在C末端螺旋区具有半胱氨酸的FC结合蛋白
文献发布时间：2023-06-19 09:47:53
技术领域
本发明涉及在C末端螺旋区具有半胱氨酸的、包含一个或多个结构域的Fc结合蛋白。本发明还涉及包含本发明Fc结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Fc结合蛋白或亲和基质用于免疫球蛋白亲和纯化的用途，以及使用本发明的Fc结合蛋白的亲和纯化方法。
背景技术
许多生物技术和药物应用需要从含有抗体的样品中去除污染物。捕获和纯化抗体的既定方法是亲和层析，其使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A(Protein A)作为免疫球蛋白的选择性配体(例如，参见Huse等人的综述，J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217-231)。野生型蛋白A以高亲和力和高选择性与IgG分子的Fc区结合，并在高温和较宽的pH值范围内保持稳定。具有改善的性质(如碱稳定性)的蛋白A变体可用于纯化抗体，并且包含蛋白A配体的各种色谱基质可商购获得。然而，特别是基于野生型蛋白A的色谱基质显示在暴露于碱性条件后免疫球蛋白的结合能力丧失。
本发明的根本技术问题
抗体或含Fc融合蛋白的大多数大规模生产过程都使用蛋白A进行亲和纯化。然而，由于蛋白A在亲和层析中应用的局限性，本领域需要提供具有改进的与免疫球蛋白特异性结合性能的新的Fc结合蛋白，以促进免疫球蛋白的亲和纯化。为了最大限度地利用包含Fc结合蛋白的色谱基质的价值，希望可以多次使用亲和配体基质。在色谱循环之间，需要一个彻底的清洁程序来清理和去除基质上的残留污染物。在此程序中，通常的做法是对亲和配体基质使用含有高浓度NaOH的碱性溶液。野生型蛋白A结构域不能长时间耐受这种苛刻的碱性条件，会迅速丧失与免疫球蛋白的结合能力。因此，在这一领域中一直需要获得能够结合包含Fc序列的蛋白质的新蛋白质。
本发明提供了Fc结合蛋白，其特别适用于免疫球蛋白的亲和纯化，但克服了现有技术的缺点。特别地，本发明的Fc结合蛋白的显著优点是它们在高pH下长时间的稳定性得到改善，而不会降低Fc结合能力和高动态结合能力。此外，新的Fc结合蛋白允许在3.5或更高的pH下从固定在基质上的Fc结合蛋白上洗脱超过95％的结合的Fc蛋白。
以上概述未必描述了本发明解决的所有问题。
发明内容
本发明的第一方面是提供适用于亲和纯化的Fc结合蛋白。这通过包含一个或多个Fc结合结构域的Fc结合蛋白来实现，其中至少对应于SEQ ID NO：2的第43、46、47、50、51或53位的氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，所述Fc结合蛋白包含一个或多个Fc结合结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，其中至少对应于SEQ ID NO:2的第43、46、47、50、51或53位的氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，至少一个结构域分别包含SEQID NO:3-16的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，其中至少对应于SEQ ID NO:3-16的第43、46、47、50、51或53位的氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，至少一个结构域分别包含SEQ ID NO:7-8的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，其中至少对应于SEQ ID NO:7-8的第43、46、47、50、51或53位的氨基酸是半胱氨酸。在一些实施方案中，至少一个结构域包含选自SEQ ID NO:17-77、90-95的组的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。
在第二方面，本发明涉及包含第一方面的Fc结合蛋白的亲和分离基质。
在第三方面，本发明涉及第一方面的Fc结合蛋白或第二方面的亲和分离基质用于免疫球蛋白或包含免疫球蛋白Fc部分的蛋白的亲和纯化的用途。
在第四方面，本发明涉及亲和纯化免疫球蛋白或包含免疫球蛋白Fc部分的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供含有免疫球蛋白的液体；(b)提供亲和分离基质，其包含与所述亲和分离基质偶联的第一方面的固定的Fc结合蛋白；(c)使所述液体和所述亲和分离基质接触，其中所述免疫球蛋白与所述固定的Fc结合蛋白结合；和(d)从所述基质中洗脱所述免疫球蛋白，从而获得含有所述免疫球蛋白的洗脱液。本发明的概述未必描述本发明的所有特征。通过阅读随后的详细描述，其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1.在c末端螺旋区中具有半胱氨酸的Fc结合结构域的氨基酸序列。第一行中的数字是指Fc结合结构域中的相应氨基酸位置。图1A.SEQ ID NO：2的Fc结合结构域。图1B.在螺旋3中具有Cys的Fc结合结构域的实例。
图2.在螺旋3中具有半胱氨酸的Fc结合结构域的固定。图2A.在第43、46、47、50或58位具有半胱氨酸的IB14蛋白在环氧树脂基质上的偶联效率。Y轴：蛋白质的偶联量，单位：nmol/ml。图2B.cs14 43C和cs14 46C与环氧树脂活化的Sepharose 6B基质的偶联。Y轴：n(每毫升树脂中的蛋白质)，单位：nmol。
图3.在c末端区域3具有半胱氨酸的Fc结合蛋白的苛性碱稳定性(causticstability)。图3A.在第43、46、47、50或58位具有半胱氨酸的IB14的碱稳定性分析。Y轴：Fc结合蛋白IB14和Cys变体的剩余IgG结合活性，单位：％。灰色柱：连续0.5M NaOH处理6小时后，IgG结合活性。黑色柱：无NaOH的IgG结合活性。图3B.在第43或46位具有半胱氨酸的cs14的苛性碱稳定性和DBC 10％。Y轴：DBC 10％(mg/ml)。黑色：DBC 10％(mg/ml)，0h NaOH，浅灰色：DBC 10％(mg/ml)，18h NaOH，深灰色：DBC 10％(mg/ml)，72h NaOH，Cys变体与具有C末端半胱氨酸的cs14和蛋白A进行比较。
图4.显示了cs26 46C在连续0.5M NaOH处理6、24和36小时后的剩余结合能力(单位为％)，与在46位无Cys的cs26和野生型蛋白A结构域C相比。x轴显示了0.5M NaOH的孵育时间(单位为小时)。
图5.显示了cs26 46C(单体和二聚体)的动态结合能力(DBC；mg/ml)，与在46位无Cys的cs26和重组野生型蛋白A相比。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于这里描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语与"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为意指包括成员(members)、整体(integers)或步骤(steps)的所陈述的成员(member)、整体(integer)或步骤(step)或分组(group)，但不排除任何其他成员(members)、整体(integers)或步骤(steps)的成员(member)、整体(integer)或步骤(step)或分组(group)。
如在本发明的说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一种”和“该”可互换使用，并且旨在也包括复数形式，并且落入每个含义内，除非上下文清楚地另有说明。此外，如本文所用，“和/或”指并包含一个或多个所列项目的任何和所有可能的组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时缺少组合。
本文使用的术语“约”包括明确列举的量以及与之±10％的偏差。更优选地，术语“约”包括5％的偏差。
若干文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书等)在本说明书全文中被引用。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这种公开。本文引用的一些文献的特征在于“通过引用并入”。在这种并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间发生冲突的情况下，本说明书的文本优先。
本文提及的所有序列都在所附序列表中公开，该序列表及其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
在本发明的上下文中，术语“Fc结合蛋白”或“免疫球蛋白结合蛋白”或“Ig结合蛋白”用于描述能够特异性结合免疫球蛋白Fc区的蛋白。本文所理解的“免疫球蛋白”可包括但不限于哺乳动物IgG，例如人IgG
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指Fc结合蛋白或Fc结合结构域与其特异的免疫球蛋白的结合比与另一个非免疫球蛋白靶标的结合更强。
术语“结合活性”是指本发明的Fc结合蛋白结合免疫球蛋白的能力。例如，结合活性可以在碱性处理之前和/或之后测定。结合活性可以针对Fc结合蛋白或针对与基质偶联的Fc结合蛋白(即针对固定的结合蛋白)来确定。术语“人工的”指的是非天然存在的物体，即该术语指的是由人生产或改造的物体。例如，由人生产的(例如，在实验室中通过基因工程，通过改组方法，或通过化学反应等)或有意改造的多肽或多核苷酸序列是人工的。
术语“解离常数”或“K
术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何线性分子链，而不是指特定长度的产物。因此，“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语都包括在“多肽”的定义内，术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个使用，或者与这些术语互换使用。术语“多肽”也指多肽翻译后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、非天然存在的氨基酸修饰和本领域公知的类似修饰。因此，包含两个或更多个蛋白质结构域的Fc结合蛋白也属于术语“蛋白质”或“多肽”的定义范围。
术语“碱稳定的”或“碱稳定性”或“苛性碱稳定的”或“苛性碱稳定性”(在本文中也缩写为“cs”)是指本发明的Fc结合蛋白耐受碱性条件而不显著丧失与免疫球蛋白结合的能力的能力。本领域的技术人员可以通过将Fc结合蛋白与氢氧化钠溶液孵育，例如如实施例中所述，随后通过本领域技术人员已知的常规实验，例如通过色谱方法来测试与免疫球蛋白的结合活性，从而很容易地测试碱稳定性。
本发明的Fc结合蛋白以及包含本发明的Fc结合蛋白的基质表现出“增加的”或“改善的”碱稳定性，这意味着相对于参考蛋白，包含所述Fc结合蛋白的分子和基质在碱性条件下在延长的时间段内是稳定的。
本文所用术语“亲代蛋白质”或“亲代结构域”中的术语“亲代”是指一种Fc结合蛋白，该Fc结合蛋白随后被修饰以产生所述亲代蛋白质或结构域的变体。所述亲代蛋白质或结构域可以是人工结构域(例如，但不限于SEQ ID NO:78-83)、天然存在的金黄色葡萄球菌蛋白A结构域(例如，SEQ ID NO:84的结构域C，SEQ ID NO:85的结构域B)或天然存在的金黄色葡萄球菌蛋白A结构域的变体或工程化版本(例如，SEQ ID NO:86的结构域Z)。
如本文所用的术语“变体”包括Fc结合蛋白或结构域的氨基酸序列，其与另一氨基酸序列的区别在于至少一个氨基酸取代、缺失或插入。这些修饰可以通过基因工程或化学合成或人工实施的化学反应产生。例如，SEQ ID NO:27(cs26 A46C)是SEQ ID NO:7(cs26)的变体。
本文使用的术语“缀合物”涉及一种分子，其包含以下或基本上由以下组成：至少一种第一蛋白质，所述第一蛋白质以化学方式连接到其它物质，例如第二蛋白质或非蛋白质部分。
术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指在亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被另一种氨基酸置换、缺失或插入。根据已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以轻松构建编码氨基酸变体的DNA。
术语“取代”或“氨基酸取代”是指在亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被另一种氨基酸置换。例如，取代G46C是指在Fc结合蛋白中第46位的甘氨酸被半胱氨酸代替。对于前面的实例，46C表示第46位的半胱氨酸。出于本文的目的，多个取代通常以斜杠分隔。例如，A1I/S11A/K35R/A46C是指包含取代A1I、S11A、K35R和A46C的组合的变体。
术语“缺失”或“氨基酸缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。
术语“插入”或“氨基酸插入”是指将氨基酸添加到亲本多肽序列中。
在整个说明书中，使用了图1的氨基酸残基位置编号惯例，并且位置编号被指定为对应于例如SEQ ID NO:1-16中的那些。
术语“氨基酸序列同一性”是指两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“百分比同一的”或“百分比同一性”被定义为在将序列比对并引入间隙(如果需要)以获得最大百分比序列同一性之后，序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。
为了确定序列同一性，将查询蛋白质的序列与参考蛋白质的序列进行比对。比对方法在本领域是众所周知的。例如，为了确定任意多肽相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列同一性的程度，优选地使用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller(1991),Advances in Applied Mathematics,vol.12:337-357)，其可免费获得(另请参阅:http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html)。对于多重比对分析，优选使用ClustalW(Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680)。优选地，在计算序列同一性百分比时，使用SIM局部相似性程序或ClustalW的默认参数。
在本发明的上下文中，序列同一性的程度通常是相对于未修饰序列的总长度来计算的，如果没有明确说明的话。
查询序列中在给定位置与参考氨基酸序列不同的每个氨基酸被计为一个差异。然后将差异的总和与参考序列的长度相关联，以得到非同一性的百分比。同一性的数量百分比计算为100减去非同一性的百分比。
当进行比较和比对以获得最大一致性时，如使用以下序列比较算法之一或通过目测所测量的，本文所用的短语“百分比同一的”或“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“百分比同一性”，在两个多肽序列的上下文中，是指两个或更多个序列或子序列在一些实施方案中具有至少约80％，在一些实施方案中至少82％，在一些实施方案中至少84％，在一些实施方案中至少86％，在一些实施方案中至少87％，在一些实施方案中至少89.5％，在一些实施方案中至少91％，在一些实施方案中至少93％，在一些实施方案中至少94％，在一些实施方案中至少96％，在一些实施方案中至少98％，和在一些实施方案中100％氨基酸残基同一性。为了清楚起见，例如，具有至少89.5％同一性的序列包括具有高于89.5％同一性的所有序列，例如具有至少91％、至少93％、至少94％、至少96％、至少98％、100％氨基酸同一性的实施方案。
百分比同一性在一些实施方案中存在于至少50个残基的区域，至少52个残基的区域，在一些实施方案中存在于至少53个残基的区域，在一些实施方案中存在于至少54个残基的区域，在一些实施方案中存在于至少55个残基的区域，在一些实施方案中存在于至少56个残基的区域，在一些实施方案中存在于至少57个残基的区域，和在一些实施方案中存在于至少58个残基的区域。
术语“融合的”是指组分通过肽键直接连接或通过肽接头连接。
术语“融合蛋白”涉及一种蛋白，其包含至少一种第一蛋白，所述至少一种第一蛋白与至少一种第二蛋白遗传接合。融合蛋白是由两个或更多个、本来编码单独的蛋白质的基因接合而成的。因此，融合蛋白可以包含表达为单一线性多肽的相同或不同蛋白质的多聚体。
如本文所用，术语“接头”在其最广泛的意义上是指共价接合至少两个其它分子的分子。在本发明的典型实施方案中，“接头”应理解为连接Fc结合结构域和至少一个另外的Fc结合结构域的部分，即将两个蛋白质结构域彼此连接以产生多聚体的部分。在优选实施方案中，“接头”是肽接头，即连接两个蛋白质结构域的部分是一个单一氨基酸或包含两个或更多个氨基酸的肽。
术语“色谱”是指使用流动相和固定相将样品中的一种分子(如免疫球蛋白)与其他分子(如污染物)分离的分离技术。液体流动相包含分子混合物，并通过固定相(如固体基质)输送这些分子。由于流动相中不同分子与固定相的不同相互作用，流动相中的分子可以被分离。
术语“亲和层析”是指一种特定的层析模式，其中与固定相偶联的配体与流动相(样品)中的分子(即免疫球蛋白)相互作用，即配体对待纯化的分子具有特定的结合亲和力。如在本发明的上下文中所理解的，亲和层析包括将含有免疫球蛋白的样品加入到包含层析配体(例如本发明的Fc结合蛋白)的固定相中。
术语“固体支持物”或“固体基质”可互换用于固定相。
本文中可互换使用的术语“亲和基质”或“亲和分离基质”或“亲和层析基质”是指基质(例如层析基质)，其上附着有亲和配体(例如本发明的Fc结合蛋白)。配体(如Fc结合蛋白)能够特异性结合待纯化或待从混合物中去除的目标分子(如上文定义的免疫球蛋白)。
本文使用的术语“亲和纯化”是指通过将如上定义的免疫球蛋白与固定在基质上的Fc结合蛋白结合，从液体中纯化如上定义的免疫球蛋白的方法。因此，除去了混合物中除免疫球蛋白以外的所有其他成分。在进一步的步骤中，结合的免疫球蛋白以纯化的形式洗脱。
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。以下定义的每个方面可以与任何其他方面结合，除非明确指出相反的情况。具体而言，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。
在第一方面，本发明涉及Fc结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO:2的第43位氨基酸、第46位氨基酸、第47位氨基酸、第50位氨基酸、第51位氨基酸或第53位氨基酸是半胱氨酸。在第一方面，所述Fc蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或具有至少80％、至少81％、至少82％、至少84％、至少86％、至少87％、至少89.5％、至少91％、至少93％、至少94％、至少96％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，其中对应于SEQ ID NO:2的第43位氨基酸、第46位氨基酸、第47位氨基酸、第50位氨基酸、第51位氨基酸或第53位氨基酸是半胱氨酸。
在第43、46、47、50、51或53位具有半胱氨酸的Fc结合蛋白的令人惊讶的优点是，它们赋予了长时间的碱稳定性，而不损害Fc结合特性，并且对基质具有位点定向的偶联效率，提供了高结合能力。本发明的Fc结合结构域是58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19，螺旋2来自氨基酸残基23-37，螺旋3来自氨基酸残基40-55。第43、46、47、50和51位氨基酸是Fc结合蛋白的螺旋3的一部分，而Fc结合是由螺旋1和2介导的。在0.5M NaOH中孵育至少6小时至至少72小时后，本发明的Fc结合蛋白的结合能力降低小于20％。这一特性对于使用高浓度NaOH的碱性溶液进行清洗步骤来去除基质上的污染物(以便于例如可以多次使用基质)的色谱方法非常重要。此外，除了具有高苛性碱稳定性外，在螺旋3的第43、46、47、50、51或53位具有Cys的Fc结合蛋白显示出高偶联效率。例如，在例如第46位具有Cys的变体的动态结合能力优于重组蛋白A(见图5)。
SEQ ID NO:1-86、90-95的氨基酸序列可能包含进一步的修饰，如插入、缺失或进一步的取代。在一些实施方案中，Fc结合结构域具有1、2、3、4、5或6个进一步的取代。在一些实施方案中，Fc结合结构域在其N末端的前4个氨基酸中缺失1、2、3或4个氨基酸，和/或在C末端缺失1或2个氨基酸。在一些实施方案中，Fc结合结构域在N末端具有缺失，例如在第1、2和4位，或在第1、2和3位。在一些实施方案中，Fc结合结构域在C末端具有缺失，例如在第57和/或58位(例如但不限于SEQ ID NO:33-34)。一些实施方案涉及与任何上述SEQ ID NO的氨基酸序列(例如但不限于SEQ ID NO:1-86、90-95)具有至少89.5％的序列同一性的氨基酸序列。在第43、46、47、50、51或53位具有Cys的Fc结合结构域的实例包括，例如但不限于图1所示的氨基酸序列。
令人惊讶的是，如附图和实施例中所示，与在第43、46、47、50、51或53位没有半胱氨酸的结构域相比，在Fc结合结构域的螺旋3中(特别是在选自由第43、46、47、50、51或53位组成的组的氨基酸位置处)的半胱氨酸，增加了Fc结合结构域的碱稳定性，并改善了Fc结合蛋白与基质的位点特异性偶联，从而提高了能力。
在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在第1位包含异亮氨酸。优选Fc结合结构域第1位的氨基酸不是苏氨酸(T)。优选第1位氨基酸是异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)。或者，可以缺失第1位氨基酸。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在第11位包含丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。优选第11位氨基酸不是天冬酰胺(N)或赖氨酸(K)。优选第11位的氨基酸是丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)或脯氨酸(P)，更优选A、I或E，最优选A。或者，第11位的氨基酸是丝氨酸(S)。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在第35位包含精氨酸(R)或异亮氨酸(I)。优选第35位的氨基酸不是脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)或蛋氨酸(M)。在一些实施方案中，所述Fc结合结构域在第42位包含亮氨酸(L)。优选第42位氨基酸不是酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，除了43C、46C、47C、50C、51C或53C，Fc结合结构域包含2、3或4个选自由1I、11A、11S、35R和42L组成的组的氨基酸位置。在一些实施方案中，位置1I、3A、6D、9Q、10Q、12A、13F、14Y、15E、16I、17L、18H、19L、20P、21N、22L、23T、24E、26Q、27R、28N、29A、30F、31I、32Q、33S、34L、36D、37D、38P、39S、41S、42L、45L、48A、52N、55Q、56A、57P的至少90％在本发明的Fc结合结构域中是相同的。优选地，位置2是A或D，位置4是K或Q，位置5是H或F，位置7是K或E，位置8是D、A或E，位置11是A、S、I或E，位置25是D或E，位置35是R或I，位置40是V、T或Q，位置43是E、S或C，位置44是I、V或L，位置46是C、A或G，位置47是E或C，位置49是K或Q，位置50是K或C，位置51是L或C，位置53是D或E或C，位置54是A或S，以及位置58是P或K。
本发明的Fc结合蛋白包含一个或多个Fc结合结构域，该结构域包含或基本上由或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少89.5％同一性的氨基酸序列组成。氨基酸序列SEQ ID NO:2是以下氨基酸序列：
IX
本发明的多聚体是人工产生的融合蛋白，通常通过技术人员熟知的重组DNA技术产生。
在一些实施方案中，多聚体是同源多聚体，例如Fc结合蛋白的所有Fc结合结构域的氨基酸序列是相同的。
多聚体可以包含两个或多个Fc结合结构域，其中所述Fc结合结构域优选包含或基本上由如上所述的序列组成，条件是它们在第43、46、47、50、51或53位具有半胱氨酸。
例如，使用SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:22产生在本文实施例1中描述的同源多聚体融合构建体，参见例如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，多聚体是异源多聚体，例如至少一个碱性稳定的Fc结合结构域与免疫球蛋白结合蛋白中的其他Fc结合结构域具有不同的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，Fc结合蛋白还可以在N和/或C末端包含额外的氨基酸残基，例如在N和/或C末端带有或不带有标签的额外序列。
在第二方面的优选实施方案中，所述亲和分离基质是固体支持物。所述亲和分离基质包含至少一种本发明的Fc结合蛋白。
亲和基质可用于免疫球蛋白的分离，即使在清洁过程中应用高碱性条件后，也应保持免疫球蛋白的结合特性。基质的这种清洁对于基质的长期重复使用是至关重要的。
用于亲和色谱的固相支持物基质是本领域已知的，包括但不限于琼脂糖和稳定的琼脂糖衍生物(例如Sepharose 6B、Praesto
固体支持基质的形式可以是任何合适的众所周知的类型。用于偶联本发明Fc结合蛋白的这种固体支持基质可以包括例如下列之一：柱、毛细管、颗粒、膜、过滤器、整料、纤维、垫、凝胶、载玻片、板、盒或色谱中常用的和本领域技术人员已知的任何其它形式。
在一个实施方案中，所述基质由基本上球形的颗粒(也称为珠，例如琼脂糖凝胶或琼脂糖珠)组成。合适的颗粒尺寸可以在5-500μm的直径范围内，例如10-100μm，例如20-80μm，例如40-70μm。颗粒形式的基质可用作填充床或悬浮形式，包括膨胀床。
在另一个实施方案中，所述固体支持基质是膜，例如水凝胶膜。在一些实施方案中，亲和纯化涉及作为基质的膜，第一方面的Fc结合蛋白共价结合到该膜上。固体支持物也可以是以在筒中的膜的形式。
在一些实施方案中，亲和纯化涉及含有固体支持基质的色谱柱，第一方面的Fc结合蛋白共价结合到该固体支持基质上。
本发明的Fc结合蛋白可以通过常规偶联技术连接到合适的固体支持基质上。将蛋白质配体固定到固体支持物上的方法在该领域是众所周知的，并且该领域的技术人员可以使用标准技术和设备容易地实施。
适用于所公开的用途和方法的亲和分离基质是那些根据上述实施方案的基质，并且是本领域技术人员已知的。
在第四方面的一些实施方案中，步骤(d)中免疫球蛋白从基质中的洗脱是通过改变酸碱度和/或改变盐浓度来实现的。可以使用任何合适的溶液，例如通过pH 5或更低的溶液(参见实施例9中的表3)，或通过pH 11或更高的溶液。
在一些实施方案中，添加用于有效清洁和净化(sanitization)亲和基质的另一步骤(f)，优选地通过使用例如pH为13-14的碱性液体。在某些实施方案中，所述清洁液包含0.1-1.0M NaOH或KOH，优选0.25-0.5M NaOH或KOH。由于本发明的Fc结合蛋白的高的碱稳定性，这种强碱性溶液可用于清洁目的。
在一些实施方案中，由于重复步骤(a)至(e)，可选地(a)至(f)可以被重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次，所述亲和基质可以重复使用至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次。
通常，进行亲和纯化方法的合适条件是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，所公开的包含所公开的Fc结合结构域的亲和纯化的用途或方法可以在大于或等于3.5(例如，约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.5)的pH下提供至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的含Fc的蛋白质的洗脱。
在第六方面，本发明涉及一种包含如上所述的核酸或载体的表达系统，例如原核宿主细胞(例如大肠杆菌)、或真核宿主(例如酿酒酵母或毕赤酵母)、或哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。
本发明的Fc结合分子可以通过许多常规的和众所周知的技术中的任何一种来制备，例如简单的有机合成策略、固相辅助合成技术或通过商业上可获得的自动合成仪。另一方面，它们也可以单独通过常规重组技术制备或与常规合成技术结合制备。
本发明的一个实施方案涉及如上详述的根据本发明的Fc结合蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码如上定义的Fc结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸导入表达载体；(c)将所述表达载体导入宿主细胞；(d)培养所述宿主细胞；(e)将所述宿主细胞置于表达Fc结合蛋白的培养条件下，从而(e)产生如上所述的Fc结合蛋白；任选地(f)分离步骤(e)中产生的蛋白质；和(g)任选地如上所述将所述蛋白质结合到固体基质上。
在本发明的另一个实施方案中，Fc结合蛋白的产生是通过无细胞体外转录/翻译进行的。
实施例
以下实施例用于进一步说明本发明。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅基于以上描述示出了本发明的可行性。
实施例1.结合Fc的人工嵌合蛋白的产生
Fc结合蛋白最初是通过天然存在的蛋白A结构域(E、B、D、A、C、Z)的改组过程产生的。更详细地说，本文所理解的改组过程是从一组不同的已知氨基酸序列开始产生人工氨基酸序列的组装过程。改组过程包括以下步骤：a)提供五个天然存在的蛋白A结构域E、B、D、A和C以及蛋白A变体结构域Z的序列；b)所述序列的比对；c)在计算机中的统计片段化以鉴定重组的子序列，然后d)组装各种片段的新的人工序列以产生嵌合产物，即新的人工氨基酸序列。步骤c)中产生的片段具有任意长度，例如，如果片段化的亲本序列的长度为n，则片段的长度为1至n-1。
嵌合产物中氨基酸的相对位置相对于起始氨基酸序列保持不变。位置Q9、Q10、A12、F13、Y14、L17、P20、L22、Q26、R27、F30、I31、Q32、S33、L34、D36、D37、P38、S39、S41、L45、E47、A48、K50、L51、Q55、A56、P57中的至少90％在例如IB14、IB27、IB24、IB26、IB28、IB20(SEQ ID NO:78-83)的人工氨基酸序列与天然存在的蛋白A结构域或蛋白A结构域变体之间是相同的。例如，Fc结合蛋白IB14、IB26和IB27的总氨基酸序列是人工的，因为它与任何天然存在的蛋白A结构域或Z结构域的总氨基酸序列的同一性不超过85％。在最初的人工Fc结合蛋白产生后，在某些情况下，通过氨基酸序列的位点特异性随机化进一步修饰所述蛋白，以进一步改变生化特性。通过单个氨基酸残基的位点饱和诱变引入了进一步的修饰。
使用技术人员已知的标准方法合成人工Fc结合蛋白的基因，并克隆到大肠杆菌表达载体中。使用DNA测序验证插入片段的正确序列。
为了产生多聚体Fc结合蛋白，将2或3个相同的Fc结合结构域遗传融合。
对于特异性纯化，任选地，在Fc结合蛋白的C末端添加链球菌标签(WSHPQFEK；SEQID NO:89)。
实施例2.诱变产生变体
对于定点诱变，根据制造商的说明使用
通过GeneArt
实施例3.Fc结合蛋白的表达
用编码Fc结合蛋白的表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。将细胞铺展在选择性琼脂平板(卡那霉素)上，并在37℃下孵育过夜。将来自单个菌落的预培养物接种到100ml2xYT培养基中，并在常规的轨道振荡器中，在补充有150μg/ml卡那霉素的、不含乳糖和消泡剂的1L带挡板的(baffled)锥形瓶中，在37℃在160rpm下培养16小时。OD
实施例4：SDS-PAGE分析Fc结合蛋白的表达和溶解性
将发酵过程中采集的样品重新悬浮在300μl提取缓冲液(补充有0.2mg/ml溶菌酶、0.5x BugBuster、7.5mM MgSO
实施例5：Fc结合蛋白的纯化
在具有C末端StrepTagII(WSHPQFEK)的大肠杆菌可溶性级分中表达Fc结合蛋白。细胞通过两轮冷冻/解冻裂解，根据制造商的说明(IBA，Goettingen，德国)用Strep-
或者，在具有C末端StrepTagII的大肠杆菌可溶性级分中表达Fc结合蛋白。将细胞重悬于细胞破碎缓冲液中，并通过恒定细胞破碎系统(Unit F8B，Holly Farm BusinessPark)以1kbar裂解两轮。根据制造商的说明，使用
实施例6.Fc结合蛋白以高亲和力与IgG结合(通过ELISA确定)
使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)确定Fc结合蛋白对IgG
实施例7.Fc结合蛋白以高亲和力与IgG结合(通过表面等离子共振实验确定)
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。通过EDC和NHS的混合物活化表面暴露的羧基，产生反应性酯基。将700-1500RU结合(on-)配体固定在一个流动池上，将解脱(off-)配体固定在另一个流动池上。配体固定后注射乙醇胺可去除非共价结合的Fc结合蛋白。在配体结合时，蛋白质分析物积聚在表面上，增加了折射率。实时测量折射率的这种变化，并将其绘制为响应或共振单位(RU)与时间的关系。将分析物以适当的流速(μl/min)以系列稀释液应用于芯片。每次运行后，用再生缓冲液再生芯片表面，并用运行缓冲液平衡。将对照样品应用于基质。如前所述进行再生和再平衡。通过在25℃下使用
表1.Fc结合蛋白对Ig的K
实施例8.Fc结合蛋白与环氧活化基质(Sepharose 6B)偶联
根据制造商的说明，将纯化的Fc结合蛋白与环氧活化的基质(Sepharose 6B，GE；Cat.No.17-0480-01)偶联(偶联条件：pH 9.0过夜，用乙醇胺封闭5小时)。西妥昔单抗用作IgG样品(5mg；1mg/ml基质)。将西妥昔单抗以饱和量施加到包含固定的Fc结合蛋白的基质上。用100mM甘氨酸缓冲液(pH2.5)洗涤基质，以洗脱与固定的IgG结合蛋白结合的西妥昔单抗。为了测定Fc结合蛋白的结合活性，通过BLI测量洗脱的IgG的浓度(用蛋白A Octet传感器和西妥昔单抗作为标准进行定量)。
图2A显示了IB14(SEQ ID NO:78)和在第43、46、47、50或58位具有半胱氨酸的IB14变体(分别为SEQ ID NO:74-77)的偶联效率。在第43、46、47、50或58位具有Cys的所有IB14变体的偶联效率都高于IB14。图2B显示了与具有C末端Cys的cs14相比和与市售蛋白A相比，cs14 46C(SEQ ID NO：18)或cs14 43C(SEQ ID NO：17)与环氧活化的Sepharose 6B基质的偶联。偶联条件为450μm，4500nmol/ml，pH9，在30℃下2小时或18小时，1mM TCEP，1M(NH
实施例9.与环氧活化的基质偶联的Fc结合蛋白的碱稳定性
在室温(22℃+/-3℃)下，用0.5M NaOH将柱孵育0小时、6小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在用0.5M NaOH孵育前后，分析固定的蛋白的Ig结合活性。将固定的蛋白质在NaOH处理前的Ig结合活性定义为100％。IB14变体(SEQ ID NO:74-77)在用0.5M NaOH连续处理6小时后的剩余IgG结合活性如图3A所示。图3B显示了用0.5M NaOH连续处理0小时、18小时或72小时后cs14 46C、cs14 43C、cs14和市售蛋白A的苛性碱稳定性。在30℃下，将蛋白质固定在环氧琼脂糖凝胶上2小时(4500nmol/ml)。以5分钟的停留时间测定动态结合能力DBC 10％。在用0.5M NaOH连续处理72小时后，cs1446C显示出最高的DBC 10％(为19.5mg/ml)，比市售蛋白A的测量值高20％以上。图4显示了在用0.5M NaOH连续处理6、24和36小时后，与cs26(SEQ ID NO:7)和野生型结构域C(SEQ ID NO:84)相比，cs26 46C(SEQ IDNO:27)的剩余结合能力。在0.5M NaOH孵育至少36小时后，cs26 A46C(单体或二聚体)的结合能力仍然>20％，见表2。
表2.与cs26和野生型结构域C相比，cs26 A46C的苛性碱稳定性
实施例10.Fc结合蛋白与基于琼脂糖的色谱珠Praesto
根据制造商的说明，将纯化的Fc结合蛋白与基于琼脂糖的色谱珠(Praesto
实施例11.从与基于琼脂糖的色谱珠Praesto
根据制造商的说明，将纯化的Fc结合蛋白(cs26 46C)与基于琼脂糖的色谱珠(Praesto
表3.从与珠子偶联的cs26 46C上洗脱IgG
序列表
<110> 瑞普利金公司
<120> 在C末端螺旋区具有半胱氨酸的FC结合蛋白
<130> SP33 EP1
<160> 95
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列1
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 可以被A、N、Q、V取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 可以被D或Q取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 可以被N取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> 可以被Q或N取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> 可以被F取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> 可以被N取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> 可以被A或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> 可以被S、N、I或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> 可以被V取代
<220>
<221> 变体
<222> (18)..(18)
<223> 可以被N取代
<220>
<221> 变体
<222> (19)..(19)
<223> 可以被M取代
<220>
<221> 变体
<222> (23)..(23)
<223> 可以被N取代
<220>
<221> 变体
<222> (24)..(24)
<223> 可以被A取代
<220>
<221> 变体
<222> (25)..(25)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (29)..(29)
<223> 可以被G取代
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> 可以被K或I取代
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以被Q或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (42)..(42)
<223> 可以被A、K、或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> 可以被S、N、或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> 可以被L或V取代
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以被C或A取代
<220>
<221> 变体
<222> (47)..(47)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (49)..(49)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (50)..(50)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (51)..(51)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> 可以被E或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> 可以被S取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> 可以被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (58)..(58)
<223> 可以被K取代, 或被缺失
<400> 1
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有序列2
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 可以被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 可以被D取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 可以被N取代，或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> 可以被Q取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> 可以被F取代, 或被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> 可以被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> 可以被A或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> 可以被S、I、或E取代
<220>
<221> 变体
<222> (25)..(25)
<223> 可以被E取代
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> 可以被I取代
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> 可以被Q或T取代
<220>
<221> 变体
<222> (43)..(43)
<223> 可以被S或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> 可以被L或V取代
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> 可以被C或A取代
<220>
<221> 变体
<222> (47)..(47)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (49)..(49)
<223> 可以被Q取代
<220>
<221> 变体
<222> (50)..(50)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (51)..(51)
<223> 可以被C取代
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> 可以被E或C取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> 可以被S取代
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> 可以被缺失
<220>
<221> 变体
<222> (58)..(58)
<223> 可以被K取代, 或被缺失
<400> 2
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14
<400> 3
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs27
<400> 4
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20
<400> 5
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42
<400> 6
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26
<400> 7
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24
<400> 8
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17
<400> 9
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs25
<400> 10
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3
<400> 11
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4
<400> 12
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1
<400> 13
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2
<400> 14
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs41
<400> 15
Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 16
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs43
<400> 16
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 43C
<400> 17
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 46C
<400> 18
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs14 47C
<400> 19
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 20
<211> 58
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<213> 人工序列
<220>
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Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
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<211> 58
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<213> 人工序列
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Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
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50 55
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<213> 人工序列
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Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
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<211> 58
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<213> 人工序列
<220>
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Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
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Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
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<211> 58
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<213> 人工序列
<220>
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20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
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Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
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1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
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<211> 58
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<213> 人工序列
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Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 28
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 47C
<400> 28
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
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<213> 人工序列
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1 5 10 15
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20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 30
<211> 58
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<213> 人工序列
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20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
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20 25 30
Ser Leu Arg His Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 46C二聚体
<400> 32
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys
115
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<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 delN 46C
<400> 33
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35 40 45
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<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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35 40 45
Asn Asp Ala Gln Ala
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<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 46C三聚体
<400> 35
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp
50 55 60
Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala
115 120 125
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130 135 140
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165 170
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<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 43C
<400> 36
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 37
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 46C
<400> 37
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 47C
<400> 38
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 39
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 11S 46C
<400> 39
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 40
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 43C
<400> 40
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 41
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 46C
<400> 41
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 42
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 47C
<400> 42
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 43
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h3 11S 46C
<400> 43
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 44
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 43C
<400> 44
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 45
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 46C
<400> 45
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 46
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs47h4 47C
<400> 46
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 47
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 43C
<400> 47
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 48
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 46C
<400> 48
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h1 47C
<400> 49
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 50
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 43C
<400> 50
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 51
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 46C
<400> 51
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 52
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs74h2 47C
<400> 52
Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 53
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 46C
<400> 53
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 54
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 43C
<400> 54
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Cys Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 55
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 47C
<400> 55
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 56
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs20 11S 46C
<400> 56
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 57
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17 46C
<400> 57
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 58
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 46C
<400> 58
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 59
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 47C
<400> 59
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 60
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 43C
<400> 60
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 61
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs42 11S 46C
<400> 61
Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 62
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs41 46C
<400> 62
Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 63
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs28 46C
<400> 63
Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 64
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs23 46C
<400> 64
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 65
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs25 46C
<400> 65
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 66
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs31 46C
<400> 66
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 67
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs43 46C
<400> 67
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 68
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs44 46C
<400> 68
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 69
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs45 46C
<400> 69
Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Ser Leu Thr Glu Asp Ala Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asp Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 70
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs15 46C
<400> 70
Ile Asp Asn Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 71
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs16 46C
<400> 71
Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 72
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs35 46C
<400> 72
Ile Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Leu Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 73
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs17 11S 46C
<400> 73
Ile Asp Ser Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu
35 40 45
Cys Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55 60
<210> 74
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 43C
<400> 74
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Cys Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 75
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 46C
<400> 75
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Cys Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 76
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 47C
<400> 76
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Cys Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 77
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14 50C
<400> 77
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 78
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB14
<400> 78
Pro Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Ser Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 79
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB27
<400> 79
Ala Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 80
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB24
<400> 80
Ala Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 81
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB26
<400> 81
Ala Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 82
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB28
<400> 82
Ala Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Lys Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 83
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IB20
<400> 83
Ala Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Thr Ser Lys Ser Leu Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro
50 55
<210> 84
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域C
<400> 84
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 85
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域B
<400> 85
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 86
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结构域Z
<400> 86
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔
<400> 87
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔和taq
<400> 88
Ala Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ala Cys Ala Ser Trp Ser His
1 5 10 15
Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于纯化的taq
<400> 89
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 90
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 50C
<400> 90
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 91
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 51C
<400> 91
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Cys Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 92
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs26 53C
<400> 92
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Cys Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 93
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 50C
<400> 93
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Cys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 94
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 51C
<400> 94
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Cys Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 95
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cs24 53C
<400> 95
Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Cys Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
- 在C末端螺旋区具有半胱氨酸的FC结合蛋白
- 在C末端螺旋区中具有半胱氨酸的FC结合蛋白