一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

猫杯状病毒(Feline Calicivirus，Fcv)是猫科动物的常见病原，可通过口、鼻等途径感染，主要在口腔和呼吸道组织中增殖，FCV的单独感染或与其他病原的混合感染可引起猫的上呼吸道和口腔病变，临床见打喷嚏、眼鼻部出血、结膜炎、口炎、牙龈炎、口腔溃疡，严重者还会发生肺炎、跛行、流产、慢性胃肠炎、皮肤水肿及溃疡等。猫杯状病毒感染是猫的多发病，发病率高，死亡率低。FCV与猫疱疹病毒等感染引起的症状非常相似，也可引起很多复杂的非典型症状，单从临床症状难以确诊病原，还需结合实验室诊断确诊。目前针对FCV的实验室诊断包括病毒分离、核酸检测和血清学检测。

利用病毒分离的检测方法会变得困难。虽然病毒分离是最为可靠的检测方法，但其耗时长。而免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。胶体金标记免疫分析法是近年兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染，且操作简单，无需操作人员具备专业知识，与传统方法相比更为适合现场检测。与ELISA相比，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。

通常大多数猫在感染猫疱疹病毒三周时体内抗体水平最高，随后机体内抗体水平快速下降，因此，利用血清学试验检测FCV感染急性期和康复之后的双份血清的中和抗体效价，具有回顾性诊断意义。

然而，目前针对血清学试验检测FCV感染的检测方法和工具仍具有较大局限性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

VP1和VP2来源于FCV病毒的FCV结构蛋白，即衣壳蛋白。其包括ORF2(Open ReadingFrame，ORF，开放阅读框)编码的VP1和ORF3编码的VP2，VP2分为A～F 6个区域，A区位于氨基末端1-120aa，B区位于121～396aa，C区位于397～401aa，D区位于402～425aa，为高度保守区，E区位于426～520aa，F区位于521～668aa，位于衣壳蛋白高度保守的羧基端，该区位于病毒的表面。

在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。

本发明的第三方面提供一种表达载体，其包括本发明第二方面所述的基因。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pET30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(His)标签。

本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的表达载体。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。

本发明的第五方面提供一种制备本发明第一方面所述重组蛋白的方法，包括诱导本发明第四方面所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。

进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。

在本发明的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：

S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，

S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5-0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h；

S3，将培养液于4℃，7000rpm离心10min，收集菌体；

S4，用缓冲液Binding Buffer破碎菌体；

S5，超声破碎菌体，条件为：500w，超声2s，间隔5s，共80-120次；

S6，4℃，12000rpm离心30min收集上清，所述重组蛋白在上清中。

优选地，步骤S2中在大肠杆菌培养液OD600至0.6时进行诱导。

优选地，步骤S5中，超声破碎100次。采用本发明的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。

在本发明的一些实施方案中，进一步包括对重组蛋白进行纯化的步骤。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本发明的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度。

在本发明的一些具体实施方案中，将包含重组蛋白的上清过Ni柱，然后用洗脱缓冲液Elution Buffer洗脱得到目的蛋白。

优选地，所述洗脱缓冲液Elution Buffer的配方为：50mM Tris，0.2M Nacl，0.5MImidazole，pH8.0。

本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测猫杯状病毒抗体的试剂盒中的应用。

本发明的第七方面提供一种用于检测猫杯状病毒抗体的试剂盒，包括本发明第一方面所述的重组蛋白。

进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。

在本发明的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：

S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；

S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；

S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；

S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(T线)，质控区有质控线(C线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。

在使用时，滴加生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：

①仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

②有两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，应当更换新试纸条重新测试。

在本发明的一些实施方案中，FCV抗体检测结果呈阳性，代表个体生物样本中含有FCV抗体，意味着个体具有FCV感染或曾被FCV感染。

在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

现有技术主要集中在VP1的C，D，E区域上，没有针对VP1基因区域和VP2进行抗体诊断试剂的开发。本发明为了防止在抗体诊断中出现漏检现象，将VP1与VP2融合在一起进行原核表达。由于VP1的A区域在VP1成熟后会被切除，发明人将VP1的B，C，D，E，F区域和VP2进行融合，填补了技术空白。

本发明利用重组蛋白进行FCV抗体检测，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。

附图说明

图1示出了猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：蛋白marker(YEASEN，货号：20313ES76)；2：细胞破碎后上样；3：流穿；4：50mM Imidazole洗脱；5：0.5MImidazole洗脱。

图2示出了本发明一个实施例的检测试剂条的试剂图。1：滤纸；2：聚酯板；21：检测线(T)；22：质控线(C)；3：金标垫；4：样本垫；5：底板。

图3示出了本发明的一个实施例利用试剂条进行检测的结果示意图。A：阴性；B：阳性，S：样本垫，T：检测线，C：质控线，FCV：猫杯状病毒。

图4示出了本发明的一个实施例利用试剂条的临床样本检测结果。S：样本垫，T：检测线，C：质控线，FCV：猫杯状病毒。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1含有猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白基因表达载体的构建

猫杯状病毒VP1基因是根据NCBI Gene bank：P27406.1的蛋白序列设计的。VP2基因是根据NCBI Gene bank：ALM55430的蛋白序列设计的。

VP1-VP2重组蛋白的氨基酸序列序列如下(SEQ ID NO.1)：

ADDGSITAPEQGTMVGGVIAEPSAQMSTAADMATGKSVDSEWEAFFSFHTSVNWSTSETQGKILFKQSLGPLLNPYLEHLAKLYVAWSGSIEVRFSISGSGVFGGKLAAIVVPPGVDPVQSTSMLQYPHVLFDARQVEPVIFCLPDLRSTLYHLMSDTDTTSLVIMVYNDLINPYANDANSSGCIVTVETKPGPDFKFHLLKPPGSMLTHGSIPSDLIPKTSSLWIGNRYWSDITDFVIRPFVFQANRHFDFNQETAGWSTPRFRPISVTITEQNGAKLGIGVATDYIVPGIPDGWPDTTIPGELIPAGDYAITNGTGNDITTATGYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTAFITTATLDGDNNNKINPCNTIDQSKIVVFQDNHVGKKAQTSDDTLALLGYTGIGEQAIGSDRDRVVRISTLPETGARGGNHPIFYKNSIKLGYVIRSIDVFNSQILHTSRQLSLNHYLLPPDSFAVYRIIDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGVSGFGKLEFPLSASYMGIQLAKIRLASNIRSPMTKLMNSILGLIDTVTNTIGKAQQIELDKAALGQQRELALQRMNLDRQALNNQVEQFNKLLEQRVQGPIQSVRLARAAGFRVDPYSYTNQNFYDDQLNAIRLSYRNLFKI

该重组蛋白由VP1的B、C、D、E、F区域和VP2进行融合得到。

由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。

本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，在进行外源蛋白表达时进行了密码子优化，反翻译成核苷酸序列，得到的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

GCGGATGATGGCAGCATTACCGCGCCGGAACAGGGCACCATGGTGGGCGGCGTGATTGCGGAACCGAGCGCGCAGATGAGCACCGCGGCGGATATGGCGACCGGCAAAAGCGTGGATAGCGAATGGGAAGCGTTTTTTAGCTTTCATACCAGCGTGAACTGGAGCACCAGCGAAACCCAGGGCAAAATTCTGTTTAAACAGAGCCTGGGCCCGCTGCTGAACCCGTATCTGGAACATCTGGCGAAACTGTATGTGGCGTGGAGCGGCAGCATTGAAGTGCGCTTTAGCATTAGCGGCAGCGGCGTGTTTGGCGGCAAACTGGCGGCGATTGTGGTGCCGCCGGGCGTGGATCCGGTGCAGAGCACCAGCATGCTGCAGTATCCGCATGTGCTGTTTGATGCGCGCCAGGTGGAACCGGTGATTTTTTGCCTGCCGGATCTGCGCAGCACCCTGTATCATCTGATGAGCGATACCGATACCACCAGCCTGGTGATTATGGTGTATAACGATCTGATTAACCCGTATGCGAACGATGCGAACAGCAGCGGCTGCATTGTGACCGTGGAAACCAAACCGGGCCCGGATTTTAAATTTCATCTGCTGAAACCGCCGGGCAGCATGCTGACCCATGGCAGCATTCCGAGCGATCTGATTCCGAAAACCAGCAGCCTGTGGATTGGCAACCGCTATTGGAGCGATATTACCGATTTTGTGATTCGCCCGTTTGTGTTTCAGGCGAACCGCCATTTTGATTTTAACCAGGAAACCGCGGGCTGGAGCACCCCGCGCTTTCGCCCGATTAGCGTGACCATTACCGAACAGAACGGCGCGAAACTGGGCATTGGCGTGGCGACCGATTATATTGTGCCGGGCATTCCGGATGGCTGGCCGGATACCACCATTCCGGGCGAACTGATTCCGGCGGGCGATTATGCGATTACCAACGGCACCGGCAACGATATTACCACCGCGACCGGCTATGATACCGCGGATATTATTAAAAACAACACCAACTTTCGCGGCATGTATATTTGCGGCAGCCTGCAGCGCGCGTGGGGCGATAAAAAAATTAGCAACACCGCGTTTATTACCACCGCGACCCTGGATGGCGATAACAACAACAAAATTAACCCGTGCAACACCATTGATCAGAGCAAAATTGTGGTGTTTCAGGATAACCATGTGGGCAAAAAAGCGCAGACCAGCGATGATACCCTGGCGCTGCTGGGCTATACCGGCATTGGCGAACAGGCGATTGGCAGCGATCGCGATCGCGTGGTGCGCATTAGCACCCTGCCGGAAACCGGCGCGCGCGGCGGCAACCATCCGATTTTTTATAAAAACAGCATTAAACTGGGCTATGTGATTCGCAGCATTGATGTGTTTAACAGCCAGATTCTGCATACCAGCCGCCAGCTGAGCCTGAACCATTATCTGCTGCCGCCGGATAGCTTTGCGGTGTATCGCATTATTGATAGCAACGGCAGCTGGTTTGATATTGGCATTGATAGCGATGGCTTTAGCTTTGTGGGCGTGAGCGGCTTTGGCAAACTGGAATTTCCGCTGAGCGCGAGCTATATGGGCATTCAGCTGGCGAAAATTCGCCTGGCGAGCAACATTCGCAGCCCGATGACCAAACTGATGAACAGCATTCTGGGCCTGATTGATACCGTGACCAACACCATTGGCAAAGCGCAGCAGATTGAACTGGATAAAGCGGCGCTGGGCCAGCAGCGCGAACTGGCGCTGCAGCGCATGAACCTGGATCGCCAGGCGCTGAACAACCAGGTGGAACAGTTTAACAAACTGCTGGAACAGCGCGTGCAGGGCCCGATTCAGAGCGTGCGCCTGGCGCGCGCGGCGGGCTTTCGCGTGGATCCGTATAGCTATACCAACCAGAACTTTTATGATGATCAGCTGAACGCGATTCGCCTGAGCTATCGCAACCTGTTTAAAATT

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组基因序列，并与pET30a质粒连接，形成重组表达载体。

实施例2含有猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白的表达

将合成好的猫杯状病毒VP1-VP2融合基因质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50μg/mL卡那霉素(上海生工，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(上海生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。

实施例3含有猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白的纯化及复性

用50mL上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)50mL破碎菌体；然后超声破碎，条件为500w，超声2s，间隔5s，共100次；最后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Ni柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。利用PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。

由图1可知，纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用BCA法测定浓度后，于-20℃保存备用。

实施例4双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体

1双抗原夹心金标法检测条的制备

1.1胶体金的烧制

在三角烧瓶中加入1000mL超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4mL，再加入10％柠檬酸三钠溶液6mL，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22um过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。

1.2重组猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白的标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

1.3鼠IgG标记

取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K

将上述金标复合物用金标稀释液稀释100倍后与1.2步骤中稀释后的猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白胶体金复合物混合后浸泡玻璃纤维，37℃烘干4h后即制成金标垫。

1.4重组猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白的点膜

用点膜稀释液(50mM Tris，2％蔗糖，pH8.5)稀释纯化后VP1-VP2融合蛋白至0.9mg/mL做为胶体金试纸条的检测线(Test-Line)，用相同稀释液稀释羊抗鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司，货号：PS00901)至0.3mg/mL做为胶体金试纸条的质控线(Control-Line)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。

1.5双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体试纸条的组装

将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(NC膜)的聚酯板及滤纸、样本垫等安装底板上，组装成猫杯状病毒抗体双抗原夹心法检测试剂条。具体安装方式如图2所示：分别将样本垫1、金标垫2、NC膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在NC膜3上，滤纸4叠加一部分压在NC膜3上。其中NC膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(T线)，质控区设置质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫2，质控线32靠近滤纸4。

进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。

2双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体试纸条/卡的检测

加入90μL待检测样本(血清、血浆)至样本加样处(S)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下：

④仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性，如图3A所示；

⑤有两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性，

如图3B所示；

⑥质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，应当更换新试纸条重新测试。

3双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体试纸条/卡的检测结果

一共检测15份阳性猫杯状病毒血清，及40份正常未患病且未经免疫的猫血清，15份阳性血清中检测出阳性14例，漏检1例，在40份阴性血清中出现假阳1例，灵敏度和特异性分别为93.3％和97.5％，整体符合率为96.3％。

部分检测结果如图4所示，其中T线和C线两条线的表示检测结果为阳性，待测猫血清中含有猫杯状病毒抗体。只有C线一条线的表示检测结果为阴性，待测猫血清中不含有猫杯状病毒抗体。

从结果数据可以说明，本发明的重组猫杯状病毒VP1-VP2融合蛋白有着很好的灵敏度和特异性，可以作为制作重组猫杯状病毒抗体检测试纸条的原料。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州亿米诺生物科技有限公司

<120> 一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用

<130> AJ2010231

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Asp Asp Gly Ser Ile Thr Ala Pro Glu Gln Gly Thr Met Val Gly

1 5 10 15

Gly Val Ile Ala Glu Pro Ser Ala Gln Met Ser Thr Ala Ala Asp Met

20 25 30

Ala Thr Gly Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe

35 40 45

His Thr Ser Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile Leu

50 55 60

Phe Lys Gln Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His Leu

65 70 75 80

Ala Lys Leu Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Ile Glu Val Arg Phe Ser

85 90 95

Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val Val

100 105 110

Pro Pro Gly Val Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr Pro

115 120 125

His Val Leu Phe Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Cys Leu

130 135 140

Pro Asp Leu Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr

145 150 155 160

Thr Ser Leu Val Ile Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala

165 170 175

Asn Asp Ala Asn Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro

180 185 190

Gly Pro Asp Phe Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu

195 200 205

Thr His Gly Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Thr Ser Ser Leu

210 215 220

Trp Ile Gly Asn Arg Tyr Trp Ser Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Arg

225 230 235 240

Pro Phe Val Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr

245 250 255

Ala Gly Trp Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Ser Val Thr Ile Thr

260 265 270

Glu Gln Asn Gly Ala Lys Leu Gly Ile Gly Val Ala Thr Asp Tyr Ile

275 280 285

Val Pro Gly Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Gly Glu

290 295 300

Leu Ile Pro Ala Gly Asp Tyr Ala Ile Thr Asn Gly Thr Gly Asn Asp

305 310 315 320

Ile Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Asp Ile Ile Lys Asn Asn

325 330 335

Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr Ile Cys Gly Ser Leu Gln Arg Ala Trp

340 345 350

Gly Asp Lys Lys Ile Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Thr Leu

355 360 365

Asp Gly Asp Asn Asn Asn Lys Ile Asn Pro Cys Asn Thr Ile Asp Gln

370 375 380

Ser Lys Ile Val Val Phe Gln Asp Asn His Val Gly Lys Lys Ala Gln

385 390 395 400

Thr Ser Asp Asp Thr Leu Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu

405 410 415

Gln Ala Ile Gly Ser Asp Arg Asp Arg Val Val Arg Ile Ser Thr Leu

420 425 430

Pro Glu Thr Gly Ala Arg Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn

435 440 445

Ser Ile Lys Leu Gly Tyr Val Ile Arg Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser

450 455 460

Gln Ile Leu His Thr Ser Arg Gln Leu Ser Leu Asn His Tyr Leu Leu

465 470 475 480

Pro Pro Asp Ser Phe Ala Val Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Ser

485 490 495

Trp Phe Asp Ile Gly Ile Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val

500 505 510

Ser Gly Phe Gly Lys Leu Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly

515 520 525

Ile Gln Leu Ala Lys Ile Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Pro Met

530 535 540

Thr Lys Leu Met Asn Ser Ile Leu Gly Leu Ile Asp Thr Val Thr Asn

545 550 555 560

Thr Ile Gly Lys Ala Gln Gln Ile Glu Leu Asp Lys Ala Ala Leu Gly

565 570 575

Gln Gln Arg Glu Leu Ala Leu Gln Arg Met Asn Leu Asp Arg Gln Ala

580 585 590

Leu Asn Asn Gln Val Glu Gln Phe Asn Lys Leu Leu Glu Gln Arg Val

595 600 605

Gln Gly Pro Ile Gln Ser Val Arg Leu Ala Arg Ala Ala Gly Phe Arg

610 615 620

Val Asp Pro Tyr Ser Tyr Thr Asn Gln Asn Phe Tyr Asp Asp Gln Leu

625 630 635 640

Asn Ala Ile Arg Leu Ser Tyr Arg Asn Leu Phe Lys Ile

645 650

<210> 2

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggatgatg gcagcattac cgcgccggaa cagggcacca tggtgggcgg cgtgattgcg 60

gaaccgagcg cgcagatgag caccgcggcg gatatggcga ccggcaaaag cgtggatagc 120

gaatgggaag cgttttttag ctttcatacc agcgtgaact ggagcaccag cgaaacccag 180

ggcaaaattc tgtttaaaca gagcctgggc ccgctgctga acccgtatct ggaacatctg 240

gcgaaactgt atgtggcgtg gagcggcagc attgaagtgc gctttagcat tagcggcagc 300

ggcgtgtttg gcggcaaact ggcggcgatt gtggtgccgc cgggcgtgga tccggtgcag 360

agcaccagca tgctgcagta tccgcatgtg ctgtttgatg cgcgccaggt ggaaccggtg 420

attttttgcc tgccggatct gcgcagcacc ctgtatcatc tgatgagcga taccgatacc 480

accagcctgg tgattatggt gtataacgat ctgattaacc cgtatgcgaa cgatgcgaac 540

agcagcggct gcattgtgac cgtggaaacc aaaccgggcc cggattttaa atttcatctg 600

ctgaaaccgc cgggcagcat gctgacccat ggcagcattc cgagcgatct gattccgaaa 660

accagcagcc tgtggattgg caaccgctat tggagcgata ttaccgattt tgtgattcgc 720

ccgtttgtgt ttcaggcgaa ccgccatttt gattttaacc aggaaaccgc gggctggagc 780

accccgcgct ttcgcccgat tagcgtgacc attaccgaac agaacggcgc gaaactgggc 840

attggcgtgg cgaccgatta tattgtgccg ggcattccgg atggctggcc ggataccacc 900

attccgggcg aactgattcc ggcgggcgat tatgcgatta ccaacggcac cggcaacgat 960

attaccaccg cgaccggcta tgataccgcg gatattatta aaaacaacac caactttcgc 1020

ggcatgtata tttgcggcag cctgcagcgc gcgtggggcg ataaaaaaat tagcaacacc 1080

gcgtttatta ccaccgcgac cctggatggc gataacaaca acaaaattaa cccgtgcaac 1140

accattgatc agagcaaaat tgtggtgttt caggataacc atgtgggcaa aaaagcgcag 1200

accagcgatg ataccctggc gctgctgggc tataccggca ttggcgaaca ggcgattggc 1260

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