-92-0)是一种比较温和的非离子型表面活性剂，它能溶解脂质，同时具有促进氢键和阳离子桥形成的作用，常作为添加剂使蛋白保持稳定，特别是使膜蛋白保持其天然构象。本发明在实施例中尝试用其他常规的非离子表面活性剂如曲拉通X-100或吐温20进行替代，令人印象深刻的是在血液样本中Brij 30相比上述两种表面活性剂具有更好的裂解细胞的效果和核酸质量和回收率，得到洗脱液是澄清的。

Gemini表面活性剂也称吉米奇季铵盐，吉米奇季铵盐(Gemini季铵盐)是由两个单链单头基普通表面活性剂在离子头基处通过化学键联接而成，因而阻抑了表面活性剂有序聚集过程中的头基分离力，极大地提高了表面活性。更易吸附液基表面，从而更有效地降低水溶液表面张力，它可以快速溶解细胞膜，促使蛋白变性加快，核酸释放。

所述的Gemini表面活性剂选自十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、乙撑基双(十六酰胺丙基二甲基溴化铵)、十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵中的一种或任意几种的组合。优选的，所述的Gemini表面活性剂为十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵。

本发明的聚丙二醇作为一种核酸沉淀剂存在，可以有效在弱碱性下和离液试剂的条件下沉淀核酸，同时所述的聚丙二醇相对于聚乙二醇具有更好的对于核酸的沉淀作用。令人意外的，在本体系下本发明人发现核酸的沉淀作用和聚丙二醇的分子量有相关性。在一些优选的实施方式中，所述聚丙二醇分子量为200-20000。优选的是，所述聚丙二醇分子量为500-10000。更优选的是，所述聚丙二醇分子量为1000-8000。最优选的是，所述聚丙二醇分子量为4000。

本发明在第二方面提供了一种核酸提取试剂盒，所述核酸试剂盒包括用于配制本发明第一方面所述的裂解结合液的裂解结合液用试剂。

在一些优选的实施方式中，所述裂解结合液用试剂由如下组分组成：马来酸钠、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、Brij 30、Gemini表面活性剂和聚丙二醇。在这种情况下，在使用所述试剂盒配制所述裂解结合液时，可以另外准备水例如去离子水。当然，也可以在所述试剂盒中提供配制所述裂解结合液需要使用的水如去离子水。于是，在另一个优选的实施方式中，所述裂解结合液用试剂由如下组分组成：马来酸钠、盐酸胍、高氯酸钠、氯化铵、Brij30、Gemini表面活性剂、聚丙二醇和水。

在使用所述试剂盒进行核酸提取时，可以采用磁珠提取法提取。在这种情况下，可以另外配制选自磁珠悬浮液、清洗液和洗脱液中的一种或多种以与上述试剂盒组合用于核酸的磁珠法提取。于是，在一些优选的实施方式中，所述快速核酸提取试剂盒还包括选自用于配制磁珠悬浮液的试剂、用于配制清洗液的试剂和用于配制洗脱液的试剂中的一种或多种。

本发明对所述磁珠悬浮液、清洗液和洗脱液的组成没有特别的限制，只要能够与本发明的裂解结合液或所述试剂盒组合用于目标生物样本提取即可。但是，在另一些优选的实施方式中，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为2-20％(例如为5、10或15％)的、粒径为0.1-10μm(例如为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0μm()的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为4.0-7.0(例如为4.5、5.0、5.5、6.0或6.5)，所述分散液包含0.05-0.2M(例如为0.06、0.07、0.08、0.09、0.1或0.15M)氯化钠、0.01-0.05％(例如为0.02、0.03或0.04％)NaN

在一些更优选的实施方式中，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为5-10％(例如为6、7、8或9％)的、粒径为0.5-5μm(例如为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0或4.0μm)的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0-6.0(例如为5.5)，所述分散液包含0.05-0.2M(例如为0.06、0.07、0.08、0.09、0.1或0.15M)氯化钠、0.01-0.05％(例如为0.02、0.03或0.04％)NaN

在一些进一步优选的实施方式中，所述磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为5％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0，所述分散液包含0.05M氯化钠、0.05％NaN

本发明对所述磁珠悬浮液所使用的水没有特别的限制，只要没有对生物样本核酸提取造成不利的影响即可。但是，所述水优选为无核酸酶水。

在另一些优选的实施方式中，所述清洗液可以包括两种清洗液，可称为第一通用清洗液和第二通用清洗液以在名称上将两者区分开。

在一些实施方式中，所述第一通用清洗液包含5-1000mM(例如为10、20、50、100、200、500或800mM)Tris-HCl，10-1000mM(例如为20、50、100、200、500或800mM)氯化锂，1-20mM(例如为2、5、10或15mM)EDTA-Na

在另一些优选的实施方式中，所述第二通用清洗液包含：10-200mM(例如为20、30、50、80、100或150mM)Tris-HCl，10-100mM(例如为20、30、40、50、60、70、80或90mM)氯化锂和30-70％(例如为40、50或60％)聚丙二醇400，pH5-8(例如为5.5、6.0、6.5、7.0或7.5)。优选的是，所述第二通用清洗液包含20-100mM Tris-HCl，50-100mM氯化锂和40-60％聚丙二醇400，pH7。更优选的是，所述第二通用清洗液包含50mM Tris-HCl，100mM氯化锂和50％聚丙二醇400，pH7。

在另一些优选的实施方式中，所述洗脱液包含10mM Tris-HCl，并且pH为8.5。

本发明在第二方面提供了一种从生物样本中提取或纯化核酸的方法，所述方法采用本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述试剂盒进行提取或纯化。

在一些优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：将全血样本加入到离心管中；

(2)样本裂解：向步骤(1)离心管中加入裂解结合液和磁珠悬浮液，在40-80℃(例如50、60或70℃)的温度下混匀孵育5-30min(例如10、15、20或25min)；

(3)核酸吸附：使用磁力架进行磁性分离，然后弃去磁性分离完成后获得的液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向所述吸附后磁珠中加入所述第一通用清洗液，混匀后使用磁力架进行磁性分离，然后弃去磁性分离完成后获得的液体，得到第一清洗磁珠；

(5)第二清洗：向所述第一清洗磁珠中加入所述第二通用清洗液并混匀，然后使用磁力架进行磁性分离，然后弃去磁性分离完成后获得的液体，得到第二清洗磁珠；

(6)样本洗脱：向所述第二清洗磁珠中加入洗脱液，混匀后在50-70℃(例如60℃)振荡孵育洗脱5-10min(例如6、7、8或9min)，收集洗脱后所得的DNA溶液。

磁性分离的操作为常规操作，本领域技术人员完全有能力判断磁性分离是否完成，通常，磁珠完全吸附或液体变得澄清，即认为磁性分离完成。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述全血样本的体积用量可以为200μL。在这种情况下，加入生物样本例如全血样本的体积用量可以为1-3倍(例如2倍或2-3倍)的所述裂解结合液；所述裂解结合液的体积可以为200-600μL(例如300、400或500μL)；在步骤(2)中，可以加入10-30μL(例如20μL)的所述磁珠悬浮液；在步骤(4)中，可以加入200-1000μL(例如300、400、500、600、700、800或900μL)的所述第一通用清洗液；在步骤(5)中，可以加入200-1000μL(例如300、400、500、600、700、800或900μL)的所述第二通用清洗液；在步骤(6)中，可以加入40-200μL(例如50、100或150μL)的所述洗脱液，在50-70℃(例如60℃)孵育洗脱3-6min(例如3、4或5min)。

所述生物样本为全血样本，例如所述生物样本为冷冻全血或新鲜全血样本如临床新鲜全血样本。例如，在所述生物样本为禽类血液样本时，在所述生物样本的体积为200μL的情况下，禽类血液样本可以是20μL禽类血液补充180μL去离子水得到的10体积％的水溶液从而得到准备用于核酸提取的禽类血液样本。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述全血样本的体积用量为200μL。在步骤(2)中，加入所述全血样本的体积用量为1-3倍的所述裂解结合液(200-600μL)；在步骤(2)中，加入10-30μL的所述磁珠悬浮液；在步骤(4)中，加入200-1000μL的所述第一通用清洗液；在步骤(5)中，加入200-1000μL的所述第二通用清洗液；在步骤(6)中，加入40-200μL的所述洗脱液，在50-70℃孵育洗脱3-6min。

在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述全血样本的体积用量为200μL。在步骤(2)中，加入所述全血样本的体积用量为2-3倍的所述裂解结合液(400-600μL)；在步骤(2)中，加入10-30μL的所述磁珠悬浮液；在步骤(4)中，加入500-700μL的所述第一通用清洗液；在步骤(5)中，加入500-700μL的所述第二通用清洗液；在步骤(6)中，加入50-100μL的所述洗脱液，在60℃下振荡孵育洗脱5min。

在一些更具体的实施方式中，本发明提供了从全血样本中快速提取DNA的试剂盒方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样本准备：将200μL全血样本加入到离心管中；

(2)样本裂解：向步骤(1)的离心管中加入400-600μL所述裂解结合液和10-30μL磁珠悬浮液，在40-80℃的温度下混匀孵育5-30min；

(3)核酸吸附：使用磁力架进行磁性分离，然后弃去磁性分离完成后获得的液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得磁珠中加入500-700μL第一通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，然后弃去磁性分离完成后获得的所有液体；

(5)第二清洗：向步骤(4)所得磁珠中加500-700μL第二通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，然后弃去磁性分离完成后获得的所有液体；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得清洗后磁珠中加入50-100μL洗脱液，60℃振荡孵育洗脱5min后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的DNA溶液，置于-80℃保存。

本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的裂解结合液或本发明第二方面所述的试剂盒在生物样本尤其是全血样本例如冷冻全血样品或新鲜全血样品(如临床新鲜全血样本)的核酸提取尤其是基因组DNA提取中的应用。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

制备例1：快速核酸提取试剂盒

本制备例采用本发明的快速核酸提取试剂盒进行核酸提取。所述试剂盒包括：用于配制裂解结合液的裂解结合液用试剂、用于配制磁珠悬浮液的磁珠悬浮液用试剂、用于配制第一通用清洗液的第一清洗试剂、用于配制第二通用清洗液的第二清洗试剂和用于配制洗脱液的洗脱液用试剂。

1)裂解结合液组成为：所述裂解结合液包含125mM马来酸钠、4M盐酸胍、5M高氯酸钠、200mM氯化铵、2.5％Brij 30、2.5％的Gemini表面活性剂、20％的聚丙二醇(分子量为4000)和余量的水，并且所述裂解结合液的pH为8.5。

2)磁珠悬浮液包含分散液和质量体积百分数为5％的、粒径为0.5-5μm的超顺磁性硅颗粒，所述磁珠悬浮液的pH为5.0，所述分散液包含0.05M氯化钠、0.05％NaN

3)第一通用清洗液由以下成分组成：100mM Tris-HCl，200mM氯化锂，2mMEDTA-Na

4)第二通用清洗液由以下成分组成：50mM Tris-HCl，100mM氯化锂和50％聚丙二醇400。

5)所述洗脱液组成为：包含10mM Tris-HCl的水溶液(pH8.5)。

对比制备例1：

裂解结合液中不含聚丙二醇，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例2：

裂解结合液中Brij 30替换成等体积的吐温20，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例3：

裂解结合液中Brij 30替换成等体积的曲拉通X-100，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例4：

裂解结合液中聚丙二醇分子量为1000，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例5：

裂解结合液中聚丙二醇分子量为2000，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例6：

裂解结合液中聚丙二醇分子量为6000，其余组分与制备例1的一致。

对比制备例7：

裂解结合液中聚丙二醇分子量为8000，其余组分与制备例1的一致。

实施例1：血液基因组DNA提取

本实施例以制备例1和对比制备例2-7的核酸提取或纯化试剂盒对不同血液样本中的基因组DNA进行提取，具体的步骤如下：

(1)样本准备：将200μL全血样本加入到离心管中；

(2)样本裂解：向步骤(1)的离心管中加入500μL制备例1提供的裂解结合液和20μLMagH1N Silica，在65℃的温度下混匀孵育10min；

(3)核酸吸附：使用磁力架进行磁性分离，待磁珠完全吸附后弃去液体，得到吸附后磁珠；

(4)第一清洗：向步骤(3)所得的吸附后磁珠中加入500μL第一通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，磁性分离至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，得到第一清洗磁珠；

(5)第二清洗：向步骤(4)所得的第一清洗磁珠中加入500μL第二通用清洗液，震荡混匀1min后置于磁力架上，磁性分离至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，得到第二清洗磁珠；

(6)样本洗脱：向步骤(5)所得的第二清洗磁珠中加入100μL洗脱液，60℃振荡孵育洗脱5min后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的DNA溶液，置于-80℃保存。

对比上述提取的5份冷冻EDTA抗凝全血样本后进行核酸浓度(Nanodrop)的检测，并将制备例1与对比制备例进行DNA提取的结果比较，检测结果如下表1所示。由表1的结果可以看出，本发明的快速核酸提取试剂盒的提取效果显著优于对比制备例相比效果。此外，本发明人观察到对比制备例2和对比制备例3提取得到的DNA洗脱物颜色不澄清，显示出浅黄或浅红色，而制备例1的DNA洗脱物澄清且无色。对比制备例1和对比例1发现，当裂解结合液中不加入聚丙二醇时，DNA未能进行提取，即无法对DNA进行沉淀。通过制备例1、对比例1和对比例4-7我们发现，DNA的提取量与聚丙二醇的分子量有相关性，从分子量从1000增加至4000时，DNA浓度也随着增加，但是分子量从4000增加至8000时，DNA浓度是随之下降的。令人意外的，本发明提供的聚丙二醇分子量为4000时能获得最佳的提取效果。

表1.实施例1血液样本的基因组DNA提取检测结果

实施例2：冷冻全血与临床新鲜全血样本的基因组DNA提取

实验以制备例1的快速核酸提取试剂盒和对比试剂盒(QIAamp DNA mini Kits,Qiagen，Cat#51304)进行冷冻全血样本和临床肿瘤患者的新鲜全血样本的基因组DNA进行提取，具体的步骤与实施例1基本相同，但是使用96位自动化核酸提取仪进行自动化提取。

(1)样本及试剂准备：将200μL全血样本加入96深孔板中的盘位1中对应的孔中。

(2)核酸提取：将上一步加好样本和试剂的96深孔加样板放入96位核酸提取仪，放入96位磁棒套，运行程序。

约20分钟后取出96深孔板，将盘位8中96深孔板的洗脱的DNA转移至干净(无核酸酶)的离心管中，-80℃保存。

对比试剂盒参考QIAamp DNAmini Kits的说明书操作，使用200μL全血进行提取，

洗脱液使用100μL进行洗脱。

对比上述提取的6份冷冻全血和6份临床肿瘤患者的新鲜全血进行核酸浓度和纯度的检测，并与对比试剂盒QIAamp DNA mini Kits进行核酸提取的结果比较，检测结果如下表2所示。由表2可以看出，本发明的快速核酸提取试剂盒的提取效果显著优于对比进口试剂盒。本发明开发的试剂盒不仅速度快，只需要20分钟就可以完成全自动化的操作流程，而对比Qiagen公司的试剂盒需要50分钟的时间，且离心柱法无法完成自动化高通量的操作。令人意外的，本发明开发的试剂盒针对临床新鲜全血依旧可以提取非常高质量的DNA，比对比Qiagen公司的试剂盒则回收的效果好很多，从凝胶电泳图(图1)上观察，本发明不管对于冷冻全血还是临床肿瘤患者的新鲜全血都可以提取到完整的DNA，条带清晰，主带完整。而Qiagen公司的试剂盒对于冷冻全血能提取到完整的DNA，条带清晰，而对于临床肿瘤患者的新鲜全血则没有清晰的主带，且浓度低，纯度低。

表2.实施例2全血样本DNA提取检测结果

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。