一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存的方法。

背景技术

近年来，生物治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第五大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法(ACI)是细胞生物治疗方法之一，它是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前在临床上应用过继性免疫细胞包括DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞及NK细胞，其中，CIK细胞、LAK细胞和A-NK细胞都是以自然杀伤细胞为主体的抗癌体系。

自然杀伤细胞(natural killer cells)也叫做NK细胞，主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，分布在骨髓、外周血和脾脏，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用：它是天然免疫防御的主要组成，位于机体防御体系的第一道防线，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，可无需抗原预先致敏即可识别并杀死肿瘤及病毒感染的细胞，通过穿孔素-颗粒酶途径和Fas-FasL通路直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞；同时它又能在发病早期分泌多种细胞因子和趋化因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1等，这些细胞因子参与抗癌和调节获得性免疫应答，故NK细胞也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。虽然NK细胞的抗癌效果的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-20％，因而如何获得高纯度、高质量地NK细胞产品是NK治疗的关键。近几年发现通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，己知IL-2、IL-15、IL-18和IL-7等细胞因子在对NK细胞的体外扩增上发挥重要作用，它们体外扩增NK细胞的倍数在几倍至数十倍不等。IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的细胞因子，它可以激活NK细胞、促进NK细胞增殖和细胞因子的产生。IL-15和IL-7的作用与IL-2相似，同时它们还可通过与NK细胞表面表达的复合受体γ链结合，促进造血干细胞定向分化为NK细胞，且对NK细胞的发育、分化和维持长期体外存活等方面发挥重要作用。IL-15与IL-2的协同作用也使两者联合作用于NK细胞的体外扩增，是目前NK细胞体外扩增最传统的细胞因子组合。据报道IL-18不但能诱导活化的THi细胞分泌产生大量的IFN-γ，更能通过促进Fas-FasL通路的开放，增强NK细胞的细胞毒性，且呈剂量依赖性。但目前市场上已有NK细胞治疗产品存在，但冻存复苏效果差、使用的培养体系繁杂、扩增倍数及杀瘤效果不佳，部分培养体系存在安全风险等问题。

由此，自然杀伤细胞的培养和冻存方法有待改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存的方法，包括以下几个具体的步骤：

步骤一：利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；

步骤二：利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；

步骤三：利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；

步骤四：利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；将所述冻存的免疫细胞置于40℃的恒温水浴装置中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；

步骤五：将复苏细胞混合液进行离心弃上清处理后得到复苏的免疫细胞；

上述所述恒温水浴装置的内部设置有加热水槽，加热水槽上方设置有水浴腔，水浴腔和加热水槽之间设置有镂空状的水浴隔板，水浴隔板上设置有磁力搅拌器，加热水槽的底部设置有电加热管；所述恒温水浴装置的外部设置有保温壳体，保温壳体和恒温水浴装置之间设置有热量回收腔。

作为本发明的一种优选方案，所述恒温水浴装置的一侧设置有进水口，进水口通过进水管连通水泵的出水口，水泵的进水口通过抽水管连通管供水箱；所述恒温水浴装置的底部一侧设置有出水管；所述热量回收腔的底部一侧设置有排水口，排水口连通排水管，排水管连通进水管；所述排水口的上方设置有入水口，入水口连通入水管，入水管连通进水管。

作为本发明的一种优选方案，所述进水管连通喷淋水管，喷淋水管的底部设置有雾化喷头，雾化喷头安装时可以朝向恒温水浴装置的内壁设置。

作为本发明的一种优选方案，所述恒温水浴装置的顶端设置有密封盖体，密封盖体上设置有多个冻存管出口，密封盖体的内部设置有密封空腔，密封空腔的内部对应冻存管出口的位置设置有弧形密封板，弧形密封板上设置有和冻存管出口位置对应的冻存管插口。

作为本发明的一种优选方案，所述弧形密封板的一端底部设置有限位滑柱，密封空腔的底壁对应限位滑柱的位置设置有供限位滑柱沿密封盖体中心处转动的环形滑轨，环形滑轨的其中一端和限位滑柱的底端位置对应。

作为本发明的一种优选方案，所述弧形密封板的内环上环形阵列设置有多个连接杆，连接杆远离弧形密封板的一端连接有连接环，连接环的内环上设置有连接齿条组，连接齿条组啮合传动连接有驱动齿轮，驱动齿轮的中心处连接有转轴，转轴的顶端连接有控制手柄，控制手柄安装在密封盖体顶端的中心处。

作为本发明的一种优选方案，所述冻存管插口的下方设置磁力搅拌器，磁力搅拌器设置在水浴隔板上，且磁力搅拌器上设置有冻存管支架，冻存管支架上设置有和冻存管插口、冻存管出口位置对应的冻存管插孔；所述水浴隔板的左右两侧均设置有升降装置。

作为本发明的一种优选方案，所述升降装置包括电动伸缩杆，电动伸缩杆的顶端和密封盖体的底壁连接。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明在恒温水浴装置的内部设置了带有电加热管的加热水槽，并在加热水槽的顶端设置了水浴隔板，水浴隔板上设置了磁力搅拌器，在对带有免疫细胞的冻存管进行水浴加热时，可以将其放置在磁力搅拌器内，通过加热水槽内的热水对其进行恒温水浴工作，结构简单，一定程度上提高了免疫细胞的融化速度，减少细胞活性损耗。

2.本发明在恒温水浴装置的顶端设置了密封盖体，并在密封盖体上设置了便于插入冻存管的冻存管出口，且在密封盖体的内部设置了便于转动的弧形密封板，通过转动弧形密封板控制冻存管出口的开闭，通过控制电动伸缩杆调节磁力搅拌器的高度，一定程度上减少了加热水槽、水浴腔和空气的接触面积，减少细菌污染，提高其密封性，且结构简单，操作十分便捷。

3.本发明在恒温水浴装置的外部设置了保温壳体，并在保温壳体和恒温水浴装置之间设置了热量回收腔，使得热量回收腔内的热水可以通过各管道之间的配合将其输送至喷淋水管或进水管内，用于回收利用，节能环保。

附图说明

图1为本发明的整体结构示意图；

图2为本发明的密封盖体的具体结构示意图。

图中：1、恒温水浴装置；2、加热水槽；3、水浴腔；4、水浴隔板；5、磁力搅拌器；6、电加热管；7、保温壳体；8、热量回收腔；9、进水管；10、水泵；11、抽水管；12、供水箱；13、排水管；14、入水管；15、喷淋水管；16、雾化喷头；17、密封盖体；18、冻存管出口；19、密封空腔；20、弧形密封板；21、冻存管插口；22、连接杆；23、连接环；24、连接齿条组；25、驱动齿轮；26、控制手柄；27、冻存管支架；28、冻存管插孔；29、电动伸缩杆；30、限位滑柱；31、环形滑轨。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“竖直”、“上”、“下”、“水平”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

请参阅图1-2，实施例1：本发明提供一种技术方案：一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存的方法，包括以下几个具体的步骤：

步骤一：利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；

步骤二：利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；

步骤三：利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；

步骤四：利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；将所述冻存的免疫细胞置于40℃的恒温水浴装置1中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；

步骤五：将复苏细胞混合液进行离心弃上清处理后得到复苏的免疫细胞；

在本实施例中：在对冷冻的免疫细胞进行恒温水浴时，操作人员先将冻存管依次从密封盖体17上的冻存管出口18、弧形密封板20上的冻存管插口21从上至下依次插入冻存管支架27上的冻存管插孔28内，接着通过控制电动伸缩杆29带动水浴隔板4向下移动至合适的高度后，用手转动控制手柄26，使得转轴带动驱动齿轮25，驱动齿轮25通过与连接环23内环上的连接齿条组24之间的啮合传动，带动弧形密封板20以转轴的中心处为轴心转动直至冻存管插口21远离冻存管出口18，弧形密封板20对冻存管出口18起到密封的作用。

实施例2：启动水泵10，通过抽水管11将供水箱12内的水经由进水管9抽送至加热水槽2或热量回收腔8内，接通电加热管6的电源，对加热水槽2进行加热工作，接通磁力搅拌器5的电源，进一步加快冻存管内免疫细胞的融化速度。

在本实施例中：在加热水槽2温度升高的同时，热量回收腔8的水温同步升高，在冻存管水浴外壁后，可以通过水泵10和排水管13之间的配合将其内部的热水抽出至喷淋水管15，通过雾化喷头16对恒温水浴装置1的内壁进行喷淋冲洗工作，或者将热量回收腔8内的热水抽送至进水管9杀菌消毒后，作为二次水浴用水使用，节能环保。

值得注意的是：整个装置通过控制器对其实现控制，由于控制器匹配的设备为常用设备，属于现有成熟技术，在此不再赘述其电性连接关系以及具体的电路结构。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。