拟肽大环化合物及其用途

本申请是申请日为2015年09月24日、申请号为 201580063937.6、发明名称为“拟肽大环化合物及其用途”的中国专 利申请(其对应PCT申请的申请日为2015年09月24日、申请号为 PCT/US2015/052031)的分案申请。

本申请要求提交于2014年9月24日的第62/054,861号美国临 时申请、提交于2015年9月3日的第62/213,831号美国临时申请以 及提交于2015年9月10日的第62/216,670号美国临时申请的优先权， 每一个所述申请均通过引用而全文并入于此。

背景技术

人转录因子蛋白质p53响应于DNA损伤和细胞应激而诱导细胞周 期停滞和凋亡，从而在保护细胞免于恶性转化方面发挥关键作用。E3遍 在蛋白连接酶MDM2(也称为HDM2或人双微体2)通过中和p53反式激 活活性的直接结合相互作用而负调节p53的功能，导致p53蛋白质从核 输出，并经由遍在蛋白化-蛋白酶体途径靶向p53使其降解。由缺失、突 变或MDM2过表达而引起的p53活性丧失是人类癌症的最常见缺陷。表 达野生型p53的肿瘤易受到稳定或提高活性p53浓度的药剂的攻击。在 此背景下，已出现了对MDM2活性的抑制，作为经过验证的、用于在体 外和体内恢复p53活性并使癌细胞再次对凋亡敏感的方法。MDMX(也称为MDM4、HDM4或人双微体4)最近已被鉴定为p53的相似的负调节 剂，并且研究显示在MDM2和MDMX的p53结合界面之间具有显著的 结构同源性。也已观察到MDMX在人类肿瘤中过表达。p53-MDM2和 p53-MDMX的蛋白质-蛋白质相互作用由p53的同一个15个残基的α螺 旋反式激活域介导，所述α螺旋反式激活域插入MDM2和MDMX的表 面上的疏水性裂隙内。野生型p53的这个域内的三个残基(F19、W23和 L26)对与MDM2和MDMX的结合至关重要。

对于治疗实体瘤的方法存在相当大的需求。本文提供了能够与p53、 MDM2和/或MDMX结合并调节其活性的化合物。本文还提供了包含能 调节p53活性的基于p53的拟肽大环化合物的药物制剂。本文还提供了 包含能抑制p53、MDM2和/或MDMX蛋白之间相互作用的基于p53的 拟肽大环化合物的药物制剂。此外，本文提供了能够用于治疗包括但不 限于实体瘤和其他高增生性疾病的疾病的方法。

发明内容

在一个方面，本发明提供了治疗人类受试者中被确定为缺乏p53 灭活突变的实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受试者施用治疗有 效量的拟肽大环化合物或其药学上可接受的盐，其中该拟肽大环化合物 与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，所述拟肽大环化 合物破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者中缺乏p53 灭活突变的实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治 疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物 组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者中的在p53 基因中具有p53灭活突变的实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受 试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可 接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX 蛋白结合。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤不是p53蛋白表达阴性的(如表达野生型p53蛋白或具有部分功能性的突变 p53蛋白的实体瘤)。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达 具有功能获得突变的p53蛋白(如超级凋亡p53)。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达 具有导致功能部分丧失的突变的p53蛋白。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤中的 细胞仅从p53基因的单一基因组拷贝表达p53(例如，在细胞具有拷贝丢失突变，例如为单倍功能不全时)。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达 具有一个或多个沉默突变的p53蛋白。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤中的 细胞是p53表达阴性的。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者中的在p53 基因中具有p53灭活突变的实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受 试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可 接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX 蛋白结合，并且其中所述实体瘤中的细胞在p53基因的一个拷贝中具有p53灭活突变。在一些实施方案中，所述实体瘤中的细胞在p53基因的 第二拷贝中具有第二p53灭活突变。在一些实施方案中，所述p53基因 的一个拷贝中的p53灭活突变与p53基因的第二拷贝中的第二p53灭活 突变相同。在一些实施方案中，所述p53基因的一个拷贝中的p53灭活 突变与p53基因的第二拷贝中的第二p53灭活突变不同。

在一些实施方案中，所述p53基因中的p53灭活突变导致缺乏从 所述p53基因表达p53蛋白，或导致功能部分丧失的部分p53蛋白的表 达。在一些实施方案中，p53基因的第二拷贝中的第二p53灭活突变导 致缺乏从所述p53基因表达p53蛋白，或导致功能部分丧失的部分p53 蛋白的表达。

在本文所述方法的一些实施方案中，所述实体瘤的细胞在p53基 因的拷贝中具有至少一个突变，其中与从非突变p53基因的拷贝表达的 野生型p53相比，所述突变消除或降低从所述p53基因的拷贝表达的p53 蛋白的活性。

在另一方面，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

在一些实施方案中，在本文所述的各种方法中使用的拟肽大环化 合物为破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用的拟肽大环化合物。

在一些实施方案中，本文所述的各种方法进一步包括在施用所述 药物组合物之前确定所述实体瘤中缺乏所述p53灭活突变。在一些实施 方案中，确定缺乏p53灭活突变包括确认所述实体瘤中存在野生型p53。

在一些实施方案中，本文所述的各种方法进一步包括确定所述实 体瘤中存在p53功能获得突变。

在一些实施方案中，本文所述的各种方法进一步包括确定所述实 体瘤中存在p53的灭活突变。

在一些实施方案中，本文所述的各种方法进一步包括确定所述实 体瘤中存在p53的拷贝丢失突变。

在一些实施方案中，本文所述的各种方法进一步包括确定所述实 体瘤中存在P53的功能部分丧失突变。

在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括在施用所述拟 肽大环化合物之前确认所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。例如，确认所 述实体瘤中存在野生型p53。

在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括确认所述实体 瘤中存在p53功能获得突变。

在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括确认所述实体 瘤中存在p53的灭活突变。

在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括确认所述实体 瘤中存在p53的拷贝丢失突变。

在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括确认所述实体 瘤中存在P53的功能部分丧失突变。

在多个实施方案中，所述确定或确认在施用所述拟肽大环化合物 之前3年、2年、1年、1-12个月、1-3个月、1个月或21天内进行。

在多个实施方案中，本文提供的治疗方法可导致所述人类受试者 中p53途径的重新激活、肿瘤细胞增殖减少、p53蛋白增加、p21增加和 /或凋亡增加。

所述拟肽大环化合物可以每周施用两次或三次，例如，每周两次。 在一些实例中，所述拟肽大环化合物每2或3周施用一次。在其他实例 中，所述拟肽大环化合物每1或2周施用一次。在一些实施方案中，所 述拟肽大环化合物在28天周期的第1天、第8天和第15天施用。在其 他实例中，所述拟肽大环化合物每周施用一次。在一些实例中，所述药 物组合物的剂量在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天施用。

所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约0.5-20 mg，例如，每千克人类受试者体重0.5-10mg。在一些实施方案中，所 施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约0.04mg、0.08 mg、0.16mg、0.32mg、0.64mg、1.28mg、3.56mg、7.12mg或14.24mg。 在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重 约1.25mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽大环化 合物每周施用两次。在其他实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每 千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述 拟肽大环化合物每周施用两次。在其他实例中，所施用的拟肽大环化合 物的量为每千克人类受试者体重0.32mg、0.64mg、1.25mg、2.5mg或 5.0mg，并且所述药物组合物每周施用两次。在一些实例中，所施用的 拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约0.32mg、0.64mg、1.25 mg、2.5mg或5.0mg，并且所述药物组合物在21天周期的第1天、第 4天、第8天和第11天施用。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物 的量为每千克人类受试者体重约0.16mg、0.32mg、0.64mg、1.25mg 2.5 mg、5mg或10mg，并且所述药物组合物在28天周期的第1天、第8 天和第15天施用。

在其他实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试 者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽 大环化合物每周施用一次。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的 量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并 且所述拟肽大环化合物每周施用一次。

在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试 者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽 大环化合物每天施用一次，在七天期间施用三次、五次或七次。例如， 所述拟肽大环化合物每天静脉内施用一次，在七天期间施用七次。

在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试 者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述拟肽大环化合 物每天施用一次，在七天期间施用三次、五次或七次。例如，所述拟肽 大环化合物每天静脉内施用一次，七天期间施用七次。

所述拟肽大环化合物可在0.25-12h的时间内，例如在0.25h、0.5 h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h的时 间内逐渐施用。在一些实例中，所述拟肽大环化合物在0.25-2.0h的时 间内施用。在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物在1h的时间内逐 渐施用。在其他实施方案中，所述拟肽大环化合物在2h的时间内逐渐 施用。

本文提供的方法可导致肿瘤体积减小。例如，根据本文提供的方 法的治疗可导致肿瘤体积在治疗开始后1个月的时间内减小约95％、 90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、 35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实例中，所述治疗 导致肿瘤体积在治疗开始后1个月的时间内减小至少60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％或95％。在一些实例中，所述治疗导致肿瘤体积 在治疗开始后1年的时间内减小约95％、90％、85％、80％、75％、70％、 65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、 10％或5％。在一些实施方案中，所述治疗导致肿瘤体积在治疗开始后1 年的时间内减小至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。 在一些实例中，所述治疗导致肿瘤体积在治疗开始后6个月的时间内减 小约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、 45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实例中， 所述治疗导致肿瘤体积在治疗开始后6个月的时间内减小至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实例中，所述治疗 导致肿瘤体积在治疗开始后3个月的时间段内减小约95％、90％、85％、 80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、 25％、20％、15％、10％或5％。在一些实例中，所述治疗导致肿瘤体积 在治疗开始后3个月的时间段内减小至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，所述实体瘤是稳定的疾病。在 一些实施方案中，所述实体瘤是进行性疾病。

在一些实施方案中，本文提供的方法可导致所述人类受试者的存 活时间与如果所述人类受试者未用所述拟肽大环化合物进行治疗而预期 的人类受试者存活时间相比增加。在一些实例中，所述人类受试者的存 活时间的增加为至少30天、至少3个月、至少6个月或至少1年。

所述拟肽大环化合物的体内循环半衰期为约1h-12h，例如约1h、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h或12h。在一些实例中， 所述拟肽大环化合物的体内循环半衰期为约4h、约6h。

所述拟肽大环化合物的生物组织半衰期为约1h-12h，例如约1h、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h或12h。在一些实例中， 所述拟肽大环化合物的生物组织半衰期为约10h。

在一些实施方案中，根据本发明的方法治疗的人类受试者对所述 实体瘤的一种或多种其他治疗而言是难治性的和/或无法忍受的。在一些 实施方案中，所述人类受试者已经历至少一种不成功的既往实体瘤治疗 和/或疗法。

在一些实施方案中，所述实体瘤表达野生型p53蛋白。

通过本发明的方法治疗的实体瘤选自胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、 肝癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、 宫颈癌、胃癌、食道癌、头颈癌、黑色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、 脑肿瘤、骨癌、皮肤癌、眼肿瘤、直肠癌、绒膜癌(胎盘的肿瘤)、肉瘤 和软组织癌、睾丸癌、胆囊癌和胆管癌。在一些实施方案中，所述实体 瘤选自膀胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、CNS癌、结肠癌、眼肿瘤、肾 癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、绒膜癌(胎盘的肿瘤)、前列腺癌、肉瘤、皮 肤癌、软组织癌、胃癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌或神经内分泌癌。所述眼肿瘤可为脉络膜痣、脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移、脉络膜血管瘤、 脉络膜骨瘤、虹膜黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、黑素细胞瘤、转移性视 网膜毛细胞血管瘤、RPE先天性肥大、RPE腺瘤或视网膜母细胞瘤。在 一些实施方案中，所述实体瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌。在一些实施方 案中，所述实体瘤为乳腺癌。在一些实施方案中，所述实体瘤为胆囊癌。 在一些实施方案中，所述实体瘤为胆管癌。在一些实施方案中，所述实 体瘤为神经内分泌癌。在一些实施方案中，所述实体瘤为骨癌。在一些 实施方案中，所述实体瘤为骨肉瘤。在一些实施方案中，所述实体瘤为 皮肤癌。在一些实施方案中，所述实体瘤为黑色素瘤。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤不是HPV阳性的 癌症。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤不是HPV阳性的 宫颈癌、HPV阳性的肛门癌或HPV阳性的头颈癌，如口咽癌。

在一些实施方案中，静脉内施用所述拟肽大环化合物。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括除所述拟肽大环化 合物或其药学上可接受的盐之外还向所述人类受试者施用治疗有效量的 至少一种额外的治疗剂和/或治疗程序。

在一些实施方案中，所述人类受试者对所述治疗表现出完全响应。 在一些实施方案中，所述人类受试者对所述治疗表现出部分响应。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括确定所施用的拟肽 大环化合物的临床活性。该临床活性可通过选自计算机断层扫描(CT)、 磁共振成像(MRI)和骨扫描的成像方法来确定。

本发明的方法可进一步包括在一个或多个特定时间点从所述人类 受试者获得生物样品，并用分析程序分析该生物样品。所述生物样品可 用于生物标记评估、药代动力学评价、免疫原性测定和/或药效学评价。 所述药代动力学评价可包括研究所述生物样品中的拟肽大环化合物和/ 或其代谢物在特定时间点的水平。所述药效学评价可包括研究所述生物 样品中的p53、MDM2、MDMX、p21和/或胱天蛋白酶在特定时间点的 水平。

所述分析程序可选自血液化学分析、染色体易位分析、针吸活检、 组织活检、荧光原位杂交、实验室生物标记分析、免疫组织化学染色法、 流式细胞术，或它们的组合。所述方法可进一步包括将所述分析程序的 结果制表和/或作图。所述一个或多个特定时间点可包括在向所述人类受 试者施用所述拟肽大环化合物之前的时间点。所述一个或多个特定时间 点可包括在向所述人类受试者施用所述拟肽大环化合物之后的时间点。 所述一个或多个特定时间点可包括在向所述人类受试者施用所述拟肽大 环化合物之前的时间点和之后的时间点。所述一个或多个特定时间点包 括在向所述人类受试者施用所述拟肽大环化合物之前和之后的多个时间 点。所述方法可进一步包括比较在向所述人类受试者施用所述拟肽大环 化合物之前和之后收集的生物样品，或比较在所述多个时间点收集的生 物样品。所述生物样品可为血液样品或肿瘤样本。

本发明的方法可进一步包括在向所述人类受试者施用所述拟肽大 环化合物之前在所述人类受试者中选择并且/或者鉴别至少一处目标病 变。所述方法还可包括测量在一个或多个特定时间点的累积直径，其中 该累积直径是所述至少一处目标病变在所述特定时间点的直径之和。所 述一个或多个特定时间点可包括所述治疗后的时间点。所述方法还可包 括测量基线直径总和，其中该基线直径总和是在向所述人类受试者施用 所述药物组合物之前，所述至少一处目标病变的直径之和。在一些实例 中，根据本发明的方法的治疗导致所述至少一处目标病变消失。在一些 实施方案中，在所述治疗后，所述人类受试者的所有病态淋巴结都表现 出短轴缩短至小于10mm。在一些实例中，在所述治疗后的时间点的累 积直径比所述基线直径总和至少小30％。在一些实例中，以所述基线直 径总和为参考，所述治疗既不导致所述一个或多个特定时间点的累积直 径充分增加，也不导致其充分降低。

在一些实例中，所述拟肽大环化合物不是细胞色素p450同种型的 抑制剂。在一些实例中，所述治疗基本不导致剂量限制的血小板减少症。 在一些实例中，所述治疗基本不在正常造血器官和/或组织中产生不良反 应。在一些实例中，所述治疗基本不在所述人类受试者中产生可能、或 许或必定与所述拟肽大环化合物施用有关的不良事件。在一些实例中， 所述治疗基本不在所述人类受试者中产生可能、或许或必定与所述拟肽 大环化合物施用有关的严重不良事件。

可通过本领域已知的任何已知方法确定p53灭活突变的缺乏。在 一些实例中，可通过对编码p53蛋白的核酸进行DNA测序来确定p53 灭活突变的缺乏。在一些实例中，可通过基于RNA阵列的检测来确定 p53灭活突变的缺乏。在一些实例中，可通过RNA分析来确定p53灭活 突变的缺乏。在一些实例中，可通过聚合酶链反应(PCR)来确定p53灭 活突变的缺乏。

在一些实施方案中，所述p53灭活突变可包括在所述蛋白质的 DNA结合域中的突变。在一些实施方案中，所述p53灭活突变可包括错 义突变。在一些实施方案中，所述p53灭活突变为显性灭活突变。在一 些实施方案中，所述p53灭活突变包括选自V173L、R175H、G245C、 R248W、R249S和R273H的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述 p53灭活突变包括表1a中所示的一个或多个突变。在一些实施方案中， 所述p53功能获得突变包括表1b中所示的一个或多个突变。

在另一方面，本发明提供了治疗被确定为缺乏p53灭活突变的人 类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括在28天周期的第1天、第8 天和第15天向所述人类受试者施用每千克人类受试者体重0.5-20mg， 例如0.5-10mg的拟肽大环化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施 方案中，在第8天和/或第15天输入的所述拟肽大环化合物的量大于在 第1天输入的所述拟肽大环化合物的量。在一些实施方案中，在第8天 和/或第15天输入的所述拟肽大环化合物与在第1天输入的所述拟肽大 环化合物的量相等。在一些实施方案中，在第1天和/或第8天输入的所 述拟肽大环化合物比在第15天输入的所述拟肽大环化合物的量大。在一 些实施方案中，在第1天、第8天和第15天施用等量的所述拟肽大环化 合物。在一些实施方案中，所述28天周期重复2次或3次。

在另一方面，本发明提供了治疗人类受试者的实体瘤的方法，其 中该方法包括在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天向所述 人类受试者施用每千克人类受试者体重0.32-10mg的拟肽大环化合物或 其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述实体瘤被确定为缺乏p53 灭活突变。在一些实施方案中，在21天周期的第1天、第4天、第8 天和第11天施用每千克人类受试者体重0.32mg的所述拟肽大环化合物 或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在21天周期的第1天、第4 天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重0.64mg的所述拟肽大 环化合物或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在21天周期的第1 天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重1.25mg的所 述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在21天周 期的第1天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重2.5mg 的所述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在21 天周期的第1天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重 5.0mg的所述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

在多个实施方案中，本文所述的方法中使用的拟肽大环化合物包 含与表3、表3a、表3b和表3c任一个中的氨基酸序列具有至少约60％、 70％、80％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中该拟肽大环化合物 具有下式：

其中：

每个A、C、D和E独立地为氨基酸；

每个B独立地为氨基酸、

每个R

每个R

每个L和L’独立地为式–L

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v独立地为整数；

每个w独立地为3-1000的整数；

u为1-10的整数；

每个x、y和z独立地为0-10的整数；且

每个n独立地为1-5的整数。

在多个实施方案中，本文所述的方法中使用的拟肽大环化合物具 有下式：

其中：

Xaa

每个D和E独立地为氨基酸；

每个R

每个L或L’独立地为大环形成连接体

每个R

每个R

每个R

每个R

v为1-1000的整数；

w为0-1000的整数。

在一些实施方案中，本文所述通式中的至少一个大环形成连接体 具有式–L

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

n为1-5的整数。

在一些实施方案中，本文所述通式中的至少一个大环形成连接体， 每个w为3-1000，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10 的整数。

在一些实施方案中，Xaa5为Glu或其氨基酸类似物。

在一些实施方案中，每个E独立地为Ala(丙氨酸)、Ser(丝氨酸) 或其类似物。

在一些实施方案中，[D]v为–Leu

在一些实施方案中，w为3-10。在一些实施方案中，w为3-6。在 一些实施方案中，w为6-10。在一些实施方案中，w为6。

在一些实施方案中，v为1-10。在一些实施方案中，v为2-10。在 一些实施方案中，v为2-5。在一些实施方案中，v为2。

在一些实施方案中，本文所述通式中的每个L

在一些实施方案中，每个L

在一些实施方案中，L为亚烷基、亚烯基或亚炔基。在一些实施 方案中，L为亚烷基。在一些实施方案中，L为C3-C16亚烷基。在一些 实施方案中，L为C10-C14亚烷基。

在一些实施方案中，本文所述通式中的每个R

在一些实施方案中，本文所述通式中的x+y+z为6。

在是一些实施方案中，本文所述通式中的u为1。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含至少一个为氨基酸类似 物的氨基酸。在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物选自表3c中所示 的拟肽大环化合物。

在一个方面，本发明提供了鉴别缺乏p53灭活突变的人类受试者 中的一种或多种实体瘤生物标记的方法，其包括向所述人类受试者施用 治疗有效量的本文所述的拟肽大环化合物。在一些实例中，所述生物标 记选自p53状态、MDM2表达水平和MDMX表达水平。

在多个实施方案中，所述药物组合物包含所述拟肽大环化合物的 药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钠盐、 钾盐或钙盐。在一些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钠盐。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入 本文，其程度如同明确地且分别地指出每个单独的出版物、专利或专利 申请通过引用而并入。

附图说明

在所附的权利要求书中详细地阐述了本发明的新特征。通过参考 以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细说明和附图， 将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1.示出了人野生型P53蛋白质序列。

图2.示出了示例性剂量水平和给药方案。

图3.示出了示例性给药概述。

图4.示出了针对每个剂量水平(DL)和剂量方案所施用的Aileron 肽-1的量。

图5.示出了本发明的示例性剂量递增策略。

图6.示出了将Aileron肽-1设计用于抑制MDMX和MDM2两者 以重新激活WT p53的一种方式。

图7.示出了Aileron肽-1的潜在适应症(来自孤儿药适应症或大市 场机会)。

图8.示出了Aileron肽-1对多种不同癌症的效果。

图9.示出了在MDMX导致的MCF-7乳腺癌异种移植模型中，通 过静脉内或IV注射施用的Aileron肽-1的效果。

图10.示出了基于“3+3”剂量递增设计的剂量递增。

图11a和11b示出了对于队列在剂量水平中的(测量或预测的)药物 浓度。

图12.示出了Aileron肽-1的药代动力学模型，其示出了2房室平 行非线性Michaelis-Menten清除和线性消除。

图13.示出了MIC-1的剂量依赖性增加。

图14.表明，已完成至少两个治疗周期的患者具有稳定的疾病。 Aileron肽-1显示出稳定的发病率。

图15.表明，Aileron肽-1显示出对患者血细胞中p21和p53的中 靶活化。

具体实施方式

虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对 于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。 在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改 变和替换。应当理解，本文所述公开内容的实施方案的各种替代方案可 用于实施本发明。旨在由以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵 盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

定义

如本文所用的，术语“大环化合物”是指这样的分子：其具有包括 由至少9个共价键合的原子形成的环或环形的化学结构。

如本文所用的，术语“拟肽大环化合物”或“交联的多肽”是指包含 通过多个肽键连接的多个氨基酸残基和至少一个大环形成连接体的化合 物，所述大环形成连接体在第一天然存在的或非天然存在的氨基酸残基 (或类似物)与同一分子内的第二天然存在的或非天然存在的氨基酸残基 (或类似物)之间形成大环。拟肽大环化合物包括其中大环形成连接体将 第一氨基酸残基(或类似物)的α碳连接至第二氨基酸残基(或类似物)的α 碳的实施方案。拟肽大环化合物任选地包含处于一个或多个氨基酸残基 和/或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，且除了形成大环化合 物的任意残基外，任选地还包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基或 氨基酸类似物残基。当在拟肽大环化合物的背景下提及时，“相应的非交 联多肽”被理解为涉及与该大环化合物长度相同并且包含对应于该大环化合物的野生型序列的等同天然氨基酸的多肽。

如本文所用的，术语“螺旋稳定性”是指如通过圆二色性或NMR 测量的，拟肽大环化合物维持α-螺旋结构。例如，在一些实施方案中， 与相应的非交联的大环化合物相比，如通过圆二色性确定的，拟肽大环 化合物在α-螺旋度上表现出至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。

术语“氨基酸”是指同时含有氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包 括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体，以及通过有机合成或其 他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。本文所用的术语氨基酸包括但 不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。

术语“α-氨基酸”是指含有的氨基和羧基都结合到被指定为α-碳的 碳上的分子。

术语“β-氨基酸”是指含有均为β构型的氨基和羧基的分子。

术语“天然存在的氨基酸”是指在自然界合成的肽中通常发现的20 种氨基酸中的任一种，已知其单字母缩写为A、R、N、C、D、Q、E、 G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。

下表示出了天然氨基酸的性质一览：

“疏水性氨基酸”包括小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸。“小疏水 性氨基酸”为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。“大疏水性氨基酸” 为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似 物。“极性氨基酸”为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、 酪氨酸及其类似物。“带电荷氨基酸”为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬 氨酸、谷氨酸及其类似物。

术语“氨基酸类似物”是指在结构上类似于氨基酸并且在拟肽大环 化合物的形成中可代替氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于β-氨 基酸和其中氨基或羧基被相似反应性基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代 伯胺，或用酯取代羧基)的氨基酸。

术语“非天然氨基酸”是指并非在自然界合成的肽中通常发现的二 十种氨基酸(已知其单字母缩写为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、 L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)之一的氨基酸。非天然氨基酸或 氨基酸类似物包括但不限于根据以下的结构：

氨基酸类似物包括β-氨基酸类似物。β-氨基酸类似物的实例包括 但不限以下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(R)-β-苯丙氨酸； (R)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(R)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(R)-3-氨基 -4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2- 氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-呋喃基)- 丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(R)-3- 氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(2-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(R)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(R)-3-氨基 -4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3- 氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-甲苯基)- 丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(R)-3- 氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(R)-3-氨基 -4-(4-氯苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4- 氟苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-甲苯基)- 丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸； (R)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(R)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(R)-3- 氨基-5-己烯酸；(R)-3-氨基-5-己炔酸；(R)-3-氨基-5-苯基戊酸；(R)-3-氨 基-6-苯基-5-己烯酸；(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(S)-3-氨基-4-(1- 萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氯苯基)- 丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸； (S)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基 -4-(2-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-三氟甲 苯基)-丁酸；

(S)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(S)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸； (S)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(S)-3- 氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基 -4-(3-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-噻吩 基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-溴苯基)- 丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸； (S)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(S)-3-氨基 -4-(4-甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-吡 啶基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-五氟-苯基 丁酸；(S)-3-氨基-5-己烯酸；(S)-3-氨基-5-己炔酸；(S)-3-氨基-5-苯基戊 酸；(S)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-甲酸；1,2,5,6-四氢 吡啶-4-甲酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3- 氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧苯 基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；D-β-苯丙氨酸；β-亮 氨酸；L-β-高丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-苄酯；L-β-高谷氨酸δ-苄酯；L-β-高异亮氨酸；L-β-高亮氨酸；L-β-高甲硫氨酸；L-β-高苯丙氨酸；L-β- 高脯氨酸；L-β-高色氨酸；L-β-高缬氨酸；L-Nω-苄氧羰基-β-高赖氨酸； Nω-L-β-高精氨酸；O-苄基-L-β-高羟脯氨酸；O-苄基-L-β-高丝氨酸；O- 苄基-L-β-高苏氨酸；O-苄基-L-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-L-β-高天冬酰胺； (R)-β-苯丙氨酸；L-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；L-β-高谷氨酸δ-叔丁酯； L-Nω-β-高赖氨酸；Nδ-三苯甲基-L-β-高谷氨酰胺；Nω-2,2,4,6,7-五甲基- 二氢苯并呋喃-5-磺酰基-L-β-高精氨酸；O-叔丁基-L-β-高羟基-脯氨酸；O-叔丁基-L-β-高丝氨酸；O-叔丁基-L-β-高苏氨酸；O-叔丁基-L-β-高酪 氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。

氨基酸类似物包括丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的类似物。 丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于 以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-L-丙氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮 氨酸；β-(1-萘基)-D-丙氨酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-萘基)-D-丙氨酸； β-(2-萘基)-L-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-L-丙氨酸； β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-L-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(3-吡啶 基)-L-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-D-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-L-丙氨酸；β-氯-L- 丙氨酸；β-氰基-L-丙氨酸；β-环己基-D-丙氨酸；β-环己基-L-丙氨酸；β- 环戊烯-1-基-丙氨酸；β-环戊基-丙氨酸；β-环丙基-L-Ala-OH·二环己基铵 盐；β-叔丁基-D-丙氨酸；β-叔丁基-L-丙氨酸；γ-氨基丁酸；L-α,β-二氨 基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氢-D-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4,4,4- 三氟-缬氨酸；4,5-脱氢-L-leu-OH·二环己基铵盐；4-氟-D-苯基甘氨酸； 4-氟-L-苯基甘氨酸；4-羟基-D-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基 己酸；环戊基-D-Gly-OH·二环己基铵盐；环戊基-Gly-OH·二环己基铵盐； D-α,β-二氨基丙酸；D-α-氨基丁酸；D-α-叔丁基甘氨酸；D-(2-噻吩基)甘 氨酸；D-(3-噻吩基)甘氨酸；D-2-氨基己酸；D-2-茚满基甘氨酸；D-烯丙基甘氨酸·二环己基铵盐；D-环己基甘氨酸；D-正缬氨酸；D-苯基甘氨 酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘 氨酸；(2-甲苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基 -3-(二甲氨基)-丙酸；L-α,β-二氨基丙酸；L-α-氨基丁酸；L-α-叔丁基甘氨 酸；L-(3-噻吩基)甘氨酸；L-2-氨基-3-(二甲氨基)-丙酸；L-2-氨基己酸二 环己基-铵盐；L-2-茚满基甘氨酸；L-烯丙基甘氨酸·二环己基铵盐；L- 环己基甘氨酸；L-苯基甘氨酸；L-炔丙基甘氨酸；L-正缬氨酸；N-α-氨 基甲基-L-丙氨酸；D-α,γ-二氨基丁酸；L-α,γ-二氨基丁酸；β-环丙基-L- 丙氨酸；(N-β-(2,4-二硝基苯基))-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己-1-基)乙基)-D-α,β-二氨基丙酸；(N-β-1-(4,4-二甲基 -2,6-二氧环己-1-亚基)乙基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-4-甲基三苯甲基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-烯丙氧羰基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-γ-1-(4,4- 二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-1-(4,4-二 甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯 甲基)-D-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ-4-甲基三苯甲基)-L-α,γ-二氨基丁酸；(N-γ- 烯丙氧羰基)-L-α,γ-二氨基丁酸；D-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脱氢-L-亮氨酸； 环戊基-D-Gly-OH；环戊基-Gly-OH；D-烯丙基甘氨酸；D-环己基高丙氨 酸；L-1-芘基丙氨酸；L-2-氨基己酸；L-烯丙基甘氨酸；L-环己基高丙氨 酸；和N-(2-羟基-4-甲氧基-Bzl)-Gly-OH。

氨基酸类似物包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的 氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；L-2-氨基-3-胍基丙酸； L-2-氨基-3-脲基丙酸；L-瓜氨酸；Lys(Me)

氨基酸类似物包括天冬氨酸或谷氨酸的类似物。天冬氨酸和谷氨 酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：α-甲基-D-天冬氨酸；α-甲 基-谷氨酸；α-甲基-L-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(N-γ-乙基)-L-谷氨酰 胺；[N-α-(4-氨基苯甲酰基)]-L-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；L-α-氨基辛 二酸；D-2-氨基己二酸；D-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙 酸；L-2-氨基己二酸；苏-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-D-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-L-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；Glu(OAll)-OH；L-Asu(OtBu)-OH； 和焦谷氨酸。

氨基酸类似物包括半胱氨酸和甲硫氨酸的类似物。半胱氨酸和甲 硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于Cys(法呢基)-OH、Cys(法呢 基)-OMe、α-甲基-甲硫氨酸、Cys(2-羟乙基)-OH、Cys(3-氨丙基)-OH、 2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜胺、乙硫氨酸、甲硫 氨酸甲基锍氯化物、硒代甲硫氨酸、磺丙氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-DL- 青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-L-半胱氨酸、4-甲氧苄基-D-青霉胺、4-甲氧 苄基-L-青霉胺、4-甲基苄基-D-青霉胺、4-甲基苄基-L-青霉胺、苄基-D- 半胱氨酸、苄基-L-半胱氨酸、苄基-DL-高半胱氨酸、氨甲酰基-L-半胱 氨酸、羧乙基-L-半胱氨酸、羧甲基-L-半胱氨酸、二苯基甲基-L-半胱氨 酸、乙基-L-半胱氨酸、甲基-L-半胱氨酸、叔丁基-D-半胱氨酸、三苯甲 基-L-高半胱氨酸、三苯甲基-D-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、L-高胱氨 酸、(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、硒代-L-胱氨酸、胱硫醚、Cys(StBu)-OH 和乙酰氨甲基-D-青霉胺。

氨基酸类似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的类似物。苯丙氨酸和酪氨 酸的氨基酸类似物的实例包括β-甲基-苯丙氨酸、β-羟基苯丙氨酸、α-甲 基-3-甲氧基-DL-苯丙氨酸、α-甲基-D-苯丙氨酸、α-甲基-L-苯丙氨酸、 1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-D-苯丙氨 酸、2-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸、2-溴-D-苯丙氨酸、2-溴-L-苯丙氨酸、2- 氯-D-苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、2-氰基-D-苯丙氨酸、2-氰基-L-苯丙 氨酸、2-氟-D-苯丙氨酸、2-氟-L-苯丙氨酸、2-甲基-D-苯丙氨酸、2-甲基 -L-苯丙氨酸、2-硝基-D-苯丙氨酸、2-硝基-L-苯丙氨酸、2,4,5-三羟基- 苯丙氨酸、3,4,5-三氟-D-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-L-苯丙氨酸、3,4-二氯-D- 苯丙氨酸、3,4-二氯-L-苯丙氨酸、3,4-二氟-D-苯丙氨酸、3,4-二氟-L-苯 丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸、3,5,3’-三碘 -L-甲状腺原氨酸、3,5-二碘-D-酪氨酸、3,5-二碘-L-酪氨酸、3,5-二碘-L- 甲状腺原氨酸、3-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-L-苯丙氨酸、 3-氨基-L-酪氨酸、3-溴-D-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、3-氯-D-苯丙氨 酸、3-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-酪氨酸、3-氰基-D-苯丙氨酸、3-氰基-L- 苯丙氨酸、3-氟-D-苯丙氨酸、3-氟-L-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-D- 苯丙氨酸、3-碘-L-苯丙氨酸、3-碘-L-酪氨酸、3-甲氧基-L-酪氨酸、3-甲基-D-苯丙氨酸、3-甲基-L-苯丙氨酸、3-硝基-D-苯丙氨酸、3-硝基-L-苯 丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、4-(三氟甲基)-D-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-L- 苯丙氨酸、4-氨基-D-苯丙氨酸、4-氨基-L-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-D-苯 丙氨酸、4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、4-双(2-氯乙基)氨基-L-苯丙氨酸、4- 溴-D-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、4-氯-D-苯丙氨酸、4-氯-L-苯丙氨酸、 4-氰基-D-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、4-氟-D-苯丙氨酸、4-氟-L-苯 丙氨酸、4-碘-D-苯丙氨酸、4-碘-L-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲状腺氨酸、 3,3-二苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、乙基-酪氨酸和甲基-酪氨酸。

氨基酸类似物包括脯氨酸的类似物。脯氨酸的氨基酸类似物的实 例包括但不限于3,4-脱氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺-4-羟基-脯氨酸、噻 唑烷-2-甲酸和反-4-氟-脯氨酸。

氨基酸类似物包括丝氨酸和苏氨酸的类似物。丝氨酸和苏氨酸的 氨基酸类似物的实例包括但不限于3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3- 羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧丁酸、2-氨基-3-甲氧丁酸、4-氨基-3-羟 基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧丙酸、2-氨基-3-苄氧丙酸、2-氨基-3-乙氧 丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸和α-甲基丝氨酸。

氨基酸类似物包括色氨酸的类似物。色氨酸的氨基酸类似物的实 例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-D-丙氨酸；β-(3- 苯并噻吩基)-L-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨 酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-L- 色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-L-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴- 色氨酸；6-氯-D-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸； 7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；D-1,2,3,4-四氢-去甲哈 尔满-3-甲酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-1-甲酸；7-氮杂色氨酸； L-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-甲酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-L- 色氨酸。

在一些实施方案中，氨基酸类似物是外消旋的。在一些实施方案 中，使用氨基酸类似物的D型异构体。在一些实施方案中，使用氨基酸 类似物的L型异构体。在其他实施方案中，氨基酸类似物包含为R或S 构型的手性中心。在又一些其他实施方案中，β-氨基酸类似物的氨基基 团被诸如叔丁氧羰基(BOC基团)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、甲苯磺酰基等 保护基团取代。在一些其他实施方案中，β-氨基酸类似物的羧酸官能团 例如作为其酯衍生物被保护。在一些实施方案中，使用氨基酸类似物的 盐。

“非必需”氨基酸残基是相对于多肽的野生型序列可能发生改变而 不消除或基本不改变其基本生物学或生物化学活性(例如，受体结合或激 活)的残基。“必需”氨基酸残基是当相对于多肽的野生型序列发生改变时 导致多肽的基本生物学或生物化学活性消除或基本消除的残基。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残 基所替代的氨基酸置换。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基 的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有 酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例 如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、 L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，T、V、I)和 具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，多肽中预测的 非必需氨基酸残基例如被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所替代。 可接受的置换的其他例子是基于电子等排考虑(例如，正亮氨酸取代甲硫 氨酸)或其他性质(如2-噻吩丙氨酸取代苯丙氨酸，或6-Cl-色氨酸取代色 氨酸)的置换。

术语“封端基团”是指出现在本发明拟肽大环化合物的多肽链的羧 基末端或氨基末端的化学部分。羧基末端的封端基团包括未修饰的羧酸 (即-COOH)或具有取代基的羧酸。例如，羧基末端可被氨基取代，从而 在C末端产生羧酰胺。各种取代基包括但不限于伯胺和仲胺，仲胺包括 聚乙二醇化的仲胺。用于C末端的代表性的仲胺封端基团包括：

氨基末端的封端基团包括未修饰的胺(即-NH

在本文中与大环化合物或大环形成连接体一起使用的术语“元”是 指形成或可以形成大环的原子，并且不包括取代基或侧链原子。以此类 推，环癸烷、1,2-二氟-癸烷和1,3-二甲基环癸烷都被认为是十元大环化 合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链都没有参与形成大环。

当用作分子结构的一部分时，符号“

术语“氨基酸侧链”是指连接到氨基酸中的α-碳(或另一个骨架原 子)上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧 链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链 是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其他非 天然存在的氨基酸侧链，例如，自然产生的氨基酸侧链(例如，氨基酸代 谢物)或合成制备的氨基酸侧链(例如，α,α-二取代的氨基酸)。

术语“α,α-二取代的氨基酸”是指包含的氨基和羧基都结合到碳(α- 碳)上而该碳(α-碳)连接到两个天然或非天然氨基酸侧链上的分子或部分。

术语“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)连接的两个或更多个天 然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全 加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段 或合成的多肽片段)。

术语“第一C-末端氨基酸”是指最靠近C-末端的氨基酸。术语“第 二C-末端氨基酸”是指连接在第一C-末端氨基酸的N末端处的氨基酸。

本文所用的术语“大环化试剂”或“大环形成试剂”是指任何可以用 来通过介导两个反应性基团之间的反应而制备拟肽大环化合物的试剂。 该反应性基团可以是，例如，叠氮和炔，在这种情况下，大环化试剂包 括但不限于Cu试剂，如提供反应性Cu(I)物质的试剂，如CuBr、CuI或 CuOTf，以及通过加入诸如抗坏血酸或抗坏血酸钠的还原剂可以原位转化为活性Cu(I)试剂的Cu(II)盐，如Cu(CO

术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘或其基团。

术语“烷基”是指含有指定数目的碳原子的直链或支链烃链。例如， C

术语“亚烷基”是指二价烷基(即，-R-)。

术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃链。烯 基部分含有指定数目的碳原子。例如，C

术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳叁键的直链或支链烃链。炔 基部分含有指定数目的碳原子。例如，C

术语“芳基”是指6碳单环或10碳双环的芳香环系，其中各环的0、 1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。术 语“芳基烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基。

“芳基烷基(arylalkyl)”是指其中芳基的氢原子中的一个被如上定义 的C

“芳基酰胺基(arylamido)”是指其中芳基的氢原子中的一个被一个 或多个-C(O)NH

“烷基杂芳基(alkylheterocycle)”是指其中C

“烷基酰胺基(alkylamido)”是指其中C

“烷醇(alkanol)”是指其中C

“烷基羧基(alkylcarboxy)”是指其中C

本文使用的术语“环烷基”包括具有3-12个碳、优选3-8个碳、更 优选3-6个碳的饱和的和部分不饱和的环烃基团，其中环烷基另外任选 地被取代。一些环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊 烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。

术语“杂芳基”是指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三 环的环系，其如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6 个杂原子，或者如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、 N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2、3或4个原子被取代 基取代。杂芳基的例子包括吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、 苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基(thiophenyl或thienyl)、喹啉基(quinolinyl)、 吲哚基、噻唑基等。

术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。 术语“杂芳基烷氧基”是指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。 术语“杂芳基烷氧基”是指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂环基”是指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14 元三环的环系，其如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有 1-6个杂原子，或者如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、 N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或 1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2或3个原子被取代基 取代。杂环基的例子包括哌嗪基、吡咯烷基、二氧杂环己基、吗啉基、 四氢呋喃基等。

术语“取代基”是指取代任何分子、化合物或部分上的第二原子或 基团如氢原子的基团。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、巯基、 氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代 烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、链烷磺酰基、烷基 羰基和氰基。

在一些实施方案中，本文公开的化合物包含一个或多个不对称中 心，因而作为外消旋体或外消旋混合物、单一对映异构体、单独的非对 映异构体和非对映体混合物存在。除非另外明确地指出，包括这些化合 物的所有这样的异构体形式。在一些实施方案中，本文公开的化合物也 呈现为多种互变异构形式，在这些情况下，所述化合物包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，如果环系的烷基化作用导致在多个位置 发生烷基化，那么本发明包括所有这些反应产物)。除非另外明确地指出， 包括这些化合物的所有这些异构体形式。除非另外明确地指出，包括本 文所述化合物的所有晶形。

如本文所用的，术语“增加”和“减少”分别意味着导致至少5％的统 计学显著的(即，p<0.1)增加或减少。

如本文所用的，提及变量的数值范围旨在表示变量等于该范围内 的任意值。因此，对于本身不连续的变量，该变量等于该数值范围内的 任意整数值，包括该范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，该变 量等于该数值范围内的任意实值，包括该范围的端点。作为例子，而不 是限制，如果变量本身是不连续的，描述为具有0-2之间的值的变量取 0、1或2的值；而如果变量本身是连续的，则取0.0、0.1、0.01、0.001 的值或≥0且≤2的其他任何实值。

如本文所用的，除非另外特别指出，单词“或”以“和/或”的包含性 含义使用，而非“任一/或”的排它性的含义。

术语“平均”表示对于每个数据点通过进行至少3次独立的重复而 获得的平均值。

术语“生物活性”包括大环化合物的结构和功能性质。生物活性是， 例如，结构稳定性、α-螺旋性、对靶标的亲和性、对蛋白水解降解的抗 性、细胞透性、细胞内稳定性、体内稳定性或其任意组合。

术语“结合亲和力”是指结合相互作用的强度，例如拟肽大环化合 物与靶标之间的结合相互作用的强度。结合亲和力可以表示为，例如， 平衡解离常数(“K

术语“体外效力”是指测试化合物如拟肽大环化合物在体外测试系 统或试验中产生有益结果的程度。例如，体外效力可以测量为“IC

术语“体外效力之比”或“体外效力比”是指来自第一试验(分子)与 来自第二试验(分母)的IC

如本文所用的，术语“实体瘤”或“实体癌”是指通常不含有囊肿或 液体区域的肿瘤。如本文所用的实体瘤包括肉瘤、癌和淋巴瘤。在多个 实施方案中，白血病(血液癌症)不是实体瘤。

如本文所用的术语“不良事件”(AE)包括由临床研究的任何阶段发 生的身体体征、症状和/或实验室变化所指示的，任何有害的、病理的或 非有意的解剖学、生理学或代谢功能的变化，不论其是否与研究药物的 施用在时间上相关，并且不论其是否被认为与研究药物有关。该定义包 括先前存在的医学状况或事件的加重、并发疾病、超敏反应、药物相互 作用或临床上有意义的实验室检查结果。AE不包括以下各项：(i)医学 或手术程序，例如，拔牙、输血、手术(导致该程序的医学状况将被记录 为AE)；(ii)在研究开始时存在或检测到且没有恶化的先前存在的状况或 程序；(iii)因选择性手术或其中未发生不利医学事件的其他情况而住院； (iv)异常的实验室值，除非研究人员认为它在临床上有意义，需要干预， 或导致研究药物的延迟、中止或剂量变化；(v)未伴有体征/症状的研究药 物或伴随用药的给药过量；如果出现体征/症状，则最终诊断应被记录为 AE；(vi)妊娠，除非妊娠期间发生导致住院的并发症；在这种情况下， 导致住院的医学状况将被记录为AE；以及(vii)作为此研究中的效力参数 而收集、因此不记录为AE的所研究的疾病的显著恶化。

如本文所用的术语严重不良事件(SAE)是指导致以下任一种结果 的不良事件：(i)死亡；(ii)危及生命的不良体验(即，事件发生时存在因其 而死亡的直接风险；这不包括在以更严重的形式发生时可能导致死亡的 不良事件)；(iii)持续或重大的残疾/失能；(iv)住院或现有住院延长；以 及(v)先天性异常/出生缺陷。在根据医学判断可能危及患者或可能需要医 疗或外科手术来防止该定义中所列出的一种结果时，可能不会导致死亡、危及生命或需要住院的重要医疗事件可被视为严重的。因潜在疾病而住 院将不会被报告为SAE，除非有理由怀疑与研究药物有因果关系。

如果AE或疑似不良反应没有在拟肽大环化合物研究者手册中列 出或没有以已观察到的特异性或严重性列出；或者与方案或其他地方描 述的风险信息不一致，则其被视为“非预期的”(被称为非预期的不良事件 (UAE))。例如，在该定义下，如果研究者手册仅提到肝酶升高或肝炎， 则肝坏死将是非预期的(由于严重性更高)。类似地，如果研究者的手册仅列出脑血管意外，则脑血栓栓塞和脑血管炎将是非预期的(由于特异性 更高)。该定义中使用的“非预期的”还指在研究者手册中提到伴随一类药 物发生，或从拟肽大环化合物的药理学性质可以预期，但没有具体提及 伴随该拟肽大环化合物发生的AE或疑似不良反应。

如本文所用的，“剂量限制毒性”(DLT)被定义为据认为可能、或许 或必定与研究药物有关的任何≥3级的AE，以下情况除外：(1)对于恶心、 呕吐、腹泻、皮疹或粘膜炎，只有在48小时内不对标准支持性/药理治 疗发生响应的≥3级的AE才被视为DLT；(2)对于电解质失衡，只有在 24小时内不对纠正发生响应的≥3级的AE才被视为DLT。此外，具体的 血液学DLT被定义为：

(i)血小板减少—任意持续时间的4级，3级持续≥7天，或伴有临床上有 意义的出血的3级

(ii)中性粒细胞减少—4级持续≥3天，或任何≥3级的发热性中性粒细胞 减少

上述标准可用于在整个试验过程中对剂量减少、中断或中止进行 单独的患者评定，但在第1周期发生的DLT将用于告知剂量递增决定的 安全性和耐受性评价。

如本文所用的“最大耐受剂量”(MTD)被定义为6名患者中≤1名患 者经历符合DLT的治疗相关毒性并且下一更高剂量使至多6名患者中≥2 名患者经历DLT的剂量。在加入队列中的所有患者完成第1周期、中止 治疗或减少剂量之前不能建立MTD。如果在之后的周期中观察到DLT， 则将重新评价之前建立的剂量水平的耐受性。

如本文所用的“可测量疾病”(MD)由至少一个可测量病变的存在来 定义。

可测量病变被定义为可以在至少一个维度[待记录的测量平面中 的最长直径(LD)]上准确测量的那些病变，其中通过CT扫描测量的最小 大小为10mm(CT扫描切片厚度不超过5mm)，通过临床检查卡尺测量 的最小大小为10mm(可将不能用卡尺准确测量的病变记录为不可测量 的)，或通过胸部X光检查测量的最小大小为20mm。

如果通过CT扫描(CT扫描切片厚度不超过5mm)评估的淋巴结短 轴为≥15mm，则“恶性淋巴结”将被视为病理学增大并且可测量的。

如本文所用的“不可测量的疾病”包括不可测量的所有其他病变 (或疾病部位)，包括被视为不可测量疾病的小病变(最长直径<10mm或 具有≥10至<15mm的短轴的病变淋巴结)。被视为真正不可测量的病变 包括：通过体检鉴别、未随后进行CT或MRI的软脑膜疾病、腹水、胸 膜/心包积液、皮肤/肺淋巴管炎、炎症性乳腺疾病、腹部肿块/腹部脏器 肿大。

如本文所用的“目标病变”包括所有可测量的病变，每个器官最多 有多达两处病变且合计五处病变，代表被鉴别为目标病变并且在基线处 进行记录和测量的所有受累器官。目标病变的选择可基于其大小(具有最 长直径的病变)以及其用于准确重复测量(通过成像技术或临床地)的适宜 性。可以计算所有目标病变的直径(非结节病变的最长直径，结节病变的 短轴)之和，并将其报告为基线直径总和。该基线直径总和可用作表征目 标肿瘤响应的参考。

如本文所用的“非目标病变”包括包含不是目标病变的病变淋巴结 的所有其他病变(或疾病部位)。可将非目标的病变鉴别为非目标病变， 并也可在基线对其进行记录。可能不需要测量这些病变，并且可将这些 病变归为“存在”、“不存在”，或在罕见情况下的“明确进展”。此外，可 以能够将涉及同一器官的多个非目标病变在病例报告表格上记录为单个 项目(例如，“多个增大的骨盆淋巴结”或“多个肝转移”)。

如本文所用的“完全响应”(CR)被定义为所有目标病变消失。任何 病变淋巴结(无论是目标的还是非目标的)的短轴必须缩短至<10mm。

如本文所用的“部分响应(PR)”被定义为以基线直径总和为参考， 目标病变的直径总和至少减少30％。

如本文所用的“进行性疾病(PD)”被定义为以研究的最小总和(如果 基线总和是最小的，则这包括基线总和)为参考，目标病变的直径总和至 少增加20％。除了20％的相对增加之外，该总和还必须显示出至少5mm 的绝对增加。一个或多个新病变的出现也可被视为进展。

如本文所用的“稳定的疾病”(SD)被定义为以研究中的最小直径总 和为参考，没有出现符合PR的充分缩小也没有出现符合PD的充分增加 的情况。

术语“受试者”或“患者”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的 实例包括但不限于人；非人类灵长类动物，如黑猩猩，及其他猿类和猴 物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔子、狗 和猫；实验动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。非哺乳 动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本文提供的方法和组合物的一个 实施方案中，所述哺乳动物为人。

术语“单倍功能不全”指当二倍体生物体只有基因的单一功能拷贝 (另一拷贝由于突变而失活)并且该单一功能拷贝不产生足够的基因产物 (通常是蛋白质)以实现野生型条件从而导致异常或疾病状态时发生的状 况。

如本文所用的术语“沉默突变”是基因编码区中的一种突变类型， 其实际上并未改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。

在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个具体实施方案 的细节。从说明书、附图和权利要求书可以明显看出本发明的其他特征、 目的和优势。

概述

在一个方面，本发明提供了治疗受试者的实体瘤的方法。例如， 本文公开的方法可用于治疗非p53阴性的实体瘤。在一些情况下，本文 公开的方法可用于治疗已被确定为缺乏p53灭活突变的实体瘤。本发明 的方法还可用于治疗表达功能获得突变p53，即超级凋亡p53的实体瘤。 在其他实例中，本发明的方法在治疗实体瘤中是有用的，其中该实体瘤表达具有功能部分丧失突变的p53，具有拷贝丢失突变的p53，或具有一 个或多个沉默突变的p53。在一些实例中，该实体瘤表达具有拷贝丢失 突变和灭活突变的p53。

所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或 治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合 物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，该拟肽大环化 合物破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。

在另一方面，本发明提供了治疗受试者的表达野生型p53的实体 瘤的方法。该方法包括向受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物 或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化 合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，该拟肽大环 化合物破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。

在一些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者为人。在 一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的受试者是已被诊断或被诊 断为患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的人。在 一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是易 发或易患缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的人。在 一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是处 于发展出缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的风险中 的人。在一些实例中，p53灭活突变可为p53蛋白的DNA结合域中的突 变。在一些实例中，p53灭活突变可为错义突变。在多个实施方案中， 所述实体瘤可被确定为缺乏选自在残基R175、G245、R248、R249、R273 和R282中的一个或多个处的突变的一个或多个p53灭活突变。实体瘤 中p53灭活突变的缺乏和/或野生型p53的存在可通过本领域已知的任何 合适的方法来确定，例如通过测序、基于阵列的检测、RNA分析和扩增 方法如PCR。

在某些实施方案中，所述人类受试者对本领域已知的实体瘤的一 种或多种其他标准治疗而言是难治性的和/或无法忍受的。在一些实施方 案中，所述人类受试者已经历至少一次不成功的既往实体瘤治疗和/或疗 法。

在一些实施方案中，根据本发明的方法治疗的受试者是已被诊断 或被诊断为患有非p53阴性的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本 发明的方法治疗的受试者是已被诊断或被诊断为患有表达功能获得突变 体p53，即超级凋亡p53的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本发 明的方法治疗的受试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有功能部分丧 失突变的p53的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法 治疗的受试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有拷贝丢失突变的p53 的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的受试者 是已被诊断或被诊断为患有表达具有一个或多个沉默突变的p53的实体 瘤的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的受试者是已被 诊断或被诊断为患有表达具有拷贝丢失突变和灭活突变的p53的实体瘤 的人。

在一些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法抑制、减 小、缩小、阻止或稳定与该实体瘤相关的肿瘤。在一些实施方案中，本 文提供的用于治疗实体瘤的方法抑制、减小、缩小、阻止或稳定与该实 体瘤或其一种或多种症状相关的肿瘤中的血液流动、代谢或水肿。在一 些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法导致肿瘤、肿瘤血流、肿瘤代谢或肿瘤周围水肿以及/或者与该实体瘤相关的一种或多种症状 的消退。在一些实施方案中，如通过本领域技术人员可用的常规方法如 超声、CT扫描、MRI、动态造影增强MRI或PET扫描所测量的，本文 提供的用于治疗实体瘤的方法保持该肿瘤的大小，使其不增加，或使其 增加得比施用标准疗法后的肿瘤增加少。在特定实施方案中，本文提供 的用于治疗实体瘤的方法使肿瘤大小减小。在一些实施方案中，本文提 供的用于治疗实体瘤的方法使肿瘤形成减少。在某些实施方案中，本文 提供的用于治疗实体瘤的方法根除、去除或控制与该实体瘤相关的原发 性肿瘤、区域性肿瘤和/或转移性肿瘤。在一些实施方案中，本文提供的 用于治疗实体瘤的方法减少与该实体瘤相关的转移的次数或大小。在一 些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法导致对该治疗的完全 响应。在一些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法导致对该 治疗的部分响应。在一些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的实体 瘤是稳定的疾病。在一些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的实体 瘤是进行性疾病。

可通过本文提供的方法治疗的实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、癌 和淋巴瘤。在特定实施方案中，可根据所述方法治疗的实体瘤包括但不 限于乳房、肝、神经母细胞瘤、头、颈、眼睛、口腔、咽喉、食道、食 管、胸部、骨、肺、肾、结肠、直肠或其他胃肠道器官、胃、脾、骨骼 肌、皮下组织、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸或其他生殖器官、皮肤、甲 状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰腺以及脑或中枢神经系统的癌症。

所述拟肽大环化合物可为任何交联的肽，即，包含在第一氨基酸 残基(或类似物)与第二氨基酸残基之间形成大环的至少一个大环形成连 接体的任何肽。例如，所述拟肽大环化合物可为能够与MDM2和/或 MDMX蛋白结合的拟肽大环化合物。在一些实施方案中，所述拟肽大环 可为式I的拟肽大环化合物：

其中：

Xaa

每个D和E独立地为氨基酸；

每个R

每个L或L’独立地为大环形成连接体

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v为1-1000，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20 或1-10的整数；且

每个w为0-1000，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20 或1-10的整数。

包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接 受的盐的药物组合物的施用可通过任何合适的手段实现。例如，该药物 组合物可肠胃外施用。例如，施用可以是静脉内施用、动脉内施用、骨 内输注、肌肉内施用、脑内施用、脑室内施用、鞘内施用或皮下施用。 在一些实施方案中，进行静脉内施用。

在一些实施方案中，本文公开的方法另外或任选地包括对本发明 的包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的 盐的药物组合物在患有被确定为缺乏p53灭活突变的实体瘤或患有表达 野生型(WT)p53蛋白的实体瘤的受试者中的安全性和/或耐受性进行评 价。

本文还提供了用于确定本文公开的拟肽大环化合物在患有被确定 为缺乏p53灭活突变的实体瘤或患有表达野生型(WT)p53蛋白的实体瘤 的受试者中的剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)的方法。

在一些实施方案中，本文公开的方法另外或任选地包括在向受试 者单次和/或多次施用拟肽大环化合物后，对血液中的所述拟肽大环化合 物和/或其代谢物进行药代动力学(PK)分析。

在一些实施方案中，本文公开的方法另外或任选地包括研究所述 拟肽大环化合物对肿瘤活检样品(例如，p21、胱天蛋白酶、MDM2)和血 液样品(例如，巨噬细胞抑制细胞因子-1[MIC-1])中的药效学生物标记的 影响，以及评估这些生物标记与临床响应之间的关系。

在一些实施方案中，本文公开的方法另外或任选地包括用于评估 潜在的患者生物标记(例如，p53状态、MDM2和MDMX表达水平)、拟 肽大环化合物治疗对这些生物标记的影响，以及这些生物标记与拟肽大 环化合物的临床响应之间可能的关系的步骤。

本文还提供了用于评价拟肽大环化合物在剂量扩充阶段于具有缺 乏p53灭活突变并且/或者表达WT p53的特定肿瘤类型的受试者中的临 床活性的方法。

化合物和组合物

拟肽大环化合物

在一些实施方案中，拟肽大环化合物具有式(I)：

式I

其中：

每个A、C和D独立地为氨基酸；

每个B独立地为氨基酸、

每个E独立地为选自Ala(丙氨酸)、D–Ala(D–丙氨酸)、Aib(α–氨 基异丁酸)、Sar(N–甲基甘氨酸)和Ser(丝氨酸)的氨基酸；

每个R

每个R

每个L和L’独立地为大环形成连接体；

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v独立地为整数；

每个w独立地为3-1000的整数；

u为1-10的整数；

每个x、y和z独立地为0-10的整数；且

每个n独立地为1-5的整数。

在一些实施方案中，每个v和w独立地为1-30的整数。在一些实 施方案中，w为3-1000，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20 或3-10的整数。在一些实施方案中，x+y+z之和为3或6。在一些实施 方案中，x+y+z之和为3。在其他实施方案中，x+y+z之和为6。

在一些实施方案中，还提供了下式的拟肽大环化合物：

其中：

Xaa

每个D和E独立地为氨基酸；

每个R

每个L或L’独立地为大环形成连接体；

每个R

每个R

每个R

每个R

v为1-1000，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10 的整数；且

w为3-1000，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10 的整数。

在一些实施方案中，每个v和w独立地为1-30的整数。在一些实 施方案中，w为3-1000，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20 或3-10的整数。在一些实施方案中，x+y+z之和为3或6。在一些实施 方案中，x+y+z之和为3。在其他实施方案中，x+y+z之和为6。

在本文所述任何通式的一些实施方案中，Xaa

在一些实施方案中，拟肽大环化合物具有下式：

其中：

Xaa

每个D独立地为氨基酸；

每个E独立地为氨基酸，例如选自Ala(丙氨酸)、D-Ala(D-丙氨酸)、 Aib(α-氨基异丁酸)、Sar(N-甲基甘氨酸)和Ser(丝氨酸)的氨基酸；

每个R

每个L或L’独立地为大环形成连接体；

每个R

每个R

每个R

每个R

v为1-1000，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10 的整数；

w为3-1000，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10 的整数；且。

在上述通式的一些实施方案中，Xaa

在一些实施方案中，w为3-10，例如3-6、3-8、6-8或6-10的整 数。在一些实施方案中，w为3。在其他实施方案中，w为6。在一些实 施方案中，v为1-10，例如2-5的整数。在一些实施方案中，v为2。

在一个实施方案中，式(I)拟肽大环化合物具有式(Ic)：

其中：

每个A、C、D和E独立地为天然或非天然氨基酸；

每个B独立地为天然或非天然氨基酸、氨基酸类似物、

每个L独立地为大环形成连接体；

每个L’独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、 亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基，它们各自任选地被R

每个L”独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、 亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基，它们各自任选地被R

每个R

每个R

R

每个L

每个R

每个K为O、S、SO、SO

每个n为1-5的整数；

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v和w独立地为1-1000，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-40、 1-25、1-20、1-15或1-10的整数；且

每个u、x、y和z独立地为0-10的整数。

在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物具有式(I):

其中：

每个A、C、D和E独立地为天然或非天然氨基酸；

每个B独立地为天然或非天然氨基酸、氨基酸类似物、

每个R

每个R

每个L独立地为下式的大环形成连接体

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v和w独立地为1-1000的整数；

每个u、x、y和z独立地为0-10的整数；且

n为1-5的整数。

在本文所述任何通式的实施方案中，所述大环形成连接体(L)具有 式–L

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

n为1-5的整数。

在本文所述任何通式的一些实施方案中，L(或L’)为下式的大环形 成连接体

以下示出这类大环形成连接体L的示例性实施方案。

在本文所述任何通式的实施方案中，L

在本文所述任何通式的实施方案中，L

在一个实例中，R

在一些实施方案中，x+y+z至少为3。在其他实施方案中，x+y+z 为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，x+y+z之和 为3或6。在一些实施方案中，x+y+z之和为3。在其他实施方案中，x+y+z 之和为6。大环化合物或大环化合物前体中每次出现的A、B、C、D或 E独立地选择。例如，由式[A]

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构且 R

在其他实施方案中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方案中，选择从第一Cα到第二Cα测量的大环形成连 接体L的长度，以稳定希望的二级肽结构，例如由拟肽大环化合物的残 基(包括但不是必须限于第一Cα到第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

在一个实施方案中，式(I)拟肽大环化合物为：

其中每个R

在相关实施方案中，式(I)拟肽大环化合物为：

其中每个R

在其他实施方案中，式(I)拟肽大环化合物为以下所示的任何通式 的化合物：

其中“AA”表示任何天然或非天然氨基酸侧链，且

以下示出了大环形成连接体L的示例性实施方案。

在其他实施方案中，为了促进细胞摄取，进一步修饰式I化合物 中的D和/或E。在一些实施方案中，将拟肽大环化合物脂质化(lipidating) 或PEG化有利于细胞摄取、提高生物利用度、增强血液循环、改变药代 动力学、降低免疫原性和/或降低所需的给药频率。。

在其他实施方案中，式I化合物中的[D]和[E]中的至少一个代表包 含另外的大环形成连接体的部分，使得该拟肽大环化合物包含至少两个 大环形成连接体。在特定实施方案中，拟肽大环化合物包含两个大环形 成连接体。在一个实施方案中，u为2。

在一些实施方案中，本文所述的任何大环形成连接体可以与表3、 表3a、表3b或表3c中所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文所 述的任何R–取代基任意组合使用。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含至少一个α-螺旋基序。 例如，式I化合物中的A、B和/或C包含一个或多个α-螺旋。一般来说， α-螺旋每圈包含3至4个氨基酸残基。在一些实施方案中，拟肽大环化 合物的α-螺旋包括1至5圈，因此包含3至20个氨基酸残基。在特定 实施方案中，α-螺旋包括1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些实施方 案中，大环形成连接体稳定化在拟肽大环化合物内包含的α-螺旋基序。 因此，在一些实施方案中，选择大环形成连接体L从第一Cα到第二Cα 的长度，以提高α-螺旋的稳定性。在一些实施方案中，大环形成连接体 跨越α-螺旋的1圈至5圈。在一些实施方案中，大环形成连接体跨越α- 螺旋的大约1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些实施方案中，大环形 成连接体的长度为每圈α-螺旋大约

在其他实施方案中，提供了式(IV)或(IVa)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E独立地为天然或非天然氨基酸，并且末端D和E独 立地任选地包括封端基团；

每个B为天然或非天然氨基酸、氨基酸类似物、

每个R

每个R

每个L为式–L

每个L

每个R

每个K为O、S、SO、SO

每个R

每个R

每个R

每个v和w独立地为1-1000的整数；

u为1-10的整数；

每个x、y和z独立地为0-10的整数；且

每个n为1-5的整数。

在一个实例中，L

在一个实例中，R

在一些实施方案中，x+y+z之和至少为1。在其他实施方案中， x+y+z之和至少为2。在其他实施方案中，x+y+z之和为1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10。大环化合物或大环化合物前体中每次出现的A、B、 C、D或E独立地选择。例如，由式[A]

在一些实施方案中，拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构且 R

在其他实施方案中，选择从第一Cα到第二Cα测量的大环形成连 接体L的长度，以稳定希望的二级肽结构，例如由拟肽大环化合物的残 基(包括但不是必须限于第一Cα到第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

以下示出了大环形成连接体-L

除非另有说明，否则任何化合物(包括拟肽大环化合物、大环化合 物前体和其他组合物)也意在包括仅在是否存在一个或多个同位素富集 的原子方面不同的化合物。例如，除了用氘或氚替代氢或者用

在一些实施方案中，本文公开的化合物可以在构成此类化合物的 一个或多个原子处含有非自然比例的原子同位素。例如，该化合物可以 用诸如例如氚(

所述拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可为约1-24h。例 如，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可为约2-24h、4-24h、6-24h、8-24h、10-24h、12-24h、14-24h、16-24h、18-24h、20-24h、 22-24h、1-20h、4-20h、6-20h、8-20h、10-20h、12-20h、14-20h、 16-20h、18-20h、1-16h、4-16h、6-16h、8-16h、10-16h、12-16h、 14-16h、1-12h、4-12h、6-12h、8-12h、10-12h、1-8h、4-8h、6-8h 或1-4h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可 为约1-12h，例如约1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、 11h或12h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰 期为约2h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期 为约4h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为 约6h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为约 8h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为约10 h。

该拟肽大环化合物在生物组织中的半衰期可为约1-24h。例如， 该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可为约1-24h、5-24h、10-24 h、15-24h、20-24h、1-22h、5-22h、10-22h、15-22h、20-22h、1-20 h、5-20h、15-20h、1-18h、5-18h、10-18h、15-18h、1-16h、5-16h、 10-16h、15-16h、1-14h、5-14h、10-14h、1-12h、5-12h、10-12h、 1-10h、5-10h、1-8h、5-8h、1-6h、5-6h或1-4h。在一些实例中，该 拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可为约5-20h，例如约5h、6h、 7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、 19h或20h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰 期为约2h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期 为约4h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为 约6h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为约8h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期为约10 h。

该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期可大于、等于或小于 该拟肽大环化合物在生物组织中的半衰期。在一些实例中，该拟肽大环 化合物在人血液中的循环半衰期可大于该拟肽大环化合物在生物组织中 的半衰期。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期 可等于该拟肽大环化合物在生物组织中的半衰期。在一些实例中，该拟 肽大环化合物在生物组织中的半衰期大于该拟肽大环化合物在人血液中 的循环半衰期。这可以促进该拟肽大环化合物以较低的剂量和/或较低的 频率给药。在一些实施方案中，该拟肽大环化合物在生物组织中的半衰 期比该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期长至少1h、2h、3h、4 h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h。在一些实例中，该拟肽 大环化合物在人血液中的循环半衰期为约4h，且在生物组织中的半衰期 为约10h。在一些实例中，该拟肽大环化合物在人血液中的循环半衰期 为约6h，且在生物组织中的半衰期为约10h。

拟肽大环化合物的制备

拟肽大环化合物可以通过本领域已知的众多方法中的任意方法来 制备。例如，在表3、表3a、表3b或表3c中由“$”或“$r8”表示的任何残 基可以被替换为能够与同一分子中的第二残基形成交联体的残基或这样 的残基的前体。

各种实现拟肽大环化合物的形成的方法是本领域已知的。例如， Schafmeister等人,J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000)；Schafmeister 和Verdine,J.Am.Chem.Soc.122:5891(2005)；Walensky等人,Science 305:1466-1470(2004)；美国专利号7,192,713和PCT申请WO 2008/121767中描述了式I的拟肽大环化合物的制备。在所引用的参考文 献中公开的α,α-二取代的氨基酸和氨基酸前体可以用于拟肽大环化合物 前体多肽的合成。例如，“S5-烯烃氨基酸”是(S)-α-(2’-戊烯基)丙氨酸， 且“R8-烯烃氨基酸”是(R)-α-(2’-辛烯基)丙氨酸。在将这样的氨基酸掺入 前体多肽中之后，末端烯烃与复分解反应催化剂反应，从而导致拟肽大 环化合物的形成。在多个实施方案中，下列氨基酸可用于合成拟肽大环 化合物。

在其他实施方案中，所述拟肽大环化合物为式IV或IVa。制备这 类大环化合物的方法例如在美国专利号7,202,332中描述。

预计为合适的形成拟肽大环化合物的另外的方法包括以下文献中 公开的方法：Mustapa,M.Firouz Mohd等人,J.Org.Chem(2003),68,第 8193-8198页；Yang,Bin等人Bioorg Med.Chem.Lett.(2004),14,第 1403-1406页；美国专利5,364,851；美国专利5,446,128；美国专利 5,824,483；美国专利6,713,280和美国专利7,202,332。在这样的实施方 案中，使用在α-位含有另外的取代基R-的氨基酸前体。这样的氨基酸在 希望的位置并入大环化合物前体中，其可以处于交联体被取代的位置， 或者，备选地，在大环化合物前体序列中的其他位置。然后根据指定的 方法实现前体的环化。

在化学、光学、异构体、对映体或非对映体基础上，本文所述的 拟肽大环化合物可以为至少1％纯、至少2％纯、至少3％纯、至少4％纯、 至少5％纯、至少6％纯、至少7％纯、至少8％纯、至少9％纯、至少10％ 纯、至少11％纯、至少12％纯、至少13％纯、至少14％纯、至少15％纯、 至少16％纯、至少17％纯、至少18％纯、至少19％纯、至少20％纯、至 少21％纯、至少22％纯、至少23％纯、至少24％纯、至少25％纯、至少 26％纯、至少27％纯、至少28％纯、至少29％纯、至少30％纯、至少31％ 纯、至少32％纯、至少33％纯、至少34％纯、至少35％纯、至少36％纯、 至少37％纯、至少38％纯、至少39％纯、至少40％纯、至少41％纯、至少42％纯、至少43％纯、至少44％纯、至少45％纯、至少46％纯、至少 47％纯、至少48％纯、至少49％纯、至少50％纯、至少51％纯、至少52％ 纯、至少53％纯、至少54％纯、至少55％纯、至少56％纯、至少57％纯、 至少58％纯、至少59％纯、至少60％纯、至少61％纯、至少62％纯、至 少63％纯、至少64％纯、至少65％纯、至少66％纯、至少67％纯、至少 68％纯、至少69％纯、至少70％纯、至少71％纯、至少72％纯、至少73％ 纯、至少74％纯、至少75％纯、至少76％纯、至少77％纯、至少78％纯、 至少79％纯、至少80％纯、至少81％纯、至少82％纯、至少83％纯、至 少84％纯、至少85％纯、至少86％纯、至少87％纯、至少88％纯、至少89％纯、至少90％纯、至少91％纯、至少92％纯、至少93％纯、至少94％ 纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、 至少99.1％纯、至少99.2％纯、至少99.3％纯、至少99.4％纯、至少99.5％ 纯、至少99.6％纯、至少99.7％纯、至少99.8％纯或至少99.9％纯。可通 过例如HPLC、MS、LC/MS、熔点或NMR来评估纯度。

两种或更多种肽/拟肽大环化合物可共享一定程度的同源性。一对 肽/拟肽大环化合物可具有例如高达约20％的成对同源性、高达约25％ 的成对同源性、高达约30％的成对同源性、高达约35％的成对同源性、 高达约40％的成对同源性、高达约45％的成对同源性、高达约50％的成 对同源性、高达约55％的成对同源性、高达约60％的成对同源性、高达约65％的成对同源性、高达约70％的成对同源性、高达约75％的成对同 源性、高达约80％的成对同源性、高达约85％的成对同源性、高达约90％ 的成对同源性、高达约95％的成对同源性、高达约96％的成对同源性、 高达约97％的成对同源性、高达约98％的成对同源性、高达约99％的成 对同源性、高达约99.5％的成对同源性或高达约99.9％的成对同源性。一对肽可具有例如至少约20％的成对同源性、至少约25％的成对同源性、 至少约30％的成对同源性、至少约35％的成对同源性、至少约40％的成 对同源性、至少约45％的成对同源性、至少约50％的成对同源性、至少 约55％的成对同源性、至少约60％的成对同源性、至少约65％的成对同 源性、至少约70％的成对同源性、至少约75％的成对同源性、至少约80％的成对同源性、至少约85％的成对同源性、至少约90％的成对同源性、 至少约95％的成对同源性、至少约96％的成对同源性、至少约97％的成 对同源性、至少约98％的成对同源性、至少约99％的成对同源性、至少 约99.5％的成对同源性、至少约99.9％的成对同源性。

可使用多种方法和软件程序测定两种或更多种肽之间的同源性， 如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline 或另一种合适的方法或算法。

试验

例如，拟肽大环化合物的性质通过使用下面所述的方法进行分析。 在一些实施方案中，拟肽大环化合相对于缺乏本文所述的取代基的相应 多肽具有改善的生物学性质。

用于测定α-螺旋度的试验

在溶液中，具有α-螺旋结构域的多肽的二级结构在随机卷曲结构 和α-螺旋结构之间达到动态平衡，这通常被称为“百分螺旋度”。因此， 例如，α-螺旋结构域在溶液中主要是随机卷曲，α-螺旋含量通常低于25％。 另一方面，具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如至少为相应的 非交联多肽的2倍的α-螺旋度。在一些实施方案中，大环化合物具有高 于50％的α-螺旋度。为了测定拟肽大环化合物的螺旋度，将化合物溶解 于水溶液(例如，pH 7的50mM磷酸钾溶液或蒸馏水，达到25-50μM的 浓度)。使用标准测量参数(例如，温度，20℃；波长，190-260nm；步 分辨率(step resolution)，0.5nm；速度，20nm/sec；累积，10；响应，1 秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710) 上获得圆二色性(CD)谱。通过将平均残基椭圆度(例如，[Φ]222obs)除以 模型螺旋十肽的报道值(Yang等人(1986),Methods Enzymol.130:208)来 计算各个肽的α-螺旋含量。

用于测量解链温度(Tm)的试验

含有二级结构如α-螺旋的拟肽大环化合物显示出例如比相应的非 交联多肽更高的解链温度。通常，拟肽大环化合物显示出>60℃的Tm， 表明在水溶液中高度稳定的结构。为了分析大环形成对解链温度的影响， 将拟肽大环化合物或未修饰的肽溶于蒸馏水中(例如，以50μM的终浓 度)，并且通过使用标准参数(例如，波长，222nm；步分辨率，0.5nm； 速度，20nm/sec；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；温度上升速度， 1℃/分钟；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上测量椭 圆度在一定温度范围(例如，4-95℃)内的变化来确定Tm。

蛋白酶抗性试验

肽骨架的酰胺键易受到蛋白酶的水解，从而致使肽化合物在体内 易于快速降解。但是，肽螺旋的形成通常包埋酰胺骨架，因此可以保护 其免于蛋白水解裂解。拟肽大环化合物可以经历体外胰蛋白酶的蛋白水 解，以评价与相应的非交联多肽相比其降解速率的任何变化。例如，拟 肽大环化合物和相应的非交联多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起温育，并在各 个时间点通过离心猝灭反应，随后进行HPLC注入以根据280nm处的 紫外吸收对残留的底物进行定量。简单来说，拟肽大环化合物和拟肽前 体(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)温育0、10、20、90和180 分钟。通过台式离心机高速离心猝灭反应；通过基于HPLC的在280nm 处的峰检测对分离的上清液中残余的底物进行定量。蛋白水解反应显示出一级动力学，且速率常数k由ln[S]相对于时间的曲线确定(k＝-1X斜 率)。

离体稳定性试验

具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如至少为相应的非交 联多肽的2倍的离体半衰期，且具有12小时或更长的离体半衰期。对于 离体血清稳定性研究，可以使用多种试验。例如，将拟肽大环化合物和 相应的非交联多肽(2mcg)与新鲜的小鼠、大鼠和/或人血清(2mL)一起在 37℃下温育0、1、2、4、8和24小时。为了测定完整化合物的水平， 可以使用下面的程序：通过将100μl的血清转移到2ml离心管中，接着 加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈并在4±2℃下以14,000RPM离 心10分钟来提取样品。然后将上清液转移到新的2ml管中，并在N

体外结合试验

为了评估拟肽大环化合物和拟肽前体与受体蛋白质的结合和亲和 力，例如使用荧光偏振试验(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测 量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附接在具有高表观 分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂 (例如，FITC)与附接在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽) 上的荧光示踪剂相比具有较慢的旋转速度，附接在具有高表观分子量的 分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。

例如，荧光标记的(fluoresceinated)拟肽大环化合物(25nM)与接受 体蛋白质(25-1000nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL， pH 7.4)中在室温下温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如， Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测定结合活性。可以使用例如 Graphpad Prism软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。在一些实施方案中，拟肽大环化合物显示出与 相应的非交联多肽类似的或更低的Kd。

用于表征肽-蛋白质相互作用的拮抗剂的体外置换试验

为了评估拮抗肽与接受体蛋白质之间相互作用的化合物的结合和 亲和力，例如，使用利用来源于拟肽前体序列的荧光标记的拟肽大环化 合物的荧光偏振试验(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子 取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附接在具有高表观分子量 的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如， FITC)与附接在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)上的荧 光示踪剂相比具有较低的旋转速度，附接在具有高表观分子量的分子上 的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。拮抗荧光标记的拟肽大环化合 物与接受体蛋白质之间相互作用的化合物将在竞争性结合FPA实验中进 行检测。

例如，推定的拮抗剂化合物(1nM至1mM)和荧光标记的拟肽大 环化合物(25nM)与接受体蛋白质(50nM)一起在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中在室温下温育30分钟。例如，用发 光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测定拮抗剂结合 活性。可以使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。

任一类分子，如有机小分子、肽、寡核苷酸或蛋白质，可以在该 试验中作为推定的拮抗剂进行检测。

通过亲和选择-质谱法对蛋白质-配体结合的分析

为了评估测试化合物对蛋白质的结合和亲和力，例如采用亲和选 择-质谱分析试验。按照以下对全系统对照实验概述的代表性程序，使用 1μM拟肽大环化合物加5μM hMDM2进行蛋白质-配体结合实验。将 40μM拟肽大环化合物储备溶液的1μL DMSO等份溶解在19μLPBS (磷酸盐缓冲盐水：含有150mM NaCl的50mM,pH 7.5磷酸盐缓冲液) 中。得到的溶液通过反复吸液进行混合并通过在10 000g下离心10分钟 进行澄清。向4μL等份得到的上清液中加入4μL 10μM hMDM2的PBS 溶液。每个8.0μL实验样品因此含有在PBS中的浓度为5.0μM的40 pmol(1.5μg)蛋白质，加1μM拟肽大环化合物和2.5％DMSO。针对每 个浓度点如此制备的双份样品在室温下温育60分钟，然后冷却至4℃， 之后进行5.0μL注入液的大小排阻层析-LC-MS分析。将含有靶蛋白、 蛋白质-配体复合体和未结合的化合物的样品注入到SEC柱上，通过快 速SEC步骤将复合体与未结合的成分在该柱上分离。采用UV检测器监 测SEC柱洗脱液，以证实在SEC柱的外水体积中洗脱的早期洗脱的蛋 白质级分从保留在柱上的未结合的成分中良好地分离出来。在含有蛋白 质和蛋白质-配体复合体的峰从主UV检测器洗脱后，它进入样品环路， 在其中从SEC阶段的流上截下，并通过阀门机构直接转移到LC-MS。通过ESI-MS以预期的m/z观察拟肽大环化合物的(M+3H)

用于蛋白质-配体Kd滴定实验的分析

为了评估测试化合物对蛋白质的结合和亲和力，例如，进行蛋白 质-配体Kd滴定实验。蛋白质-配体K

通过亲和选择-质谱法进行竞争性结合实验的分析

为了确定测试化合物竞争性结合蛋白质的能力，例如，进行亲和 选择-质谱分析试验。通过将三种化合物中每一种的2μL等份400μM储 备液与14μL DMSO混合制备每种成分40μM的配体混合物。然后，将 1μL等份的该每种成分40μM的混合物与滴定剂拟肽大环化合物连续 稀释储备溶液(10,5,2.5,...,0.078mM)的1μL DMSO等份混合。将这些 2μL样品溶解在38μL PBS中。得到的溶液通过反复吸液进行混合并通 过在10 000g下离心10分钟进行澄清。向4.0μL等份得到的上清液中加 入4.0μL 10μM hMDM2蛋白的PBS溶液。每个8.0μL实验样品因此含 有在PBS中的浓度为5.0μM的40pmol(1.5μg)蛋白质，加0.5μM配 体、2.5％DMSO和不同浓度(125,62.5,...,0.98μM)的滴定剂拟肽大环化 合物。针对每个浓度点如此制备的双份样品在室温下温育60分钟，然后 冷却至4℃，之后进行2.0μL注入液的SEC-LC-MS分析。这些和其他 方法的另外的细节在以下文献中提供：“A General Technique toRank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs.DirectBinding Site Competition in Compound Mixtures.”Annis,D.A.；Nazef,N.； Chuang,C.C.；Scott,M.P.；Nash,H.M.J.Am.Chem.Soc.2004,126, 15495-15503；以及“ALIS:AnAffinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery andCharacterization of Protein-Ligand Interactions”D.A. Annis,C.-C.Chuang,andN.Nazef.In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry.Wanner K,

在完整细胞中的结合分析

有可能通过免疫沉淀实验测定肽或拟肽大环化合物与其天然受体 在完整细胞中的结合。例如，完整的细胞与荧光标记的(FITC-标记的)化 合物在无血清的情况下温育4小时，接着进行血清置换并进一步温育 4-18小时。然后使细胞沉淀，并在4℃下在裂解缓冲液(50mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1％的CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)中温育10 分钟。以14,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液，并与10μl山羊 抗-FITC抗体一起温育2小时，在4℃下旋转，接着进一步在4℃下与 蛋白A/G Sepharose(50μl的50％微珠浆)温育2小时。快速离心之后， 将沉淀物在含有渐增的盐浓度(例如，150、300、500mM)的裂解缓冲液 中洗涤。随后以150mM NaCl再平衡微珠，之后加入含有SDS的样品 缓冲液并煮沸。离心之后，任选地使用4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶对上 清液进行电泳，接着转移到Immobilon-P膜上。封闭后，任选地将印迹 与检测FITC的抗体一起温育，也与一种或多种检测与拟肽大环化合物 结合的蛋白质的抗体一起温育。

细胞透性分析

与相应的非交联大环化合物相比，拟肽大环化合物例如具有更高 的细胞透性。具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如是相应的非 交联大环化合物的至少2倍的细胞透性，并且常常观察到20％或更多的 应用的拟肽大环化合物在4小时后已渗透入细胞。为了测量拟肽大环化 合物和相应的非交联大环化合物的细胞透性，将完整的细胞与荧光标记 的(例如荧光化的(fluoresceinated))拟肽大环化合物或相应的非交联大环 化合物(10μM)一起在不含血清的培养基中37℃温育4小时，用培养基 洗涤2次，并与胰蛋白酶(0.25％)在37℃下温育10分钟。再次洗涤细胞 并将其重悬浮于PBS中。例如，通过使用FACSCalibur流式细胞仪或 Cellomics’

细胞效力分析

例如，在基于细胞的杀伤试验中，使用多种致瘤和非致瘤的细胞 系及源自人类或小鼠细胞群体的原代细胞测定某些拟肽大环化合物的效 力。例如，在与拟肽大环化合物(0.5-50μM)一起温育的24-96小时期间 监测细胞的活力，以鉴定那些以EC

体内稳定性分析

为了研究拟肽大环化合物的体内稳定性，例如，向小鼠和/或大鼠 通过静脉内、腹膜内、口服或吸入途径以0.1-50mg/kg的浓度施用化合 物，并在注射后0'、5'、15'、30'、1小时、4小时、8小时和24小时抽 取血样。然后如上所述通过LC-MS/MS测定25μL新鲜血清中的完整化 合物的水平。

在动物模型中的体内效力

为了确定拟肽大环化合物在体内的抗致癌活性，例如，化合物单 独给予(静脉内、腹膜内、口服、通过吸入或鼻途径)或与亚最佳剂量的 相关化疗剂(例如，环磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)联合给予。在一个实 例中，在NOD-SCID小鼠遭受全身辐射3小时后，通过尾静脉注射稳定 表达萤光素酶的5x 10

临床试验

为了确定拟肽大环化合物对于人类治疗的适用性，进行了临床试 验。例如，可选择出被诊断为患有实体瘤并且需要治疗的患者并将他们 分成治疗组和一个或多个对照组，其中，对治疗组施用拟肽大环化合物， 而对照组接受安慰剂或已知的抗癌药物。这样，可以通过对患者组就诸 如生存率和生活质量的因素进行比较来评价拟肽大环化合物的治疗安全 性和有效性。在本实例中，相比于用安慰剂治疗的患者对照组，用拟肽 大环化合物治疗的患者组可以显示出提高的长期生存率。

制剂和给药

给药模式

有效量的本发明的拟肽大环化合物或其药学上可接受的盐可以以 药物组合物的方式作为单剂量或多剂量通过接受的给药模式施用。在一 些实施方案中，肠胃外施用本发明的包含治疗有效量的拟肽大环化合物 或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，例如通过皮下注射、 肌肉内注射、鞘内注射、静脉内注射或硬膜外注射。例如，静脉内、动 脉内、皮下或通过输注施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等 效量的其药学上可接受的盐的药物组合物。在一些实例中，静脉内施用 包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐 的药物组合物。在一些实例中，动脉内施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物。

无论所选择的给药途径如何，本发明的拟肽大环化合物和/或本发 明的药物组合物均通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可 接受的剂型。通过与其他药物类似的方法，可将根据本发明的拟肽大环 化合物配制用于以任何方便的方式施用用于人类或兽医学中。

在一个方面，本发明提供了包含与一种或多种药学上可接受的载 体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的、治疗有效量的一种或多种上述拟肽 大环化合物的药物组合物。在一个实施方案中，一种或多种本文所述的 拟肽大环化合物被配制用于肠胃外给药，本文公开的一种或多种拟肽大 环化合物可被配制为水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可 在临使用前重建成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这样的药物组 合物可包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使该制剂与意向接受 者的血液等张的溶质，或悬浮剂或增稠剂。药物组合物还可含有辅剂， 如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真 菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，确保防止微生 物作用于主题化合物。还可期望药物组合物中包含等张剂，如糖、氯化 钠等。此外，可通过包含延缓吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶，导致可 注射药物组合物的延长吸收。若需要，可在使用前，用例如等张盐水溶 液或右旋糖溶液稀释药物组合物。在一些实例中，所述拟肽大环化合物 被配置为水溶液并静脉内施用。

给药量和频率

可采用本领域技术人员已知的技术确定剂量。所选择的剂量水平 可取决于多种因素，包括所采用的特定拟肽大环化合物的活性，给药途 径，给药时间，所采用的特定拟肽大环化合物的排出或代谢速率，治疗 的持续时间，与所采用的特定拟肽大环化合物联合使用的其他药物、化 合物和/或物质，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和 既往医疗史，以及医学领域公知的其他因素。剂量值还可随待缓解的状 况的严重程度而变化。对于任何特定的受试者，可根据个体需要以及施 用该组合物或监督该组合物的施用的人的专业判断而随时间调整具体剂 量方案。

具有本领域普通技能的医师或兽医可容易确定和开具所需的药物 组合物的有效量。例如，该医师或兽医可以以低于所需水平的水平开始 在所述药物组合物中采用的本发明化合物的给药，以便实现所需的治疗 效果并逐渐增加剂量直到实现所需的效果。

在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物的合适的每日剂量 可以是为有效产生治疗效果的最低剂量的拟肽大环化合物的量。这样的 有效剂量通常将取决于上述因素。将在给定患者中产生最有效治疗的任 何特定拟肽大环化合物的准确给药时间和量将取决于特定拟肽大环化合 物的活性、药代动力学和生物利用度，患者的生理学状况(包括年龄、性 别、疾病类型和阶段、总体身体状况、对给定剂量的响应性和药物类型)、 给药途径，等等。

剂量可基于每kg患者体重的拟肽大环化合物的量。其他的量是本 领域技术人员已知的，并且容易确定。或者，可通过参考拟肽大环化合 物的血浆浓度来确定本发明的剂量。例如，可以使用最大血浆浓度(Cmax) 和从时间0至无穷的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。

在一些实施方案中，所述受试者为人类受试者，并且所施用的拟 肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重0.01-100mg。例如，在多个 实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为约0.01-50mg/kg、约0.01-20 mg/kg、约0.01-10mg/kg、约0.1-100mg/kg、约0.1-50mg/kg、约0.1-20 mg/kg、约0.1-10mg/kg、约0.5-100mg/kg、约0.5-50mg/kg、约0.5-20mg/kg、约0.5-10mg/kg、约1-100mg/kg、约1-50mg/kg、约1-20mg/kg、 约1-10mg/kg人类受试者体重。在一个实施方案中，施用每千克人类受 试者体重约0.5mg-10mg拟肽大环化合物。在一些实例中，所施用的拟 肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约0.16mg、0.32mg、0.64mg、 1.28mg、3.56mg、7.12mg、14.24mg或20mg。在一些实例中，所施 用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约0.16mg、0.32mg、 0.64mg、1.28mg、3.56mg、7.12mg或14.24mg。在一些实例中，所施 用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重0.16mg。在一些实 例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重0.32mg。 在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重 0.64mg。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受 试者体重1.28mg。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每 千克人类受试者体重3.56mg。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合 物的量为每千克人类受试者体重7.12mg。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重14.24mg。

在一些实施方案中，每周施用两次每千克人类受试者体重约 0.5-20mg或0.5-10mg的拟肽大环化合物。例如，每周施用两次每千克 人类受试者体重约0.5-1.0mg、0.5-5.0mg、0.5-10.0mg、0.5-15mg或1-5 mg、1-10mg、1-15mg、1-20mg、5-10mg、1-15mg、5-20mg、10-15mg、 10-20mg、15-20mg的拟肽大环化合物。在一些实例中，每周施用两次 每千克人类受试者体重约1.0mg、1.25mg、1.5mg、1.75mg、2.0mg、 2.25mg、2.5mg、2.75mg、3.0mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4.0mg、 4.25mg、4.5mg、4.75mg、5.0mg、5.25mg、5.5mg、5.75mg、6.0mg、 6.25mg、6.5mg、6.75mg、7.0mg、7.25mg、7.5mg、7.75mg、8.0mg、 8.25mg、8.5mg、8.75mg、9.0mg、9.25mg、9.5mg、9.75mg、10.0mg、 10.25mg、10.5mg、10.75mg、11.0mg、11.25mg、11.5mg、11.75mg、 12.0mg、12.25mg、12.5mg、12.75mg、13.0mg、13.25mg、13.5mg、13.75mg、14.0mg、14.25mg、14.5mg、14.75mg、15.0mg、15.25mg、 15.5mg、15.75mg、16.0mg、16.5mg、17.0mg、17.5mg、18.0mg、18.5 mg、19.0mg、19.5mg或20.0mg的拟肽大环化合物。在一些实例中， 所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5 mg、5.0mg、10.0mg或20mg，并且所述拟肽大环化合物每周施用两次。 在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重 约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述拟肽大环化合物每周 施用两次。

在一些实施方案中，每周施用一次每千克人类受试者体重约 0.5-20mg或0.5-10mg的拟肽大环化合物。例如，每周施用一次每千克 人类受试者体重约0.5-1.0mg、0.5-5.0mg、0.5-10.0mg、0.5-15mg或1-5 mg、1-10mg、1-15mg、1-20mg、5-10mg、1-15mg、5-20mg、10-15mg、 10-20mg、15-20mg的拟肽大环化合物。在一些实例中，每周施用一次 每千克人类受试者体重约1.0mg、1.25mg、1.5mg、1.75mg、2.0mg、 2.25mg、2.5mg、2.75mg、3.0mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4.0mg、 4.25mg、4.5mg、4.75mg、5.0mg、5.25mg、5.5mg、5.75mg、6.0mg、 6.25mg、6.5mg、6.75mg、7.0mg、7.25mg、7.5mg、7.75mg、8.0mg、 8.25mg、8.5mg、8.75mg、9.0mg、9.25mg、9.5mg、9.75mg、10.0mg、 10.25mg、10.5mg、10.75mg、11.0mg、11.25mg、11.5mg、11.75mg、 12.0mg、12.25mg、12.5mg、12.75mg、13.0mg、13.25mg、13.5mg、13.75mg、14.0mg、14.25mg、14.5mg、14.75mg、15.0mg、15.25mg、 15.5mg、15.75mg、16.0mg、16.5mg、17.0mg、17.5mg、18.0mg、18.5 mg、19.0mg、19.5mg或20.0mg的拟肽大环化合物。在一些实例中， 所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5 mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽大环化合物每周施用一 次。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者 体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述拟肽大环化合物 每周施用一次。

在一些实施方案中，每周施用3次、4次、5次、6次或7次每千 克人类受试者体重约0.5-20mg或0.5-10mg的拟肽大环化合物。例如， 每周施用3次、4次、5次、6次或7次每千克人类受试者体重约0.5-1.0 mg、0.5-5.0mg、0.5-10.0mg、0.5-15mg或1-5mg、1-10mg、1-15mg、1-20mg、5-10mg、1-15mg、5-20mg、10-15mg、10-20mg、15-20mg 的拟肽大环化合物。在一些实例中，每周施用3次、4次、5次、6次或7次每千克人类受试者体重约1.0mg、1.25mg、1.5mg、1.75mg、2.0mg、 2.25mg、2.5mg、2.75mg、3.0mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4.0mg、 4.25mg、4.5mg、4.75mg、5.0mg、5.25mg、5.5mg、5.75mg、6.0mg、 6.25mg、6.5mg、6.75mg、7.0mg、7.25mg、7.5mg、7.75mg、8.0mg、 8.25mg、8.5mg、8.75mg、9.0mg、9.25mg、9.5mg、9.75mg、10.0mg、 10.25mg、10.5mg、10.75mg、11.0mg、11.25mg、11.5mg、11.75mg、 12.0mg、12.25mg、12.5mg、12.75mg、13.0mg、13.25mg、13.5mg、 13.75mg、14.0mg、14.25mg、14.5mg、14.75mg、15.0mg、15.25mg、 15.5mg、15.75mg、16.0mg、16.5mg、17.0mg、17.5mg、18.0mg、18.5 mg、19.0mg、19.5mg或20.0mg的拟肽大环化合物。在一些实例中， 所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5 mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽大环化合物每周施用3 次、4次、5次、6次或7次。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物 的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg， 并且所述拟肽大环化合物每周施用3次、4次、5次、6次或7次。

在一些实施方案中，每2周、3周或4周施用一次每千克人类受 试者体重约0.5-20mg或0.5-10mg的拟肽大环化合物。例如，每2周或 3周施用3次、4次、5次、6次或7次每千克人类受试者体重约0.5-1.0 mg、0.5-5.0mg、0.5-10.0mg、0.5-15mg或1-5mg、1-10mg、1-15mg、 1-20mg、5-10mg、1-15mg、5-20mg、10-15mg、10-20mg、15-20mg 的拟肽大环化合物。在一些实例中，每2周或3周施用一次每千克人类 受试者体重约1.0mg、1.25mg、1.5mg、1.75mg、2.0mg、2.25mg、2.5 mg、2.75mg、3.0mg、3.25mg、3.5mg、3.75mg、4.0mg、4.25mg、4.5mg、4.75mg、5.0mg、5.25mg、5.5mg、5.75mg、6.0mg、6.25mg、 6.5mg、6.75mg、7.0mg、7.25mg、7.5mg、7.75mg、8.0mg、8.25mg、 8.5mg、8.75mg、9.0mg、9.25mg、9.5mg、9.75mg、10.0mg、10.25mg、 10.5mg、10.75mg、11.0mg、11.25mg、11.5mg、11.75mg、12.0mg、 12.25mg、12.5mg、12.75mg、13.0mg、13.25mg、13.5mg、13.75mg、 14.0mg、14.25mg、14.5mg、14.75mg、15.0mg、15.25mg、15.5mg、15.75mg、16.0mg、16.5mg、17.0mg、17.5mg、18.0mg、18.5mg、19.0mg、19.5mg或20.0mg的拟肽大环化合物。在一些实例中，所施用的 拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg、 10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽大环化合物每2周施用一次。在一些 实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试者体重约1.25 mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述拟肽大环化合物每2周施用 一次。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物的量为每千克人类受试 者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg或20.0mg，并且所述拟肽 大环化合物每3周施用一次。在一些实例中，所施用的拟肽大环化合物 的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg或10.0mg， 并且所述拟肽大环化合物每3周施用一次。

在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物在一个时间段内逐渐施 用。可在约0.1h-24h的时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。 在一些情况下，在0.1h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、 4.5h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、 16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h的时间段内逐渐 施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例中，在0.25-12h的时间段内， 例如在0.25-1h、0.25-2h、0.25-3h、0.25-4h、0.25-6h、0.25-8h、0.25-10 h的时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例中，在0.25-2h的时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例中， 在0.25-1h的时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例 中，在0.25h、0.3h、0.4h、0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1.0h、 1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h或2.0h的 时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例中，在1h的 时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。在一些实例中，在2h的 时间段内逐渐施用所需量的拟肽大环化合物。

只要需要可以继续施用所述拟肽大环化合物，以治疗有需要的受 试者的实体瘤。在一些实施方案中，本发明的一种或多种拟肽大环化合 物施用持续超过1天、1周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21 个月、22个月、23个月或24个月。在一些实施方案中，本发明的一种 或多种拟肽大环化合物施用持续少于1周、1个月、2个月、3个月、4 个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12 个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个 月、20个月、21个月、22个月、23个月或24个月。

在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物在28天周期的第1天、 第8天、第15天和第28天施用。在一些实施方案中，所述拟肽大环化 合物在28天周期的第1天、第8天、第15天和第28天施用，并且施用 持续两个周期。在一些实施方案中，所述拟肽大环化合物在28天周期的 第1天、第8天、第15天和第28天施用，并且施用持续三个周期。在 一些实施方案中，所述拟肽大环化合物在28天周期的第1天、第8天、 第15天和第28天施用，并且施用持续4、5、6、7、8、9、10个或更多 个周期。

在一些实施方案中，本发明的一种或多种拟肽大环化合物持续地 长期施用。在一些实施方案中，本发明的一种或多种拟肽大环化合物的 施用持续直到记录到疾病进展、不可接受的毒性，或者患者或医师决定 中止施用。

方法及用途

在一个方面，本发明提供了治疗受试者的实体瘤的方法，该方法 包括向该受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的 其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，该拟肽大环化合物可破坏 p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。在一些实施方案中，根据本 文公开的方法的治疗可导致人类受试者中p53途径的重新激活、肿瘤细 胞增殖减少、p53蛋白增加、p21增加和/或凋亡增加。

在一个方面，本发明提供了治疗受试者中缺乏p53灭活突变的实 体瘤的方法，该方法包括向该受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化 合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大 环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，在治疗 前，该实体瘤被确定为缺乏p53灭活突变。在一些实施方案中，该拟肽 大环化合物可破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。所述方法 可进一步包括在施用所述拟肽大环化合物之前确认所述受试者中缺乏 p53灭活突变。在一些实施方案中，根据本文公开的方法的治疗可导致 人类受试者中p53途径的重新激活、肿瘤细胞增殖减少、p53蛋白增加、 p21增加和/或凋亡增加。

在一个方面，本发明提供了治疗表达野生型p53的受试者的实体 瘤的方法，该方法包括向该受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合 物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环 化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实施方案中，该拟肽大 环化合物可破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。所述方法可 进一步包括在施用所述拟肽大环化合物之前确认所述受试者的野生型 p53状态。在一些实施方案中，根据本文公开的方法的治疗可导致人类 受试者中p53途径的重新激活、肿瘤细胞增殖减少、p53蛋白增加、p21 增加和/或凋亡增加。

在一些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法抑制、减 小、缩小、阻止或稳定与该实体瘤相关的肿瘤。在其他实施方案中，本 文提供的用于治疗实体瘤的方法抑制、减小、缩小、阻止或稳定与该实 体瘤或其一种或多种症状相关的肿瘤中的血液流动、代谢或水肿。在一 些实例中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法导致肿瘤、肿瘤血流、肿 瘤代谢或肿瘤周围水肿以及/或者与该实体瘤相关的一种或多种症状的 消退。在其他实例中，如通过本领域技术人员可用的常规方法如超声、 CT扫描、MRI、动态造影增强MRI或PET扫描所测量的，本文提供的 用于治疗实体瘤的方法保持该肿瘤的大小，使其不增加，或使其增加得 比施用标准疗法后的肿瘤增加少。在一些实例中，本文提供的用于治疗 实体瘤的方法使肿瘤大小减小。在一些实例中，本文提供的用于治疗实 体瘤的方法使肿瘤形成减少。在一些实例中，本文提供的用于治疗实体 瘤的方法根除、去除或控制与该实体瘤相关的原发性肿瘤、区域性肿瘤 和/或转移性肿瘤。在一些实例中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法减 少与该实体瘤相关的转移的次数或大小。在一些实例中，如通过本领域 公知的方法例如CT扫描、MRI、DCE-MRI或PET扫描所评估的，本文 提供的用于治疗实体瘤的方法使受试者中的肿瘤体积或肿瘤大小(例如， 直径)相对于在施用所述拟肽大环化合物前受试者中的肿瘤大小(例如， 体积或直径)减小一定量，该量在约5-10％、5-20％、10-20％、15-20％、 10-30％、20-30％、20-40％、30-40％、10-50％、20-50％、30-50％、40-50％、 10-60％、20-60％、30-60％、40-60％、50-60％、10-70％、20-70％、30-70％、 40-70％、50-70％、60-70％、10-80％、20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、 60-80％、70-80％、10-90％、20-90％、30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、 70-90％、80-90％、10-100％、20％-100％、30-100％、40-100％、50-100％、 60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％的范围内，或其间的 任意范围内。在某些实施方案中，如通过本领域公知的方法例如CT扫 描、MRI、DCE-MRI或PET扫描所评估的，本文的方法使受试者中的 肿瘤大小(例如，体积或直径)相对于施用所述拟肽大环化合物前受试者 中的肿瘤体积或肿瘤大小(例如，直径)减小至少约5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、80％、85％、 90％、95％、99％或100％。

在一些实施方案中，如通过本领域公知的方法例如MRI、 DCE-MRI或PET扫描所评估的，本文提供的方法使受试者中的肿瘤灌 注相对于施用所述拟肽大环化合物前的肿瘤灌注减少一定量，该量在约 5-10％、5-20％、10-20％、15-20％、10-30％、20-30％、20-40％、30-40％、 10-50％、20-50％、30-50％、40-50％、10-60％、20-60％、30-60％、40-60％、 50-60％、10-70％、20-70％、30-70％、40-70％、50-70％、60-70％、10-80％、 20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、10-90％、20-90％、 30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、70-90％、80-90％、10-100％、20％-100％、 30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％的范围内，或其间的任意范围内。在某些实施方案中，如通过 本领域公知的方法例如MRI、DCE-MRI或PET扫描所评估的，本文提 供的方法使受试者中的肿瘤灌注相对于施用所述拟肽大环化合物前的肿 瘤灌注减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。

在一些实施方案中，如通过本领域公知的方法所评估的，本文提 供的方法使受试者中的肿瘤代谢相对于施用所述拟肽大环化合物前的肿 瘤代谢抑制或减少约5-10％、5-20％、10-20％、15-20％、10-30％、20-30％、 20-40％、30-40％、10-50％、20-50％、30-50％、40-50％、10-60％、20-60％、 30-60％、40-60％、50-60％、10-70％、20-70％、30-70％、40-70％、50-70％、 60-70％、10-80％、20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、 10-90％、20-90％、30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、70-90％、80-90％、 10-100％、20％-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、 80-100％、90-100％、95-100％，或其间的任意范围。在某些实施方案中， 如通过本领域公知的方法例如PET扫描所评估的，本文提供的方法抑制 或减少受试者中的肿瘤代谢。在特定实施方案中，如通过本领域公知的 方法所评估的，本文提供的方法使受试者中的肿瘤代谢相对于施用所述 拟肽大环化合物前的肿瘤代谢抑制或减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、80％、85％、 90％、95％或100％。

在其他方面，本发明提供了用于增加患有被确定为缺乏p53灭活 突变的实体瘤并且/或者患有表达野生型p53的实体瘤的受试者的存活 时间的方法，该方法包括向该受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化 合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大 环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。在一些实例中，所述受试者 的存活时间比如果所述受试者没有根据本文提供的方法进行治疗而预期 的受试者存活时间至少长30天。在一些实例中，所述受试者的存活时间 比如果所述受试者没有根据本文提供的方法进行治疗而预期的受试者存 活时间长1个月至约5年。例如，所述受试者的存活时间比如果所述受 试者没有根据本文提供的方法进行治疗而预期的受试者存活时间长至少 3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少 18个月、至少21个月或至少24个月。

在一个方面，本发明提供了用于评估罹患实体瘤的受试者中生物 标记的存在、不存在或量的方法，该方法包括。在一些实例中，所述生 物标记包括患者生物标记，例如，受试者的p53状态以及受试者的MDM2 和MDMX表达水平。

本发明的方法还可任选地包括研究和/或评价本文公开的拟肽大 环化合物在所述受试者中的安全性和/或耐受性。

本文还提供了用于重新激活患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达 野生型p53的实体瘤的受试者中的p53途径的方法，该方法包括向该受 试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可 接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX 蛋白结合。

本文还提供了用于减少患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生 型p53的实体瘤的人类受试者中的肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括向 该受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学 上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或 MDMX蛋白结合。

本文还提供了用于增加患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生 型p53的实体瘤的受试者中的p53蛋白的方法，该方法包括向该受试者 施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受 的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白 结合。

本文还提供了用于增加患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生 型p53的实体瘤的受试者中的p21的方法，该方法包括向该受试者施用 包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐 的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

本文还提供了用于增加患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生 型p53的实体瘤的受试者中的凋亡的方法，该方法包括向该受试者施用 包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐 的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

在一些实施方案中，本发明还提供了用于确定本文公开的拟肽大 环化合物在患有缺乏p53灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的 受试者中的剂量限制毒性(DLT)和/或最大耐受剂量(MTD)的方法。

本发明的方法可任选地包括本文公开的拟肽大环化合物的药代动 力学分析。相应地，所述方法可进一步包括在一个或多个特定时间点从 所述受试者收集一个或多个生物样品，并对该一个或多个生物样品的拟 肽大环化合物和/或其代谢物的水平进行分析。所述生物样品可为来自所 述受试者的血液样品，例如，来自人类受试者的血液样品。所述一个或 多个特定时间点可包括在向受试者施用拟肽大环化合物之前、之后和/ 或期间的时间点。在一些实施方案中，一个或多个生物样品包括在每次 向受试者施用拟肽大环化合物之前和之后收集的生物样品。在一些实施 方案中，用于药代动力学分析的生物样品在第一次向受试者施用拟肽大 环化合物之前，以及每次向受试者施用拟肽大环化合物之后的一个或多 个时间点收集。在向受试者施用拟肽大环化合物之前收集的生物样品可 在开始向受试者施用拟肽大环化合物前0-24小时内完成。例如，所述生 物样品可在向受试者施用拟肽大环化合物前24h、23h、22h、21h、20 h、19h、18h、17h、16h、15h、14h、13h、12h、11h、10h、9h、 8h、7h、6h、5h、4h、3h、2h、1h、30min、15min内收集，或临 在施用前收集。在向受试者施用拟肽大环化合物之后收集的一个或多个 生物样品可在向受试者施用拟肽大环化合物后0-约72h内收集，例如， 在0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、1.25h、1.5 h、1.75h、2.0h、2.25h、2.5h、2.75h、3.0h、3.25h、3.5h、3.75h、 4.0h、4.25h、4.5h、4.75h、5.0h、5.25h、5.5h、5.75h、6.0h、6.25h、 6.5h、6.75h、7.0h、7.25h、7.5h、7.75h、8.0h、8.25h、8.5h、8.75h、、 9.0h、9.25h、9.5h、9.75h、10.0h、10.25h、10.5h、10.75h、11.0h、11.25h、11.5h、11.75h、12.0h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、60h、64h、68h或72h之后收集。在一些实 施方案中，所述拟肽大环化合物在28天周期的第1天、第8天、第15 天施用，并且在第1天施用前、第1天施用后(可以例如在施用后约0min、 约30min、约1h、约2h、约4h、约8h、约24h和48小时收集多个 生物样品)、第8天施用前、第8天施用后(可以例如在施用后约0min、 约30min、约1h、约2h和约4h收集多个生物样品)、第15天施用前 和第15天施用后(可以例如在施用后约0min、约30min、约1h、约2h、 约4、约8h和约24h收集多个生物样品)收集生物样品。

本发明的方法可任选地包括本文公开的拟肽大环化合物的药效学 分析。相应地，所述方法可包括在一个或多个特定时间点从受试者收集 一个或多个生物样品以供药效学分析。药效学分析可包括分析生物样品 中包括MIC-1、p53、MDM2、MDMX、p21和/或病例在内的生物标记 的水平。生物样品中生物标记的检测可通过用于检测生物标记类型的任 何常规方法进行，例如，直接测量、免疫组织化学、免疫印迹、免疫荧 光、免疫吸附、免疫沉淀、蛋白质阵列、荧光原位杂交、FACS分析、 杂交、原位杂交、Northern印迹法、Southern印迹法、Western印迹法、 ELISA、放射免疫测定、基因阵列/芯片、PCR、RT-PCR或细胞遗传学 分析。用于药效学分析的生物样品可为来自受试者的血液样品或肿瘤样 本，例如，用于药效学分析的生物样品可为来自人类受试者的血液样品 或肿瘤样本。用于拟肽大环化合物的药效学分析的生物样品可以在向受 试者施用该拟肽大环化合物之前、期间或之后的任意时间收集。在一些 实施方案中，用于药代动力学分析的血液样品在第一次向受试者施用拟 肽大环化合物之前，以及每次向受试者施用拟肽大环化合物之后的一个 或多个时间点收集。在向受试者施用拟肽大环化合物之前收集的血液样 品可在开始向受试者施用拟肽大环化合物前0-24小时内完成。例如，所 述生物样品可在向受试者施用拟肽大环化合物前24h、23h、22h、21h、 20h、19h、18h、17h、16h、15h、14h、13h、12h、11h、10h、9h、 8h、7h、6h、5h、4h、3h、2h、1h、30min、15min内收集，或临 在施用前收集。在向受试者施用拟肽大环化合物之后收集的用于药效学 分析的一个或多个血液样品可在向受试者施用拟肽大环化合物后0-约72h，例如之后约12h、24h、36h或48h收集。在一些实施方案中， 所述拟肽大环化合物在28天周期的第1天、第8天、第15天施用，并 且在第1天施用前、第1天施用后(可以例如在施用后约24h和48小时 收集多个样品)、第8天施用前、第8天施用后(可以例如在施用后约1h 收集多个样品)、第15天施用前和第15天施用后(可以例如在施用后约1 h和约48h收集多个样品)以及第22天收集用于药效学分析的血液样品。 可以在向受试者施用拟肽大环化合物之前、之后或期间的任意时间收集 用于药效学分析的肿瘤样本。例如，所述拟肽大环化合物可在28天周期 的第1天、第8天、第15天施用，并且可在第1天施用前以及第14-18 天之间，例如第16天，收集用于药效学分析的肿瘤样品。

本发明的方法可任选地包括本文公开的拟肽大环化合物的临床活 性分析。相应地，所述方法可包括对在一个或多个特定时间点从受试者 收集的一个或多个生物样品进行分析。可将任何合适的分析程序用于生 物样品的分析。例如，可采用成像技术，如放射照片、超声、CT扫描、 PET扫描、MRI扫描、胸部X射线、腹腔镜检查、全血细胞计数(CBC) 检验、骨扫描和粪便隐血试验。可使用的其他分析程序包括血液化学分 析、染色体易位分析、针吸活检、组织活检、荧光原位杂交、实验室生 物标记分析、免疫组织化学染色法、流式细胞术，或它们的组合。所述 方法可进一步包括将所述分析程序的结果制表和/或作图。

生物样品

如本申请中所用的，“生物样品”是指来源于正常或患病受试者的 身体的任何流体或其他物质，如血液、血清、血浆、淋巴、尿、唾液、 泪液、脑脊液、乳汁、羊水、胆汁、腹水、脓等。术语“生物样品”的含 义内还包括器官或组织提取物，以及其中已经培养有来自受试者的任何 细胞或组织制品的培养液。生物样品还包括肿瘤样品或样本。肿瘤样品 可为肿瘤组织样品。获得肿瘤组织样品的方法是本领域公知的，并且可 根据肿瘤的类型和位置以及医师的偏好而改变。在一些实施方案中，肿 瘤组织样品可从手术切除的组织获得。组织样品和细胞样品还可在不进 行侵入式手术的情况下通过例如用细针刺取胸壁或腹壁或乳房、甲状腺 或其他部位的肿块，并取出细胞物质(细针抽吸活检)而获得。

根据样品的性质、所采用的测定和实施者的方便性，所获得的生 物样品可以以新鲜、冷冻或固定(例如，石蜡包埋)的形式使用。虽然新 鲜、冷冻和固定的物质适用于各种RNA和蛋白质测定，但通常新鲜组 织对离体活性测量可能是优选的。

还可采用固定的组织样品。常通过福尔马林、甲醛或戊二醛，或 例如通过醇浸泡来固定通过活检获得的组织。如本领域已知的，固定的 生物样品通常被脱水并包埋在石蜡或其他固体支持体中。参见文献 Plenat等人,2001,Ann.Pathol.21:29-47。未包埋、固定的组织，以及固 定且包埋的组织均可在本方法中使用。可用有机溶剂去除用于包埋固定 组织的固体支持体，以使得保存的组织随后能够再水合。

在一些情况下，所述测定包括细胞或组织培养步骤。培养方法是 本领域公知的。例如，可采用酶(如胶原酶和透明质酸酶)和/或物理破坏 (例如，反复穿过25号针)使来自活检的细胞散开从而分离细胞，通过离 心收集细胞，并将其重悬在所需的缓冲液或培养基中以供培养，立即分 析，或进一步处理。

受试者/患者群体

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有实体瘤的人。在其他实施方案中，根据 本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是易发或易患实体瘤的人。 在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是 处于发展出实体瘤的风险中的人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有被确定为缺乏p53灭活突变并且/或者 表达野生型p53的实体瘤的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方 法对实体瘤进行治疗的受试者是易发或易患被确定为缺乏p53灭活突变 并且/或者表达野生型p53的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本文 提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是处于发展出被确定为缺乏p53 灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的风险中的人。如本文所用 的，p53灭活突变为导致p53的体外凋亡活性丧失(或降低)的任何突变。 p53灭活突变的非限制性实例被包括在表1a中。相应地，在一些实施方 案中，根据如本文提供的组合物治疗的患有实体瘤的受试者是已被诊断 或被诊断为患有被确定为缺乏p53灭活突变(如表1a中所示的那些)的实 体瘤的人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有被确定为具有p53功能获得突变的实体 瘤的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的 受试者是易发或易患被确定为具有p53功能获得突变的实体瘤的人。在 一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是处 于发展出被确定为具有p53功能获得突变的实体瘤的风险中的人。如本 文所用的，p53功能获得突变是使得突变p53发挥出的致癌功能超出其 相对于野生型p53肿瘤抑制功能的负主导的任何突变。p53功能获得突 变体蛋白质可表现出新的活性，该新活性可对肿瘤进展的各个阶段和抗 癌治疗的抗性增加有积极贡献。p53功能获得突变的非限制性实例被包 括在表1b中。相应地，在一些实施方案中，根据如本文提供的组合物治 疗的患有实体瘤的受试者是已被诊断或被诊断为患有被确定为具有p53 功能获得突变(如表1b中所示的那些)的实体瘤的人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有非p53阴性的实体瘤的人。在其他实施 方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是易发或易患 非p53阴性的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法对 实体瘤进行治疗的受试者是处于发展出非p53阴性的实体瘤的风险中的 人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有功能部分丧失突变的p53的实 体瘤的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗 的受试者是易发或易患表达具有功能部分丧失突变的p53的实体瘤的人。 在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是 处于发展出表达具有功能部分丧失突变的p53的实体瘤的风险中的人。 如本文所用的，“p53功能部分丧失”突变是指该突变p53表现出一定水 平的正常p53功能，但其程度更低或更缓慢。例如，p53功能部分丧失 可指细胞的细胞分裂被阻滞为更低程度或更缓慢。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有拷贝丢失突变和灭活突变的 p53的实体瘤的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤 进行治疗的受试者是易发或易患表达具有拷贝丢失突变和灭活突变的 p53的实体瘤的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是处于发展出表达具有拷贝丢失突变和灭活突变的 p53的实体瘤的风险中的人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有拷贝丢失突变的p53的实体瘤 的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是易发或易患表达具有拷贝丢失突变的p53的实体瘤的人。在一些 实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是处于发 展出表达具有拷贝丢失突变的p53的实体瘤的风险中的人。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有表达具有一个或多个沉默突变的p53的 实体瘤的人。在其他实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治 疗的受试者是易发或易患表达具有一个或多个沉默突变的p53的实体瘤 的人。在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是处于发展出表达具有一个或多个沉默突变的p53的实体瘤的风险 中的人。如本文所用的沉默突变是不导致编码的p53氨基酸序列改变的 突变。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被诊断或被诊断为患有被确定为缺乏显性p53灭活突变的实体 瘤的人。如本文所用的，显性p53灭活突变或显性失活突变是其中突变 的p53抑制或破坏野生型p53基因的活性的突变。

表1a：示例性p53灭活突变

表1b.示例性p53激活突变

表1a和表1b是指图1中所示的野生型人TP53肿瘤蛋白p53的序列。 氨基酸改变被报告为：被置换的氨基酸，紧接着是被置换的氨基酸在野生 型p53序列中的位置，紧接着是用于置换的氨基酸。例如，L344P表明在 野生型序列的344位置处的赖氨酸(K)被脯氨酸(P)替代。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是难治性的患者。在某些实施方案中，难治性患者是对标准疗法(例 如，手术、放疗、抗雄激素疗法和/或药物疗法如化疗)而言难治性的患 者。在某些实施方案中，当实体瘤未被显著根除和/或一种或多种症状未 得到显著缓解时，患有该实体瘤的患者对疗法而言是难治性的。患者是 否难治的确定可通过本领域已知的用于测定实体瘤治疗的有效性的任何 方法在体内或体外进行。在多个实施方案中，当与实体瘤相关的一个或 多个肿瘤未被缩小或已经增大时，患有该实体瘤的患者是难治性的。在 多个实施方案中，当一个或多个肿瘤转移和/或扩散至另一器官时，患有 该实体瘤的患者是难治性的。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法对实体瘤进行治疗的受 试者是已被证实对除了用本发明拟肽大环化合物治疗之外的疗法而言是 难治性的，但不再进行这些疗法的人。在某些实施方案中，根据本文提 供的方法对实体瘤进行治疗的受试者是已接受一种或多种常规抗癌疗法 如手术、药物疗法如化疗、抗雄激素疗法或放疗的人。这些患者中有难 治性患者，对常规疗法而言太年轻的患者，以及尽管用现有疗法治疗但 仍有肿瘤复发的患者。

在一些实施方案中，所述受试者是已经历至少一次不成功的既往 实体瘤治疗和/或疗法的人。

检测野生型p53和/或p53突变的方法

可测定来自受试者的肿瘤样品，以便确定p53灭活突变的缺乏和/ 或野生型p53的表达。

为了检测组织中的p53野生型基因和/或p53灭活突变的缺乏，分 离没有周围正常组织的组织可能是有帮助的。用于富集肿瘤细胞的组织 制品的手段是本领域已知的。例如，可从石蜡或恒冷切片机切片分离组 织。还可通过流式细胞术将癌细胞与正常细胞分离。这些以及其他用于 将肿瘤与正常细胞分离的技术是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细 胞高度污染，则突变的检测可能更加困难。

可通过对存在于肿瘤组织中的p53等位基因(或多个p53等位基因) 进行分子克隆并使用本领域公知的技术对该等位基因进行测序来完成点 突变的检测。或者，可使用聚合酶链反应直接从来自肿瘤组织的基因组 DNA制品扩增p53基因序列。然后可确定经扩增序列的DNA序列。聚 合酶链反应本身是本领域公知的。参见，例如，Saiki等人,Science,Vol.239,p.487,1988；美国专利号4,683,202；以及美国专利号4,683,195。

也可检测p53基因的特定缺失。例如，针对p53基因或周围标志 物基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可用于对p53等位基因的丧 失进行评分。可使用如本领域已知的用于检测缺失的其他技术。

还可基于p53基因的野生型表达产物的丧失来检测野生型p53基 因的丧失。这样的表达产物包括mRNA以及p53蛋白质产物本身。可通 过直接对mRNA进行测序或经由从mRNA制备的cDNA的分子克隆来 检测点突变。可使用本领域公知的DNA测序技术来确定所克隆的cDNA 的序列。还可经由聚合酶链反应(PCR)对cDNA进行测序。

或者，可使用错配检测来检测p53基因或其mRNA产物中的点突 变。该方法可涉及使用与人野生型p53基因互补的标记的核糖核酸探针。 将核糖核酸探针与从肿瘤组织中分离的mRNA或DNA退火(杂交)在一 起，并随后用能够检测双链体RNA结构中的一些错配的RNA酶A进行 消化。如果RNA酶A检测到错配，则其在错配位点切割。因此，当退 火的RNA制品在电泳凝胶基质上得到分离时，如果错配已被检测到并 被RNA酶A切割，则可看到比核糖核酸探针与p53 mRNA或DNA的 全长双链体RNA更小的RNA产物。核糖核酸探针不需要是p53 mRNA或基因的全长，而可为p53 mRNA或基因的区段。如果该核糖核酸探针 仅包含p53 mRNA或基因的区段，则将期望使用多个这些探针来筛选整 个mRNA序列的错配。

以类似的方式，可通过酶或化学切割，使用DNA探针来检测错配。 参见，例如，Cotton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.85,4397,1988； 和Shenk等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.72,p.989,1975。或者，可 通过错配的双链体相对于匹配的双链体的电泳迁移率的变化来检测错配。 参见，例如，Cariello,Human Genetics,vol.42,p.726,1988。采用核糖核 酸探针或DNA探针，可在杂交前使用PCR(参见下文)来扩增可能含有 突变的细胞mRNA或DNA。

还可使用等位基因特异性探针筛选已通过使用聚合酶链反应扩增 的来自肿瘤组织的p53基因的DNA序列。这些探针为核酸寡聚物，其 各自含有携带已知突变的p53基因序列的区域。例如，一个寡聚物可为 约30个核苷酸的长度，对应于p53基因序列的一部分。在编码p53基因 的第175个密码子的位置，该寡聚物编码丙氨酸，而不是野生型密码子 缬氨酸。通过使用一连串这样的等位基因特异性探针，可筛选PCR扩增 产物以鉴别p53基因中先前鉴别的突变的存在。等位基因特异性探针与 扩增的p53序列的杂交可在例如尼龙过滤器上进行。与特定探针的杂交 表明，该肿瘤组织中存在与该等位基因特异性探针相同的突变。

通过多样化的一系列高分辨率、高通量微阵列平台的开发和应用， 促进了肿瘤细胞中p53基因结构改变的鉴别。基本上有两种类型的阵列： 携带来自克隆核酸的PCR产物的阵列(例如，cDNA、BAC、粘粒)和使 用寡核苷酸的阵列。每种都有优点和缺点，但现在可以调查全基因组 DNA拷贝数异常和表达水平，从而允许将肿瘤细胞的损失、增加和扩增 与在相同样品中过表达和低表达的基因相互关联。提供肿瘤中mRNA水 平估计值的基因表达阵列已经产生了可鉴定基因表达水平、可变剪接事 件和mRNA加工改变的外显子特异性阵列。还使用寡核苷酸阵列来探询 整个基因组中的单核苷酸多态性(SNP)以供联系和关联研究，并且这些寡 核苷酸阵列已经适应于量化拷贝数异常和杂合性丢失事件。最终DNA 测序阵列将允许染色体区域和整个基因组的重新测序。

还考虑使用基于SNP的阵列或其他基因阵列或芯片来确定野生型 p53等位基因的存在以及突变的结构。单核苷酸多态性(SNP)——DNA 中单个位点的变异——是基因组中最常见的变异类型。例如，在人类基 因组中估计有500-1000万个SNP。由于SNP在整个进化中及群体内高 度保守，因此将SNP的图谱作为研究的优秀基因型标记物。SNP阵列是 用于研究整个基因组的有用工具。

此外，SNP阵列可用于研究杂合性丢失(LOH)。LOH是一种等位 基因不平衡的形式，其可由等位基因完全丧失或一个等位基因相对于另 一个等位基因的拷贝数增加而导致。虽然存在其他基于芯片的方法(例如， 比较基因组杂交仅可检测基因组增加或缺失)，但SNP阵列具有检测由 于单亲二体性(UPD)而导致的拷贝数中性LOH的额外优点。在UPD中，来自一个亲本的一个等位基因或整个染色体丢失，导致另一亲本等位基 因的重复复制(单亲＝来自一个亲本，二体性＝复制的)。在疾病情况下， 当野生型等位基因(例如，来自母本)丢失而存在两个拷贝的杂合等位基 因(例如，来自父本)时，这种情况可能是病态的。SNP阵列的使用在癌 症诊断中具有巨大的潜力，因为LOH是大多数人类癌症的显著特征。基于SNP阵列技术的最近研究已经表明，不仅实体瘤(例如，胃癌，肝 癌等)，而且血液恶性肿瘤(ALL、MDS、CML等)由于基因组缺失或UPD 以及基因组获得而具有较高的LOH率。在本公开内容中，使用高密度SNP阵列检测LOH允许鉴别等位基因不平衡的模式，以确定野生型p53等位基因的存在(Lips等人,2005；Lai等人,2007)。

当前p53基因序列和单核苷酸多态性阵列的实例包括p53基因芯 片(Affymetrix,Santa Clara,CA)、Roche p53 Ampli-Chip(Roche Molecular Systems,Pleasanton,CA)、Ampli-Chip阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)、 SNP阵列6.0(Affymetrix,Santa Clara,CA)、BeadArrays(Illumina,San Diego,CA)等。

还可基于p53基因的野生型表达产物的突变来检测野生型p53基 因的突变。这样的表达产物包括mRNA以及p53蛋白质产物本身。可通 过直接对mRNA进行测序或经由从mRNA制备的cDNA的分子克隆来 检测点突变。可使用本领域公知的DNA测序技术来确定所克隆的cDNA 的序列。还可经由聚合酶链反应(PCR)对cDNA进行测序。可使用一组 单克隆抗体，其中每个与p53功能有关的表位均由单克隆抗体表示。该 组中单克隆抗体的结合的损失或干扰将指示p53蛋白的突变改变，并因 此指示p53基因本身的突变改变。还可在身体样品如血清、粪便或其他 体液如尿液和痰液中检测到突变p53基因或基因产物。上述用于检测组 织中突变p53基因或基因产物的相同技术可应用于其他身体样品。2.p53 蛋白水平的评估

还可通过筛选野生型p53蛋白功能的丧失来检测野生型p53基因 的丧失。尽管p53蛋白确定具有的所有功能尚未得到阐明，但至少两种 具体功能是已知的。蛋白质p53与SV40大T抗原以及腺病毒E1B抗原 结合。p53蛋白与这些抗原中的任一个或两者结合的能力的丧失表明蛋 白质的突变改变，该突变改变反映出基因本身的突变改变。或者，可使 用一组单克隆抗体，其中每个与p53功能有关的表位均由单克隆抗体表 示。该组中单克隆抗体的结合的损失或干扰将指示p53蛋白的突变改变， 并因此指示p53基因本身的突变改变。用于检测改变的p53蛋白的任何 手段均可用于检测野生型p53基因的丧失。

还可在身体样品如血清、粪便或其他体液如尿液和痰液中检测到 突变p53基因或基因产物。上述用于检测组织中突变p53基因或基因产 物的相同技术可应用于其他身体样品。

可在施用拟肽大环化合物之前、期间或之后的任何时间进行患有 实体瘤的患者中p53灭活突变的缺乏和/或野生型p53表达的确定。在一 些实施方案中，在向受试者第一次施用拟肽大环化合物之前，例如，在 向受试者第一次施用拟肽大环化合物之前约5年–1个月、4年–1个月、 3年–1个月、2年-1个月、1年–1个月、5年–1周、4年–1周、3年–1 个月、2年-1周、1年–1周、5年–1天、4年–1天、3年–1天、2年-1 天、1年–1天、15个月-1个月、15个月-1周、15个月-1天、12个月-1 个月、12个月-1周、12个月-1天、6个月-1个月、6个月-1周、6个月 -1天、3个月-1个月、3个月-1周或3个月-1天进行患有实体瘤的患者 中p53灭活突变的缺乏和/或野生型p53表达的确定。在一些实例中，在 向受试者第一次施用拟肽大环化合物之前至多6年、5年、4年、3年、 24个月、23个月、22个月、21个月、20个月、19个月、18个月、17 个月、16个月、15个月、14个月、13个月、12个月、11个月、10个 月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、 1个月、4周(28天)、3周(21天)、2周(14天)、1周(7天)、6天、5天、 4天、3天、2天或1天进行p53灭活突变的缺乏和/或野生型p53表达 的确认。在一些实例中，在向受试者第一次施用拟肽大环化合物的1个 月内进行p53灭活突变的缺乏的确认。在一些实例中，在向受试者第一 次施用拟肽大环化合物的21天内进行p53灭活突变的缺乏的确认。

实体瘤

可通过本方法治疗的实体瘤包括除淋巴癌之外的肿瘤和/或转移 (无论位于何处)，例如，大脑及其他中枢神经系统肿瘤(包括但不限于脑 膜、大脑、脊髓、颅神经及中枢神经系统的其他部位的肿瘤，例如，胶 质母细胞瘤或髓母细胞瘤)；头部和/或颈部癌症；乳腺肿瘤；循环系统 肿瘤(包括但不限于心脏、纵隔和胸膜及其他胸腔内器官的肿瘤、血管肿瘤和肿瘤相关血管组织)；排泄系统肿瘤(包括但不限于肾、肾盂、输尿 管、膀胱、其他及未指定的泌尿器官的肿瘤)；胃肠道肿瘤(包括但不限 于食道、胃、小肠、结肠、结直肠、直肠乙状结肠连接部、直肠、肛门 和肛管的肿瘤，累及肝脏和肝内胆管、胆囊、胆道的其他部位及未指定 部位、胰腺、其他以及消化器官的肿瘤)；口腔肿瘤(包括但不限于唇、 舌、齿龈、口底部、腭及口腔的其他部位、腮腺及唾液腺的其他部位、 扁桃体、口咽、鼻咽、梨状隐窝、下咽以及唇部、口腔和咽部中的其他 部位的肿瘤)；生殖系统肿瘤(包括但不限于外阴、阴道、子宫颈、子宫 体、子宫、卵巢及与女性生殖器官相关的其他部位、胎盘、阴茎、前列 腺、睾丸及与男性生殖器官相关的其他部位的肿瘤)；呼吸道肿瘤(包括 但不限于鼻腔和中耳、副鼻窦、喉部、气管、支气管和肺的肿瘤，例如， 小细胞肺癌或非小细胞肺癌)；骨骼系统肿瘤(包括但不限于骨和四肢的 关节软骨、骨关节软骨及其他部位的肿瘤)；皮肤肿瘤(包括但不限于皮 肤恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞 癌、间皮瘤、卡波西肉瘤)；以及累及包括周围神经和自主神经系统、结 缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼及附件、甲状腺、肾上腺及其他 内分泌腺和相关结构在内的其他组织的肿瘤，淋巴结的继发和未指定的 恶性肿瘤，呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤，以及其他部位的继发性恶性肿瘤。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是胰腺癌、膀胱 癌、结肠癌、肝癌、结直肠癌(结肠癌或直肠癌)、乳腺癌、前列腺癌、 肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、头颈癌、黑 色素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌、皮肤癌、眼肿瘤、绒 膜癌(胎盘的肿瘤)、肉瘤或软组织癌。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是膀胱癌、骨癌、 乳腺癌、宫颈癌、CNS癌、结肠癌、眼肿瘤、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺 癌、绒膜癌(胎盘的肿瘤)、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、软组织癌或胃癌。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是乳腺癌。可以 通过本发明的方法治疗的乳腺癌的非限制性实例包括原位导管癌(DCIS 或导管内癌)、原位小叶癌(LCIS)、侵袭性(或浸润性)导管癌、侵袭性(或 浸润性)小叶癌、炎性乳腺癌、三阴性乳腺癌、乳头的佩吉特病、叶状瘤 (叶状肿瘤或叶状囊性肉瘤)、血管肉瘤、腺样囊性(或囊性腺样)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌、微乳头状癌和混合癌。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是骨癌。可以通 过本发明的方法治疗的骨癌的非限制性实例包括骨肉瘤、软骨肉瘤、尤 因肉瘤家族肿瘤(ESFT)。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是皮肤癌。可以 通过本发明的方法治疗的皮肤癌的非限制性实例包括黑色素瘤、基底细 胞皮肤癌和鳞状细胞皮肤癌。

在一些实例中，通过本发明的方法治疗的实体瘤是眼肿瘤。可以 通过本发明的方法治疗的眼肿瘤的非限制性实例包括眼肿瘤是脉络膜痣、 脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移、脉络膜血管瘤、脉络膜骨瘤、虹膜黑色 素瘤、葡萄膜黑色素瘤、黑素细胞瘤、转移性视网膜毛细血管瘤、RPE 先天性肥大、RPE腺瘤或视网膜母细胞瘤。

在一些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的实体瘤不包括已 知与HPV(人乳头瘤病毒)相关的癌症。所排除的组包括HPV阳性宫颈 癌、HPV阳性肛门癌和HPV头颈癌，如口咽癌。

通过本文公开的方法进行的癌症治疗的有效性和/或响应可通过 本领域已知的任何方法来确定。该响应可以是完全响应，其可以是客观 响应、临床响应或对治疗的病理响应。例如，可根据如Therese等人,New Guidelines to Evaluate the Response toTreatment in Solid Tumors,J.of the National Cancer Institute 92(3):205-207(2000)所述的用于评价对实体瘤治 疗的响应的技术来确定该响应，该文献通过引用以全文并入于此。该响 应可以是存活持续时间(或这种持续时间的概率)或无进展间隔时间。这类事件的计时或持续时间可以大约从诊断时间，或大约从治疗开始的时 间，或大约从治疗结束的时间(如拟肽大环化合物的最后施用)来确定。 或者，该响应可基于肿瘤大小、肿瘤体积或肿瘤代谢的降低，或基于总 肿瘤负荷，或基于血清标志物的水平(特别是在疾病状态下血清标志物升 高的情况下)。

个体患者的响应可被描述为完全响应、部分响应、稳定的疾病和 进行性疾病，这些术语是本领域中所理解的。在一些实施方案中，该响 应是完全响应(CR)。在一些实例中，完全响应可被定义为所有目标病变 的消失，即任何病态淋巴结(无论是目标或是非目标的)的短轴均必须缩 小至<10mm。在某些实施方案中，该响应是部分响应(PR)。部分响应可被定义为以基线直径总和为参考，目标病变的直径总和减少至少30％。 在一些实施方案中，该响应为进行性疾病(PD)。进行性疾病可被定义为 以研究的最小总和(如果基线总和是最小的，则这包括基线总和)为参考， 目标病变的直径总和至少20％的增加，以及目标病变的直径总和至少5 mm的绝对增加。一个或多个新病变的出现也可被视为进展。在一些实施方案中，该疾病可为稳定的疾病(SD)。稳定的疾病可被定义为以研究 中的最小直径总和为参考，没有出现符合PR的充分缩小也没有出现符 合PD的充分增加的情况。在某些实施方案中，该响应是病理学完全响 应。例如通过病理学家在检查手术或活检时移除的组织后确定的病理学 完全响应通常是指手术样本中没有侵袭性肿瘤细胞的组织学证据。

联合治疗

本文还提供了用于治疗实体瘤的联合疗法，其包括将本文公开的 拟肽大环化合物与一种或多种其他疗法联合施用至患有被确定为缺乏 p53灭活突变并且/或者表达野生型p53的实体瘤的受试者。在特定实施 方案中，本文呈现了用于治疗实体瘤的联合疗法，其包括将有效量的拟 肽大环化合物与有效量的另一疗法联合施用至患有被确定为缺乏p53灭 活突变的实体瘤并且/或者患有表达野生型p53的实体瘤的受试者。

如本文所用的，在拟肽大环化合物施用的上下文中，术语“联合” 是指在施用用于治疗实体瘤的一种或多种其他疗法(例如，药剂、手术或 放疗)之前、同时或之后施用拟肽大环化合物。术语“联合”的使用不限制 向受试者施用拟肽大环化合物以及一种或多种其他疗法的顺序。在特定 实施方案中，拟肽大环化合物的施用与一种或多种其他疗法的施用之间 的时间间隔可为约1-5分钟、1-30分钟、30分钟至60分钟、1小时、1-2 小时、2-6小时、2-12小时、12-24小时、1-2天、2天、3天、4天、5 天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、26周、52周、11-15周、15-20周、20-30周、30-40 周、40-50周、1个月、2个月、3个月、4个月5个月、6个月、7个月、 8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年，或其间的任 意时间段。在某些实施方案中，拟肽大环化合物与一种或多种其他疗法 的施用相隔少于1天、1天、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、 6个月、1年、2年或5年。

在一些实施方案中，本文提供的联合疗法包括每周1-2次、每周 一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一 次、每7周一次或每8周一次的拟肽大环化合物施用，以及每周一次、 每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每2个月(例如，约 8周)一次、每3个月(例如，约12周)一次或每4个月(例如，约16周) 一次地施用一种或多种其他疗法。在某些实施方案中，拟肽大环化合物 以及一种或多种其他疗法周期地施用至受试者。周期疗法包括持续一段 时间施用拟肽大环化合物，紧接着持续一段时间施用一种或多种其他疗 法，并且重复这种顺序施用。在某些实施方案中，周期疗法还可包括一 段时间内不施用拟肽大环化合物或其他疗法的休息期(例如，2天、3天、 4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、10周、20周、 1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9 个月、10个月、11个月、12个月、2年或3年)。在一个实施方案中， 所施用的周期的数目为1至12个周期、2至10个周期或2至8个周期。

在一些实施方案中，本文提供的用于治疗实体瘤的方法包括在联 合施用拟肽大环化合物与其他疗法之前，将拟肽大环化合物作为单一药 剂施用一段时间。在某些实施方案中，本文提供的用于治疗癌症的方法 包括在联合施用拟肽大环化合物与其他疗法之前，将其他疗法单独施用 一段时间。

在一些实施方案中，相对于单独施用拟肽大环化合物或一种或多 种其他疗法，根据本文呈现的方法的拟肽大环化合物以及所述一种或多 种其他疗法的施用具有叠加效应。在一些实施方案中，相对于单独施用 拟肽大环化合物或一种或多种其他疗法，根据本文呈现的方法的拟肽大 环化合物以及所述一种或多种其他疗法的施用具有协同效应。

如本文所用的，“协同”是指拟肽大环化合物与一种或多种其他疗 法(例如，药剂)联合施用的效果，该组合比任两种或更多种单一疗法(例 如，药剂)的叠加效应更加有效。在特定实施方案中，联合疗法的协同效 应允许使用更低剂量(例如，次优剂量)的拟肽大环化合物或其他疗法， 并且/或者允许向受试者更低频率地施用拟肽大环化合物或其他疗法。在 某些实施方案中，使用更低剂量的拟肽大环化合物或其他疗法和/或更低 频率地施用该拟肽大环化合物或所述其他疗法的能力使得分别与该拟肽 大环化合物或所述其他疗法的施用相关的对受试者的毒性降低，而不降 低该拟肽大环化合物或所述其他疗法分别在治疗实体瘤中的效力。在一 些实施方案中，协同效应导致该拟肽大环化合物或每一种所述其他疗法 在治疗癌症中的效力提高。在一些实施方案中，拟肽大环化合物与一种 或多种其他疗法的组合的协同效应避免或减少了与使用任一种疗法相关 的不良作用或不想要的副作用。

拟肽大环化合物与一种或多种其他疗法的组合可在同一药物组合 物中施用至受试者。或者，拟肽大环化合物以及一种或多种其他疗法可 在单独的药物组合物中同时施用至受试者。拟肽大环化合物以及一种或 多种其他疗法可在单独的药物组合物中顺序地施用至受试者。还可通过 相同或不同的给药途径将拟肽大环化合物以及一种或多种其他疗法施用 至受试者。

本文提供的联合疗法包括将拟肽大环化合物与常规或已知的用于 治疗癌症的疗法联合施用至有需要的受试者。用于癌症或与癌症相关的 状况的其他疗法旨在控制或减轻一种或多种症状。相应地，在一些实施 方案中，本文提供的联合疗法包括向有需要的受试者施用止痛药或旨在 缓解或控制与癌症相关的一种或多种症状或与该癌症相关的状况的其他 疗法。

可与拟肽大环化合物联合使用的抗癌剂的非限制性实例包括：激 素剂(例如，芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)和雌激素 受体拮抗剂)、化疗剂(例如，微管解装配阻断剂、抗代谢物、拓扑异构 酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂)、抗-抗原剂(例如，VEGF拮抗剂、 受体拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、血管靶向剂(VTA)/血管破坏剂(VDA))、 放射疗法以及常规手术。

可与拟肽大环化合物联合使用的激素剂的非限制性实例包括芳香 酶抑制剂、SERM和雌激素受体拮抗剂。为芳香酶抑制剂的激素剂可以 是甾体或非甾体的。非甾体激素剂的非限制性实例包括来曲唑、阿那曲 唑、氨鲁米特、法倔唑和伏罗唑。甾体激素剂的非限制性实例包括阿诺 新(依西美坦)、福美坦和睾内酯。为SERM的激素剂的非限制性实例包括他莫昔芬(以

可与拟肽大环化合物联合使用的化疗剂的非限制性实例包括微管 解装配阻断剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂。 为微管解装配阻断剂的化疗剂包括但不限于紫杉烷类(例如，紫杉醇(以

为抗代谢物的化疗剂包括但不限于叶酸抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、 氨基蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)；嘌呤抗代谢物(例如，克拉屈滨、氯 法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤)；嘧啶抗代谢物(例 如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨

为拓扑异构酶抑制剂的化疗剂包括但不限于I类(喜树属)拓扑异 构酶抑制剂(例如，托泊替康(以

为DNA交联剂(或DNA损伤剂)的化疗剂包括但不限于烷化剂(例 如，环磷酰胺、氮芥、异环磷酰胺(以

可与拟肽大环化合物联合施用至受试者的其他疗法的非限制性实 例包括：(1)他汀类，如洛伐他汀(例如，以

在一些实施方案中，本文公开的拟肽大环化合物可在临床相关的 浓度下抑制一种或多种转运蛋白酶(例如，OATP1B1、OATP1B3、BSEP)。 因此，本文公开的这类拟肽大环化合物可与主要由肝胆转运蛋白清除的 药物相互作用。具体地，甲氨蝶呤和他汀类(例如，阿托伐他汀、氟伐他 汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀)不能在施用这类拟肽大环化合物的48h、36h、24h或12h内(例如，24h内)给 药。可能受共施用这类拟肽大环化合物影响的示例性药物在下面列出。 在多个实施方案中，一种或多种选自表2的药物不能在施用这类拟肽大 环化合物的48h、36h、24h或12h内(例如，24h内)给药。

表2：可能受共施用本文公开的拟肽大环化合物影响的示例性药 物。

本发明提供了包括但不限于以下实施方案：

1.一种治疗有需要的人类受试者中被确定为缺乏p53灭活突变的 实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的 拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其 中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

2.一种治疗有需要的人类受试者中缺乏p53灭活突变的实体瘤的 方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环 化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽 大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

3.一种治疗有需要的人类受试者中的在p53基因中具有p53灭活 突变的实体瘤的方法，其中该方法包括向该人类受试者施用包含治疗有 效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的其药学上可接受的盐的药物组合 物，其中该拟肽大环化合物与MDM2和/或MDMX蛋白结合。

4.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤不是p53蛋白表达阴性的 (如表达野生型p53蛋白或具有部分功能性的突变p53蛋白的实体瘤)。

5.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达具有功能获得突变的 p53蛋白(如超级凋亡p53)。

6.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达具有导致功能部分丧 失的突变的p53蛋白。

7.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤中的细胞仅从p53基因的 单一基因组拷贝表达p53(例如，在细胞具有拷贝丢失突变，例如为单倍 功能不全时)。

8.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤表达具有一个或多个沉默 突变的p53蛋白。

9.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括 向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量的 其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合，并且其中所述实体瘤中的细胞是p53表达阴性 的。

10.如实施方案3所述的方法，其中所述实体瘤中的细胞在p53基 因的一个拷贝中具有p53灭活突变。

11.如实施方案10所述的方法，其中所述实体瘤中的细胞在p53 基因的第二拷贝中具有第二p53灭活突变。

12.如实施方案11所述的方法，其中所述p53基因的一个拷贝中的 p53灭活突变与p53基因的第二拷贝中的第二p53灭活突变相同。

13.如实施方案11所述的方法，其中所述p53基因的一个拷贝中的 p53灭活突变与p53基因的第二拷贝中的第二p53灭活突变不同。

14.如实施方案3或10-13所述的方法，其中所述p53基因中的p53 灭活突变导致缺乏从所述p53基因表达p53蛋白，或导致功能部分丧失 的部分p53蛋白的表达。

15.如实施方案3或10-13所述的方法，其中p53基因的第二拷贝 中的第二p53灭活突变导致缺乏从所述p53基因表达p53蛋白，或导致 功能部分丧失的部分p53蛋白的表达。

16.如实施方案2-15中任一项所述的方法，其中所述实体瘤的细胞 在p53基因的拷贝中具有至少一个突变，其中与从非突变p53基因的拷 贝表达的野生型p53相比，所述突变消除或降低从所述p53基因的拷贝 表达的p53蛋白的活性。

17.一种治疗有需要的人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包 括向该人类受试者施用包含治疗有效量的拟肽大环化合物或治疗等效量 的其药学上可接受的盐的药物组合物，其中该拟肽大环化合物与MDM2 和/或MDMX蛋白结合。

18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物破坏p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。

19.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其包括在施用所述药物 组合物之前确定所述实体瘤中缺乏所述p53灭活突变。

20.如实施方案19所述的方法，其中所述确定缺乏p53灭活突变包 括确认所述实体瘤中存在野生型p53。

21.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其包括确定所述实体瘤 中存在p53功能获得突变。

22.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确定所述实体瘤 中存在p53的灭活突变。

23.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确定所述实体瘤 中存在p53的拷贝丢失突变。

24.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确定所述实体瘤 中存在P53的功能部分丧失突变。

25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所 述拟肽大环化合物之前确认所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。

26.如实施方案25所述的方法，其中所述确认缺乏p53灭活突变包 括确认所述实体瘤中存在野生型p53。

27.如实施方案1-18中任一项所述的方法，其包括确认所述实体瘤 中存在p53功能获得突变。

28.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确认所述实体瘤 中存在p53的灭活突变。

29.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确认所述实体瘤 中存在p53的拷贝丢失突变。

30.如实施方案2-18中任一项所述的方法，其包括确认所述实体瘤 中存在P53的功能部分丧失突变。

31.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前1-15个月内进行。

32.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前1-12个月内进行.

33.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前1-3个月内进行。

34.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前1个月内进行。

35.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前21天内进行。

36.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前最多约1年内进行。

37.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前最多约2年内进行.

38.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述确定或确认 在施用所述药物组合物之前最多约3年内进行。

39.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致所述 人类受试者中p53途径的重新激活、肿瘤细胞增殖减少、p53蛋白增加、 p21增加和/或凋亡增加。

40.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量每周施用两次或三次。

41.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量每周施用两次或更多次。

42.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量每2或3周施用一次。

43.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量每1或2周施用一次。

44.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量在28天周期的第1天、第8天和第15天施用。

45.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的 剂量在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天施用。

46.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约0.5-20 mg。

47.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约0.5-10 mg。

48.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约0.04mg、 0.08mg、0.16mg、0.32mg、0.64mg、1.28mg、3.56mg、7.12mg或14.24 mg。

49.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、 2.5mg、5.0mg 10.0mg或20.0mg，并且所述药物组合物每周施用两次。

50.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、 2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述药物组合物每周施用两次。

51.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约0.32mg、 0.64mg、1.25mg、2.5或5.0mg，并且所述药物组合物每周施用两次。

52.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐为每千克人类受试者体重约0.32mg、0.64 mg、1.25mg 2.5或5.0mg，并且所述药物组合物在21天周期的第1天、 第4天、第8天和第11天施用。

53.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐为每千克人类受试者体重约0.16mg、0.32 mg、0.64mg、1.25mg、2.5、5.0mg或10mg，并且所述药物组合物在 28天周期的第1天、第8天和第15天施用。

54.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、 2.5mg、5.0mg 10.0mg或20.0mg，并且所述药物组合物每周施用一次。

55.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、 2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述药物组合物每周施用两次。

56.如实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、2.5mg、5.0mg 10.0mg或20.0mg，并且所述药物组合物每天施用一次， 在七天期间施用三次、五次或七次。

57.如实施方案39所述的方法，其中所述药物组合物每天静脉内施 用一次，在七天期间施用七次。

58.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所施用的拟肽大环 化合物或其药学上可接受的盐的量为每千克人类受试者体重约1.25mg、 2.5mg、5.0mg或10.0mg，并且所述药物组合物每天施用一次，在七天 期间施用三次、五次或七次。

59.如实施方案1-812中任一项所述的方法，其中所述药物组合物 每天静脉内施用一次，七天期间施用七次。

60.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在 0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h 或12h的时间内施用。

61.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在 0.25-2.0h的时间内施用。

62.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在 1h的时间内逐渐施用。

63.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在 2h的时间内逐渐施用。

64.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后1个月的时间内减小约95％、90％、85％、80％、75％、 70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、 15％、10％或5％。

65.如实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后1个月的时间内减小至少60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或95％。

66.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后1年的时间内减小约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、 15％、10％或5％。

67.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后1年的时间内减小至少60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％或95％。

68.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后6个月的时间内减小约95％、90％、85％、80％、75％、 70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、 15％、10％或5％。

69.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后6个月的时间内减小至少60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或95％。

70.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后3个月的时间段内减小约95％、90％、85％、80％、 75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、 20％、15％、10％或5％。

71.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致肿瘤 体积在治疗开始后3个月的时间段内减小至少60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或95％。

72.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤是稳定 的疾病。

73.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗导致所述 人类受试者的存活时间与如果所述人类受试者未用所述拟肽大环化合物 进行治疗而预期的人类受试者存活时间相比增加。

74.如实施方案73所述的方法，其中所述人类受试者的存活时间的 增加为至少30天。

75.如实施方案73所述的方法，其中所述人类受试者的存活时间的 增加为至少3个月。

76.如实施方案73所述的方法，其中所述人类受试者的存活时间的 增加为至少6个月。

77.如实施方案73所述的方法，其中所述人类受试者的存活时间的 增加为至少1年。

78.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物的体内循环半衰期为约1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、 10h或12h。

79.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物的体内循环半衰期为约4h。

80.如实施方案1-78中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物的体内循环半衰期为约6h。

81.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物的生物组织半衰期为约1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、 10h或12h。

82.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物的生物组织半衰期为约10h。

83.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述人类受试者对 所述实体瘤的一种或多种其他治疗而言是难治性的和/或无法忍受的。

84.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述人类受试者已 经历至少一种不成功的既往实体瘤治疗和/或疗法。

85.如实施方案1、4和18-84中任一项所述的方法，其中所述实体 瘤表达野生型p53蛋白。

86.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自胰 腺癌、膀胱癌、结肠癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、 肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、头颈癌、黑色素瘤、 神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌、皮肤癌、眼肿瘤、直肠癌、绒 膜癌(胎盘的肿瘤)、肉瘤和软组织癌、睾丸癌、胆囊癌、涎腺癌、脂肪 肉瘤、下颌下腺癌、GIST(肉瘤)、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、 胸腺瘤和胆管癌。

87.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自膀 胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、CNS癌、结肠癌、眼肿瘤、肾癌、肝癌、 肺癌、胰腺癌、绒膜癌(胎盘的肿瘤)、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、软组 织癌、胃癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、神经母细胞瘤或神经内分泌癌。

88.如实施方案86或87所述的方法，其中所述眼肿瘤为脉络膜痣、 脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移、脉络膜血管瘤、脉络膜骨瘤、虹膜黑色 素瘤、葡萄膜黑色素瘤、黑素细胞瘤、转移性视网膜毛细胞血管瘤、RPE 先天性肥大、RPE腺瘤或视网膜母细胞瘤。

89.如实施方案1-88中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自非 小细胞肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、 前列腺癌和乳腺癌。

90.如实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为乳腺 癌。

91.如实施方案1-88中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为胆囊 癌。

92.如实施方案1-88中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为胆管 癌。

93.如实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为神经 内分泌癌。

94.如实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为骨癌。

95.如实施方案94所述的方法，其中所述胃癌为骨肉瘤。

96.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤为皮肤 癌。

97.如实施方案96所述的方法，其中所述皮肤癌为黑色素瘤。

98.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤不是 HPV阳性的癌症。

99.如实施方案98所述的方法，其中所述实体瘤不是HPV阳性的 宫颈癌、HPV阳性的肛门癌或HPV阳性的头颈癌，如口咽癌。

100.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述药 物组合物。

101.如前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括除所述药 物组合物之外还向所述人类受试者施用治疗有效量的至少一种额外的治 疗剂和/或提供治疗程序。

102.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述人类受试者对 所述治疗表现出完全响应。

103.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述人类受试者对 所述治疗表现出部分响应。

104.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤是进行 性疾病。

105.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述实体瘤是稳定 的疾病。

106.如前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括确定所施 用的药物组合物的临床活性。

107.如实施方案106所述的方法，其中所述临床活性通过选自计算 机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和骨扫描的成像方法来确定。

108.如前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括在一个或 多个特定时间点从所述人类受试者获得生物样品，并用分析程序分析该 生物样品。

109.如实施方案108所述的方法，其中所述分析程序可选自血液化 学分析、染色体易位分析、针吸活检、组织活检、荧光原位杂交、实验 室生物标记分析、免疫组织化学染色法、流式细胞术，或它们的组合。

110.如实施方案108所述的方法，其进一步包括将所述分析程序的 结果制表和/或作图。

111.如实施方案108所述的方法，其中所述一个或多个特定时间点 包括在向所述人类受试者施用所述药物组合物之前的时间点。

112.如实施方案108所述的方法，其中所述一个或多个特定时间点 包括在向所述人类受试者施用所述药物组合物之后的时间点。

113.如实施方案108所述的方法，其中所述一个或多个特定时间点 可包括在向所述人类受试者施用所述药物组合物之前的时间点和之后的 时间点。

114.如实施方案113所述的方法，其进一步包括比较在向所述人类 受试者施用所述药物组合物之前和之后收集的生物样品。

115.如实施方案108所述的方法，其中所述一个或多个特定时间点 包括在向所述人类受试者施用所述药物组合物之前和之后的多个时间点。

116.如实施方案115所述的方法，其进一步包括比较在所述多个时 间点收集的生物样品。

117.如实施方案108所述的方法，其中所述生物样品用于生物标记 评估。

118.如实施方案108所述的方法，其中所述生物样品用于药代动力 学评价。

119.如实施方案118所述的方法，其中所述药代动力学评价包括研 究所述生物样品中的拟肽大环化合物、其药学上可接受的盐和/或代谢物 在特定时间点的水平。

120.如实施方案119所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。

121.如实施方案108所述的方法，其中所述生物样品用于药效学评 价。

122.如实施方案121所述的方法，其中所述药效学评价包括研究所 述生物样品中的p53、MDM2、MDMX、p21和/或胱天蛋白酶在特定时 间点的水平。

123.如实施方案122所述的方法，其中所述生物样品是肿瘤样本。

124.如实施方案108所述的方法，其中所述生物样品用于免疫原性 测定。

125.如前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括在向所述 人类受试者施用所述药物组合物之前在所述人类受试者中选择并且/或 者鉴别至少一处目标病变。

126.如实施方案125所述的方法，其进一步包括测量在一个或多个 特定时间点的累积直径，其中该累积直径是所述至少一处目标病变在所 述特定时间点的直径之和。

127.如实施方案126所述的方法，其进一步包括测量基线直径总和， 其中该基线直径总和是在向所述人类受试者施用所述药物组合物之前， 所述至少一处目标病变的直径之和。

128.如实施方案125所述的方法，其中所述治疗导致所述至少一处 目标病变消失。

129.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述治疗后，所 述人类受试者的所有病态淋巴结都表现出短轴缩短至小于10mm。

130.如实施方案127所述的方法，其中所述一个或多个特定时间点 包括所述治疗之后的时间点。

131.如实施方案130所述的方法，其中在所述治疗后的时间点的累 积直径比所述基线直径总和至少小30％。

132.如实施方案127所述的方法，其中以所述基线直径总和为参考， 所述治疗既不导致所述一个或多个特定时间点的累积直径充分增加，也 不导致其充分降低。

133.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物或其药学上可接受的盐不是细胞色素p450同种型的抑制剂。

134.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗基本不导 致剂量限制的血小板减少症。

135.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗基本不在 正常造血器官和/或组织中产生不良反应。

136.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗基本不在 所述人类受试者中产生与所述药物组合物施用有关的不良事件。

137.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述治疗基本不在 所述人类受试者中产生与所述拟肽大环化合物施用有关的严重不良事件。

138.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过对编码p53 蛋白的核酸进行DNA测序来确定所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。

139.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过基于RNA阵 列的检测来确定所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。

140.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过RNA分析来 确定所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。

141.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过聚合酶链反应 (PCR)来确定所述实体瘤中缺乏p53灭活突变。

142.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述p53灭活突变 包括在所述蛋白质的DNA结合域中的突变。

143.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述p53灭活突变 包括错义突变。

144.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述p53灭活突变 为显性灭活突变。

145.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述p53灭活突变 包括表1a中所示的一个或多个突变。

146.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述p53灭活突变 包括选自V173L、R175H、G245C、R248W、R249S和R273H的一个或 多个突变。

147.如实施方案5所述的方法，其中所述p53功能获得突变包括表 1b中所示的一个或多个突变。

148.一种治疗人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括在28 天周期的第1天、第8天和第15天向所述人类受试者施用每千克人类受 试者体重0.5-20mg的拟肽大环化合物或其药学上可接受的盐。

149.如实施方案148所述的方法，其中所述实体瘤被确定为缺乏 p53灭活突变。

150.如实施方案148或149所述的方法，其中向所述人类受试者施 用每千克人类受试者体重0.5-10mg的所述拟肽大环化合物或其药学上 可接受的盐。

151.如实施方案148-150中任一项所述的方法，其中在第8天和/ 或第15天输入的所述拟肽大环化合物的量大于在第1天输入的所述拟肽 大环化合物的量。

152.如实施方案148-150中任一项所述的方法，其中在第8天和/ 或第15天输入的所述拟肽大环化合物的量等于在第1天输入的所述拟肽 大环化合物的量。

153.如实施方案148-150中任一项所述的方法，其中在第1天和/ 或第8天输入的所述拟肽大环化合物的量大于在第15天输入的所述拟肽 大环化合物的量。

154.如实施方案148-150中任一项所述的方法，其中在第1天、第 8天和第15天施用等量的所述拟肽大环化合物。

155.如实施方案148-154中任一项所述的方法，其中所述28天周 期重复2次或3次。

156.一种治疗人类受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括在21 天周期的第1天、第4天、第8天和第11天向所述人类受试者施用每千 克人类受试者体重0.32-10mg的拟肽大环化合物或其药学上可接受的盐。

157.如实施方案156所述的方法，其中所述实体瘤被确定为缺乏 p53灭活突变。

158.如实施方案156或157中任一项所述的方法，其中在21天周 期的第1天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重0.32 mg的所述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

159.如实施方案156或157所述的方法，其中在21天周期的第1 天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重0.64mg的所 述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

160.如实施方案156或157所述的方法，其中在21天周期的第1 天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重1.25mg的所 述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

161.如实施方案156或157中任一项所述的方法，其中在21天周 期的第1天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重2.5mg 的所述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

162.如实施方案156或157所述的方法，其中在21天周期的第1 天、第4天、第8天和第11天施用每千克人类受试者体重5.0mg的所 述拟肽大环化合物或药学上可接受的盐。

163.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物包含与表3、表3a、表3b和表3c任一个中的氨基酸序列具有至少约 60％、70％、80％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中该拟肽大环化 合物具有下式：

其中：

每个A、C、D和E独立地为氨基酸；

每个B独立地为氨基酸、

每个R

每个R

每个L和L’独立地为式–L

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

每个R

每个R

每个R

每个v独立地为整数；

每个w独立地为3-1000的整数；

u为1-10的整数；

每个x、y和z独立地为0-10的整数；且

每个n独立地为1-5的整数。

164.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述拟肽大环化合 物具有下式：

其中：

Xaa

每个D和E独立地为氨基酸；

每个R

每个L或L’独立地为大环形成连接体

每个R

每个R

每个R

每个R

v为1-1000的整数；

w为0-1000的整数。

165.如实施方案163或163所述的方法，其中所述大环形成连接体 中的至少一个具有式–L

每个L

每个R

每个K独立地为O、S、SO、SO

每个R

每个n独立地为1-5的整数。

166.如实施方案163所述的方法，其中w为3-1000，例如3-500、 3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10的整数。

167.如实施方案163所述的方法，其中Xaa

168.如实施方案163-167中任一项所述的方法，其中每个E独立地 为选自Ala(丙氨酸)、D–Ala(D–丙氨酸)、Aib(α–氨基异丁酸)、Sar(N– 甲基甘氨酸)和Ser(丝氨酸)的氨基酸。

169.如实施方案163-167中任一项所述的方法，其中每个E独立地 为Ala(丙氨酸)、Ser(丝氨酸)或其类似物。

170.如实施方案163-169中任一项所述的方法，其中[D]

171.如实施方案163-170中任一项所述的方法，其中w为1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10。

172.如实施方案163-170中任一项所述的方法，其中w为3-10。

173.如实施方案163-170中任一项所述的方法，其中w为3-6。

174.如实施方案163-170中任一项所述的方法，其中w为6-10。

175.如实施方案163-170中任一项所述的方法，其中w为6。

176.如实施方案163-175中任一项所述的方法，其中v为1-10。

177.如实施方案163-175中任一项所述的方法，其中v为2-10。

178.如实施方案163-175中任一项所述的方法，其中v为2-5。

179.如实施方案163-175中任一项所述的方法，其中v为2。

180.如实施方案163或163所述的方法，其中每个L

181.如实施方案163或164所述的方法，其中L

182.如实施方案163或164所述的方法，其中L为亚烷基、亚烯 基或亚炔基。

183.如实施方案163或164所述的方法，其中L为亚烷基。

184.如实施方案163或164所述的方法，其中L为C

185.如实施方案163或164所述的方法，其中L为C

186.如实施方案163中任一项所述的方法，其中每个R

187.如实施方案163中任一项所述的方法，其中R

188.如实施方案163中任一项所述的方法，其中每个R

189.如实施方案163中任一项所述的方法，其中R

190.如实施方案163所述的方法，其中x+y+z＝6。

191.如实施方案163所述的方法，其中u为1。

192.如实施方案163-191中任一项所述的方法，所述拟肽大环化合 物包含至少一个为氨基酸类似物的氨基酸。

193.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:163)或其药学上可接受的盐。

194.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:124)或其药学上可接受的盐。

195.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:123)或其药学上可接受的盐。

196.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:108)或其药学上可接受的盐。

197.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:397)或其药学上可接受的盐。

198.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:340)或其药学上可接受的盐。

199.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:454)或其药学上可接受的盐。

200.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:360)或其药学上可接受的盐。

201.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:80)或其药学上可接受的盐。

202.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:78)或其药学上可接受的盐。

203.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:16)或其药学上可接受的盐。

204.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:169)或其药学上可接受的盐。

205.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:324)或其药学上可接受的盐。

206.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:258)或其药学上可接受的盐。

207.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:446)或其药学上可接受的盐。

208.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:358)或其药学上可接受的盐。

209.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:464)或其药学上可接受的盐。

210.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:466)或其药学上可接受的盐。

211.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:467)或其药学上可接受的盐。

212.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:376)或其药学上可接受的盐。

213.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:471)或其药学上可接受的盐。

214.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:473)或其药学上可接受的盐。

215.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:475)或其药学上可接受的盐。

216.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:476)或其药学上可接受的盐。

217.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:481)或其药学上可接受的盐。

218.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:482)或其药学上可接受的盐。

219.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:487)或其药学上可接受的盐。

220.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:572)或其药学上可接受的盐。

221.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:572)或其药学上可接受的盐。

222.如实施方案163或164所述的方法，其中所述拟肽大环化合物 具有下式：

(SEQ ID NO:1500)或其药学上可接受的盐。

223.一种鉴别缺乏p53灭活突变的人类受试者中的一种或多种实 体瘤生物标记的方法，其包括向所述人类受试者施用包含治疗有效量的 拟肽大环化合物的药物组合物。

224.如实施方案223所述的方法，其中所述生物标记选自p53状态、 MDM2表达水平和MDMX表达水平。

225.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包 含所述拟肽大环化合物的药学上可接受的盐。

226.如实施方案223所述的方法，其中所述药学上可接受的盐为钠 盐、钾盐或钙盐。

227.如实施方案224所述的方法，其中所述药学上可接受的盐为钠 盐。

实施例

如以前所述以及如下所述合成、纯化和分析拟肽大环化合物 (Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000)；Schafmeister 和Verdine，J.Am.Chem.Soc.122:5891(2005)；Walensky等人，Science 305:1466-1470(2004)；和美国专利号7,192,713)。通过用相对应的合成 氨基酸替代两个或多个天然存在的氨基酸来设计拟肽大环化合物。替代 发生在i和i+4以及i和i+7位。使用固相条件、rink amide AM树脂(Novabiochem)和Fmoc主链保护基团化学方法人工地或在自动化肽合成 仪(AppliedBiosystems，433A型)上进行肽合成。对于天然Fmoc保护的 氨基酸(Novabiochem)的偶联，使用10当量的氨基酸和1:1:2摩尔比的偶 联试剂HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEA。非天然氨基酸(4当量)与1:1:2 摩尔比的HATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEA偶联。合成肽的N末 端被乙酰化，而C末端被酰胺化。

通过在反相C18柱(Varian)上的高效液相色谱法(HPLC)(Varian ProStar)来实现交联化合物的纯化，以产生纯的化合物。通过LC/MS质 谱法(与Agilent 1100HPLC系统接口连接的Micromass LCT)和氨基酸分 析(Applied Biosystems，型号420A)确认该纯产物的化学组成。

在包括SP662、SP663和SP664在内的二炔交联的拟肽大环化合 物的合成中使用下列方案。以0.2mmol规模在PEG-PS树脂(加载0.45 mmol/g)上合成完全保护的结合树脂的肽。通过采用在DMF中的20％ (v/v)的哌啶对结合树脂的肽进行3×10min的处理来实现临时Fmoc基团 的脱保护。用NMP(3×)、二氯甲烷(3×)和NMP(3x)洗涤后，通过与适当 的预活化的Fmoc-氨基酸衍生物进行1×60min的温育来实现每个连续氨 基酸的偶联。在将偶联溶液转移至脱保护的结合树脂的肽之前，将所有 被保护的氨基酸(0.4mmol)溶解在NMP中，并用HCTU(0.4mmol)和 DIEA(0.8mmol)进行活化。偶联反应完成后，洗涤树脂，准备下一个脱保护/偶联循环。在存在于NMP中的乙酸酐/DIEA的存在下进行氨基末 端的乙酰化。对从完全组装的结合树脂的肽的等分试样所获得的已切割 和脱保护的样品进行LC-MS分析以验证每个偶联的完成。在典型的实 例中，将四氢呋喃(4ml)和三乙胺(2ml)加入到在40ml玻璃小瓶中的肽树 脂(0.2mmol)中并摇动10分钟。然后加入Pd(PPh

在包括SP665在内的单炔交联的拟肽大环化合物的合成中使用下 列方案。以0.1mmol规模在Rink amide MBHA树脂(加载0.62mmol/g) 上合成完全保护的结合树脂的肽。通过采用在NMP中的25％(v/v)的哌 啶对结合树脂的肽进行2×20min的处理来实现临时Fmoc基团的脱保护。 采用NMP和二氯甲烷进行充分的流动洗涤后，通过与适当的预活化的 Fmoc-氨基酸衍生物进行1×60min的温育来实现每个连续氨基酸的偶联。 在将偶联溶液转移至脱保护的结合树脂的肽之前，将所有被保护的氨基 酸(1mmol)溶解在NMP中，并用HCTU(1mmol)和DIEA(1mmol)进行 活化。偶联反应完成后，对树脂进行充分的流动洗涤，准备下一个脱保 护/偶联循环。在存在于NMP/NMM中的乙酸酐/DIEA的存在下进行氨 基末端的乙酰化。对从完全组装的结合树脂的肽的等分试样所获得的已 切割和脱保护的样品进行LC-MS分析以验证每个偶联反应的完成。在 一个典型的实例中，用DCM洗涤肽树脂(0.1mmol)。将树脂装入微波小 瓶中。对容器进行抽真空并用氮气进行吹扫。加入六羰基钼(0.01当量, Sigma Aldrich 199959)。将无水氯苯加入到反应容器中。然后加入2-氟苯 酚(1当量,Sigma Aldrich F12804)。将反应物装入微波炉，并在130℃保 持10分钟。可能需要在随后的时间推动反应以完成反应。在室温下通过 用TFA/H

表3示出了所制备的拟肽大环化合物的列表。

表3

表3a显示拟肽大环化合物的选择。

表3a

表3b显示拟肽大环化合物的进一步选择。

表3b

在上文和别处显示的序列中，使用了以下缩写：“Nle”表示正亮氨 酸，“Aib”表示2-氨基异丁酸，“Ac”表示乙酰基，并且“Pr”表示丙酰基。 由“$”表示的氨基酸是由全碳交联体连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃 氨基酸，其包含一个双键。由“$r5”表示的氨基酸是由全碳交联体连接的 α-Me R5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸，其包含一个双键。由“$s8”表示的 氨基酸是由全碳交联体连接的α-Me S8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸，其包 含一个双键。由“$r8”表示的氨基酸是由全碳交联体连接的α-Me R8-辛烯 基-丙氨酸烯烃氨基酸，其包含一个双键。“Ahx”表示氨基环己基连接体。 该交联体是直链全碳交联体，其在每个氨基酸的α碳之间包含8个或11 个碳原子。由“$/”表示的氨基酸是并非由任何交联体连接的α-MeS5-戊 烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由“$/r5”表示的氨基酸是未由任何交联体连接 的α-MeR5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由“$/s8”表示的氨基酸是未由任 何交联体连接的α-MeS8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由“$/r8”表示的氨 基酸是未由任何交联体连接的α-MeR8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。由 “Amw”表示的氨基酸是氨基酸α-Me色氨酸。由“Aml”表示的氨基酸是氨 基酸α-Me亮氨酸。由“Amf”表示的氨基酸是氨基酸α-Me苯丙氨酸。由 “2ff”表示的氨基酸是氨基酸2-氟-苯丙氨酸。由“3ff”表示的氨基酸是氨基 酸3-氟-苯丙氨酸。由“St”表示的氨基酸是包含两条戊烯基丙氨酸烯烃侧 链且如所示每条侧链与另一氨基酸交联的氨基酸。由“St//”表示的氨基酸 是包含两条不交联的戊烯基丙氨酸烯烃侧链的氨基酸。由“％St”表示的 氨基酸是包含两条戊烯基丙氨酸烯烃侧链且如所示每条侧链通过完全饱 和的烃交联与另一氨基酸交联的氨基酸。由“Ba”表示的氨基酸是β-丙氨 酸。交联氨基酸的名称内的小写字母“e”或“z”(例如“$er8”或“$zr8”)表示 双键构型(分别为E或Z)。在其他情况下，诸如“a”或“f”的小写字母表示 D氨基酸(例如，分别为D-丙氨酸或D-苯丙氨酸)。指定为“NmW”的氨 基酸表示N-甲基色氨酸。指定为“NmY”的氨基酸表示N-甲基酪氨酸。 指定为“NmA”的氨基酸表示N-甲基丙氨酸。“Kbio”表示连接至赖氨酸残 基的侧链氨基的生物素基团。指定为“Sar”的氨基酸表示肌氨酸。指定为 “Cha”的氨基酸表示环己基丙氨酸。指定为“Cpg”的氨基酸表示环戊基甘 氨酸。指定为“Chg”的氨基酸表示环己基甘氨酸。指定为“Cba”的氨基酸 表示环丁基丙氨酸。指定为“F4I”的氨基酸表示4-碘代苯丙氨酸。“7L” 表示N15同位素亮氨酸。指定为“F3Cl”的氨基酸表示3-氯苯丙氨酸。指 定为“F4cooh”的氨基酸表示4-羧基苯丙氨酸。指定为“F34F2”的氨基酸表 示3,4-二氟苯丙氨酸。指定为“6clW”的氨基酸表示6-氯色氨酸。指定为 “$rda6”的氨基酸表示经由二炔键交联至第二炔基氨基酸的α-Me R6-己 炔基-丙氨酸炔基氨基酸。指定为“$da5”的氨基酸表示α-Me S5-戊炔基- 丙氨酸炔基氨基酸，其中该炔烃与第二炔基氨基酸形成二炔键的一半。指定为“$ra9”的氨基酸表示经由炔烃复分解反应与第二炔基氨基酸交 联的α-Me R9-壬炔基-丙氨酸炔基氨基酸。指定为“$a6”的氨基酸表示经 由炔烃复分解反应与第二炔基氨基酸交联的α-Me S6-己炔基-丙氨酸炔 基氨基酸。指定“iso1”或“iso2”指示该拟肽大环化合物是单一异构体。

指定为“Cit”的氨基酸表示瓜氨酸。分别指定为“Cou4”、“Cou6” 、“Cou7”和“Cou8”的氨基酸表示下列结构：

在一些实施方案中，拟肽大环化合物以多于一种异构体获得，例 如这是由于交联体结构中双键的构型(E与Z)造成的。此类异构体能够或 不能通过常规的色谱法分离。在一些实施方案中，一种异构体相对于其 他异构体具有改善的生物学性质。在一个实施方案中，拟肽大环化合物 的E交联体烯烃异构体相对于其Z对应物具有更好的溶解度、更好的靶标亲和性、更好的体内或体外效力、更高的螺旋度或提高的细胞透性。 在一个实施方案中，拟肽大环化合物的Z交联体烯烃异构体相对于其E 对应物具有更好的溶解度、更好的靶标亲和性、更好的体内或体外效力、 更高的螺旋度或提高的细胞透性。

表3c显示了示例性的拟肽大环化合物：

表3c

在一些实施方案中，拟肽大环化合物不包括表4a中所示的拟肽大 环化合物：

表4a

在表4a中，X表示S或任意氨基酸。所示的肽可包含N-末端封端基团 如乙酰基或另外的连接体，如在封端基团与肽序列的起点之间的β-丙氨 酸。

在一些实施方案中，拟肽大环化合物不包含如表4a所示的拟肽大 环化合物结构。

在其他实施方案中，拟肽大环化合物不包括表4b所示的拟肽大环 化合物。

表4b

观测质量通过电喷雾离子化质谱法测得。

在一些实施方案中，本文公开的拟肽大环化合物不包含如表4b所 示的拟肽大环化合物结构。

表4c显示包含D-氨基酸的非交联多肽的实例。

表4c

从液氮保存状态解冻细胞。一旦细胞扩充并且在预期的倍增时间 将其分开后，开始筛选。将细胞以500个细胞/孔接种在黑色384孔组织 培养处理的板中的生长培养基中。经由离心将细胞在测定平板中平衡， 并在处理之前放置在附接于给药模块的37℃培养箱中24小时，产生细 胞密度约为500个细胞/平板。在处理时，收集一组测定平板(未接受处理)，并通过添加ATPLite(Perkin Elmer)测量ATP水平。在Envision Plate Readers上使用超灵敏发光读取这些T-零(T

在给药(T

若T

若T≥V

其中T是检验物品的信号测量值，V是媒介物处理的控制测量值， 而V

根据可从癌细胞系百科全书获得的信息将细胞系分配为p53野生 型、突变体或空。示例性的p53拟肽大环化合物的结果示于以下表5中。

表5：p53WT/p53MUT癌细胞系中的细胞活力

研究目标

本研究旨在(i)评估Aileron肽-1的安全性和/或耐受性，以及(ii)确 定晚期实体瘤患者(包括具有表达WT p53蛋白的肿瘤的患者)中Aileron 肽1的DLT和MTD。Aileron肽1是α螺旋烃交联的多肽大环化合物， 其氨基酸序列小于20个氨基酸的长度，衍生自野生型人P53蛋白的反 式激活域，并与相对于彼此在野生型人P53蛋白的反式激活域中相同的 位置含有苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸氨基酸。Aileron肽1具有跨越在该 氨基酸序列的i到i+7位置的氨基酸的单个交联，并且在i+7位置与羧基 末端之间具有超过三个氨基酸。Aileron肽1与人MDM2和MDM4结合， 并且具有如通过电喷雾离子化质谱法测得的950-975m/e的观测质量。

研究计划

研究设计

该研究由剂量递增阶段(DEP)和扩充阶段(EXP)组成。DEP是用于 确立Aileron肽-1的MTD的“3+3”剂量递增设计。EXP选择在MTD下 具有特定实体瘤的患者，以进一步研究剂量水平的临床安全性概况和潜 在效力。根据DEP的结果以及来自其他非临床药理学研究的数据，完成 了EXP的患者选择。后者包括有助于将肿瘤类型之间和之内对Aileron 肽-1的细胞系敏感性进行比较的多种实体瘤细胞系(例如，乳腺癌、膀胱 癌、头/颈癌、胃肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤)的研究。

在完成筛选后，合格的患者在第1天、第8天和第15天接受Aileron 肽-1的单次IV给药，并在给药完成后约8小时停留在诊所以供临床评 价、实验室检验和药代动力学评价。此外，除非活检对患者构成重大风 险，否则在第1周期或第2周期的第3次给药(最后的给药)的48小时内 进行肿瘤活检，以供药效学评价。第1周期或第2周期的选择根据研究 者的判定来进行。患者在第22天返回诊所进行其他观察和实验室评估， 并在第29天返回进行周期结束评估。

在研究的剂量递增阶段和剂量扩充阶段中的患者的治疗持续直到 确定疾病进展、不可接受的毒性，或患者或医师决定中止疗法。

入选前p53状态确定和肿瘤采样要求

中心实验室采用新一代测序(NGS)，对来入选本研究的所有患者的 存档组织样品或新鲜活检样品的p53状态进行检测。

关于第1阶段的前3个剂量水平：

患者在不考虑p53状态的情况下入选。尽管如此，仍在中心实验 室然测试了患者的p53状态。为此，使用存档组织(样品不超过3年)， 或者替代地，除非活检对患者构成重大风险，考虑使用新鲜活检。

在第1阶段的剂量水平4开始(以及对于入选DEP的第2阶段的 患者)：

仅纳入了患有表达WT p53蛋白的肿瘤的患者。这个关键的纳入 标准基于所提出的Aileron肽-1的作用机制，其需要WT p53蛋白是药理 活性的。该纳入标准也得到体外肿瘤生长试验的结果的支持，其中 Aileron肽-1在表达WT p53蛋白的肿瘤细胞中表现出活性，但未在具有 p53无效突变的细胞中表现出活性。患者通过以下情况之一满足p53要 求：

·根据在当地实验室完成的先前p53基因测试结果，患者符合资格。 仍在中心实验室采用SNG对这些患者的p53状态进行检测。为此，使用 存档组织(样品不超过

·根据测试了p53的存档组织(样品不超过

对于选入EXP的患者：

·只选择患有表达p53 WT的肿瘤的患者，并且在入选前在中心实验 室采用NGS对所有患者的p53状态进行测试。使用存档组织(样品不超 过

只选择患有表达p53 WT的肿瘤的患者。在筛选期间获得的肿瘤 样品上进行p53状态的确定。该测定由具有所需能力的研究点进行；否 则在中央实验室进行。来自存档组织样品(若可用)的结果还可用于确定 DEP中的患者资格。选入本研究的患者的总数目取决于剂量水平的数目 和在MTD建立前每个队列中患者的数目。DEP中选入了约27名成年患 者，不包括出于非安全性原因中止的患者的替代者，而EXP中选入了约 30名另外的患者。本研究计划选入合计多达60名患者。计划使用在US 的多达6个临床点。预计应计阶段约为24个月。预期的随访阶段是在最 后一名患者入选后的约9个月，持续约33个月的总研究期限。

将满足所有纳入标准和排除标准的患者(包括确定WT p53状态) 的患者选入3至6名患者的队列中，以接受Aileron肽1。在每个28天 周期的第1天、第8天和第15天经1小时(±15min)通过IV输注施用 Aileron肽1。治疗持续直到疾病进展、不可接受的毒性，或患者或医师 撤回同意书。在MTD建立后，将约30名另外的患者选入扩充队列中， 以获得在此剂量水平下和在特定患者或肿瘤类型中的进一步的经验。

基于发病率、严重程度、持续时间、致死率、严重性和AE类型， 以及患者体检、生命体征和临床实验室结果中的变化，对安全性进行评 估。研究者采用NCI CTCAE 4.0版评估AE的严重程度。

因为此研究的主要目标是基于安全性和药代动力学，所以统计学 分析本质上是描述性的，并且考虑了研究的所有剂量和所有观察到的反 应，包括实现完全响应(CR)或部分响应(PR)的患者，或基于RECIST 1.1 保持稳定的疾病(SD)的患者。接受至少一个剂量的Aileron肽1的患者 组成安全性群体，并被包括在所有安全性分析中。完成至少一个周期的Aileron肽1并且经历治疗后客观疾病评估的患者组成可评估效力的患 者群体。

患者群体

纳入标准

所有患者都需要满足以下纳入标准：(i)知情同意时年龄大于等于 18岁(包含)的男性或女性；(ii)组织学或细胞学确认为转移或不可切除的 恶性肿瘤，以及没有进行标准治疗措施或标准治疗措施不再有效的；(iii) 对于在DEP的第1阶段的剂量水平4及更高剂量水平下选入的患者，以 及在DEP或EXP的第2阶段选入的所有患者，复发或治疗难治性实体 肿瘤的WT p53状态是强制的；(iv)可通过RECIST 1.1衡量的至少一处 目标损伤；(v)ECOG体能状态0-1；(vi)≥3个月的预期寿命；(vii)在Aileron 肽1的第一次给药之前7天内测量的充分的血液学功能(定义为：ANC ≥1.5×10

排除标准

在筛选或第1天满足任意以下标准的患者被排除：(i)先前采用影 响MDM2或MDMX活性的研究药剂进行治疗；已知对任何研究药物组 分均有超敏反应；(iii)已知且未治疗的脑转移。已经治疗并且表现为临床 稳定持续≥30天的脑转移患者可选入本研究的剂量递增部分中；(iv)凝血 病、血小板病或非药物诱导的血小板减少症史；(v)在Aileron肽1的第 一次给药前6个月内的肺栓塞史，或未治疗的DVT；(vi)需要同时使用 抗凝血剂或抗血小板药物，阿司匹林剂量≤81mg/天、用于DVT预防 的低剂量SC肝素或SC低分子量肝素，或肝素冲洗以维持IV导管通畅 的情况除外；(vii)具有预先存在的或已知的心血管风险史(例如：急性冠 状动脉综合征史，包括心肌梗死、不稳定心绞痛、冠状动脉旁路移植术、 血管成形术，或在Aileron肽1的第一次给药前6个月内的支架术；不 受控制的高血压，其被定义为收缩BP≥160mmHg并且/或者舒张BP≥100 mmHg；预先存在的心力衰竭(纽约心脏协会III-IV级)；抗凝血剂引起房 颤；临床显著的不受控制的心率失常，或需要治疗的心律失常，房颤和 阵发性室上性心动过速除外；严重瓣膜病；筛选时校正的QTc间隔，男 性ECG≥450msec，女性ECG≥470msec)；(viii)在Aileron肽1的第一次 给药前6个月内的有临床意义的胃肠道出血；(ix)有临床意义的第三空间 流体积累(例如，尽管使用了利尿剂，腹水仍需要开口，或需要开口或与 呼吸短促相关的胸膜积液)；(x)妊娠或哺乳期女性；(xi)证明存在可能干 扰患者安全性或参与此研究的知情同意书的条款的严重和/或不稳定预 先存在的医学状况、精神病学状况或其他状况；(xii)活动性的不受控制 的感染，HIV/AIDS史，或不存在肝细胞癌的乙型肝炎或丙型肝炎史。 肝炎血清学阳性但未表现出活动性病毒性肝炎的原发性肝癌患者可被考 虑入选，如果其满足所有其他纳入标准并且不满足其他排除标准；(xiii) 在DEP的第1阶段中的剂量水平4或更高剂量水平下开始(以及对于在 DEP或EXP的第2阶段入选的所有患者)：具有已知人乳头瘤病毒(HPV) 相关性如HPV阳性宫颈癌、HPV阳性口咽癌和HPV阳性肛门癌的癌症； (xiv)持续≥2年尚未缓解的另一种原发性恶性肿瘤的已知病史。非黑色素 瘤皮肤癌和原位宫颈癌或鳞状上皮内病变(例如，CIN或PIN)是允许的； (xv)可能干扰遵守研究方案和后续进度的任何心理学、社会学或地理状 况；(xvi)在Aileron肽1输注24小时内需要使用主要由肝胆转运蛋白(例 如，OATP成员，OATP1B1和OATP1B3)清除的任何伴随药物；(xvii) 在Aileron肽1的第一次给药前的4周或5个循环半衰期内使用任何研 究药剂。

患者从研究疗法的移除/替换

患者因多种原因从本研究中移除，包括：(i)疾病进展；(ii)不可接 受的不良事件；(iii)阻止进一步参与的并发疾病；(iv)2周给药延缓或在 两次剂量降低后仍有临床显著的毒性；(v)患者拒绝继续通过本研究进行 治疗，和/或同意取消研究参与；(vi)患者不能或不愿遵守研究要求；(vii) 妊娠或未能使用充分的避孕措施；(viii)据研究者判断，患者状况总体或 特定地改变，使得患者不能接受此研究的进一步治疗。

任何完成入选但未接受Aileron肽1的给药的患者均被替换。出于 除安全性之外的原因，在本研究的剂量递增部分中于第一周期完成前中 止本研究的患者被替换。出于任何原因，在本研究的剂量扩充部分中于 治疗第一周期完成前中止本研究的患者被替换。

治疗计划

药物施用研究-1

研究药物为研究药剂Aileron肽1。将此研究药剂分配至临床点。 在筛选开始后的12天内开始用Aileron肽1对患者进行治疗。Aileron肽 1药物为提供于一次性玻璃小瓶中的冷冻液体产品。用于注射的拟肽大 环化合物储存在≤-15℃下。将Aileron肽1引入至含有D5W(被称为 Aileron肽1给药溶液)的IV输注袋中，并通过定点药房提供以施用至患 者。Aileron肽1给药溶液标有患者标识编号。研究人员确认此信息以及 其与预期患者的相关性。

在每个28天治疗周期的第1天、第8天和第15天通过在D5W中 IV输注经1小时(±15min)施用Aileron肽1。基于患者在每个周期开始 时的体重计算每名患者的预定剂量。在计划的时间表之外不施用Aileron 肽1(即，在28天周期的第1天、第8天和第15天输注)。若存在偏差， 将其记录在eCRF上。在本研究的剂量递增和剂量扩充阶段中的患者的 治疗持续直到确定疾病进展、不可接受的毒性，或患者或医师决定中止 疗法。

在存在与输注相关的反应的情况下，暂时中止Aileron肽1输注。 按照机构准则施用药理学药剂和其他治疗干预。在仔细评估患者后作出 重新开始Aileron肽1输注的决定。

起始剂量、剂量递增和剂量降低

在本研究的剂量递增部分中，在3-6名患者的队列中评价Aileron 肽1的剂量水平增加。在每个28天周期的第1天、第8天和第15天通 过IV输注经1小时(±15min)施用Aileron肽1。入选队列1中的患者接 受剂量水平1的Aileron肽1(0.16mg/kg)。根据类比，0.16mg/kg(50 μg·hr/mL)下人的预计AUC为在STD

在不存DLT时，后续3至6名患者的队列接受递增的剂量，直到 确立MTD。

采用2-阶段剂量递增设计。在初始第1阶段递增期(表6)期间，采 用100％剂量增量，直到队列中≥1/3的患者经历至少可能与研究药物有 关的任何≥2级的AE。使用3-患者队列和改良斐波纳契序列(即，第2阶 段递增期；表7)继续后续剂量递增，直到确立MTD。

表6：第1阶段剂量递增时间表

表7：第2阶段剂量递增时间表

在研究者、赞助商的医疗监护人和安全医师代表同意更保守的进 展的时间点，将递增方案切换至第2阶段递增方案。

将DLT的观察用于在整个试验时间表中作出关于剂量降低、中断 或中止的个体患者决定，但将在第1周期期间出现的DLT用于告知安全 性和耐受性评估，以用于剂量递增决定。

如果在第一队列中观察到DLT，则将剂量递减至剂量水平1。如 果在剂量水平1下观察到DLT，则将剂量递减至剂量水平2。如果在剂 量水平2下观察到DLT，则考虑其他剂量水平，并且该剂量水平在研究 者、赞助商的医疗监护人和安全医师代表之间讨论后实施。

在每个剂量水平下对至少三名患者进行治疗。如果没有患者经历 DLT，则在下一计划的剂量水平下对后续3名患者进行治疗。

如果在队列中≥2/3的患者中观察到DLT，则不进行进一步的剂量 递增，并将当前剂量定义为MAD。

如果在3名患者的一名中观察到DLT，则然后在该相同剂量水平 下选入至多3名另外的患者。如果在扩充队列中的≥2名患者中观察到 DLT，则然后将不进行进一步的剂量递增，并且将当前剂量定义为MAD。

在确定MAD后，要么将先前施用的降低剂量扩充至合计6名患 者，要么将中间值(在MAD与下一较低剂量水平之间的)于至多6名患者 中进行研究。在队列的至少5/6的患者耐受且无DLT的最高剂量被定义 为MTD。

在确定MTD之后，将约30名另外的患者入扩充研究中以在该剂 量水平下获得进一步的经验，并研究Aileron肽1在特定患者或肿瘤类 型中的作用。选择两种疾病类型进行评估，每种疾病类型15位患者选入 扩充研究中的两个队列中的每一个中。施用于扩充队列中的患者的Aileron肽1的剂量来源于本研究的剂量递增部分中可获得的安全性和其 他信息的评估。

不允许患者内剂量递增。

在周期中发生的毒性需要如下所述进行恢复以继续治疗。

血红蛋白≥8.5g/dL；ANC≥1.0 10

如果在治疗周期期间在患者中观察到临床上有意义的AE，则延迟 进一步给药直到毒性已经解决到可接受的水平。治疗可以延迟长达2周， 以便允许解决AE，并且可以由研究者与赞助商的医疗监护人和安全医 师代表协商自行决定将剂量减少至先前的水平。如果患者经历多次AE， 对剂量延迟或剂量减少的决定基于最严重的AE。在一次剂量之后经历复发性、临床上有意义的AE的任何患者经受一次附加的剂量减少。在 2周延迟或两次剂量减少后继续经历临床上有意义的毒性的患者从该研 究中停止。

被考虑剂量减少的不良事件不包括由仅与潜在疾病或其他医疗病 况或伴随治疗相关的研究者评估的事件。在该患者接受临床益处和/或该 研究者感觉继续参与对该患者具有最佳益处的情况下，经历被认为与 Aileron肽1相关的AE的患者继续研究。在这样的情况下，在该研究者 自行决定并与赞助商的医疗监护人和安全医师代表达成一致的情况下，将针对患者的剂量减少至先前的较低水平。

允许针对患者进行多达两次剂量减少，在此之后患者从该研究中 停止。

在该研究者自行决定并与赞助商的医疗监护人和安全医师代表达 成一致的情况下，经历DLT的患者继续以先前的较低水平治疗，直到疾 病进展或不可接受的毒性。一旦患者的剂量已减少，就不再增加。

毒性分级基于NCI CTCAE v4.0。

统计方法

DEP和EXP的安全性和效力的统计分析本质上主要是描述性的， 因为该研究的目的是确定DLT和MTD。这些目的通过确定性算法的结 果来实现；因此，在这种情况下统计假设检验不能预期，也不适用。使 用描述性统计学总结连续变量[n，平均值，标准差，中位数，最小值和 最大值]。分类变量＝总结的e，其显示每个分类中患者的数目和百分比(n， ％)。

研究程序

将进行的以筛选开始，并在整个第1周期[28天周期的第1天、第 8天和第15天]中持续的研究活动(包括评估、测试、检查、疾病评估、 组织样品的提交和研究药物施用)的时间表概括在表8中。将会以第2周 期[第1周期的第29天＝第2周期的第1天]开始进行的研究列于表9中。

表8：整个第1周期中的研究活动的时间表

表9：整个第2周期中的研究活动的时间表

药代动力学分析

将测量在以下所述的指定时间点收集的血液样品中Aileron肽1 及其代谢物的水平。药代动力学数据将按照剂量水平根据个体患者和全 体患者制表并总结。在对于解释结果有用时将提供图形显示。

将在以下时间点收集用于药代动力学评估的血液样品。

表10：收集用于药代动力学评估的血液样品的时间点

SOI代表开始Aileron肽1输注；EOI代表Aileron肽1输注结束。

药效学分析

测量在开始治疗之前和第1周期和第2周期结束时收集的肿瘤样 品中的p53、MDM2、MDMX、p21的水平。测量血液样品中的MIC-1。 以下描述了收集血液和组织用于药效动力学评估的指定时间点。药效动 力学数据将被制成表并通过单独患者并联合剂量水平进行总结。在对于 解释结果有用时将提供图形显示。

可针对与患者结果的可能的相关性，研究从先前遗传和生物标记 测试以及针对与Aileron肽-1的安全性和效力相关的生物标记的血液和 肿瘤样品的其他测试中可获得的结果。

将在以下时间点收集用于药效学评估的血液样品。

表11：收集用于药效学评估的血液样品的时间点

拟肽大环化合物的临床活性的评估

为评估临床活性，将以表现出CR、PR或SD的所有患者的逐个 案例的方式，提供基于RECIST 1.1或其他适当标准的响应率和响应持续 时间。基于效力或临床抗肿瘤活性的临床、X光线照相术或其他合适的 评估，提供抗肿瘤活性或其他临床益处的其他证据的描述性分析。临床 活性的分析将在两种患者群体上进行：(i)接受至少一个疗法周期并且具有至少一个基线后疾病评估的患者亚组(可评估效力的群体)，以及(2)较 大的一组患者，其包括可评估效力的群体，以及在第1周期结束前表现 出目标疾病进展或经历DLT和/或不可接受的毒性的患者。

将在基线(在第1周期第1天的21天内)处获得具有相关疾病指征 的患者的成像扫描、身体检查和/或基于实验室的测定(例如，前列腺特 异性抗原)，以及第二治疗周期后和之后的每两个治疗周期(例如，第4 周期，第6周期等)后获得上述各项以供客观肿瘤评估。同类型的成像、 身体检查或基于实验室的测定程序将用于每次患者评估。RECIST 1.1将用于评估肿瘤响应和响应持续时间。将在下一治疗周期开始前解释安排 的扫描(和/或其他基于实验室的测定)。如果满足CR或PR的标准，则然 后在不早于4周后重复该扫描，以确认该响应。响应的患者(CR、PR或 SD)将继续进行研究，每两个周期后进行疾病评估，直到疾病进展、撤 回知情同意书或不可接受的毒性。

来自成像程序(包括在主要机构外的区域性或其他设施进行的那 些程序)的胶片或其他记录由患者的相应主要研究机构的放射学人员进 行读取和审阅。

药物施用研究-II

研究目的

该I期开放标签、多中心、剂量递增、2-臂研究被设计为在患有表 达WT p53蛋白的晚期实体瘤或淋巴瘤(参见以下p53状态确定)的患者中 使用28天或21天周期的2种不同剂量方案评价通过IV输注施用的 Aileron肽-1的安全性、耐受性、药代动力学、药效学和抗肿瘤效果。对 于28天周期，患者每周一次接受Aileron肽-1连续三周，对于21天周 期为每周两次连续两周。许多患有实体瘤或淋巴瘤的患者在外周血中呈 现循环肿瘤细胞(CTC)，这可以使用流式细胞术检测和分析。这使得能 够检测这些细胞中研究药物特异性靶标的参与。

该研究由DEP和EXP组成。DEP为设计用于确定Aileron肽-1 的MTD或OBD的“3+3”剂量递增。EXP选择多达2个不同的患有特定 实体瘤的患者组，以进一步研究MTD或OBD下Aileron肽-1的临床安 全性概况和潜在效力。

起始剂量、剂量递增和剂量减少

所有受试者根据体重以预先确定的水平给药。以剂量水平(DL)3 开始，将患者依次分配到两个治疗组之一：剂量方案(DR)A测试Aileron 肽-1的每周一次施用，或剂量方案(DR)B测试Aileron肽-1的每周两次 施用。对于剂量水平3，首先选择DR-A，其次选择DR-B。根据来自非 临床毒理学评价的结果，DEP中的起始剂量(DL-1)为0.16mg/kg。

在前2个剂量水平期间，患者在28天周期的第1天、第8天和第 15天接受Aileron肽-1。以DL 3开始，DR-A中的患者在28天周期的第 1天、第8天和第15天持续每周治疗一次，而DR-B在21天周期的第1 天和第4天，第8天和第11天每周治疗两次。该给药时间表总结于图2 中。

在随后的剂量水平中剂量加倍，直到队列中≥1/3的患者经历任何 药物相关的等级≥2的不良事件(AE)。药物相关的AE是可能、或许或必 定归因于Aileron肽-1的事件。AE的分级由NCI不良事件常用术语标准 (CTCAE)4.03版来确定。使用修饰的斐波那契序列(Fibonacci sequence) 持续随后的剂量递增(即，67％、50％、40％和33％；图3和图4)。

在第1周期(治疗周期＝DR-A为28天，DR-B为21天)结束时不 存在DLT的情况下，继续递增至每个DR内的下一剂量水平。向每个 DR内的下一剂量水平的递增通过由主要研究者、赞助商的医疗监督者 和安全医师代表组成的安全审查委员会(SRC)决定，该安全审查委员会 审查来自所有患者的所有可获得的安全性信息。

在每个剂量方案队列中，如果在队列中没有观察到DLT，则随后 的患者组在该剂量方案的下一计划剂量水平下加入。如果在任何剂量水 平下在≥2/3患者中观察到DLT，则在该DR中不进行进一步的剂量递增， 并且当前剂量被确定为最大施用剂量(MAD)。如果在任何剂量水平下在 队列中的1/3患者中观察到DLT，则最多3位另外的患者在该剂量水平下加入同一DR中。如果在扩充队列中的2位或更多位患者中观察到DLT， 则不进行进一步的剂量递增，并且当前剂量被确定为MAD。在确定MAD 后，将先前施用的较低剂量扩充至总计6位患者，或者在总计6位患者 中研究中间剂量(在MAD与先前剂量水平之间)。在6位患者中的至少5 位患者中耐受的最高剂量被确定为MTD或OBD。

对于多达2个EXP队列的剂量方案和剂量水平的选择基于第1周 期中的MTD确定，以及Aileron肽-1在DEP中随后的治疗周期中的累 积安全性、效力和药代动力学/药效学特性。

剂量水平在每个队列中的周期之间没有增加，并且患者仅被指定 一个剂量水平(即，没有患者内的剂量递增)。

统计方法

比较所有剂量水平和患者组的DR-A和DR-B的结果。

在第1周期的第1天之前的分子筛选：分子筛选包括在第一次施 用Aileron肽-1(第1周期的第1天)之前的以下各项：(i)收集签署的分子 筛选知情同意书；(ii)收集归档的肿瘤样品或新鲜的肿瘤活检样品(除非 活检造成重大的临床风险)以供p53测试；(i)如果被确认为p53 WT，则 使用来自入选患者的组织样品的其余部分测试药效学生物标记。在施用 第一剂Aileron肽-1之前确认p53 WT状态对于以剂量水平4及以上水平 开始的患者加入DEP的第1阶段以及所有患者加入DEP和EXP的第2 阶段(必要时)是强制性的。

在DEP的第1阶段中以剂量水平4及以上水平之前(以及对于加 入DEP的第2阶段中的所有患者)的分子筛选，在开始临床筛选之前在 具有未知p53状态的患者中进行分子筛选。如果已知p53状态为WT， 则继续对这些患者进行临床筛选，并在由中心实验室确认p53WT之前 加入并接受Aileron肽-1。

在EXP中，患者在加入之前在中心实验室已完成分子筛选。这些 患者仅在由中心实验室确认p53 WT之后加入并接受Aileron肽-1。

在首次施用Aileron肽-1(第1周期的第1天)之前的21个日历日(或 根据所述)内进行的筛选评估和程序包括收集签署的知情同意书、医疗史 (基线体征和症状的评价)、人口统计数据、资格评估、HIV、乙型和丙型 肝炎的血液检验、生命体征(包括血压、脉搏、呼吸率、体温)、身体检 查、ECG、实验室评估，包括临床化学指标(葡萄糖、钙、白蛋白、总蛋 白、钠、钾、CO

在首次施用Aileron肽-1(第1周期的第1天)之前的7个日历日内 完成的筛选评估包括针对具有生育潜能的女性进行的血清或尿妊娠试验 (β-hCG)：在第一剂Aileron肽-1之前的2天内进行，确认资格，生命体 征，实验室评估(如果筛选测试在之前7天内进行，则可以省略)，ECOG 体能状态，和伴随用药。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 之前的30分钟内，身体检查，ECG：在SOI之前30分钟内(重复三次进 行(读数之间间隔5-10min))，在SOI之前1hr内收集血液以检测免疫原 性，在SOI之前1hr内收集血液以供所有生物标记的评估，收集血液以 供药代动力学评价：在SOI之前1hr内，以及伴随用药。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)时，以及EOI后1(±5min)和 2hr(±10min)；ECG：在EOI(+5min)时以及EOI后1hr(±5min)和2hr (±10min)。只有当患者的QTc为a)>500msec；b)比给药前增加60msec； 或c)比给药前记录减少50msec时，才重复进行三次(读数之间间隔5-10min)；收集血液以供药代动力学评价：在EIO(+5min)时，EOI后30min (±5min)以及1hr(±5min)、2(±10min)、4(±10min)和8hr(±10min)； 收集血液以供所有生物标记的评估，EOI(+5min)以及EIO后1hr(±5 min)和2、4和8hr(±10min)；伴随用药；以及不良事件(AE)评估。

进行的研究程序包括生命体征、实验室评估、在第1天SOI后24 hr(±4hr)收集血液以供所有生物标记的评估、第1天SOI后24hr(±4hr) 收集血液以供药代动力学评价、伴随用药、AE评估以及TLS监测(通过 常规实验室评估样品)。

进行的研究程序包括生命体征、实验室评估(在第1天SOI后48hr (±4hr)收集血液以供所有生物标记的评估)、第1天SOI后48hr(±4hr) 收集血液以供药代动力学评价、伴随用药以及AE评估。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 之前30分钟内，身体检查，ECG：在SOI之前30分钟内。重复进行三 次(读数之间间隔5-10min)，实验室评估、在SOI之前1hr内收集血液 以供免疫原性分析、在SOI之前1hr内收集血液以供所有生物标记的评 估、在SOI之前1hr内收集血液以供药代动力学评价、伴随用药以及不 良事件(AE)评估

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)时，以及EOI后1和2hr(±10 min)；ECG：在EOI(+5min)时以及EOI后1hr(±5min)和2hr(±10min)。 只有当患者的QTc为a)>500msec；b)比给药前增加60msec；或c)比给 药前记录减少50msec时，才重复三次(读数之间间隔5-10min)进行；在EOI后1hr内收集血液以供所有生物标记的评估；在EOI(+5min)时， EOI后30min(±5min)以及1hr(±5min)、2(±10min)、4(±10min)收集 血液以供药代动力学评价；伴随用药以及不良事件(AE)评估

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 前30分钟内；身体检查；实验室评估，在SOI前1hr内收集血液以供 所有生物标记的评估，在SOI前1hr内收集血液以供药代动力学评价， ECOG体能状态，伴随用药以及AE评估。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)时以及EOI后1hr(±5min)和2 hr(±10min)；在EOI后1hr内收集血液以供所有生物标记的评估；在 EOI(+5min)时以及在EOI后30min(±5min)、1hr(±5min)、2和4hr (±10min)收集血液以供药代动力学评价；伴随用药以及AE评估。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 前30分钟内；身体检查；实验室评估；在SOI前1hr内收集血液以供 所有生物标记的评估；在SOI前1hr内收集血液以供药代动力学评价； ECOG体能状态；伴随用药以及AE评估。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)时以及EOI后1hr(±5min)和2 hr(±10min)；在EOI(+5min)时以及在EOI后30min(±5min)、1hr(±5 min)、2、4和8hr(±10min)收集血液以供药代动力学评价；在EOI(+5 min)的1hr内、EOI加1hr(±5min)、在EOI后4和8hr(±10min)收集 血液以供所有生物标记的评估；伴随用药；以及AE评估。

进行的研究程序包括生命体征；实验室评估；收集血液以供生物 标记评估：在前一天的SOI后24hr(±4hr)；仅针对在开始研究药物之前 进行了成功的研究活检的患者：用于生物标记评估的针吸活检——在第 1周期的第15天(DR-A)或第11天(DR-B)输注或在第2周期的第15天 (DR-A)或第11天(DR-B)输注的48小时内进行，由研究者自行决定(除非 活检对患者构成重大风险)；在第15天(DR-A)或第11天(DR-B)SOI后 24hr(±4hr)收集血液以供药代动力学评价；在前一天SOI后24hr(±4hr) 收集血液以供所有药效学评估；伴随用药；cAE评估；以及针对在筛选 时接受FLT-PET且SUV≥5的患者进行FLT-PET。

在第1周期的第22天针对DR-A以及第18天针对DR-B

进行的研究程序包括生命体征；实验室评估——仅血液学；收集 血液以供所有生物标记的评估；伴随用药；以及AE评估。

进行从第2周期开始的在后续周期中的要求下列出的程序。注意： “第22天或第29天”＝患者继续治疗的下一周期的第1天。在下一周期 药物施用前3天内进行第1周期第22天或第29天/第2周期第1天的给 药前评估。

如果患者在第1周期以后不继续治疗，则进行在研究结束访视部 分下列出的程序。

在前一周期的第29天针对DR-A以及第22天针对DR-B/第2周期 和后续周期的第1天

注意：“第22天或第29天”＝患者继续治疗的下一周期的第1天。 在药物施用前3天内进行前一周期的第22天或第29天/当前周期的第1 天的给药前评估。

注意：在第2周期或后续周期中没有收集用来评估CTC的血液样 品。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 之前的30分钟内；身体检查；ECG：在SOI之前的30分钟内。重复进 行三次(读数之间间隔5-10min)；实验室评估；收集血液以供免疫原性 分析：在SOI之前1hr内；收集血液以供生物标记的评估(仅MIC-1)： 在SOI之前1hr内；收集血液以供药代动力学评价(仅第2周期)：在SOI 之前1hr内；ECOG体能状态；伴随用药；以及AE评估。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(在输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)时以及在EOI后根据临床指示； ECG：在EOI(+5min)时。只有当患者的QTc为a)>500msec；b)比给药 前增加60msec；或c)比给药前记录减少50msec时，才重复进行三次(读 数之间间隔5-10min)；收集血液以供生物标记评估(仅MIC-1)：在EOI 之后1hr内；收集血液以供药代动力学评价(仅第2周期)：在EOI(+5min) 时以及在EOI之后30min(±5min)、1hr(±5min)、2和4hr(±10min)； 伴随用药；以及AE评估。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 之前的30分钟内；身体检查；实验室评估——仅血液学；ECOG体能状 态；伴随用药；以及AE评估。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(在输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)以及在EOI后根据临床指示； 伴随用药；以及AE评估。

在施用Aileron肽-1之前进行的研究程序包括生命体征：在SOI 前30min内；身体检查；实验室评估；收集血液以供生物标记评估(仅 MIC-1)：在SOI前1hr内；收集血液以供药代动力学评价(仅第2周期)： 在SOI前1hr内；ECOG体能状态；伴随用药；以及AE评估。

在施用Aileon肽-1后进行的研究程序包括生命体征：(输注期间) 30min(±3min)；(输注后)在EOI(+5min)以及在EOI后根据临床指示； 收集血液以供生物标记评估(仅MIC-1)：在EOI之后1hr内；在EOI(+5 min)时以及在EOI后30min(±5min)、1hr(±5min)、2和4hr(±10min) 收集血液以供药代动力学评价(仅第2周期)；伴随用药，以及AE评估。

进行的研究程序包括生命体征，实验室评估，收集血液以供生物 标记评估：在第15天或第11天SOI后24hr(±4hr)，收集血液以供药代 动力学评价(仅第2周期)：在第15天或第11天SOI后24hr(±4hr)，伴 随用药，以及AE评估。

收集血液以供免疫原性分析。按照用于基线测量的相同程序进行 肿瘤评估，例如对具有相关疾病指征的患者的成像、身体检查以及基于 实验室的测定(例如，前列腺特异性抗原)。

对于达到如RECIST或IWG标准所定义的“稳定的疾病”的患者， 指示FDG-PET扫描，条件是在开始用研究药物治疗之前进行可评估的 FDG-PET扫描。

所有患者在首次剂量之前接受CT成像。在以给药方案-A(DR-A) 开始给药之后，将在DR-A中第2周期和此后每隔一个周期例如第4、6 和8周期结束时获得CT图像。在给药方案-B(DR-B)中，将在DR-B中 第3周期和此后每三个周期例如第6、9和12周期中最后一次输注后获 得CT图像。在那些周期中施用最后一次剂量之后但在第18天访视之前 获得图像。

研究结束访视

在最后一次施用Aileron肽-1或从研究中退出之后30(±2)个日历 日进行研究结束访视。进行的研究程序包括血清或尿妊娠试验，生命体 征，身体检查，ECG，实验室评估，血液收集以供免疫原性分析，收集 血液以供生物标记评估，收集血液以供药代动力学评价，ECOG体能状 态，按照用于基线测量的相同程序进行的肿瘤评估，例如成像、身体检 查以及对具有相关疾病指征的患者的基于实验室的测定(例如前列腺特 异性抗原)，伴随用药和AE评估。

药效学评价

在以下时间点处收集用于药效学评价的血液样品：

表12：第1周期和第2周期给药方案药效学评价

在以下时间点收集用于药代动力学评价的血液样品：

表13：第1周期和第2周期给药方案药代动力学评价

实施例4：进一步的研究

在患有表达WT p53的晚期实体瘤或淋巴瘤的、对标准治疗难治 性或无法忍受的或者不存在标准治疗的成年患者中，针对安全性、耐受 性、药代动力学和药效学评价Aileron肽-1。图6显示了将Aileron肽-1 设计为抑制MDMX和/或MDM2的一种方式，其导致WTp53的重新激 活。

Aileron肽-1能够穿透细胞膜并定位在细胞核内。此外，Aileron 肽-1可以破坏细胞内蛋白质-蛋白质相互作用，如p53与MDM2和 MDMX之间的相互作用。

进行Aileron肽-1的若干体内和体外研究。在这些研究中，Aileron 肽-1以纳摩尔亲和力与MDM2和MDMX结合，并通过基因表达谱分析 显示了体外特异性中靶机制的证据。此外，Aileron肽-1显示出在过表达 MDM2/MDMX的异种移植癌模型中的肿瘤生长抑制、p53依赖性细胞周 期停滞、凋亡和抗肿瘤活性，与中靶药代动力学和药效学或药代动力学/ 药效学活性具有明显的相关性。

剂量递增阶段被设计为评价在患有实体瘤或淋巴瘤的患者中的 Aileron肽-1。该剂量递增阶段不受肿瘤或淋巴瘤类型的限制。将Aileron 肽-1施用于患有肉瘤、胃癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和胸腺瘤的患者。 在一些情况下，使用Aileron肽-1治疗肿瘤和淋巴瘤，其中WT p53在超 过50％的患者中普遍存在。p53野生型状态在超过50％的患有至少19 种不同肿瘤类型的患者中普遍存在。因此，适应潜力可以在罕见适应证 或巨大市场机会中有所不同。参见例如图7。

进行p53信号激活研究以确定相比于WT p53，Aileron肽-1是否 对具有突变p53的癌细胞系具有不同的作用。在研究中，我们测量了 Aileron肽-1在跨越各种不同癌症的312种细胞系中的作用，以比较 Aileron肽-1在具有突变p53的细胞系与在具有WT p53的细胞系中的作 用。参见图8。在207种突变p53细胞系中，Aileron肽-1没有明显的作 用，但是在105种WT p53细胞系中，几乎全部显示肿瘤细胞死亡。参 见图8。没有显示肿瘤细胞死亡的WT p53细胞系包括与人乳头瘤病毒 或HPV、有关癌症如宫颈癌和头颈癌相关的WT p53细胞系。通过关注 WT p53和响应性肿瘤，我们能够预测对于我们的候选产品可能有更好 的响应机会的患者群体。

在另一研究中，相对于对WT p53的MDM2和MDMX的结合亲 和力，以及对MDM2小分子抑制剂的结合亲和力，测量Aileron肽-1对 MDM2或MDMX的结合亲和力。药物对受体的亲和力是药物与其靶标 结合的有效性大小的量度，并且可以提供对中靶效应和脱靶毒性的潜力 的深入了解。Aileron肽-1被设计为以高于WT p53的亲和力与MDM2 和/或MDMX结合，使得Aileron肽-1通过代替p53与MDM2和/或 MDMX结合而破坏MDM2和/或MDMX与WT p53的结合。这样的结 合可使得p53能够被释放和激活。在本研究中，我们还测量了小分子 MDM2抑制剂对MDMX的结合亲和力，它显示不与该靶标结合。以下 表14显示了Aileron肽-1相对于WT p53和小分子MDM2抑制剂与 MDM2和MDMX结合的能力。

表14：Aileron肽-1相对于WT p53和小分子MDM2抑制剂与 MDM2和MDMX结合的能力

体内

我们研究了Aileron肽-1在两种实体瘤中的作用。在图9描述的 研究中，我们评估了通过静脉内或IV注射施用的Aileron肽-1在MDMX 驱动的MCF-7乳腺癌异种移植模型中的作用。在该研究中，我们评估了 用Aileron肽-1和媒介物治疗的不同剂量、时间表和持续时间，以测定 对肿瘤体积生长的影响。在范围为2.5mg/kg至5mg/kg至10mg/kg和 20mg/kg的剂量下，当这些剂量在28天的时间内每周施用两次时，Aileron 肽-1显示了统计学显著的肿瘤生长抑制。参见图11a和图11b。

毒理学和非临床安全性实验

大鼠和猴子中的关键性4周多剂量GLP研究利用被计划为最初临 床方案的每周两次IV给药，而非每周一次IV给药。该研究提供在给药 和恢复时间期间的剂量和暴露相关的评估，并且使用结果确定最大耐受 剂量(MTD)以及估算大鼠的10％严重中毒剂量(STD

两个动物物种中的DLT似乎都与骨髓中造血细胞(特别是巨核细 胞谱系的细胞)的抑制有关，这导致外周血血小板的显著减少，这显示在 停止给药时恢复。参见图7。

基于恢复期间供血液学取样的伴随组中一只动物的死亡，大鼠中 的STD

基于最大耐受剂量下的暴露，大鼠比猴子对Aileron肽-1的骨髓和 血液学作用更敏感。大鼠STD

Aileron肽-1在遗传毒理学研究中是阴性的，该研究包括细菌诱变 性(Ames)、染色体畸变(人外周血淋巴细胞)和体内小核(大鼠骨髓)测定。 进行安全性药理学研究以评估Aileron肽-1对体外hERG钾通道和食蟹 猴的心脏功能的影响。在这些研究中没有显著的不良发现。

与4周GLP毒性研究中利用的每周两次IV给药时间表相比， Aileron肽-1的首次人类临床试验将首先评估每周一次IV给药达三周。 此外，证明的Aileron测试肽-1诱导的血液学作用的可逆性，采用常规 实验室测量检测此类发现的能力，以及有效的支持疗法的可用性，其均 在诊所中提供额外的安全性裕度。

在大鼠中，Aileron肽-1通常显示C

在非人灵长类中，Aileron肽-1通常显示与剂量成比例增加的暴露， 尽管在4周猴子GLP毒性研究中的高剂量组(20mg/kg)观察到暴露的明 显平台期。在该研究中，Aileron肽-1的C

在大鼠或猴子中没有观察到药代动力学参数的显著的基于性别的 差异，并且在GLP毒性研究中关于每周两次时间表重复的剂量后没有观 察到积累。

蛋白水解是预期的Aileron肽-1的主要生物转化途径。主要代谢 物Aileron肽代谢物-1是具有完整环肽部分的3-氨基酸截短，并且在用 猴子、大鼠、小鼠和人类冷藏保存的肝细胞的体外稳定性研究中记录了 相同的代谢物谱。在单剂量大鼠研究中，肝胆代谢和消除代表了Aileron 肽-1的主要清除途径，其中Aileron肽代谢物-1作为在胆汁中观察到的 主要排泄产物。

体外研究揭示，Aileron肽-1不是任何所测的细胞色素P450(CYP) 同种型的抑制剂。CYP诱导的体外测定也没有表明采用Aileron肽-1的 任何显著的治疗相关的作用。基于这些发现，通过CYP介导的机制清除 的针对伴随用药的临床相关的药物-药物相互作用的潜力被认为是低的。

Aileron肽-1在体外针对常见转运蛋白进行测试，并观察到在可能 临床相关的浓度下(例如，在高剂量水平的C

体内

使用开放标签、多中心、剂量递增的双臂研究来设计，以在患有 对标准疗法而言难治或无法忍受或不存在标准疗法的、表达WT p53的 晚期实体瘤或淋巴癌的患者中，评估通过静脉内(IV)输注施用的Aileron 肽-1的安全性、耐受性、药代动力学、药效学和抗肿瘤作用。该研究包 括用于确立Aileron肽-1的最大耐受剂量或MTD，或最佳生物剂量或 OBD的剂量递增期，以及用于研究MTD或OBD下Aileron肽-1的临床 安全性概况和潜在效力的剂量扩充期。在该研究的扩充期中，在患有特 定实体瘤或淋巴癌的患者的不同组中对Aileron肽-1进行研究。基于剂 量递增期的结果，以及来自其他非临床药理学研究的数据，完成实体瘤 或淋巴瘤的选择。后者包括有助于将肿瘤类型之间和之内对Aileron肽-1 的细胞系敏感性进行比较的多种实体瘤细胞系(例如，乳腺癌、膀胱癌、 头/颈癌、胃肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤)的研究。在 该试验的剂量递增期和剂量扩充期中对患者的治疗持续直到确定疾病进 展、不可接受的毒性，或患者或医师决定中止疗法。

剂量递增期基于“3+3”剂量递增设计。在剂量递增期中，前两个 剂量水平的患者每28天中每周接受一次Aileron肽-1，持续3周。对于 28天周期，更高剂量水平的患者每周接受一次Aileron肽-1，持续连续 三周，而对于21天周期，每周接受两次持续连续二周。参见图10。

将用尽标准疗法或对其而言标准疗法不可用的患有实体瘤或淋巴 癌的患者选入剂量递增期中，直到剂量组4b完成入选，并且所述患者是 入选剂量组5a中的患者。将罹患已知HPV相关癌症的患者从入选中排 除，因为已知HPV使WT p53失活。到该日期时包括的肿瘤类型有非小 细胞肺癌、各种类型的肉瘤、胆管癌、囊性腺样癌、滤泡性非霍奇金淋 巴瘤、胸腺瘤、前列腺癌、子宫内膜癌以及卵巢癌。由于我们的试验主 要集中在安全性和耐受性，因此我们在相对较低的剂量水平下开始给药， 并且该方案不需要前三个剂量水平的患者是p53野生型或HPV阴性的。

为了鉴别我们试验的特定p53患者，我们利用中心实验室，使用 新一代测序对来自入选p53状态试验中的患者的归档肿瘤组织样品和新 鲜活检样品进行了测试。入选那些剂量水平的13名患者中的12名被证 实具有WT状态。从剂量水平4开始，WT p53状态是强制性合格标准。

在该试验中，通过使用药效学生物标记和成像评估二者评估了临 床活性或对Aileron肽-1的响应。药效学生物标记为我们提供了关于中 靶活性、特定患者类型响应以及关于对肿瘤效果的早期认知的信息。作 为实验的一部分，我们还评估了Aileron肽-1对各种不同来源的生物样 品(如肿瘤活检、可检测的循环肿瘤细胞、单核血细胞和血液样品)中的 潜在药效学生物标记的影响。根据样品类型，那些药效学生物标记包括 MDMX、MDM2、p21、p53、凋亡以及巨噬细胞抑制细胞因子-1或MIC-1 的测量。此外，根据施用的循环次数，我们接受了标准的成像评估，如 来自患者的计算机断层扫描或CT、磁共振成像、骨扫描和PET扫描。 CT-成像在28天周期组中于第2周期以及之后每两个循环的结束时进行， 而在21天周期组中于第3周期以及之后每三个周期的结束时进行。我们 采用RECIST对实体瘤患者的抗肿瘤活性进行测量，并采用2014国际工 作组(或IWG)标准对淋巴癌患者的抗肿瘤活性进行测量，使得我们能够 客观评价肿瘤是否已经进展、稳定或萎缩。此外，可通过身体检查或临 床验证的血清肿瘤标志物来确定抗肿瘤效果。

药代动力学谱

通过IV施用全身递送Aileron肽-1，这给予了避免来自肝酶和胃 肠酶的代谢影响的潜在优势，以及随剂量递增可重现的全身生物利用度 的能力。如图11a所示，在队列1的剂量水平(0.16mg/kg)、队列2的剂 量水平(0.32mg/kg)、队列3a的剂量水平(0.64mg/kg)、队列3b的剂量水 平(0.32mg/kg)、队列4a的剂量水平(1.25mg/kg)下测量了药物浓度。患者中，Aileron肽-1一致地产生了所观察到的最大药物血清浓度或Cmax 的剂量依赖性增加，以及在8至10小时之间的更长的相应半衰期。该半 衰期足够将WT p53重新激活并开始启动基因转录调控的过程。

Aileron肽-1示出了在患者间和剂量间可重现的谱，使得能够进行 更高剂量水平的暴露推测，以预测效率和安全性。图11b示出了在剂量 水平1(0.16mg/kg)、剂量水平2(0.32mg/kg)和剂量水平3(0.64mg/kg) 下的测得的药物浓度；并且推测了剂量水平4(1.25mg/kg)、剂量水平5 (2.5mg/kg)和剂量水平6(5.0mg/kg)的药物浓度。

图12示出了Aileron肽-1的药代动力学模型。该肽显示出非线性 Michaelis-Menten清除和线性清除。

安全性结果

研究中认为Aileron肽-1在所有剂量水平下都是良好耐受的。没有 报告剂量限制毒性，也没有报告研究相关的严重不良事件。从非血液学 安全性看，最常见的相关不良事件是恶心和疲劳。从血液安全性看，前 两个剂量水平1和2在第1周期和第2周期期间没有显示血细胞减少， 而在剂量水平3A、3B和4A下，患者显示轻度至中度贫血、轻度血小 板减少症和轻度中性粒细胞减少的药物相关事件。一名患者在剂量水平 3B下经历4级中性粒细胞减少，对此研究人员报告称可能与研究药物有 关。患者的完整血细胞计数显示2级白细胞减少症、1级贫血和1级血 小板减少的谷值。大约在开始用Aileron肽-1治疗的同时开始两种伴随 药物，这两种药物都被怀疑与中性粒细胞减少的发生有关。患者的中性 粒细胞减少与药物暴露之间无关联，患者的最后一次完全血细胞计数显 示3级中性粒细胞减少改善，没有施用对中性粒细胞减少的治疗，并且 没有报告感染性并发症。

与研究者的4次正式安全审查会议确认没有DLT。对于DL1、2 和3A，一致决定递增两倍剂量。对于DL3B，一致决定经由DL4B中的 斐波纳契递增。新剂量可为0.53mg/Kg，而非0.64mg/Kg。

血液学和非血液学不良事件与我们的临床前毒理学概况大体一致：

··无遗传毒性

··无免疫原性

··没有心血管安全性的相关发现

··没有暗示GI毒性的相关发现

··没有因剂量限制性毒性的骨髓抑制

生物标记评估

在剂量递增期，我们使用了几种探索性生物标记来确认Aileron 肽-1的药理学活性或中靶生物活性、辅助患者招募以及帮助告知剂量选 择。

接收关于MDMX、MDM2、p21、p53、凋亡和MIC-1的药效学 生物标记。我们接收数据的第一生物标记为MIC-1。MIC-1是分泌的p53 调节的细胞因子，如果p53被激活，其在血液中容易测量，并且其可用 作p53激活的生物标记。在正常条件下，p53表达保持较低，导致相应MIC-1水平可忽略。然而，当WT p53激活响应于肿瘤时，这也导致MIC-1 水平增加。我们在初次输注前1小时测量MIC-1，并在初次输注后24 小时再次对其进行测量。在剂量水平1至剂量水平4A范围内的剂量水 平下的患者中，我们观察到MIC-1增加的统计学显著的剂量依赖性反应。 见图13。

此外，来自4名患者的单核血细胞确认Aileron肽-1渗透细胞膜并 激活p53信号传导。我们在以下时间点测量了来自4名患者的单核血细 胞中的细胞内p53和p21的量：(a)Aileron肽-1输注结束，(b)Aileron肽 -1输注结束后1小时，以及(c)Aileron肽-1输注结束后4小时。如图 14所示，观察到细胞内p53水平增加1.8倍，细胞内p21水平增加约3 倍。

因此，我们得出结论，Aileron肽-1穿透细胞膜，定位在细胞核内， 并释放WT p53。MIC-1水平相对于基线至少8倍的增加作为p53重新 激活所需最小剂量的指导。

总的来说，至少两个独立的生物标记研究支持细胞内p53信号传 导的Aileron肽-1介导的激活：(i)MIC-1血清蛋白(如通过ELISA测量的)： 剂量-响应关系，以及(ii)血细胞中的p53和p21增加(如通过流式细胞术 测量的)。

效力

客观肿瘤响应是试验中效力的终点。28天周期组中的患者在基线 时测量并在两个治疗周期后或大约在初始给药后56天内再次测量。21 天周期组中的患者在基线时测量并在三个治疗周期后或大约在初始给药 后63天内再次测量。RECIST标准定义如下：

·稳定的疾病或SD：以研究中的最小直径总和为参考，没有出现符 合部分响应的充分肿瘤缩小也没有出现符合进展的充分增加的情 况。

·部分响应或PR：以基线直径总和为参考，目标病变的直径总和至 少减少30％。

·完全响应或CR：所有目标病变消失。任何病变淋巴结(无论是目标 的还是非目标的)的短轴必须缩短至小于10毫米。

试验表明，已完成至少两个治疗周期的患者，一些患者具有稳定 的疾病。Aileron肽-1已显示稳定疾病率。参见图15。

以下表15显示用Aileron肽-1治疗的示例性患者。这些患者包含 具有野生型或突变p53的一系列实体瘤。如表16所见，在2/3周期治疗 后，患者4、5、7、8、10、11和15中的每一名具有稳定的疾病，而仅 患者2、6和12显示进行性疾病。完成3/4治疗周期后，患者11继续显 示稳定的疾病。如此处所用的，稳定的疾病是指以研究中的最小直径总 和为参考，没有出现符合部分响应的充分肿瘤缩小也没有出现符合进展 的充分增加的情况。

表15.患者信息

表16：用Aileron肽-1治疗2/3个周期后的患者响应