一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。SARS-CoV-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞，从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。SARS-CoV-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。

S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(ReceptorBinding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。RBD与细胞表面血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素。RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS-CoV-2病毒感染的治疗和预防，因此开发针对SARS-CoV-2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。然而，将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分的对于病毒的预防作用，但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(Antibody-dependent enhancement，简称ADE)作用，从而产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用，本发明将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域单独进行跨膜的细胞表达，避免了其它S蛋白表位导致的抗体依赖性增强的风险，再将新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域与跨膜蛋白结构域融合后，在动物体内诱发出更佳的中和滴度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。

优选的，所述步骤2)嘌呤霉素筛选时的使用浓度为5μg/ml。

优选的，所述步骤2)电转化的条件包括：560V、30ms。

优选的，所述步骤2)PB-S-RBD-NGFR质粒的质量与K562细胞的数量比为10μg:1×10

优选的，所述步骤2)筛选的时间在7d以上。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞，所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域；

所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SRQ ID No.3所示，所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

优选的，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的细胞在制备新型冠状病毒的细胞疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用本发明提供的制备方法制备得到的细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。这种效果源自：

1、新型冠状病毒刺突糖蛋白中S1亚基内部包含受体结合域RBD，介导病毒与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2结合吸附和侵入过程。RBD免疫原性强，在诱导中和抗体方面效果突出，故细胞疫苗选择RBD进一步优化和表达。

2、表达RBD强度高。在细胞感染新型冠状病毒时，或转染新型冠状病毒基因到细胞中时，可以检测到细胞表面有S蛋白表达。但天然S蛋白为三聚体，跨膜表达能力较差。将S蛋白中RBD结构和有SEQ ID No.4氨基酸序列的跨膜蛋白结构域融合表达时，跨膜表达RBD效率更高。

3、由于表达RBD强度高于S蛋白天然跨膜结构，因此与新型冠状病毒刺突糖蛋白或者表达该蛋白天然构象的细胞比较，使用这种细胞免疫动物，可以诱导出更高滴度的中和抗体。

附图说明

图1为Western-Blot结果(Exposure_120.0s)；

图2为NGFR-RNA胶图；

图3为RBD-NGFR-RNA胶图；

图4为电转24h K562-NGFR表达情况，A.K562野生型；B.电转RBD-NGFR的24h后的K562；C.电转NGFR的24h后的K562；

图5为电转24h K562-RBD表达情况，A.K562野生型；B.电转NGFR的24h后的K562；C.电转RBD-NGFR的24h后的K562；

图6为K562细胞电转4种新型质粒标签的表达结果；

图7为K562细胞电转4种新型质粒S-RBD的表达结果；

图8为抗体IgG的ELISA检测，A，以新型冠状病毒刺突蛋白全长蛋白进行ELISA检测，B，以新冠冠状病毒结合结构域进行ELISA检测；

图9为PB-S-RBD-NGFR质粒的结构图；

图10为嵌合蛋白的结构图。

具体实施方式

本发明提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将所述步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。

本发明将序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明中，所述序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

在本发明中，SEQ ID No.1序列中，下划线为PB-713质粒的原始序列，加粗的序列为Bsu36I-酶切后补足的EF1启动子序列，斜体序列为编码信号肽的核苷酸序列，双下划线序列为编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列，波浪线的序列为编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列。在本发明中，编码信号肽的核苷酸序列引导细胞表达出的嵌合蛋白(即新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域融合跨膜蛋白结构域)移动到细胞膜上，S蛋白的RBD区域是抗原(缩写为S-RBD)，诱导中和抗体产生，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列为去除胞内区的蛋白片段，让嵌合蛋白可以附着在细胞膜上。

在本发明中，所述PB-713质粒采用市售产品即可，如购买于SBI公司。本发明对序列通过Bsu36I和BmgBI双酶切位点整合到PB-713质粒中的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规技术操作即可。在本发明中，制备得到的PB-S-RBD-NGFR质粒优选进行大量抽提和去除内毒素后再进行后续操作。在本发明中，所述PB-S-RBD-NGFR质粒的结构图如图9所示。

本发明将得到的PB-S-RBD-NGFR质粒电转化到K562细胞中，经嘌呤霉素筛选，当活细胞比例持续大于80％时，得到跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞。

本发明对所述K562细胞的来源没有特殊限定，采用市售即可。在本发明中，所述电转化的条件优选包括：560V、30ms。在本发明中，所述PB-S-RBD-NGFR质粒的质量与K562细胞的数量比优选为10μg:1×10

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞，所述细胞的细胞膜上表达信号肽、新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域和跨膜蛋白结构域；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SRQ ID No.3所示，所述跨膜蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGA。

在本发明中，所述新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFDYKDDDDK。

在本发明中，所述跨膜蛋白结构域(简称NGFR)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

TRKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKR。

在本发明中，信号肽引导细胞表达出的嵌合蛋白(即冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域融合跨膜蛋白结构域)移动到细胞膜上，S蛋白的RBD区域是抗原(缩写为S-RBD)，诱导中和抗体产生，跨膜蛋白结构域去除胞内区的蛋白片段，让嵌合蛋白可以附着在细胞膜上。在本发明中，所述嵌合蛋白的结构如图10所示。

在本发明中，编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：

ccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac。

在本发明中，编码新型冠状病毒刺突糖蛋白的受体结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：

agagtgcagcccacagagagcattgtgagattccccaacatcaccaacctgtgcccctttggggaggtgttcaatgccacaagatttgcctctgtgtatgcctggaacagaaagagaatcagcaactgtgtggctgactactctgtgctctataattctgctagcttcagcaccttcaagtgctatggggtgagccccaccaagctgaatgacctgtgcttcaccaatgtgtatgctgacagctttgtgatcagaggggatgaggtgagacagattgcccctgggcagactggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcactggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtggggggcaactacaactacctctatagactgttcagaaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatctaccaagctggcagcaccccctgcaatggggtggagggcttcaactgctacttccccctgcagagctatggctttcagcccaccaatggggtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctttgagctgctgcatgcccctgccacagtgtgtggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtgaactttgactacaaggatgatgatgacaag。

在本发明中，编码跨膜蛋白结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：

cacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。

本发明还提供了上述技术方案所述的细胞在制备新型冠状病毒的细胞疫苗中的应用。本发明对所述细胞制备成细胞疫苗的方法没有特殊限定，采用常规制备细胞疫苗的方法即可。本发明对所述细胞疫苗的使用方法没有特殊限定。

实施例1

通过上游Bsu36I和下游BmgBI双酶切位点，将SEQ ID No.1的核苷酸序列整合进入PB-713质粒(购自SBI公司)。新质粒命名为PB-S-RBD-NGFR质粒。由金唯智对制备成的质粒进行大量抽提和去除内毒素。

细胞的转染：

1.K562细胞按照ATCC的说明书进行培养，培养条件为：IMDM+10％FBS。传代方法：维持细胞浓度在1×10

2.使用Celetrix电转仪，按照使用说明书对K562细胞进行质粒电转，取4×10

3.电转48h后，细胞取1ml通过流式检测NGFR的表达量，然后在原培养基基础上，加入嘌呤霉素到5μg/ml的浓度进行药筛。

4.药物筛选7天，每天通过Cellometer X2细胞计数仪，按照说明书中方法进行细胞活力测定，当活细胞比例可持续大于80％时，即获得转入S-RBD-NGFR的稳定细胞池称K562-S-RBD-NGFR(即跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞)。

通过流式分析检测K562-S-RBD-NGFR中S-RBD的表达量。使用野生型K562细胞作为流式细胞术的阴性对照，当设门策略为阴性对照细胞表达量小于1％时，K562-S-RBD-NGFR细胞的阳性率应为50％以上。

实施例2

一、实验目的

RBD-NGFR结构的聚集体情况。

二、实验材料

1.样品

K562-细胞；实施例1制备的K562-S-RBD-NGFR细胞

2.试剂

表1试剂

3.仪器

表2仪器

二、实验方法

(一)蛋白样品的提取

1.取细胞培养液于15mL离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL 1×PBS液重悬，2000rpm离心5min，离心洗涤两次；

2.取一1.5mL的EP管，加入5μL 100×Phosphatase Inhibitor蛋白抑制剂和495μLPierce

3.轻轻弃上清，用移液枪将上清尽量全部弃干净，加入100μL上述混合液重悬后，冰浴孵育15min，4℃预冷，12000rpm离心15min，取上清至1.5mL EP管中。

(二)BCA法测样品蛋白浓度

1.配制BCA工作液(BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配)：将A液和B液摇晃混匀，按照A：B＝50：1的比例配制BCA工作液，充分混匀；

2.配制不同浓度的标准蛋白液(BSA)：0μg/μL(空白组)、0.3125μg/μL、0.125μg/μL、0.5μg/μL以及2μg/μL；

3.取不同浓度的标准蛋白液以及待测的蛋白样品各5μL加入96孔板中，向各孔的蛋白液中加入200μL的BCA工作液(加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数)，混匀后，37℃放置30min进行静置；

4.静置结束，冷却至室温后，用酶标仪在562nm处测定吸光度值，并制作标准曲线，根据待测样品的吸光度值，比对标准曲线，计算待测蛋白样品的浓度。

(三)SDS-PAGE电泳

1.样品的制备：

a、取80μL裂解的蛋白样品于1.5mL EP管中，加入20μL 5×Lane Marker LoadingBuffer混匀；

b、取60μL裂解的蛋白样品于1.5mL EP管中，加入20μL 4×非变性蛋白上样缓冲液混匀；

c、金属浴105℃煮沸10min，12000rpm/min离心1min；

2、加样：在电泳槽里加入电极缓冲液，样品的加样量如表3所示(20μg/孔)；

表3SDS-PAGE电泳的加样量(Tris-Glycine胶，10％，10孔)

3.设置电泳仪参数(120V，70min)，进行SDS-PAGE电泳。

(四)转印

1.膜处理：电泳期间将PVDF膜置于无水甲醇浸泡30s-1min进行活化，之后置于1×eBlot L1PVDF膜平衡液中浸泡进行平衡备用；

2.电泳结束取出胶后置于超纯水中，用超纯水清洗一下；

3.转印：按照海绵→胶→PVDF膜→海绵的顺序从上往下依次放置于eBlot快速转膜仪上，每层放好后，都需要用试管赶去气泡，装配好eBlot快速转膜仪，设置好参数(24V，11min)，进行转印；

4.转印结束后，将PVDF膜取出，置于封闭液中，室温摇床封闭2h。

(五)抗体孵育

1.一抗的稀释：用封闭液按1：1000的比例稀释抗体兔多抗40592-T62 SARS-CoV-2/2019-nCoV Spike/RBD Antibody Rabbit PAb(20200827回收)，混匀后备用，

2.一抗的孵育：将PVDF膜置于一抗稀释液中，4℃冰箱摇床孵育过夜；

3.一抗稀释液的回收：将一抗稀释液回收至50mL离心管中，4℃冰箱保存备用；

4.加入1×TBST进行洗膜，5min×5次；

5.二抗的稀释：用封闭液按1：10000的比例稀释抗体兔二抗；

6.二抗的孵育：将PVDF膜置于上述二抗稀释液中，室温摇床孵育1h；

7.加入1×TBST进行洗膜，3min×4次；

8.加入1×TBS进行洗膜，3min×1次。

(六)免疫印迹

1.显色液的配制(现配现用)：按照化学发光液Ⅰ：化学发光液Ⅱ＝1：1的比例配制，用超纯水进行1：1稀释；

2.将PVDF膜置于显色液中，立即进行后续实验；

3.显影：在凝胶成像分析系统上拍照，观察并分析结果。

三、实验结果与讨论

1.样品的蛋白浓度

BCA法测定样品的蛋白浓度结果如表4所示。

表4样品蛋白浓度测定结果

2、Western-Blot结果

Western-Blot的实验结果如图1所示。由图1可知，还原与非还原状态下，K562细胞中均有S-RBD-NGFR的表达，且二者条带位置相差一倍左右，分子量大小与预期相符，表明NGFR存在三聚体。

实施例3

一、实验材料

1.细胞：K562细胞

2.核酸：质粒：RBD in NGFR in PB713、NGFR in PB713

3.抗体：Anti-1P-PE(博奥龙)

Anti-human-IgG-FC(博奥龙)

Anti-NGFR-PE(博奥龙)

4.试剂：

Gel Extraction Kit(OMAGA D2500-03)

琼脂糖(invitrogen 75510-019)

mMESSAGE

IMDM培养基(含10％FBS)

5.仪器：PCR仪(BIO-RAD T100)

电泳仪(BIO-RAD POWERPAC HC)

凝胶成像仪(BIO-RAD Universal Hood Ⅱ)

高速台式离心机(Gene 1730R)

水浴锅(上海博讯HHS-11-2)

酶标仪(Thermo 1510)

电转仪(流式细胞仪(BD Fortessa)

二、实验方法

1.DNA的获得

1)快速基因合成：

委托金唯智快速合成基因NGFR，将基因通过5'Bsu36I and 3'BmgBI(使用重组的方法)克隆至载体PB713(Ampicillin)，构建质粒NGFR in PB713，序列如下:

SEQ ID No.8：

Cctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacgctagacgccaccgaattcatgggggcaggtgccaccggccgcgccatggacgggccgcgcctgctgctgttgctgcttctgggggtgtcccttggaggtgccaaggaggcatgccccacaggcctgtacacacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagaggctcgaggagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtg。

委托金唯智优化并快速合成基因RBD，将基因通过5'BsrGI and 3'BsrGI(使用重组的方法)克隆至载体NGFR in PB713(Ampicillin)，构建质粒RBD in NGFR in PB713，序列如下：

SEQ ID No.9：

Tgtacagtcgacagagtgcagcccacagagagcattgtgagattccccaacatcaccaacctgtgcccctttggggaggtgttcaatgccacaagatttgcctctgtgtatgcctggaacagaaagagaatcagcaactgtgtggctgactactctgtgctctataattctgctagcttcagcaccttcaagtgctatggggtgagccccaccaagctgaatgacctgtgcttcaccaatgtgtatgctgacagctttgtgatcagaggggatgaggtgagacagattgcccctgggcagactggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcactggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtggggggcaactacaactacctctatagactgttcagaaagagcaacctgaagccctttgagagagacatcagcacagagatctaccaagctggcagcaccccctgcaatggggtggagggcttcaactgctacttccccctgcagagctatggctttcagcccaccaatggggtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctttgagctgctgcatgcccctgccacagtgtgtggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgtgtgaactttgactacaaggatgatgatgacaagacgcgtaaggaggcatgccccacaggcctgtaca。

2)PCR扩增：

基于之前构建的质粒NGFR in PB713和RBD in NGFR in PB713设计引物。

RBD-NGFR线性化模板扩增引物:其中加粗部分为T7启动子

Primer Forward(SEQ ID No.10)：

Primer Reverse(SEQ ID No.11)：caccgtgggcttgtactc

NGFR线性化模板扩增引物：

Primer Forward(SEQ ID No.12)：

Primer Reverse(SEQ ID No.13)：caccgtgggcttgtactc

委托金唯智合成引物。在超净台中按照引物外侧推荐量加入适量的ddH

表5PCR扩增体系

然后在PCR仪上运行以下反应体系，获得体外转录的线性化模板。

表6反应体系

NGFR线性化PCR产物序列如下(SEQ ID No.14)，其中加粗序列为T7启动子区，斜体序列为引物序列：

RBD-NGFR线性化PCR产物序列如下(SEQ ID No.15)，其中加粗序列为T7启动子区，斜体序列为引物序列：

扩增结束后，将所得RBD-NGFR、NGFR的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，130V，电泳30min。

3)胶回收

按照Gel Extraction Kit(OMAGA)对上述PCR产物进行胶回收，具体步骤如下：

a.按照预测目的条带大小切除胶块，放入1.5ml EP管中，称重；

b.按照0.3g胶块加入0.3ml Binding Buffer的量加入适当体积的BindingBuffer，置55-65℃，6-8min，或胶块完全融化，将EP管内溶液转移至吸附柱内，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；

c.在吸附柱内加300ul Binding Buffer，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；

d.在吸附柱内加600ul SPW Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃掉下层废液；

e.重复步骤d；

f.将空的吸附柱置于离心机中，12000rpm，离心2min，去掉残余的洗脱液；

g.取30μl Elution Buffer悬浮滴于吸附柱上，室温静置2min，12000rpm，离心1min，得到体外转录的线性化模板，取2μl产物在酶标仪(Thermo)上进行浓度测定。

2.体外转录

按照mMESSAGE

1)反应体系：

表7反应体系

混匀，37℃水浴过夜反应；

2)加1μL TURBO DNase，混匀，37℃反应15min，消化DNA模板，得到RBD-NGFR和NGFR的mMESSAGE

3.加尾

按照mMESSAGE

1)反应体系：

表8反应体系

2)从上述反应体系中取出2.5μl反应液作为加尾反应的对照；

3)加4μL of E-PAP，混匀，加水使最终反应体系为100μL；

4)37℃反应30-45min，反应结束后将产物置于冰上。

4.LiCl沉淀

按照mMESSAGE

1)通过加入50μL LiCl Precipitation Solution，混匀终止反应；

2)在-20℃放置≥30min；

3)最高转速，4℃离心15min，沉淀RNA；

4)小心弃去上清，用1mL 70％乙醇漂洗，重新离心；

5)小心弃去上清，用适当体积的Nuclease-free Water重新溶解RNA，得到RBD-NGFR-RNA和NGFR-RNA，取出3μl进行浓度测定和琼脂糖凝胶电泳分析；

6)将所得RBD-NGFR-RNA和NGFR-RNA在-20℃或-70℃保存。

5.电转表达

1)取2*10

2)取20ml 1640无血清培养基重悬细胞，去除血清的干扰，400*g离心5min，弃上清；

3)取2ml 1640无血清培养基重悬细胞，分别取1ml细胞悬液到1.5mlEP管中，400*g离心5min，弃上清；

4)轻弹EP管底部使细胞呈糊状，分别加入适量的RNA(RBD-NGFR 6μl，18μg；NGFR6μl,15μg)，加1640无血清培养基至140ul体系，混匀，将细胞悬液转移至电击杯中，避免产生气泡；

5)启动电转仪，设置参数：560V，30ms，将电击杯快速放入电击槽中，进行电转，电击完成后快速插入冰中，静置2min；

6)将细胞悬液转移至75ml细胞培养瓶中，补加30ml IMDM培养基(含10％FBS)，37℃恒温培养箱中培养，得到NGFR-K562、RBD-NGFR-K562细胞悬液。

6.流式检测

1)实验一：1P+Anti-human-IgG-FC

a.将上一步电转后的NGFR-K562、RBD-NGFR-K562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中取出1*10

b.在细胞沉淀中加1μl 1P抗体和100μl PBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育40min；

c.加1ml PBS溶液洗去一抗，400*g离心5min，弃上清；

d.在细胞沉淀中加2μl Anti-human-IgG-FC和100μl PBS溶液，室温孵育30min；

e.加1ml PBS溶液洗去一抗，400*g离心5min，弃上清；

f.加300μl PBS上机检测；

2)实验二：Anti-NGFR-PE

a.将上一步电转后的NGFR-K562、RBD-NGFR-K562细胞于37℃恒温培养箱中培养24h后，于生物安全柜中取出1*106 K562(野生型)、NGFR-K562、RBD-NGFR-K562细胞，400*g离心5min，弃上清；用1ml PBS溶液洗一次，400*g离心5min，弃上清；

b.在细胞沉淀中加1.5μl 1P Anti-NGFR-PE和100ul PBS溶液，轻弹流式管底部混匀，室温孵育30min；

c.加1ml PBS溶液洗去抗体，400*g离心5min，弃上清；

d.加300μl PBS溶液上机检测。

3)流式细胞仪上机检测

表9检测条件

三、实验结果与讨论

1.DNA的获得

线性化模板的浓度如下表所示：

表10线性化模板的浓度

2.加尾

图2、图3分别是NGFR-RNA和RBD-NGFR-RNA的琼脂糖凝胶电泳图，图像显示成功制备到RNA，且加尾后条带有所上移。但RBD-NGFR-RNA有些许拖尾和弥散，且相比加尾前大小基本没有改变。

下表是NGFR-RNA和RBD-NGFR-RNA的浓度。

表11NGFR-RNA、RBD-NGFR-RNA的浓度

3.流式检测

图4为电转NGFR-RNA和RBD-NGFR-RNA的24h培养后的K562表达NGFR情况，结果显示，与K562野生型相比，电转NGFR的24h后的K562NGFR的表达率为99.6％，电转RBD-NGFR的24h后的K562NGFR的表达率为97.6％。

表12 24h K562-NGFR表达情况

图5为电转NGFR-RNA和RBD-NGFR-RNA的24h培养后的K562表达RBD情况，结果显示，K562野生型和电转NGFR的24h后的K562RBD的表达率均为5％左右，而电转RBD-NGFR的24h后的K562 RBD的表达率为59.7％。

表13 24h K562-RBD表达情况

结果表明：RBD-NGFR-RNA可以在K562细胞上进行表达。

对比例1

一、实验材料

1.细胞：K562细胞、0330B细胞

2.培养基：IMDM完全培养基、1640完全培养基(含150IU/ml的IL-2)

3.流式抗体：

Anti-Human-IgG-Fc-PE

Anti-Protien S-1P(博奥龙公司2mg/ml、识别S-RBD区域)

4.质粒：

分别基因合成(委托金唯智生物科技有限公司)

PDGFR基因片段(SEQ ID No.16)

gctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt。

CD4基因片段(SEQ ID No.17)

ACGCGTAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCtttccagaaggcctccagcatagtctataagaaagagggggaacaggtggagttctccttcccactcgcctttacagttgaaaagctgacgggcagtggcgagctgtggtggcaggcggagagggcttcctcctccaagtcttggatcacctttgacctgaagaacaaggaagtgtctgtaaaacgggttacccaggaccctaagctccagatgggcaagaagctcccgctccacctcaccctgccccaggccttgcctcagtatgctggctctggaaacctcaccctggcccttgaagcgaaaacaggaaagttgcatcaggaagtgaacctggtggtgatgagagccactcagctccagaaaaatttgacctgtgaggtgtggggacccacctcccctaagctgatgctgagcttgaaactggagaacaaggaggcaaaggtctcgaagcgggagaaggcggtgtgggtgctgaaccctgaggcggggatgtggcagtgtctgctgagtgactcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtcgaccccggtgcagccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttctgtgtcaggtgccggcac。

MSLN基因片段(SEQ ID No.18)

gaagtggagaagacagcctgtccttcaggcaagaaggctcccgagatagacgagagcctcatcttctacaagaagtgggagctggaagcctgcgtggatgcggccctgctggccacccagatggaccgcgtgaacgccatccccttcacctacgagcagctggacgtcctaaagcataaactggatgagctctacccacaaggttaccccgagtctgtgatccagcacctgggctacctcttcctcaagatgagccctgaggacattcgcaagtggaatgtgacgtccctggagaccctgaaggctttgcttgaagtcaacaaagggcacgaaatgagtcctcaggtggccaccctgatcgaccgctttgtgaagggaaggggccagctagacaaagacaccctagacaccctgaccgccttctaccctgggtacctgtgctccctcagccccgaggagctgagctccgtgccccccagcagcatctgggcggtcaggccccaggacctggacacgtgtgacccaaggcagctggacgtcctctatcccaaggcccgccttgctttccagaacatgaacgggtccgaatacttcgtgaagatccagtccttcctgggtggggcccccacggaggatttgaaggcgctcagtcagcagaatgtgagcatggacttggccacgttcatgaagctgcggacggatgcggtgctgccgttgactgtggctgaggtgcagaaacttctgggaccccacgtggagggcctgaaggcggaggagcggcaccgcccggtgcgggactggatcctacggcagcggcaggacgacctggacacgctggggctggggctacagggcggcatccccaacggctacctggtcctagacctcagcatgcaagaggccctctcg。

替换PB-S-RBD-NGFR质粒中的基因(SEQ ID No.19)：

acacacagcggtgagtgctgcaaagcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacagcgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagcatgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgactgggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacaccgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccgtgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctggccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggcacctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtggtgacccgaggcaccaccgacaacctcatccctgtctattgctccatcctggctgctgtggttgtgggccttgtggcctacatagccttcaagagg。

制备质粒，分别命名为S-RBD-PDGFR、S-RBD-CD4、S-RBD-MSLN。由金唯智对制备成的质粒进行大量抽提和去除内毒素。

二、实验方法

1.取4×10

2.电转48h后，每种细胞各取1ml通过流式检测4种标签的表达量，然后用5μg/ml的嘌呤霉素进行药筛。一周后，通过流式分析检测K562-S-RBD-NGFR、K562-S-RBD-PDGFR、K562-S-RBD-CD4、K562-S-RBD-MSLN四种细胞膜上S-RBD的表达量。

结果见图6和图7。流式分析结果表明：K562细胞电转4种新型质粒(S-RBD-NGFR、S-RBD-PDGFR、S-RBD-CD4、S-RBD-MSLN)后均可表达S-RBD(图7)，并且在用5ug/ml的嘌呤霉素药筛一周后K562-S-RBD-NGFR细胞S-RBD表达量高达98.4％，远远超过嘌呤霉素的跨膜表达量。

对比例2

一、实验材料

1.细胞：K562细胞

2.培养基：IMDM完全培养基

3.ELISA抗体：

Biotinylated2019n-Cov Spike S-His (KACTUS公司)

S1-RBD(SARS-Cov-2)(HEK293)(北京博奥龙免疫技术有限公司)

Goa Anti-Mouse IgG-HRP(1:10000)

4.小鼠：雌性Balb/c小鼠(5周，25g左右)

二、实验方法

1.将K562-S-RBD-NGFR、K562-S-RBD-PDGFRR、K562-S-RBD-CD4、K562-S-RBD-MSLN和K562-PZX-K-S-Hygro五种细胞各取1×10

K562-PZX-K-S-Hygro的获取：通过悬浮293T细胞(购自中山康晟生物技术有限公司)以阳离子聚合物转染试剂(JetPrime，购自Polyplus公司)瞬时转染PZX-K-S-Hygro慢病毒穿梭质粒(序列如SEQ ID No.20所示)与慢病毒包装辅助质粒(如SBI公司的pPACKPackaging System，参考其说明书进行转染)后待细胞表达慢病毒并分泌于细胞培养上清中。浓缩收获的病毒上清，沉淀获得高滴度病毒后感染K562细胞，经过含有潮霉素的抗性培养基筛选高表达细胞，构建得到K562-PZX-K-S-Hygro细胞。

SEQ ID No.20：

gtaaaacgacggccagtgccaagctgacgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagttgaaagaccccacctgtaggtttggcaagttagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagcgaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagtttgcttcttgcttctgtttgtgtgcttctgctccctgagctcaataaaagagcccacaacccctcacttggtgggccagtcctctgatagactgtgtcccctggatacccgtattctagagctagcgaattcgccaccatgttcgtcttcctggtcctgctgcctctggtctcctcacagtgcgtcaatctgacaactcggactcagctgccacctgcttatactaatagcttcaccagaggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttggcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgccaacaactgcacatttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgacggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagggcttcagcgccctggagcccctggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgactcctctagcggatggaccgccggcgctgccgcctactatgtgggctacctccagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcggatcagcaactgcgtggccgactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtctacgccgattctttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagacaggcaagatcgcagactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactccagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggtgctgagctttgagctgctgcacgccccagcaacagtgtgcggccccaagaagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctggacatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacacccggcaccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggtgcccgtggctatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctccaacgtcttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagacaaactctcccagaagagcccggagcgtggcctcccagtctatcatcgcctataccatgtccctgggcgccgagaacagcgtggcctactctaacaatagcatcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagcaacctgctgctccagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctgggcgacatcgcagccagggacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctggccggcaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctccagatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaagatccaggacagcctgtcctctacagccagcgccctgggcaagctccaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggccggctccagagcctccagacctatgtgacacagcagctgatcagggccgccgagatcagggccagcgccaatctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccacagacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaataccgtgtatgatccactccagcccgagctggacagctttaaggaggagctggataagtatttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggctaagaatctgaacgagagcctgatcgacctccaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaagggctgctgtagctgtggctcctgctgtaagtttgacgaggatgactctgaacctgtgctgaagggcgtgaagctgcattacaccggatccatggaaggtagaggttctctcctcacttgtggtgatgttgaagaaaaccctggtccaatgtctagaaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagacttttgcagagaccaaattcgtaatcatgtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatga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2.动物实验共分六组：①PBS组、②K562-S-RBD-NGFR组、③K562-S-RBD-PDGFR组、④K562-S-RBD-CD4组、⑤K562-S-RBD-MSLN组和⑥K562-PZX-K-S-Hygro组，每组4只小鼠，每支只小鼠注射2×10

3.14天后每只小鼠取适量血分离血清：将采集的血清放37℃培养箱温浴1h，然后3000rpm离心20min，离心结束后，将上层血清转移到标记好的1.5ml离心管，然后进行ELISA检测。

4.ELISA包被：将S全长蛋白和S-RBD蛋白按照1μg/ml的浓度分别包被3块ELISA板，100μl/孔，4℃过夜包被。

5.ELISA封闭：用TBST配置120ml的5％脱脂牛奶，200μl/孔，37℃培养箱孵育1h。

6.ELISA上样：将24管血清分别按照1:100、1:1000、1:10000稀释三个梯度，加入到封闭好的ELISA板中，每管血清做3次重复，100μl/孔，37℃培养箱孵育2-3h。

7.ELISA二抗：将Goat Anti-Mouse IgG-HRP抗体按照1:10000的比例用PBS稀释60ml，100μl/孔，室温孵育40min。

8.ELISA显色：每孔加入100μl TMB显色液避光显色5min后再加入100μl终止液。

9.酶标仪检测波长为450nm时的OD值。

如图8所示：与对照组(血清滴度分别为1:1054)相比，K562-PZX-K-S-Hygro、K562-S-RBD-NGFR、K562-S-RBD-PDGFR三组细胞均可使小鼠体内产生S-RBD抗体(各组平均血清滴度分别为1:906，1:3218和1:165)，在血清稀释比例为1:10000的条件下依然可以在K562-S-RBD-NGFR组的个别小鼠体内检测到S-RBD抗体，并且其表达量最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> 一种跨膜表达新型冠状病毒抗原的细胞的制备方法、细胞和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct 60

cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc 120

cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc 180

ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt 240

gaccggcgcc tacgctagac gccaccgaat tcatgggggc aggtgccacc ggccgcgcca 300

tggacgggcc gcgcctgctg ctgttgctgc ttctgggggt gtcccttgga ggtgccgtcg 360

acagagtgca gcccacagag agcattgtga gattccccaa catcaccaac ctgtgcccct 420

ttggggaggt gttcaatgcc acaagatttg cctctgtgta tgcctggaac agaaagagaa 480

tcagcaactg tgtggctgac tactctgtgc tctataattc tgctagcttc agcaccttca 540

agtgctatgg ggtgagcccc accaagctga atgacctgtg cttcaccaat gtgtatgctg 600

acagctttgt gatcagaggg gatgaggtga gacagattgc ccctgggcag actggcaaga 660

ttgctgacta caactacaag ctgcctgatg acttcactgg ctgtgtgatt gcctggaaca 720

gcaacaacct ggacagcaag gtggggggca actacaacta cctctataga ctgttcagaa 780

agagcaacct gaagcccttt gagagagaca tcagcacaga gatctaccaa gctggcagca 840

ccccctgcaa tggggtggag ggcttcaact gctacttccc cctgcagagc tatggctttc 900

agcccaccaa tggggtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc tttgagctgc 960

tgcatgcccc tgccacagtg tgtggcccca agaagagcac caacctggtg aagaacaagt 1020

gtgtgaactt tgactacaag gatgatgatg acaagacgcg taaggaggca tgccccacag 1080

gcctgtacac acacagcggt gagtgctgca aagcctgcaa cctgggcgag ggtgtggccc 1140

agccttgtgg agccaaccag accgtgtgtg agccctgcct ggacagcgtg acgttctccg 1200

acgtggtgag cgcgaccgag ccgtgcaagc cgtgcaccga gtgcgtgggg ctccagagca 1260

tgtcggcgcc gtgcgtggag gccgacgacg ccgtgtgccg ctgcgcctac ggctactacc 1320

aggatgagac gactgggcgc tgcgaggcgt gccgcgtgtg cgaggcgggc tcgggcctcg 1380

tgttctcctg ccaggacaag cagaacaccg tgtgcgagga gtgccccgac ggcacgtatt 1440

ccgacgaggc caaccacgtg gacccgtgcc tgccctgcac cgtgtgcgag gacaccgagc 1500

gccagctccg cgagtgcaca cgctgggccg acgccgagtg cgaggagatc cctggccgtt 1560

ggattacacg gtccacaccc ccagagggct cggacagcac agcccccagc acccaggagc 1620

ctgaggcacc tccagaacaa gacctcatag ccagcacggt ggcaggtgtg gtgaccacag 1680

tgatgggcag ctcccagccc gtggtgaccc gaggcaccac cgacaacctc atccctgtct 1740

attgctccat cctggctgct gtggttgtgg gccttgtggc ctacatagcc ttcaagaggc 1800

tcgaggaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt g 1841

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala

20 25

<210> 3

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asp

210 215 220

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

225 230

<210> 4

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Arg Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu

1 5 10 15

Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly

20 25 30

Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser

35 40 45

Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val

50 55 60

Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val

65 70 75 80

Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys

100 105 110

Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr

115 120 125

Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys

130 135 140

Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro

165 170 175

Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro

180 185 190

Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr

195 200 205

Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

210 215 220

Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu

225 230 235 240

Val Ala Tyr Ile Ala Phe Lys Arg

245

<210> 5

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 60

tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 120

cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 180

actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 240

gcctac 246

<210> 6

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagtgcagc ccacagagag cattgtgaga ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttt 60

ggggaggtgt tcaatgccac aagatttgcc tctgtgtatg cctggaacag aaagagaatc 120

agcaactgtg tggctgacta ctctgtgctc tataattctg ctagcttcag caccttcaag 180

tgctatgggg tgagccccac caagctgaat gacctgtgct tcaccaatgt gtatgctgac 240

agctttgtga tcagagggga tgaggtgaga cagattgccc ctgggcagac tggcaagatt 300

gctgactaca actacaagct gcctgatgac ttcactggct gtgtgattgc ctggaacagc 360

aacaacctgg acagcaaggt ggggggcaac tacaactacc tctatagact gttcagaaag 420

agcaacctga agccctttga gagagacatc agcacagaga tctaccaagc tggcagcacc 480

ccctgcaatg gggtggaggg cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta tggctttcag 540

cccaccaatg gggtgggcta tcagccctac agagtggtgg tgctgagctt tgagctgctg 600

catgcccctg ccacagtgtg tggccccaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgt 660

gtgaactttg actacaagga tgatgatgac aag 693

<210> 7

<211> 710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacacagcgg tgagtgctgc aaagcctgca acctgggcga gggtgtggcc cagccttgtg 60

gagccaacca gaccgtgtgt gagccctgcc tggacagcgt gacgttctcc gacgtggtga 120

gcgcgaccga gccgtgcaag ccgtgcaccg agtgcgtggg gctccagagc atgtcggcgc 180

cgtgcgtgga ggccgacgac gccgtgtgcc gctgcgccta cggctactac caggatgaga 240

cgactgggcg ctgcgaggcg tgccgcgtgt gcgaggcggg ctcgggcctc gtgttctcct 300

gccaggacaa gcagaacacc gtgtgcgagg agtgccccga cggcacgtat tccgacgagg 360

ccaaccacgt ggacccgtgc ctgccctgca ccgtgtgcga ggacaccgag cgccagctcc 420

gcgagtgcac acgctgggcc gacgccgagt gcgaggagat ccctggccgt tggattacac 480

ggtccacacc cccagagggc tcggacagca cagcccccag cacccaggag cctgaggcac 540

ctccagaaca agacctcata gccagcacgg tggcaggtgt ggtgaccaca gtgatgggca 600

gctcccagcc cgtggtgacc cgaggcacca ccgacaacct catccctgtc tattgctcca 660

tcctggctgc tgtggttgtg ggccttgtgg cctacatagc cttcaagagg 710

<210> 8

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct 60

cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc 120

cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc 180

ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt 240

gaccggcgcc tacgctagac gccaccgaat tcatgggggc aggtgccacc ggccgcgcca 300

tggacgggcc gcgcctgctg ctgttgctgc ttctgggggt gtcccttgga ggtgccaagg 360

aggcatgccc cacaggcctg tacacacaca gcggtgagtg ctgcaaagcc tgcaacctgg 420

gcgagggtgt ggcccagcct tgtggagcca accagaccgt gtgtgagccc tgcctggaca 480

gcgtgacgtt ctccgacgtg gtgagcgcga ccgagccgtg caagccgtgc accgagtgcg 540

tggggctcca gagcatgtcg gcgccgtgcg tggaggccga cgacgccgtg tgccgctgcg 600

cctacggcta ctaccaggat gagacgactg ggcgctgcga ggcgtgccgc gtgtgcgagg 660

cgggctcggg cctcgtgttc tcctgccagg acaagcagaa caccgtgtgc gaggagtgcc 720

ccgacggcac gtattccgac gaggccaacc acgtggaccc gtgcctgccc tgcaccgtgt 780

gcgaggacac cgagcgccag ctccgcgagt gcacacgctg ggccgacgcc gagtgcgagg 840

agatccctgg ccgttggatt acacggtcca cacccccaga gggctcggac agcacagccc 900

ccagcaccca ggagcctgag gcacctccag aacaagacct catagccagc acggtggcag 960

gtgtggtgac cacagtgatg ggcagctccc agcccgtggt gacccgaggc accaccgaca 1020

acctcatccc tgtctattgc tccatcctgg ctgctgtggt tgtgggcctt gtggcctaca 1080

tagccttcaa gaggctcgag gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtg 1136

<210> 9

<211> 739

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtacagtcg acagagtgca gcccacagag agcattgtga gattccccaa catcaccaac 60

ctgtgcccct ttggggaggt gttcaatgcc acaagatttg cctctgtgta tgcctggaac 120

agaaagagaa tcagcaactg tgtggctgac tactctgtgc tctataattc tgctagcttc 180

agcaccttca agtgctatgg ggtgagcccc accaagctga atgacctgtg cttcaccaat 240

gtgtatgctg acagctttgt gatcagaggg gatgaggtga gacagattgc ccctgggcag 300

actggcaaga ttgctgacta caactacaag ctgcctgatg acttcactgg ctgtgtgatt 360

gcctggaaca gcaacaacct ggacagcaag gtggggggca actacaacta cctctataga 420

ctgttcagaa agagcaacct gaagcccttt gagagagaca tcagcacaga gatctaccaa 480

gctggcagca ccccctgcaa tggggtggag ggcttcaact gctacttccc cctgcagagc 540

tatggctttc agcccaccaa tggggtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc 600

tttgagctgc tgcatgcccc tgccacagtg tgtggcccca agaagagcac caacctggtg 660

aagaacaagt gtgtgaactt tgactacaag gatgatgatg acaagacgcg taaggaggca 720

tgccccacag gcctgtaca 739

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg ctcgcatctc tccttcac 38

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccgtgggc ttgtactc 18

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taatacgact cactataggg cgccgttaca gatccaa 37

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccgtgggc ttgtactc 18

<210> 14

<211> 980

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg cctacgctag 60

acgccaccga attcatgggg gcaggtgcca ccggccgcgc catggacggg ccgcgcctgc 120

tgctgttgct gcttctgggg gtgtcccttg gaggtgccaa ggaggcatgc cccacaggcc 180

tgtacacaca cagcggtgag tgctgcaaag cctgcaacct gggcgagggt gtggcccagc 240

cttgtggagc caaccagacc gtgtgtgagc cctgcctgga cagcgtgacg ttctccgacg 300

tggtgagcgc gaccgagccg tgcaagccgt gcaccgagtg cgtggggctc cagagcatgt 360

cggcgccgtg cgtggaggcc gacgacgccg tgtgccgctg cgcctacggc tactaccagg 420

atgagacgac tgggcgctgc gaggcgtgcc gcgtgtgcga ggcgggctcg ggcctcgtgt 480

tctcctgcca ggacaagcag aacaccgtgt gcgaggagtg ccccgacggc acgtattccg 540

acgaggccaa ccacgtggac ccgtgcctgc cctgcaccgt gtgcgaggac accgagcgcc 600

agctccgcga gtgcacacgc tgggccgacg ccgagtgcga ggagatccct ggccgttgga 660

ttacacggtc cacaccccca gagggctcgg acagcacagc ccccagcacc caggagcctg 720

aggcacctcc agaacaagac ctcatagcca gcacggtggc aggtgtggtg accacagtga 780

tgggcagctc ccagcccgtg gtgacccgag gcaccaccga caacctcatc cctgtctatt 840

gctccatcct ggctgctgtg gttgtgggcc ttgtggccta catagccttc aagaggctcg 900

aggagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatga 960

ccgagtacaa gcccacggtg 980

<210> 15

<211> 1936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taatacgact cactataggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 60

ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 120

tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 180

cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 240

actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 300

gcctacgcta gacgccaccg aattcatggg ggcaggtgcc accggccgcg ccatggacgg 360

gccgcgcctg ctgctgttgc tgcttctggg ggtgtccctt ggaggtgccg tcgacagagt 420

gcagcccaca gagagcattg tgagattccc caacatcacc aacctgtgcc cctttgggga 480

ggtgttcaat gccacaagat ttgcctctgt gtatgcctgg aacagaaaga gaatcagcaa 540

ctgtgtggct gactactctg tgctctataa ttctgctagc ttcagcacct tcaagtgcta 600

tggggtgagc cccaccaagc tgaatgacct gtgcttcacc aatgtgtatg ctgacagctt 660

tgtgatcaga ggggatgagg tgagacagat tgcccctggg cagactggca agattgctga 720

ctacaactac aagctgcctg atgacttcac tggctgtgtg attgcctgga acagcaacaa 780

cctggacagc aaggtggggg gcaactacaa ctacctctat agactgttca gaaagagcaa 840

cctgaagccc tttgagagag acatcagcac agagatctac caagctggca gcaccccctg 900

caatggggtg gagggcttca actgctactt ccccctgcag agctatggct ttcagcccac 960

caatggggtg ggctatcagc cctacagagt ggtggtgctg agctttgagc tgctgcatgc 1020

ccctgccaca gtgtgtggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgtgtgaa 1080

ctttgactac aaggatgatg atgacaagac gcgtaaggag gcatgcccca caggcctgta 1140

cacacacagc ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg 1200

tggagccaac cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt 1260

gagcgcgacc gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc 1320

gccgtgcgtg gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga 1380

gacgactggg cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc 1440

ctgccaggac aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga 1500

ggccaaccac gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct 1560

ccgcgagtgc acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac 1620

acggtccaca cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc 1680

acctccagaa caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg 1740

cagctcccag cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc 1800

catcctggct gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggctcgagga 1860

gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc ctatgaccga 1920

gtacaagccc acggtg 1936

<210> 16

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctgtgggcc aggacacgca ggaggtcatc gtggtgccac actccttgcc ctttaaggtg 60

gtggtgatct cagccatcct ggccctggtg gtgctcacca tcatctccct tatcatcctc 120

atcatgcttt ggcagaagaa gccacgt 147

<210> 17

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgcgtaaaa tagacatcgt ggtgctagct ttccagaagg cctccagcat agtctataag 60

aaagaggggg aacaggtgga gttctccttc ccactcgcct ttacagttga aaagctgacg 120

ggcagtggcg agctgtggtg gcaggcggag agggcttcct cctccaagtc ttggatcacc 180

tttgacctga agaacaagga agtgtctgta aaacgggtta cccaggaccc taagctccag 240

atgggcaaga agctcccgct ccacctcacc ctgccccagg ccttgcctca gtatgctggc 300

tctggaaacc tcaccctggc ccttgaagcg aaaacaggaa agttgcatca ggaagtgaac 360

ctggtggtga tgagagccac tcagctccag aaaaatttga cctgtgaggt gtggggaccc 420

acctccccta agctgatgct gagcttgaaa ctggagaaca aggaggcaaa ggtctcgaag 480

cgggagaagg cggtgtgggt gctgaaccct gaggcgggga tgtggcagtg tctgctgagt 540

gactcgggac aggtcctgct ggaatccaac atcaaggttc tgcccacatg gtcgaccccg 600

gtgcagccaa tggccctgat tgtgctgggg ggcgtcgccg gcctcctgct tttcattggg 660

ctaggcatct tcttctgtgt caggtgccgg cac 693

<210> 18

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaagtggaga agacagcctg tccttcaggc aagaaggctc ccgagataga cgagagcctc 60

atcttctaca agaagtggga gctggaagcc tgcgtggatg cggccctgct ggccacccag 120

atggaccgcg tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtcct aaagcataaa 180

ctggatgagc tctacccaca aggttacccc gagtctgtga tccagcacct gggctacctc 240

ttcctcaaga tgagccctga ggacattcgc aagtggaatg tgacgtccct ggagaccctg 300

aaggctttgc ttgaagtcaa caaagggcac gaaatgagtc ctcaggtggc caccctgatc 360

gaccgctttg tgaagggaag gggccagcta gacaaagaca ccctagacac cctgaccgcc 420

ttctaccctg ggtacctgtg ctccctcagc cccgaggagc tgagctccgt gccccccagc 480

agcatctggg cggtcaggcc ccaggacctg gacacgtgtg acccaaggca gctggacgtc 540

ctctatccca aggcccgcct tgctttccag aacatgaacg ggtccgaata cttcgtgaag 600

atccagtcct tcctgggtgg ggcccccacg gaggatttga aggcgctcag tcagcagaat 660

gtgagcatgg acttggccac gttcatgaag ctgcggacgg atgcggtgct gccgttgact 720

gtggctgagg tgcagaaact tctgggaccc cacgtggagg gcctgaaggc ggaggagcgg 780

caccgcccgg tgcgggactg gatcctacgg cagcggcagg acgacctgga cacgctgggg 840

ctggggctac agggcggcat ccccaacggc tacctggtcc tagacctcag catgcaagag 900

gccctctcg 909

<210> 19

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acacacagcg gtgagtgctg caaagcctgc aacctgggcg agggtgtggc ccagccttgt 60

ggagccaacc agaccgtgtg tgagccctgc ctggacagcg tgacgttctc cgacgtggtg 120

agcgcgaccg agccgtgcaa gccgtgcacc gagtgcgtgg ggctccagag catgtcggcg 180

ccgtgcgtgg aggccgacga cgccgtgtgc cgctgcgcct acggctacta ccaggatgag 240

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gccaaccacg tggacccgtg cctgccctgc accgtgtgcg aggacaccga gcgccagctc 420

cgcgagtgca cacgctgggc cgacgccgag tgcgaggaga tccctggccg ttggattaca 480

cggtccacac ccccagaggg ctcggacagc acagccccca gcacccagga gcctgaggca 540

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atcctggctg ctgtggttgt gggccttgtg gcctacatag ccttcaagag g 711

<210> 20

<211> 11162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtaaaacgac ggccagtgcc aagctgacgc gtgtagtctt atgcaatact cttgtagtct 60

tgcaacatgg taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca 120

tgccgattgg tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacgggt 180

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ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 360

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aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg 780

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