抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性细菌的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月29日提交的美国临时专利申请号62/650,235(其全部公开内容通过引用并入本文)的权益，并依赖于其申请日。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本，在2019年3月28日创建，命名为0341_0002-PCT_SL.txt，且大小为28,097字节。

公开领域

本公开涉及抗微生物剂的领域，并且更具体地涉及感染革兰氏阴性细菌的噬菌体来源的抗微生物amurin肽，以及这些肽在杀死革兰氏阴性细菌和对抗细菌感染和污染中的用途。

公开背景

革兰氏阴性细菌，特别是假单胞菌属的成员和新出现的多药抗性病原体鲍氏不动杆菌，是严重且可能威胁生命的侵入性感染的重要原因。假单胞菌感染在烧伤伤口、慢性伤口、慢性阻塞性肺病症(COPD)、囊性纤维化、植入的生物材料上以及医院表面和供水系统(在此处其对脆弱患者构成许多威胁)内的表面生长中构成主要问题。

一旦在患者中立足，铜绿假单胞菌可能特别难以治疗。该基因组编码许多抗性基因，包括赋予对β-内酰胺和氨基糖苷抗生素的抗性的多药外排泵和酶，由于缺乏新型抗微生物治疗剂，这使针对该革兰氏阴性病原体的疗法特别有挑战性。铜绿假单胞菌在生物膜中生长的能力使该挑战复杂化，所述能力可以通过保护细菌免于宿主防御和化学疗法来增强其引起感染的能力。

在健康护理环境中，铜绿假单胞菌的药物抗性菌株的发生率正在增加。在社区医院中的健康护理相关的血流感染(BSI)的一项观察性研究中，铜绿假单胞菌是前四种多药抗性(MDR)病原体之一，占18%的总体医院死亡率。此外，充分记录了MDR铜绿假单胞菌的暴发。结果不佳与经常需要用最后使用的药物(诸如粘菌素)进行治疗的铜绿假单胞菌的MDR菌株相关。

已经被世界卫生组织(WHO)和疾病控制中心(CDC)鉴定为重大威胁的其他药物抗性细菌包括以下革兰氏阴性细菌：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌科(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌)、沙门氏菌属物种、淋病奈瑟氏菌和志贺氏菌属物种(Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogens. Lancet Infect Dis 18:234-236)。

为了解决对具有新型机制的新的抗微生物剂的需求，研究人员正在研究各种药物和生物制剂。一类这样的抗微生物剂包括溶素。溶素是细胞壁肽聚糖水解酶，其充当“分子剪刀”以降解用于维持细胞形状且用于承受内部渗透压的肽聚糖网状结构。肽聚糖的降解导致渗透裂解。然而，至少部分地由于在革兰氏阳性细菌中不存在且限制对次相邻的肽聚糖的接近的外膜(OM)的存在，某些溶素针对革兰氏阴性细菌不是有效的。还已经开发了修饰的溶素(“artylysins”)。包含与具有聚阳离子、两亲性和疏水性特征的特定α-螺旋结构域融合的溶素的这些药剂能够跨OM易位。然而，某些artilysins表现出低体内活性。这可能由人血清的成分且特别是由生理盐和二价阳离子引起。这些成分竞争脂多糖结合位点，并且可能干扰溶素的α-螺旋易位结构域，由此限制某些溶素和artilysins在血液中的活性并限制其治疗侵入性感染的有效性。对于多种不同的外膜穿透和去稳定抗微生物肽，已经报道了类似的血液中的活性缺乏。

除了溶素和artilysins以外，也已鉴定了其他噬菌体编码的宿主裂解系统，包括“amurin”(Chamakura KR等人, 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis proteinL. Microbiology 163:961-969)。术语amurin描述了来自ssDNA和ssRNA噬菌体(分别为微小噬菌体科和光滑噬菌体科)的有限的一组非胞壁质分解性(nonmuralytic)(非“破坏壁”，即，不是基于细胞壁的肽聚糖水解)裂解活性。例如，噬菌体φX174(微小噬菌体科，微小噬菌体属)的蛋白E amurin是91个氨基酸的膜蛋白，其通过抑制细菌的易位酶Mra Y (一种催化胞壁质前体脂质I的形成的重要的膜嵌入酶)引起裂解(Zheng Y等人, 2009.Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E.Biochemistry 48:4999-5006)。此外，噬菌体Qβ(光滑噬菌体科，异光滑噬菌体属)的A2衣壳蛋白是420个氨基酸的结构蛋白(和amurin)，其通过干扰MurA活性并使肽聚糖生物合成的过程失调而引起裂解(Gorzelnik KV等人, 2016. Proc Natl Acad Sci U S A 113:11519-11524)。其他非限制性实例包括噬菌体M的LysM amurin(其为MurJ (大肠杆菌的脂质II翻转酶)的特异性抑制剂)，和噬菌体MS2 (光滑噬菌体科，光滑噬菌体属)的蛋白Lamurin (其为75个氨基酸的完整膜蛋白并且以需要宿主伴侣蛋白DnaJ的活性的方式引起裂解)(Chamakura KR等人, 2017. J Bacteriol 199)。L-样amurin的推定结构域结构已经指定，并且包括内部亮氨酰丝氨酸二肽，紧接前面为一段10-17个疏水残基。这些amurin是完整膜蛋白，并且尚未像溶素一样纯化和使用。此外，它们的靶标在细胞质中。它们尚未作为裂解剂进行测试。一些amurin已经详细描述于例如PCT公开的申请号WO 2001/009382中，但它们最多构成开发治疗剂的基础，并且尚未开发成抗细菌治疗剂。

尽管最近的出版物已经描述了可以在体内以各种水平的效力针对革兰氏阴性细菌使用的溶素/artylysin和其他宿主裂解系统(例如，amurin)，但仍然需要靶向MDR铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性细菌用于治疗侵入性感染的额外抗细菌化合物，尤其是高度可溶、在血清存在的情况下在体内保持活性和/或不具有溶血活性的抗细菌化合物。

附图简述

图1A是由I-Tasser预测的衣原体噬菌体肽(Chp)家族成员Chp1、Chp 2、Chp4、Chp5、Chp6、Chp7、Ecp1、Ecp2和Osp1的结构的三维模型。包括人先天性免疫效应肽LL-37用于比较。α螺旋结构是明显的，并且顶部末端通常是N-末端。

图1B显示使用JPRED4对Chp2 (SEQ ID NO:2)的共有二级结构预测。α-螺旋由粗条纹条指示。

图1C显示使用JPRED4对Chp4 (SEQ ID NO:4)的共有二级结构预测。α-螺旋由粗条纹条指示。

图2A是从ClustalW比对生成的某些Chp家族成员的有根(UPGMA聚类方法)系统发生树。

图2B是从ClustalW比对生成的某些Chp家族成员的无根(邻位-接合聚类方法)系统发生树。

图3是一系列显微照片，其显示用100%人血清中的Chp2 (10 µg/mL)或缓冲液对照(“未处理”)处理15分钟的铜绿假单胞菌菌株1292的显微镜分析(2000倍放大)。将样品使用活/死细胞活力试剂盒(ThermoFisher)染色，并通过微分干涉反差(DIC)和荧光显微镜两者进行检查。显微照片显示，在未处理的行中不存在死细菌，且在经处理的行中的活细菌减少。

发明概述

本申请公开了新型类别的噬菌体裂解剂，其源自例如微小噬菌体科基因组序列，并且不同于其他此类药剂，包括已知的溶素/artilysin和amurin。本文公开的噬菌体裂解剂被称为衣原体噬菌体(Chp)肽，也被称为“amurin肽”(功能性定义，其并不暗示与amurin的序列相似性)。本文公开了已经鉴定的40种Chp肽，其构成特定的细菌裂解蛋白的家族。本文公开的几种Chp肽表现出与彼此显著的序列相似性，但与序列数据库中的其他已知肽不同。尽管Chp肽具有独特的序列，但预测它们都采用类似于一些先前描述的脊椎动物先天免疫系统的抗细菌肽(AMP)的α-螺旋结构(E.F. Haney等人, 2017, Hansen PR (编),Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,vol. 1548)，但与此类AMP没有序列相似性。与Chp类别的抗细菌功能一致，本文公开了几种不同的纯化的Chp肽针对革兰氏阴性病原体的有效且广谱的杀细菌活性。与先前描述的微小病噬菌体科的amurin (其具有在外部应用的蛋白不能轻易进入细胞壁生物合成装置中的细胞质靶标)不同，可以使用纯化形式的本文公开的Chp肽以“从无到有”发挥杀细菌活性，即通过作用于细胞壁的外侧。此处鉴定的Chp肽代表新型类别的抗细菌剂，其具有针对革兰氏阴性病原体的广谱活性和在血清存在的情况下持续存在的能力。

在一个方面，本公开涉及药物组合物，其包含药学上可接受的载体和有效量的(i)分离的Chp肽，其具有选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列，或(ii)修饰的Chp肽，其与SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66中的至少一个具有至少80%、诸如至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括铜绿假单胞菌。

在本文公开的另一个实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的分离的Chp肽，所述Chp肽选自肽Chp1、Chp 2、Chp3、Chp4、Chp6、Chp7、Chp8、Chp9、Chp10、Chp11、Chp12、CPAR39、Gkh1、Gkh2、Unp1、Ecp1、Tma1、Ecp2、Osp1、Unp2、Unp3、Gkh3、Unp5、Unp6、Spi1、Spi2、Ecp3、Ecp4、Lvp1、Lvp2、ALCES1、AVQ206、AVQ244、CDL907、AGT915、HH3930、Fen7875和SBR77或其活性片段。

在一些实施方案中，所述Chp肽是Chp2、Chp4、Chp6、Ecp1或Ecp2。

在本公开的各个实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的(i)分离的Chp肽，其具有选自SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66或其活性片段的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的(i)分离的Chp肽，其具有选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16；SEQ IDNO:18；和SEQ ID NO:54或其活性片段的氨基酸序列。

在某些实施方案中，如本文所公开的Chp肽或其活性片段含有相对于SEQ IDNO.1-4、6-26和54-66中任一个的氨基酸序列的至少一个非天然修饰，且在某些实施方案中，所述非天然修饰选自取代修饰，诸如氨基酸的取代；N-末端乙酰化修饰；和C-末端酰胺化修饰。在某些实施方案中，所述修饰的Chp肽包含相对于SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66中任一个的氨基酸序列的至少一个氨基酸取代、插入或缺失，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括铜绿假单胞菌。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。在某些实施方案中，包含相对于SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66中任一个的氨基酸序列的至少一个氨基酸取代的修饰的Chp肽是具有至少一个α螺旋结构域的阳离子肽。

在一些实施方案中，所述药物组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂。在一些实施方案中，所述药物组合物也可以包含一种或多种适合于治疗革兰氏阴性细菌的抗生素。任选地，排除肽Chp1，使得所述药物组合物不包含Chp1。

在某些实施方案中，本文公开了包含核酸的载体，所述核酸编码(i) Chp肽，其具有选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列，或(ii)Chp肽，其与SEQID NO.1-4、6-26和54-66中的至少一个具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括铜绿假单胞菌。

本文还公开了包含核酸的重组表达载体，所述核酸编码(i) Chp肽，其包含选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列，或(ii)修饰的Chp肽，其与SEQID NO.1-4、6-26和54-66中的至少一个具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中，革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括铜绿假单胞菌。在某些实施方案中，所述核酸可操作地连接至异源启动子。在某些实施方案中，所述核酸编码Chp肽，所述Chp肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:54；SEQ IDNO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ IDNO:63；和SEQ ID NO:66或其活性片段，且在某些实施方案中，所述核酸编码Chp肽，所述Chp肽包含选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；和SEQID NO:54或其活性片段的氨基酸序列。

本文公开的进一步实施方案包括包含前述载体的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述核酸序列是cDNA序列。

在又另一个方面，本公开涉及分离的纯化的核酸，其编码包含选自SEQ ID NO.1-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列的Chp肽。在某些实施方案中，所述核酸编码包含选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列的Chp肽。在一个替代实施方案中，分离的纯化的DNA包含选自SEQ ID NO.27-53和68-80的核苷酸序列，且在某些实施方案中，分离的纯化的DNA包含选自SEQ ID NO.27-30、32-53和68-79的核苷酸序列。任选地，所述核酸是cDNA。在某些实施方案中，所述核苷酸序列包含至少一个非天然修饰，诸如突变(例如，取代、插入或缺失)，或编码N-末端修饰或C-末端修饰的核酸序列。

在其他方面，本公开涉及各种方法/用途。一种此类用途是用于抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，所述方法包括使所述细菌与组合物接触，所述组合物包含有效量的(i)Chp肽，其包含选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的氨基酸序列，或(ii)与其具有至少80%、诸如至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的修饰的Chp肽，其中所述修饰的Chp肽抑制所述生长，减少所述种群，和/或杀死所述革兰氏阴性细菌的至少一种物种。在某些实施方案中，所述Chp肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ IDNO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ IDNO:62；SEQ ID NO:63；和SEQ ID NO:66或其活性片段，且在某些实施方案中，所述Chp肽包含选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；和SEQ IDNO:54或其活性片段的氨基酸序列。

本文还公开了用于抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，所述方法包括使所述细菌与组合物接触，所述组合物包含有效量的选自以下的Chp肽：Chp1、Chp 2、Chp3、Chp4、Chp6、Chp7、Chp8、Chp9、Chp10、Chp11、Chp12、CPAR39、Gkh1、Gkh2、Unp1、Ecp1、Tma1、Ecp2、Osp1、Unp2、Unp3、Gkh3、Unp5、Unp6、Spi1、Spi2、Ecp3、Ecp4、Lvp1、Lvp2、ALCES1、AVQ206、AVQ244、CDL907、AGT915、HH3930、Fen7875和SBR77或其活性片段，其中所述Chp肽或其活性片段具有抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的特性。

在某些实施方案中，所述革兰氏阴性细菌的至少一种物种是铜绿假单胞菌，且在某些实施方案中，所述方法进一步包括杀死除了铜绿假单胞菌以外的革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。

本文还公开了用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用如本文所公开的药物组合物。

在任何前述方法/用途中，所述革兰氏阴性细菌可以是至少一种选自以下的革兰氏阴性细菌：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、沙门氏菌物种、淋病奈瑟氏菌和志贺氏菌属物种。在某些实施方案中，所述革兰氏阴性细菌是铜绿假单胞菌。

本文还公开了用于治疗或预防由革兰氏阴性细菌引起的局部或全身性致病性细菌感染的方法，其包括向需要治疗或预防的受试者施用如本文所公开的药物组合物。

本文进一步公开了用于预防或治疗细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一量的如本文所公开的药物组合物和第二量的适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的组合，其中第一和第二剂量一起有效地预防或治疗所述革兰氏阴性细菌感染。

在一些实施方案中，所述适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。在某些实施方案中，所述抗生素选自阿米卡星、阿奇霉素、氨曲南、环丙沙星、粘菌素、磷霉素、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林、利福平和妥布霉素中的一种或多种。

在又另一个实施方案中，公开了用于加强适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的效力的方法，其包括共同施用所述抗生素与如本文所公开的药物组合物的组合，其中与单独施用所述抗生素或其药物组合物相比，所述组合的施用更有效地抑制革兰氏阴性细菌的生长，减少革兰氏阴性细菌的种群或杀死革兰氏阴性细菌。

详述

定义

除非上下文另外明确指明，否则本文使用的以下术语及其同源词应具有以下含义：

“载体”是指与活性化合物一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。此类载体可以是无菌液体，诸如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。

“药学上可接受的载体”是指生理上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣剂、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。载体必须是在通常用于药物中的量下不对待治疗的受试者有害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其他成分相容，而不使组合物不适合于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适用于本文所提供的受试者，而没有不适当的不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)。当其风险超过组合物所提供的益处时，副作用是“不适当的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂、诸如油/水乳剂和微乳剂。合适的药物载体描述于例如E.W. Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版。所述药学上可接受的载体可以是自然界中不存在的载体。

“杀细菌的”或“杀细菌活性”是指在18-24小时时段内在初始细菌种群中至少减少3-log10 (99.9%)或更好的减少的程度上具有细菌死亡或能够杀死细菌的特性。

“抑细菌的”或“抑细菌活性”是指抑制细菌生长(包括抑制细菌细胞的生长)，因此在18-24小时时间段内在初始细菌种群中引起2-log10 (99%)或更好且最多达仅略低于3-log减少的特性。

“抗细菌剂”是指抑细菌剂和杀细菌剂两者。

“抗生素”是指具有对细菌具有负面影响的特性(诸如致死性或生长减少)的化合物。抗生素可以对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或两者具有负面影响。通过实例的方式，抗生素可以影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性或DNA或蛋白合成。针对革兰氏阴性细菌有活性的抗生素的非限制性实例包括头孢菌素类，诸如头孢曲松-头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮和头孢吡普；氟喹诺酮类，诸如环丙沙星和左氧氟沙星；氨基糖苷类，诸如庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星；哌拉西林、替卡西林、亚胺培南、美罗培南、多利培南、有或没有β-内酰胺酶抑制剂的广谱青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素。

“药物抗性的”通常是指对药物的抗细菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时，药物抗性可以具体地是指抗生素抗性。在一些情况下，通常对特定抗生素敏感的细菌可对抗生素发展抗性，由此成为药物抗性的微生物或菌株。“多药抗性的” (“MDR”)病原体是已经对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物发展抗性的病原体。例如，已经发现金黄色葡萄球菌的某些菌株对几种抗生素(包括甲氧西林和/或万古霉素)具有抗性(Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department ofHealth and Services, Centers for Disease Control and Prevention)。本领域技术人员可使用确定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术，容易地确定细菌是否是药物抗性的。

“有效量”是指当以适当的频率或给药方案应用或施用时足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或预防、减少或改善被治疗的病症(例如，革兰氏阴性细菌病原体生长或感染)的发作、严重程度、持续时间或进展，预防所治疗的病症的发展，引起所治疗的病症的消退、或者增强或改善另外的疗法(诸如抗生素或抑细菌疗法)的预防或治疗效果的量。

“共同施用”是指以依次的方式施用两种药剂、诸如Chp肽和抗生素或任何其他抗细菌剂，以及以基本上同时的方式施用这些药剂，诸如在单一混合物/组合物中或以分开给予的剂量，但仍基本上同时施用于受试者，例如在同一天或24小时时段中的不同时间。Chp肽与一种或多种额外的抗细菌剂的这种共同施用可作为持续最多达数天、数周或数月的持续治疗而提供。另外，取决于用途，共同施用不需要是连续的或共同延伸的(coextensive)。例如，如果用途是作为局部抗细菌剂以治疗例如细菌性溃疡或感染的糖尿病性溃疡，则可以仅在额外抗生素的24小时内开始施用Chp肽，且然后额外抗生素使用可以继续而不进一步施用Chp肽。

“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物或细胞培养物。例如，术语“受试者”意欲包括易感或患有细菌感染、例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者是人，例如患有革兰氏阴性细菌感染、处于患有革兰氏阴性细菌的风险中、或易于被革兰氏阴性细菌感染的人，无论这种感染是全身性的、局部的还是以其他方式集中或局限于特定的器官或组织。

“多肽”在本文中与术语“肽”可互换使用，并且是指由氨基酸残基构成且通常具有至少约30个氨基酸残基的聚合物。该术语不仅包括分离形式的多肽，而且还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖包含如本文所述的Chp肽并维持例如裂解功能的融合蛋白或融合多肽。取决于背景，多肽可以是天然存在的多肽或者重组、工程改造或合成产生的多肽。特定的Chp肽可以例如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或移取，或者可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(诸如Sambrook, J. 等人, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)中公开的那些)制备，或者可策略性地将其截短或分段，产生维持例如针对相同或至少一种常见靶标细菌的裂解活性的活性片段。

“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段的融合产生的表达产物，导致通常具有两个或更多个通常具有不同特性或功能的结构域或区段的融合表达产物。在更具体的意义上，术语“融合多肽”还可以指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常被C-末端至N-末端连接，尽管它们也可以被C-末端至C-末端、N-末端至N-末端或N-末端至C-末端连接。术语“融合多肽”与术语“融合蛋白”可互换使用。开放式表述“包含”某种结构的“多肽”包括比所记载的结构、诸如融合多肽更大的分子。

“异源的”是指非天然连续的核苷酸、肽或多肽序列。例如，在本公开的上下文中，术语“异源的”可以用于描述两个或更多个肽和/或多肽的组合或融合，其中该融合肽或多肽通常在自然界中未发现，诸如例如Chp肽或其活性片段和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等人，Cell Mol Life Sci.，65(7-8)：1202-19(2008))、防卫素肽(Ganz，T. Nature Reviews Immunology 3，710-720(2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽，其可具有增强的裂解活性。该定义中包括两种或更多种Chp肽或其活性片段。这些可用于制备具有裂解活性的融合多肽。

“活性片段”是指多肽的一部分，其保留从其中获取片段的分离多肽的一种或多种功能或生物活性，例如针对一种或多种革兰氏阴性细菌的杀细菌活性。

“两亲性肽”是指具有亲水和疏水性官能团两者的肽。在某些实施方案中，二级结构可以将疏水和亲水性氨基酸残基置于两亲性肽的对侧(例如，当所述肽在溶剂、诸如水中时，内侧相对于外侧)。在某些实施方案中，这些肽可以采用螺旋二级结构，诸如α-螺旋二级结构。

“阳离子肽”是指具有高百分比的带正电荷的氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，阳离子肽具有8.0或更高的pKa-值。在本公开的上下文中，术语“阳离子肽”还涵盖聚阳离子肽，其为由主要带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸(Lys)和/或精氨酸(Arg)残基)构成的合成产生的肽。不带正电荷的氨基酸残基可以是带中性电荷的氨基酸残基、带负电荷的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。

“疏水性基团”是指对水分子具有低亲和力或不具有亲和力、但对油分子具有更高亲和力的化学基团，诸如氨基酸侧链。疏水性物质倾向于在水或水相中具有低溶解度或不具有溶解度，并且通常是非极性的，但倾向于在油相中具有更高的溶解度。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。

“加强”是指药剂的活性、诸如抗微生物活性的程度高于除此以外的情况。“加强”涵盖加性以及协同(超加性)作用。

“协同”或“超加性”是指由两种物质组合产生的有益作用，其超过两种药剂独立起作用的作用的总和。在某些实施方案中，协同或超加性作用显著、即统计学显著超过两种药剂独立起作用的作用的总和。一种活性成分或活性成分两者可以在亚阈值水平(即，如果活性物质单独使用则不产生或产生非常有限的效果的水平)下使用。可通过测定、诸如此处所述的棋盘测定来测量效果。

“治疗”是指任何过程、作用、应用、疗法等，其中使受试者(诸如人类)经受医疗救助，目的是直接或间接地治愈病症、根除病原体、或改善受试者的状况。治疗还指降低发病率、减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病、降低发病的风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可以进一步涵盖减少受试者中细菌的种群、生长速率或毒力，且由此控制或减少受试者中的细菌感染或者器官、组织或环境的细菌污染。因此，降低发病率的“治疗”可以例如有效抑制至少一种革兰氏阴性细菌在特定环境(无论它是受试者还是环境)中的生长。另一方面，已经确定的感染的“治疗”是指抑制造成感染或污染的革兰氏阴性细菌的生长，减少造成感染或污染的革兰氏阴性细菌的种群，杀死造成感染或污染的革兰氏阴性细菌，包括根除造成感染或污染的革兰氏阴性细菌。

术语“预防”是指预防病症、诸如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或确立。无意于将本公开限制为感染的完全预防或感染的确立的预防。在一些实施方案中，发作被延迟，或者随后感染的疾病的严重程度或感染疾病的机会被降低，并且这样构成了预防的实例。

“感染的疾病”是指表现出临床或亚临床症状的疾病，诸如发烧、败血症或菌血症的检测，以及当尚未表现出与这种病理学相关的症状时，可以通过细菌病原体(例如培养物中)的生长检测的疾病。

肽或多肽或其活性片段的上下文中的术语“衍生物”意欲涵盖例如经修饰以含有除氨基酸以外的基本上不会不利地影响或破坏裂解活性的一个或多个化学部分的多肽。化学部分可以与肽共价连接，例如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基，或在内部氨基酸残基处。此类修饰可以是天然或非天然的。在某些实施方案中，非天然修饰可以包括在反应性部分上添加保护或加帽基团、添加可检测标记物、诸如抗体和/或荧光标记物、添加或改变糖基化、或添加大体积基团(bulking group)、诸如PEG(聚乙二醇化)和本领域技术人员已知的其他变化。在某些实施方案中，非天然修饰可以是加帽修饰，诸如N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。可以添加至Chp肽的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记物蛋白诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry，是可以共价或非共价结合至Chp肽或融合至Chp肽而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧凑蛋白。在某些实施方案中，编码荧光蛋白的多核苷酸可以被插入Chp多核苷酸序列的上游或下游。这将产生不干扰与其附接的Chp肽的细胞功能或功能的融合蛋白(例如，Chp肽:: GFP)。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药物蛋白的循环半衰期的方法。因此，在Chp肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”涵盖通过共价附接一个或多个PEG分子而化学修饰的Chp肽。预期聚乙二醇化的Chp肽与未聚乙二醇化的Chp肽相比将表现出延长的循环半衰期，同时保留生物学和治疗活性。

“百分比氨基酸序列同一性”是指在比对序列和(如果必要的话)引入缺口以获得最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列、诸如特定Chp肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的软件、诸如BLAST或可例如自DNASTAR商业获得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%同一性的任何一处，或其之间的任何整数值。在本公开的上下文中，当至少80%的氨基酸残基(诸如至少约85%、至少约90%、至少约92.5%、至少约95%、至少约98%或至少约99%)相同时，两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”也适用于Chp肽。因此，术语“基本上相同的”将涵盖本文所述的分离的Chp多肽和肽的突变、截短、融合或在其他方面的序列修饰的变体及其活性片段，以及相比于参考(野生型或其他完整)多肽具有基本上的序列同一性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%同、至少98%或至少99%同一性，如通过例如上文提到的一种或多种方法所测量)的多肽。

如本文所用，当至少约80%的氨基酸残基(诸如至少约85%、至少约90%、至少约92.5%、至少约95%、至少约98%或至少约99%)相同或代表保守取代时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽、诸如本文所述的Chp肽的一个或多个、诸如最多达10%、最多达15%或最多达20%的氨基酸被相似或保守的氨基酸取代进行取代时，并且其中所得肽具有参考多肽、诸如本文公开的Chp肽的至少一种活性(例如，抗细菌作用)和/或细菌特异性，本公开的多肽的序列是基本上同源的。

如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的取代。具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

“可吸入组合物”是指被配制用于在常规或辅助呼吸期间或与常规或辅助呼吸相结合而直接递送至呼吸道(例如通过气管内支气管、肺、和/或鼻腔施用)的本公开的药物组合物，包括但不限于雾化、喷洒、干粉和/或气雾化制剂。

“生物膜”是指附着至表面并聚集在水合聚合物基质中的细菌，该基质可以由细菌和/或宿主来源的组分构成。生物膜为微生物的聚集体，其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞通常被嵌入包含(但不限于)胞外聚合物质(EPS)的基质内。生物膜EPS也称为粘液(尽管并非所有描述为粘液的东西均为生物膜)或菌斑，为一种通常由胞外DNA、蛋白和多糖构成的聚合物团聚物。

在适合于针对某些细菌的抗生素使用的上下文中，“适合”是指被发现针对那些细菌有效的抗生素，即使随后发展出抗性。

“外膜”或“OM”是指革兰氏阴性细菌的特征。外膜由脂质双层构成，所述脂质双层具有内部的磷脂小叶和外部的主要由脂多糖(LPS)组成的两亲小叶。LPS具有三个主要部分：称为脂质A的六酰化的基于葡萄糖胺的磷脂，多糖核和称为O-抗原的延伸的外部多糖链。所述OM呈现通过三种主要相互作用稳定的非流体连续体，所述三种主要相互作用包括：i) LPS分子与彼此的亲合(avid)结合，特别是如果存在阳离子以中和磷酸酯基团；ii)大大饱和的酰基链的紧密堆积；iii)脂质A部分的疏水堆叠。所得结构是疏水和亲水分子两者的屏障。在OM下，肽聚糖形成薄层，其对水解裂解非常敏感 – 不同于革兰氏阴性细菌的肽聚糖，其厚30-100纳米(nm)，且由最多达40层组成，革兰氏阴性细菌的肽聚糖仅为2-3 nm厚，且仅由1-3层组成。

微小噬菌体科噬菌体

由于几种原因，噬菌体微小噬菌体科的成员作为抗感染剂的潜在来源可能是特别感兴趣的。如本文所公开，已经发现这些噬菌体的大子集，包括衣原体微小噬菌体属(

基于对GenBank中所有注释的微小噬菌体科基因组序列的生物信息学分析(其聚焦于缺乏amurin的噬菌体)，鉴定了40种新型和同线(syntenic)的开放阅读框。它们编码小阳离子肽，其具有与来自各种脊椎动物的先天免疫系统的AMP类似(但氨基酸序列与AMP不同)的预测的α-螺旋结构。这些肽，统称为“Chp肽”或“amurin肽”，主要在衣原体微小噬菌体属中发现，并且在较小程度上在蘑菇状噬菌体亚科的其他相关成员中发现。参见例如下表1和2。来自一系列的微小噬菌体科噬菌体的Chp肽可以表现出与彼此的30-100%同一性，并且可与蛋白序列数据库中的其他肽没有同源性或同源性很小。参见例如下表3。基于Chp肽具有AMP-样活性的预测，合成39种不同的家族成员(Chp2和Chp3是相同的氨基酸序列)，用于在不同的天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定中进行分析。基于在人血清存在的情况下的0.25-4 µg/mL的最小抑制浓度(MIC)值，与测试的一组多达17种已知AMP (包括先天免疫效应子及其衍生物)相比，几种Chp肽已表明优异的血清活性。此外，已经表明针对一系列的革兰氏阴性病原体(包括世界卫生组织(WHO)和疾病控制中心(CDC)优先列表上的几种，包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)的活性。

对于有效的Chp肽中的至少两种，Chp2和Chp4，已经表明具有与一系列的最多达11种针对铜绿假单胞菌的抗生素(包括用于临床治疗革兰氏阴性感染的抗生素)体外协同作用的能力。此外，显示Chp2和Chp4两者在MBEC测定形式(MBEC = 0.25 µg/mL)中具有有效的抗生物膜活性，并且显示Chp2和Chp4两者在时间-杀死测定形式中在低至1 µg/mL或更低的浓度下具有杀细菌活性。参见下面的实施例5。

总体而言，这些发现不仅与Chp家族成员在宿主细胞裂解过程中的作用(在噬菌体生命周期的背景下)一致，而且与纯化的Chp肽或其衍生物作为靶向革兰氏阴性病原体的广谱抗细菌剂的使用一致。使用先前描述的AMP作为侵入性感染的治疗的一个主要缺点涉及对红细胞的毒性和普遍的膜裂解活性(即，溶血作用)(Oddo A.等人, 2017. HemolyticActivity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol Biol 1548:427-435)。通常，这可以使用用于检测人红血细胞裂解的标准化测定法在体外进行测试。与文献中描述的几种具有溶血活性的AMP(以及Triton X-100)相反，本文公开的许多Chp肽没有表现出对人红血细胞的溶血活性。在某些实施方案中，与AMP相比，本文公开的Chp肽可能仅表现出针对人红细胞的最小的溶血活性或没有溶血活性。文献中描述的AMPs的另一个缺点涉及在人血液基质和生理盐浓度存在的情况下的活性损失(Mohanram H. 等人, 2016. Salt-resistantshort antimicrobial peptides. Biopolymers 106:345-356)；实际上，可以在下表6中观察到已知AMP的这种作用。本文提供的数据表明某些Chp肽在人血清或血浆存在的情况下有活性和/或在含有生理盐浓度的生长培养基(诸如Mueller Hinton培养液和酪蛋白氨基酸培养基)中有活性。尽管不希望受到理论的束缚，但据信在Chp肽和AMP肽(在文献中)的活性中观察到的差异可能归因于两种类型的药剂的不同来源，其中Chp肽来自噬菌体且AMP主要基于脊椎动物免疫系统的先天免疫效应子。Chp肽的高活性，血液基质中的Chp肽的活性，和/或不存在溶血活性，使它们适合用于治疗侵入性疾病。例如，在某些实施方案中，纳摩尔量的所述Chp肽可以有活性。

总之，尽管病原体-特异性靶向的溶素治疗剂具有充当由已知的MDR病原体引起的严重单微生物感染的定制疗法的能力，但仍然存在对于解决由多微生物抗性的革兰氏阴性感染引起的严重且威胁生命的感染(例如，某些腹内感染，以及严重的烧伤、手术和其他伤口感染)的药剂的未满足的医药需求。本文公开的Chp肽有助于满足该需求，因为此处已显示它们表现出针对通常与MDR相关的所有主要ESKAPE病原体(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌)的有效的活性，并且预期它们针对许多革兰氏阴性细菌有活性。本文公开的Chp肽可以在高纳摩尔浓度下有活性，与活性溶素的那些相当。本文公开的Chp肽还可以负责高效、快速的细菌裂解作用，清除生物膜的能力，与常规抗生素的协同作用以及与彼此的协同作用，诸如两种或更多种Chp肽之间的协同作用。

尽管本公开的Chp肽不需要通过添加抗微生物肽进行修饰，但在某些实施方案中，本文公开的Chp肽可以并入融合蛋白中。例如，融合蛋白可以包含如本文所公开的Chp肽和溶素，诸如针对革兰氏阴性细菌有活性的溶素。在某些实施方案中，可以将所述Chp肽添加至溶素的N-末端或C-末端，具有或不具有接头序列。预期含有多于一个细菌裂解区段的融合多肽可以对亲本溶素和/或亲本Chp肽的细菌裂解活性有积极贡献。

多肽

如本文所表明和解释，该部分中描述的Chp肽，包括野生型Chp肽、修饰的Chp肽及其衍生物或活性片段，可以用于本文所述的药物组合物和方法中。

在一些实施方案中，所述Chp肽选自以下中的至少一种：Chp1 (SEQ ID NO:1)、Chp2 (SEQ ID NO:2)、CPAR39 (SEQ ID NO:3)、Chp3 (SEQ ID NO:54); Chp4 (SEQ ID NO:4)、Chp6 (SEQ ID NO:6)、Chp7 (SEQ ID NO:7)、Chp8 (SEQ ID NO:8)、Chp 9 (SEQ ID NO:9)、Chp 10 (SEQ ID NO:10)、Chp 11 (SEQ ID NO:11)、Chp12 (SEQ ID NO:12)、Gkh1 (SEQID NO:13)、Gkh2 (SEQ ID NO:14)、Unp1 (SEQ ID NO:15)、Ecp1 (SEQ ID NO:16)、Tma1(SEQ ID NO:17)、Ecp2 (SEQ ID NO:18)、Osp1 (SEQ ID NO:19)、Unp2 (SEQ ID NO:20)、Unp3 (SEQ ID NO:21)、Gkh3 (SEQ ID NO:22)、Unp5 (SEQ ID NO:23)、Unp6 (SEQ ID NO:24)、Spi1 (SEQ ID NO:25)、Spi2 (SEQ ID NO:26)、Ecp3 (SEQ ID NO:55)、Ecp4 (SEQ IDNO:56)；Lvp1 (SEQ ID NO:57)、Lvp2 (SEQ ID NO:58)、ALCES1 (SEQ ID NO:59)、AVQ206(SEQ ID NO:60)、AVQ244 (SEQ ID NO:61)、CDL907 (SEQ ID NO:62)、AGT915 (SEQ ID NO:63)、HH3930 (SEQ ID NO:64)、Fen7875 (SEQ ID NO:65)、SBR77 (SEQ ID NO:66)和Bdp1(SEQ ID NO:67)或其具有裂解活性的活性片段。

所述Chp肽可以是修饰的Chp肽或其活性片段。在某些实施方案中，所述Chp肽或其活性片段含有相对于SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66中的至少一个的至少一个修饰，诸如至少一个氨基酸取代、插入或缺失。在某些实施方案中，所述修饰的Chp肽包含与至少一种选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66或其活性片段的Chp肽的氨基酸序列具有至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少92.5%、诸如至少95%、诸如至少98%或诸如至少99%序列同一性的多肽序列，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和任选地如本文所述的革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种。

在一些实施方案中，所述Chp肽选自：(i)以下中的至少一种：Chp1 (SEQ ID NO:1)、Chp2 (SEQ ID NO:2)、CPAR39 (SEQ ID NO:3)、Chp3 (SEQ ID NO:54); Chp4 (SEQ IDNO:4)、Chp6 (SEQ ID NO:6)、Chp7 (SEQ ID NO:7)、Chp8 (SEQ ID NO:8)、Chp10 (SEQ IDNO:10)、Chp11 (SEQ ID NO:11)、Ecp1 (SEQ ID NO:16)、Ecp2 (SEQ ID NO:18)、Ecp3 (SEQID NO:55)、Ecp4 (SEQ ID NO:56)、Osp1 (SEQ ID NO:19)、Unp2 (SEQ ID NO:20)、Gkh3(SEQ ID NO:22)、Unp5 (SEQ ID NO:23)、Unp6 (SEQ ID NO:24)、Spi1 (SEQ ID NO:25)、Lvp1 (SEQ ID NO:57)、ALCES1 (SEQ ID NO:59)、AVQ206 (SEQ ID NO:60)、CDL907 (SEQID NO:62)、AGT915 (SEQ ID NO:63)和SBR77 (SEQ ID NO:66)或其活性片段，或(ii)修饰的Chp肽，其与SEQ ID NO.1-4、6-8、10、11、16、18、19、21-25、54-57、59、60、62、63和66中的至少一个具有至少80%、诸如至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的生长，减少铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的种群，和/或杀死铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种。

在一些实施方案中，所述Chp肽选自：(i)以下中的至少一种：Chp2 (SEQ ID NO:2)、Chp3 (SEQ ID NO:54)、Chp4 (SEQ ID NO:4)、Chp6 (SEQ ID NO:6)、Ecp1 (SEQ ID NO:16)和Ecp2 (SEQ ID NO:18)或其活性片段，或(ii)修饰的Chp肽，其与SEQ ID NO.2、4、6、16和18中的至少一个具有至少80%、诸如至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种。

在某些实施方案中，所述Chp肽选自：(i)至少一种Chp肽，其具有选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；和SEQ ID NO:6或其活性片段的氨基酸序列，或(ii)修饰的Chp肽，其与SEQID NO.2、4和6中的至少一个具有至少92.5%序列同一性，其中任选地在人血清存在的情况下，所述修饰的Chp肽抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的生长，减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种的种群，和/或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种、诸如铜绿假单胞菌和革兰氏阴性细菌的至少一种额外物种。

在一些实施方案中，本公开的Chp肽是已经被化学修饰的参考Chp肽之一的衍生物。化学修饰包括但不限于添加化学部分，产生新键，和除去化学部分。化学修饰可以发生在Chp肽中的任何位置，包括氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。例如，在某些实施方案中，所述Chp肽包含N-末端乙酰化修饰。在某些实施方案中，所述Chp肽或其活性片段包含C-末端酰胺化修饰。这种修饰可以存在于Chp肽中的多于一个位点处。

此外，Chp肽或其活性片段的一个或多个侧基或末端基团可以被本领域普通技术人员已知的保护基团保护。

在一些实施方案中，将所述Chp肽或其活性片段缀合至持续时间增强部分。在一些实施方案中，所述持续时间增强部分是聚乙二醇。聚乙二醇(“PEG”)已用于获得持续时间增强的治疗性多肽(Zalipsky, S.,

多核苷酸

Chp肽和其活性片段

在一个方面，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含编码具有裂解活性的Chp肽或其活性片段的核酸分子。如本文所用，“裂解活性”涵盖Chp肽在人血清存在或不存在的情况下，杀死细菌、减少细菌的种群或抑制细菌生长(例如，通过渗透革兰氏阴性细菌(例如，铜绿假单胞菌)的外膜)的能力。裂解活性还涵盖在人血清存在和/或不存在的情况下，除去或减少生物膜的能力和/或减少抗生素的最小抑制浓度(MIC)的能力。

在某些实施方案中，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ IDNO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ IDNO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ IDNO:65；和SEQ ID NO:66或其活性片段。

在某些实施方案中，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ IDNO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14；SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ IDNO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ IDNO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ IDNO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66或其活性片段。

在某些实施方案中，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ IDNO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:54；SEQ IDNO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:62；SEQ IDNO:63；和SEQ ID NO:66或其活性片段，且在某些实施方案中，所述核酸编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16；SEQ IDNO:18；和SEQ ID NO:54或其活性片段。

在一些实施方案中，本文公开的Chp肽及其活性片段能够穿透革兰氏阴性细菌的外膜。不受理论的限制，在穿透外膜之后，所述Chp肽或其活性片段可以降解肽聚糖(细菌细胞壁的主要结构组分)，导致细胞裂解。在一些实施方案中，本文公开的Chp肽或其活性片段含有带正电荷的(和两亲性的)N-和/或C-末端α-螺旋结构域，其促进与革兰氏阴性细菌的阴离子外膜的结合，以实现向次相邻肽聚糖中的易位。

可以通过本领域中已知的任何方法，诸如WO 2017/049233(其通过引用以其整体并入本文)中描述，来评价Chp肽或其活性片段穿透革兰氏阴性细菌的外膜的能力。例如，可以将所述Chp肽或其活性片段与革兰氏阴性细菌和疏水性化合物一起孵育。由于存在外膜，大多数革兰氏阴性细菌对疏水性化合物强烈抵抗，且因此不允许摄取疏水剂、诸如1-N-苯基萘胺(NPN)、结晶紫或8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)。NPN，例如，在疏水条件下强烈发荧光，且在水性条件下微弱发荧光。因此，NPN荧光可以用作外膜渗透性的测量值。

更具体地，可以通过在待测试活性的Chp肽或其活性片段存在的情况下，将例如NPN与革兰氏阴性细菌、例如铜绿假单胞菌菌株PA01一起孵育来评价所述Chp肽或其活性片段穿透外壁的能力。与在Chp肽不存在的情况下(阴性对照)发出的荧光相比，较高的荧光诱导表明外膜渗透。此外，可以将荧光诱导与确定的透化剂、诸如EDTA(乙二胺四乙酸酯)或抗生素、诸如用于治疗铜绿假单胞菌的最后使用的抗生素、即多粘菌素B(PMB))的荧光诱导进行比较，以评价外膜透化的水平。

在一些实施方案中，本文公开的Chp肽或其活性片段在人血清存在和/或不存在的情况下表现出裂解活性。用于评价人血清中的Chp肽或其活性片段的活性的合适方法是本领域中已知的，并且描述于实施例中。简而言之，可以测定Chp肽或其活性片段的MIC值(即，与对照相比足以抑制至少80%的细菌生长的肽的最小浓度)，并且与例如人血清中无活性的化合物、例如T4噬菌体溶菌酶或artilysin GN126进行比较。T4噬菌体溶菌酶是商业可得的，例如来自Sigma-Aldrich, Inc。GN126对应于Art-175，其描述于文献中，并通过将AMPSMAP-29与GN溶素KZ144融合而获得。参见Briers等人2014,

更具体地，可以在例如Mueller-Hinton培养液，补充有人血清的Mueller-Hinton培养液、如本文所述的CAA (其包括生理盐浓度)和补充有人血清的CAA中，测定Chp肽或其活性片段针对例如实验室铜绿假单胞菌菌株PA01的MIC值。PA01的使用使得能够在升高血清浓度存在的情况下进行测试，因为不同于大多数临床分离株，PA01对人血液基质的抗细菌活性不敏感。

在一些实施方案中，本文公开的Chp肽或其活性片段能够减少生物膜。用于评价Chp肽或其活性片段的最小生物膜根除浓度(MBEC)的方法可以使用具有修改的培养液微量稀释MIC方法的变式来测定(参见Ceri等人 1999.

在一些实施方案中，本文公开的Chp肽或其活性片段降低抗生素在人血清存在和/或不存在的情况下的最小抑制浓度(MIC)。可以使用任何已知的评价MIC的方法。在一些实施方案中，棋盘测定法用于测定Chp肽或其活性片段对抗生素浓度的作用。棋盘测定法基于通过培养液微量稀释测定MIC的CLSI方法的修改(参见临床和实验室标准协会(CLSI),CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-第10版. Clinical andLaboratory Standards Institute, Wayne, PA, 其通过引用以其整体并入本文，以及Ceri等人1999.

通过首先准备例如96-孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘，其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在分开的板中，准备可比较的行，其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释例如2倍的Chp肽或其活性片段。然后将Chp肽或其活性片段和抗生素稀释液合并，使得每列具有恒定量的抗生素和Chp肽的两倍稀释液，而每行具有恒定量的Chp肽和抗生素的两倍稀释液。因此，每个孔具有Chp肽和抗生素的独特组合。将细菌以CAA中1x 10

在一些实施方案中，本文公开的Chp肽或其活性片段显示针对红细胞的低毒性。可以使用本领域中已知的任何方法来评价本发明的Chp肽或其活性片段的溶血活性的潜力。

在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸包含核酸分子，所述核酸分子编码修饰的Chp肽，例如，与参考Chp肽相比含有一个或多个插入、缺失和/或氨基酸取代的Chp肽。此类参考Chp肽包括SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66中的任一个。在某些实施方案中，所述修饰的Chp肽与具有选自SEQ ID NO.1-4、6-26和54-66的氨基酸序列的参考Chp多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性。

通常设计本公开的修饰的Chp肽以保留α-螺旋结构域，所述α-螺旋结构域的存在或不存在可以使用各种软件程序、诸如Jpred4 (compio.dundee.ac.uk/jpred)和HelicalWheel (hael.net/helical.htm)容易地确定。

在一些实施方案中，α-螺旋结构域跨越分子的大部分。参见例如图1中的Chp1和Chp4。在一些实施方案中，α-螺旋结构域被中断(参见例如图1中的Chp2)，并且在一些实施方案中，α-螺旋结构域被截短(参见例如图1中的Chp6和Osp1)。本公开的Chp肽的α-螺旋结构域的大小在约3和32个氨基酸之间变化，更通常在约10和25个氨基酸残基之间变化。

本公开的修饰的Chp肽通常保留参考Chp肽的一种或多种功能或生物学活性。在一些实施方案中，所述修饰提高所述Chp肽的抗细菌活性。通常，与参考Chp肽相比，所述修饰的Chp肽具有提高的体外抗细菌活性(例如，在缓冲液和/或培养基中)。在其他实施方案中，所述修饰的Chp肽具有提高的体内抗细菌活性(例如，在动物感染模型中)。在一些实施方案中，所述修饰提高所述Chp肽在人血清不存在和/或存在的情况下的抗细菌活性。

在一些实施方案中，在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下，本文公开的Chp肽或其变体或活性片段能够抑制铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的生长，或减少铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种的种群，或杀死铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码本文公开的Chp肽或修饰的Chp肽的活性片段。术语“活性片段”是指全长Chp肽的一部分，其保留参考肽的一种或多种生物学活性。因此，如本文所用Chp肽的活性片段或修饰的Chp肽，在人血清不存在或存在或不存在和存在的情况下，抑制如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，或杀死如本文所述的铜绿假单胞菌和任选地革兰氏阴性细菌的至少一种物种。通常，所述活性片段保留α-螺旋结构域。在某些实施方案中，所述活性片段是保留α-螺旋结构域的阳离子肽。

载体和宿主细胞

在另一个方面，本公开涉及载体，所述载体包含含有编码本文公开的任何Chp肽或其活性片段的核酸分子的分离的多核苷酸或本发明的分离的多核苷酸的互补序列。在一些实施方案中，所述载体是质粒或粘粒。在其他实施方案中，所述载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连接至病毒载体中。在一些实施方案中，所述载体可以在其引入的宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中，所述载体可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。

在一些实施方案中，特定载体，在本文中称为“重组表达载体”或“表达载体”，可以指导与其可操作连接的基因的表达。当多核苷酸序列被置于与另一核苷酸序列的功能关系中时，其被“可操作连接”。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA和/或蛋白的DNA序列可操作连接或定位成使得所述启动子或调节DNA序列影响编码或结构DNA序列的表达水平，则所述启动子或调节DNA序列被称为“可操作连接”至编码RNA和/或蛋白的DNA序列。可操作连接的DNA序列通常但不一定是连续的。

在一些实施方案中，本公开涉及包含核酸分子的载体，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ IDNO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ IDNO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ IDNO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ IDNO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66或其活性片段。

在某些实施方案中，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ IDNO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ IDNO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66或其活性片段。

在某些实施方案中，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ IDNO:25；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59；SEQ IDNO:60；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；和SEQ ID NO:66或其活性片段，且在某些实施方案中，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子编码具有选自以下的氨基酸序列的Chp肽：SEQID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；和SEQ ID NO:54或其活性片段。

通常，适合于在宿主中维持、繁殖或表达多肽的任何系统或载体都可用于表达本文公开的Chp肽或其活性片段。可以通过任何各种众所周知和常规的技术、诸如例如Sambrook等人, 编,

各种各样的宿主/表达载体组合可用于表达编码本文公开的Chp肽或其活性片段的多核苷酸序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，并且是商业可得的。例如在Sambrook等编辑，

此外，所述载体可以提供本公开的Chp肽或其活性片段的组成型或诱导型表达。合适的载体包括但不限于SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如大肠杆菌质粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9和它们的衍生物，质粒、诸如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO；噬菌体DNAS，例如噬菌体A的许多衍生物，例如NM989和其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒、诸如2D质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已经修饰为使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。上述载体中的许多可从供应商、诸如New England Biolabs Inc.、Addgene, Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等商业可得。

另外，载体可以包含各种调节元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件)，其中载体根据宿主细胞而构建。各种各样的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任何一种可用于这些载体中以表达编码本公开的Chp肽或其活性片段的多核苷酸序列。有用的控制序列包括但不限于：SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体A的主要操作子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酯激酶或其他糖分解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母交配因子的启动子、用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他启动子序列，及其各种组合。通常，编码所述Chp肽或其活性片段的多核苷酸序列可操作地连接至异源启动子或调节元件。

在另一个方面，本公开涉及宿主细胞，其包含本文公开的任何载体，包括包含编码本公开的Chp肽或其活性片段的多核苷酸序列的表达载体。各种各样的宿主细胞可用于表达本发明的多肽。适用于表达本发明的多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主，诸如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属的菌株，真菌，诸如酵母，和动物细胞，诸如CHO、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS1、COS7、BSCl、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养物中的人细胞和植物细胞。尽管表达宿主可以是任何已知的表达宿主细胞，但在一个典型的实施方案中，表达宿主是大肠杆菌菌株之一。这些包括但不限于商业可得的大肠杆菌菌株、诸如Top10 (ThermoFisher Scientific,Inc.)、DH5a (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、XLI-Blue (Agilent Technologies,Inc.)、SCSllO (Agilent Technologies, Inc.)、JM109 (Promega, Inc.)、LMG194 (ATCC)和BL21 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)。

使用大肠杆菌作为宿主系统存在几个优点，包括：快速生长动力学，其中在最佳环境条件下，其倍增时间为约20分钟(Sezonov等人,

本发明的Chp肽或其活性片段的有效表达取决于各种因素，诸如最佳表达信号(在转录和翻译水平二者)、正确的蛋白折叠和细胞生长特征。关于用于构建载体的方法和用于将构建的重组载体转导入宿主细胞的方法，可以使用本领域中已知的常规方法。尽管理解并非所有载体、表达控制序列和宿主将同样良好地发挥功能以表达编码本公开的Chp肽或其活性片段的多核苷酸序列，但在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员将能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主，而无需过多实验以完成期望的表达。

通过众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱，可以从重组细胞培养物回收和纯化本公开的Chp肽或其活性片段。高效液相色谱也可用于Chp肽纯化。

或者，用于产生本公开的Chp肽或其活性片段的载体系统可以是无细胞表达系统。各种无细胞表达系统是商业可得的，包括但不限于可得自Promega、LifeTechnologies、Clonetech等的那些。

如上所示，当提到蛋白生产和纯化时，存在许多选择。在蛋白生产和纯化中待考虑的合适方法和策略的实例提供于WO 2017/049233，其通过引用以其整体并入本文，并且进一步提供于Structural Genomics Consortium等人,

药物组合物

本公开的药物组合物可以采取溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、丸粒、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、粉剂、缓释制剂、栓剂、棉条应用乳剂、气溶胶、喷雾剂、悬浮剂、锭剂、含片、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂布剂、定时释放的贴剂、吸收液体的湿巾及其组合的形式。

本公开的组合物或其药学上可接受的形式的施用可以是局部的，即，可以在期望其作用之处直接应用所述药物组合物(例如直接应用至伤口)，或者是全身的。进而，全身施用可以是肠内或口服的(即，所述组合物可以经由消化道给予)，肠胃外(即，所述组合物可以通过除了消化道以外的其他途径、诸如通过注射或吸入给予)。因此，可以将本公开的Chp肽和包含它们的组合物口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、经鼻、经颊、经由植入的储库或通过任何其他已知方法施用于受试者。本公开的Chp肽或其活性片段也可以通过持续释放剂型的方式施用。

对于口服施用，可以将本公开的Chp肽或其活性片段配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末、溶液剂、混悬剂和分散剂。所述组合物可以与赋形剂、诸如例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、明胶、马铃薯淀粉、海藻酸和/或硬脂酸镁一起配制。

为了制备固体组合物、诸如片剂和丸剂，可以将本公开的Chp肽或其活性片段与药物赋形剂混合以形成固体预配制组合物。如果期望，片剂可以通过标准技术被糖包衣或肠溶包衣。片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合以提供赋予延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者呈前者上的包膜的形式。两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。各种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。

本公开的局部组合物可以进一步包含药学上或生理学上可接受的载体，诸如皮肤病学或耳可接受的载体。在皮肤病学可接受的载体的情况下，此类载体可以与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的任何常规使用的皮肤病学载体。在耳可接受的载体的情况下，所述载体可以与耳朵的所有部分相容。本领域普通技术人员可以容易地选择此类载体。用于局部施用本文公开的组合物的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。在配制皮肤软膏剂时，本公开的活性组分可以配制在例如油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油水可移除基质和/或水溶性基质中。在配制耳用组合物时，本公开的活性组分可以配制在例如包括载体的水性聚合悬浮液中，所述载体诸如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、结兰胶、诸如Gelrite®、纤维素聚合物、诸如羟丙基甲基纤维素和含羧基聚合物、诸如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其他聚合缓和剂。根据公开的局部组合物可以呈适合于局部应用的任何形式，包括水性、水性-醇性、或油性溶液，洗剂或精华液分散体，水性、无水或油性凝胶，通过将脂肪相分散于水相(O/W或水包油)或相反(W/O或油包水)中获得的乳液、微乳液或者可替代地微囊、微粒或者离子型和/或非离子型的脂质囊泡分散体，乳膏，洗剂，凝胶剂，泡沫剂(其可以使用加压罐、合适的涂抹器、乳化剂和惰性推进剂)，香精，奶类产品，悬浮剂和贴剂。本公开的局部组合物还可以含有助剂，诸如亲水或亲脂胶凝剂、亲水或亲脂活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、填料、防晒剂、气味吸收剂和染料。在一个进一步方面，本文公开的局部组合物可以与能够粘附至受试者的皮肤或其他组织或以其他方式与受试者的皮肤或其他组织缔合的装置、诸如经皮贴片、敷料、垫、包裹物、基质和绷带结合施用，其能够递送治疗有效量的如本文所公开的一种或多种Chp肽或其活性片段。

在一些实施方案中，本公开的局部组合物另外包含用于治疗局部烧伤的一种或多种组分。此类组分可以包括但不限于丙二醇水凝胶；二醇、纤维素衍生物和水溶性铝盐的组合；防腐剂；抗生素；和皮质类固醇。还可添加湿润剂(诸如固体或液体蜡酯)、吸收促进剂(诸如亲水性粘土、或淀粉)、粘性增加剂(viscocity building agent)和皮肤保护剂。局部制剂可以呈冲洗剂、诸如漱口水的形式。参见例如WO2004/004650。

本公开的组合物还可以通过注射治疗剂来施用，所述治疗剂包括适量的Chp肽或其活性片段和载体。例如，可以肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用所述Chp肽或其活性片段，以治疗革兰氏阴性细菌的感染，诸如由铜绿假单胞菌引起的感染。所述载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合构成。另外，肠胃外注射剂的药物组合物可以包含如本文所公开的Chp肽或其活性片段的药学上可接受的水性或非水性溶液以及以下中的一种或多种：pH缓冲溶液、助剂(例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。

在肠胃外注射是所选择的施用模式的情况下，可以使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液、诸如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可以包括明胶和白蛋白。可以将血管收缩剂添加至所述制剂中。可以提供根据该类型应用的药物制剂，其为无菌且无热原的。

所述稀释剂可以进一步包含一种或多种其他赋形剂，诸如乙醇、丙二醇、油或药学上可接受的乳化剂或表面活性剂。

在另一个实施方案中，本公开的组合物是可吸入组合物。本公开的可吸入组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本公开的Chp肽或其活性片段可以被配制为干燥的可吸入粉末。在具体实施方案中，包含Chp肽或其活性片段的吸入溶液可以进一步与推进剂一起配制以用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以被雾化。

可以将表面活性剂添加至本公开的可吸入药物组合物中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。在所述药物、推进剂和赋形剂形成悬浮液的情况，则可以使用或可以不使用表面活性剂。在所述药物、推进剂和赋形剂形成溶液的情况下，可以使用或可以不使用表面活性剂，这取决于例如特定药物和赋形剂的溶解度。所述表面活性剂可以是与药物不反应并降低所述药物、赋形剂和推进剂之间的表面张力和/或充当阀润滑剂的任何合适的无毒化合物。

合适的表面活性剂的实例包括但不限于：油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯；氯化鲸蜡基吡啶；大豆卵磷脂；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚氧乙烯(10)硬脂基醚；聚氧乙烯(2)油基醚；聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；蓖麻油乙氧基化物；及其组合。

合适的推进剂的实例包括但不限于：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷和二氧化碳。

用于可吸入组合物中的合适的赋形剂的实例包括但不限于：乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯；中链、短链或长链脂肪酸的甘油三酯，或其任何组合；全氟二甲基环丁烷；全氟环丁烷；聚乙二醇；薄荷醇；丙二醇单月桂酸甘油酯(lauroglycol)；二甘醇单乙基醚；中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯；醇；桉树油；短链脂肪酸；及其组合。

在一些实施方案中，本公开的组合物包括鼻应用剂。鼻应用剂包括用于直接使用的应用剂，诸如鼻用喷雾剂、滴鼻剂、鼻用软膏剂、洗鼻液、鼻用注射液、鼻用填充物、支气管喷雾剂和吸入剂，以及用于间接使用的应用剂，诸如咽喉锭剂和漱口水或漱口剂、或通过使用涂敷至鼻孔或面部的软膏，和这些和类似应用方法的任何组合。

在另一个实施方案中，本公开的药物组合物包含补充剂，包括一种或多种抗微生物剂和/或一种或多种常规抗生素。为了加速感染的治疗或加强抗细菌效果，含有本公开的Chp肽或其活性片段的治疗剂可以进一步包括至少一种补充剂，所述补充剂也可以加强该肽的杀细菌活性。所述补充剂可以是一种或多种用于治疗革兰氏阴性细菌的抗生素。在一个实施方案中，所述补充剂是用于治疗由铜绿假单胞菌引起的感染的抗生素或抗微生物剂。

本公开的组合物可以以单位剂型呈现并且可以通过本领域中众所周知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据例如所治疗的宿主、接受者暴露于感染性细菌的持续时间、受试者的体型和重量，和具体施用模式而不同。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量可以例如是产生治疗效果的每种化合物的量。在某些实施方案中，在百分之一百中，活性成分的总量可以范围为约百分之一至约百分之九十九，诸如约百分之五至约百分之七十，或约百分之十至约百分之三十。

剂量和施用

施用的剂量可以取决于许多因素，诸如所治疗的感染的活性；待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况；特定的Chp肽或其活性片段的活性；根据本公开的Chp肽或其活性片段与其配对的抗生素(如果有的话)的性质和活性；以及这种配对的组合效果。在某些实施方案中，待施用的Chp肽或其活性片段的有效量可以落入约1-50 mg/kg (或1至50毫克/ml)的范围内。在某些实施方案中，所述Chp肽或其活性片段可以每天1-4次施用，持续范围为1至14天的时段。如果还使用抗生素，则可以以标准给药方案或鉴于任何协同作用以较低量施用抗生素。然而，所有此类剂量和方案(不论是所述Chp肽或其活性片段还是与其结合施用的任何抗生素)都进行优化。可以通过进行体外和体内试验性效力实验确定最佳剂量，如在本领域的技能之内，但将本公开纳入考虑。

考虑本文公开的Chp肽或其活性片段可以提供快速杀细菌作用，并且当以亚-MIC量使用时，可以提供抑细菌作用。进一步考虑本文公开的Chp肽或其活性片段可以针对一系列的抗生素抗性细菌可以有活性，并且可能与抗性进化无关。基于本公开，在临床环境中，本发明的Chp肽或其活性片段可以是用于单独或与抗生素(包括已对其发展抗性的抗生素)一起治疗由药物抗性和多药抗性细菌引起的感染的有效替代物(或添加剂)。据信革兰氏阴性细菌的现有抗性机制不影响对本发明的Chp肽或其活性片段的裂解活性的敏感性。

在一些实施方案中，暴露于本文公开的Chp肽或其活性片段的时间可以影响每ml的活性肽单位的期望浓度。被分类为“长”或“慢”释放载体(诸如例如某些鼻用喷雾剂或锭剂)的载体可以具有或提供每ml的更低浓度的肽单位，但经历更长时间段，而“短”或“快”释放载体(诸如例如漱口液)可以具有或提供每ml的高浓度肽单位(微克)，但经历更短时间段。存在这样的情况，其中具有更高的单位/ml剂量或更低的单位/ml剂量可以是期望的。

对于本公开的Chp肽或其活性片段，可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中初始地估计治疗有效剂量。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。获得的信息然后可用于确定在人中的有效剂量以及施用途径。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望效果。可以纳入考虑的额外的因素包括疾病状态的严重程度；患者的年龄、重量和性别；饮食；期望的治疗持续时间；施用方法；施用的时间和频率；药物组合；反应灵敏度；对疗法的耐受性/应答；以及治疗医师的判断。

治疗方案可以使得有必要每日(例如，每天一次、两次、三次等)，每隔一天(例如每隔一天一次、两次、三次等)、每半周、每周、每两周一次、一个月一次等施用。在一个实施方案中，治疗可以作为连续输注给予。单位剂量可以在多个时机施用。如通过监测临床症状所示，间隔也可以是不规则的。或者，单位剂量可以作为缓释制剂施用，在这种情况下可以使用较低频率的施用。剂量和频率可以根据患者变化。本领域技术人员将理解，此类指南将根据局部施用，例如鼻内、吸入、直肠等，或全身施用，例如口服、直肠(例如经由灌肠)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)，经尿道等而调整。

方法

本公开的Chp肽及其活性片段可以在体内使用，例如用于治疗受试者中由于革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌导致的细菌感染，以及体外使用，例如用于减少例如，如医疗装置的表面上的细菌污染的水平。

例如，在一些实施方案中，本发明的Chp肽或其活性片段可用于预防、控制、破坏和治疗由革兰氏阴性细菌形成的细菌生物膜。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)的基质中时，生物膜形成发生。微生物在富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白)和营养素的这种受保护环境中的生长允许增强的微生物串扰(cross-talk)和增加的毒力。生物膜可以在任何支持环境(包括活体和非生命体表面、诸如CF肺的粘液栓、污染的导管、隐形眼镜等)中发展(Sharma等人.

在一个方面，本公开涉及治疗由如本文所述的一种或多种额外的革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者施用如本文所述的药物组合物。

术语“感染”和“细菌感染”意在包括呼吸道感染(RTI)，诸如患者中的呼吸道感染，所述患者具有囊性纤维化(CF)，下呼吸道感染，诸如慢性支气管炎的急性恶化(ACEB)，急性鼻窦炎，社区获得性肺炎(CAP)，医院获得性肺炎(HAP)和医院呼吸道感染；性传播疾病，诸如淋球菌性宫颈炎和淋球菌性尿道炎；尿道感染；急性中耳炎；败血症，包括新生儿败血症和导管相关的败血症；和骨髓炎。还考虑由药物抗性细菌和多药抗性细菌引起的感染。

由革兰氏阴性细菌、诸如铜绿假单胞菌引起的感染的非限制性实例可以包括：A)医院感染：1.呼吸道感染，特别是在囊性纤维化患者和机械通气患者中；2.菌血症和败血症；3.伤口感染，尤其是烧伤受害者的那些；4.泌尿道感染；5.侵入性装置上的手术后感染；6.静脉内施用受污染的药物溶液引起的心内膜炎；7.具有获得性免疫缺陷综合征、癌症化疗、类固醇疗法、血液恶性肿瘤、器官移植、肾脏替换疗法和具有严重中性粒细胞减少症的其他病况的患者中的感染。B)社区获得性感染：1.社区获得性呼吸道感染；2.脑膜炎；3.由受污染的水引起的毛囊炎和耳道感染；4.老年人和糖尿病患者中的恶性外耳炎；5.儿童中跟骨的骨髓炎；6.通常与被污染的隐形眼镜相关的眼部感染；7.皮肤感染，诸如手经常暴露于水的人中的指甲感染；8.胃肠道感染；和9.肌肉骨骼系统感染。

本发明的方法的革兰氏阴性细菌的一种或多种物种可以包括如本文所述的革兰氏阴性细菌的任何物种。通常，革兰氏阴性细菌的额外物种选自以下中的一种或多种：鲍氏不动杆菌，溶血不动杆菌，放线共生放线杆菌，嗜水气单胞菌，拟杆菌属物种，诸如，脆弱拟杆菌，多形拟杆菌(

更通常地，革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种选自以下中的一种或多种：鲍氏不动杆菌、百日咳博德特氏菌、洋葱伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西斯氏菌、流感嗜血杆菌、杜氏雷嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、多杀巴斯德氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、霍乱弧菌和/或肺炎衣原体。

甚至更通常地，革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种选自以下中的一种或多种：鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌属物种、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、沙雷氏菌属物种，奇异变形杆菌、摩氏摩根氏菌、普罗维登斯菌属物种、爱德华菌属物种、耶尔森氏菌属物种、流感嗜血杆菌、五日热巴尔通体、布鲁氏菌属物种、百日咳博德特氏菌、伯克霍尔德菌属物种、莫拉克斯氏菌属物种、土拉热弗朗西斯氏菌、嗜肺军团菌、伯纳特氏立克次氏体、拟杆菌属物种、肠杆菌属物种和/或衣原体属物种。

又甚至更通常地，革兰氏阴性细菌的至少一种其他物种选自克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和/或土拉热弗朗西斯氏菌中的一种或多种。

在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌的感染导致局部感染，诸如局部细菌感染，例如皮肤伤口。在其他实施方案中，所述细菌感染是全身性病原性细菌感染。常见的革兰氏阴性病原体和相关的感染列于本公开的表A中。这些意欲充当可以用本发明的Chp肽及其活性片段治疗、减轻或预防的细菌感染的实例，并且无意进行限制。

表A - 医学相关的革兰氏阴性细菌和相关疾病

在一些实施方案中，本公开的Chp肽及其活性片段用于治疗处于由于革兰氏阴性细菌而获得感染的风险中的受试者。处于获得革兰氏阴性细菌感染的风险中的受试者包括，例如，囊性纤维化患者、中性粒细胞减少症患者、具有坏死性小肠结肠炎的患者、烧伤受害者、具有伤口感染的患者，以及更通常，医院环境中的患者，尤其是手术患者和在使用可植入医疗装置(诸如导管，例如中心静脉导管、Hickman装置或电生理心脏装置(例如起搏器和可植入除颤器)进行治疗的患者。处于被革兰氏阴性细菌感染的风险中的其他患者群体包括但不限于具有植入的假体、诸如全关节置换术(例如全膝或髋关节置换术)的患者。

在另一个方面，本公开涉及预防或治疗细菌感染的方法，其包括向诊断为具有细菌感染、处于细菌感染的风险中或表现出细菌感染的症状的受试者共同施用第一有效量的含有有效量的如本文所述的Chp肽或其活性片段的组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性细菌感染的抗生素的组合。

如在本领域的技术之内，本公开的Chp肽及其活性片段可以与标准护理抗生素或与最后手段的抗生素单独或以各种组合共同施用。针对铜绿假单胞菌使用的传统抗生素描述于表B中。用于其他革兰氏阴性细菌、诸如克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌的抗生素与表B中对于铜绿假单胞菌提供的抗生素是类似的。

表B - 用于治疗铜绿假单胞菌的抗生素

在更具体实施方案中，所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。

组合本公开的Chp肽或其活性片段与抗生素提供了有效的抗细菌方案。在一些实施方案中，本公开的Chp肽或其活性片段与一种或多种抗生素的共同施用可以在所述Chp肽或其活性片段或抗生素中的任一或两者的降低的剂量和量、和/或降低的频率和/或治疗持续时间下实施，具有加强的杀细菌和抑细菌活性、降低的抗生素抗性风险，并具有降低的有害的神经或肾脏副作用(诸如与粘菌素或多粘菌素B使用有关的那些)的风险。先前的研究已经显示，粘菌素的总累积剂量与肾脏损害有关，表明使用与Chp肽或其活性片段的组合疗法的剂量的减少或治疗持续时间的缩短可以降低肾毒性的发生率(Spapen等人，

在一些实施方案中，本公开提供了通过向受试者施用本文公开的Chp肽或其活性片段连同目标抗生素，与单独使用的一种或多种抗生素的活性相比，加强所述抗生素针对革兰氏阴性细菌的抗生素活性的方法。该组合针对细菌是有效的并允许克服针对该抗生素的抗性和/或以较低剂量使用该抗生素，减少不期望的副作用，诸如多粘菌素B的肾毒性和神经毒性作用。

任选地与本公开的抗生素组合的所述Chp肽或其活性片段可以进一步与革兰氏阴性细菌的外膜的额外透化剂组合，所述透化剂包括但不限于金属螯合剂，诸如例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸(Vaara M.

在又另一个方面，本公开涉及抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种的方法，所述方法包括使所述细菌与含有有效量的如本文所述的Chp肽或其活性片段的组合物接触，其中所述Chp肽或其活性片段抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种。

在一些实施方案中，抑制革兰氏阴性细菌的至少一种物种的生长，或减少革兰氏阴性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阴性细菌的至少一种物种包括使细菌与如本文所述的Chp肽或活性片段接触，其中所述细菌存在于例如医疗装置、医院和其他健康相关或公共使用建筑中的地板、楼梯、墙壁和工作台面的表面以及手术室、急诊室、病房、诊所和浴室等中的设备的表面上。

可使用本文所述的Chp肽或其活性片段保护的医疗装置的实例包括但不限于管道和其他表面医疗装置，诸如导尿管、粘液提取导管、抽吸导管、脐带插管、隐形眼镜、子宫内装置、阴道内和肠内装置、气管内管、支气管镜、牙齿假体和牙齿矫正装置、手术器械、牙科器械、管道、牙科用水线、织物、纸张、指示条(例如纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如水凝胶粘合剂、热融粘合剂或基于溶剂的粘合剂)、绷带、组织敷料或愈合装置和闭塞贴片，以及医疗领域中使用的任何其他表面装置。装置可以包括各种类型的电极、外部假体、固定带、压迫绷带和监视器。医疗装置还可以包括可以放置在插入或植入部位处的任何装置，所述部位诸如插入或植入部位附近的皮肤，并且其可以包括易感于革兰氏阴性细菌的定殖的至少一个表面。

实施例

材料和方法

细菌菌株和生长条件. 本文公开的大多数研究使用在纽约特种外科医院(theHospital for Special Surgery in New York)从人血液获得的碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌临床分离株CFS-1292(由病理学和实验室医学教授Lars Westblade博士提供)进行，但也可以使用市售的抗生素抗性分离株。所有其他分离株都获得自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，d'Herelle保藏中心(HER)，BEI Resources (“HM”)或纽约特种外科医院(“HSS”)。将分离株，在溶原性培养液(LB; Sigma-Aldrich)、酪蛋白氨基酸(CAA)培养基(5g/L酪蛋白氨基酸, Ameresco/VWR; 5.2 mM K

生物信息学研究. 在所有微小噬菌体科和光滑噬菌体科基因组的注释的GenBank数据库条目中识别所有蛋白。每种Chp组肽的登录号示于下表1和2中。使用UniProt服务器(在uniprot.org/blast/可得)进行Blastp分析。蛋白二级结构预测使用在www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index可得的JPRED4和在www.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/可得的I-Tasser进行。系统发生分析使用在www.genome.jp/tools-bin/clustalw可得的ClustalW Multiple Sequence Alignment工具进行。预测的分子量和等电点使用在web.expasy.org/compute_pi/可得的ExPASyResource Portal确定。

最小生物膜根除浓度(MBEC)的测定. MBEC值使用修改的培养液微量稀释MIC方法的变式(Ceri H等人, 1999. J Clin Microbiol 37:1771-1776; 和Schuch R等人, 2017.Antimicrob Agents Chemother 61)进行测定。将铜绿假单胞菌菌株ATCC 17647的新鲜菌落悬浮于PBS (0.5 McFarland单位)中，在含有0.2%葡萄糖的LB中以1:100稀释，作为0.15ml等分试样添加至96-孔Calgary Biofilm Device (Innovotech)的每个孔中，并在37℃下孵育24小时，用于在聚碳酸酯塞上形成生物膜。将生物膜洗涤并用每种肽在TSBg中的2-倍稀释系列在37℃下处理16小时。处理后，将孔洗涤，在37℃下风干，用0.05%结晶紫染色10分钟，并在33%乙酸中脱色。测定提取的结晶紫的OD

棋盘测定. 棋盘测定基于通过培养液微量稀释法测定MIC的CLSI方法的修改版(CLSI 2015; 和Moody J. 2010. Synergy testing: broth microdilutioncheckerboard and broth macrodilution methods, p 5.12.11-15.12.23. Garcia LS(编), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol 2)。通过首先准备96-孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘，其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在单独的板中，制备可比较的行，其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释2倍的肽。然后将肽和抗生素稀释液合并，使得每列具有恒定量的抗生素和革兰氏阴性溶素的两倍稀释液，而每行具有恒定量的革兰氏阴性溶素和抗生素的两倍稀释液。因此，每个孔具有肽和抗生素的独特组合。将细菌以1 x 105 CFU/mL的浓度添加至每个孔中的具有2.5%人血清的CAA中。然后在环境空气中在37℃下16小时后，记录单独和组合的每种药剂的MIC。计算每种药物的总和分数抑制浓度指数(FICI)，并使用最小FICI来确定协同作用。FICI计算如下：FICI = FICA + FIC B，其中FIC A是组合中的每种抗生素的MIC/单独的每种抗生素的MIC，且FIC B是组合中的每种革兰氏阴性溶素的MIC/单独的每种革兰氏阴性溶素的MIC。当FICI为≤0.5时，该组合被认为是协同的；当FICI>0.5至<1时，该组合被认为是强烈累加的；当FICI为1-<2时，该组合被认为是累加的；并且当FICI为≥2时，该组合被认为是拮抗的。在CAA/HuS中使用铜绿假单胞菌菌株CFS-1292用Chp2或Chp4对一系列的11种不同的抗生素(包括阿米卡星、阿奇霉素、氨曲南、环丙沙星、粘菌素、磷霉素、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林、利福平和妥布霉素)的组合进行棋盘测定。对于大多数组合，观察到≤0.5的FICI值，表明Chp2和Chp4与广泛范围的抗生素协同作用的能力(参见下表8)。这些发现表明，在抗生素存在的情况下，Chp肽可以提供有效的抗细菌活性。

革兰氏阴性溶素溶血活性的测定. 溶血活性被测量为通过人红细胞的裂解释放的血红蛋白的量(Lv Y等人, 2014. PLoS One 9:e86364)。简而言之，将含有肝素的聚碳酸酯管中的3 ml获得自合并的健康供体的新鲜人血细胞(hRBC)(BioreclamationIVT)在4℃下以1,000×g离心5 min。将获得的红细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.2)洗涤3次，并且重悬浮于30 ml PBS中。将50 µl体积的红细胞溶液与50 µl的2倍稀释范围(从128 μg/mL至0.25 μg/mL)的每种革兰氏阴性溶素(在PBS中)在37℃下孵育1 h。通过在4℃下以1,000x g离心5min来沉淀完整的红细胞，并将上清液转移至新的96-孔板。通过测量570nm的光密度(OD)下的吸光度来监测血红蛋白的释放。将最小溶血浓度测定为表现出视觉裂解的最低肽浓度(其对应于导致OD值≥5%的未处理对照样品的最小浓度)。使用额外的对照，包括如上所述用0.1% Triton X-100或具有已知溶血活性的一系列抗微生物肽(包括RR12、RR12极性和RR12疏水性(Mohanram H. 等人, 2016. Biopolymers 106:345-356))或具有很少或不具有溶血活性的抗微生物肽(包括RI18 (Lyu Y. 等人, 2016. Sci Rep 6:27258)和RR22)中的每种处理的PBS中的hRBC。

革兰氏阴性溶素活性的时间-杀死测定. 将铜绿假单胞菌菌株CFS-1292的过夜培养物1:00稀释至具有2.5%人血清的新鲜CAA培养基(CAA/HuS)中，并在37℃下在搅拌的情况下生长2.5小时。然后将指数相细菌1:100稀释至CAA/HuS中，并以1或10 μg/mL的最终浓度添加肽。包括不添加肽的对照培养物(即，缓冲液对照)。将培养物在37℃下在通气的情况下孵育，并且在1小时、3小时和24小时时间点，移取样品，用于定量铺板在CAA琼脂板上。

显微镜检查. 在LB中生长2.5小时的铜绿假单胞菌菌株CFS-1292的等分试样用PBS洗涤并重悬浮于PBS或100%人血清中，并在室温下用和不用肽Chp2以10 μg/mL的最终浓度处理15分钟。根据制造商的方案，使用活/死细胞活力试剂盒(ThermoFisher)对样品子集进行染色，并通过微分干涉反差(DIC)显微镜和荧光显微镜进行检查。

实施例1：Chp肽的鉴定

已知某些描述不清的特异性感染并杀死革兰氏阴性细菌衣原体的细菌噬菌体(衣原体微小噬菌体科)的知识，研究这些生物体的公开基因组，最初查看以鉴定新型溶素，尽管既没有观察到溶素样序列，也没有观察到与先前描述的amurin类似的任何序列。衣原体不像其他细菌那样充分地在其结构中利用肽聚糖(溶素的已知靶标)，但衣原体范围通常仅在分裂期间使用肽聚糖。因此，提出了衣原体噬菌体的靶标是什么的问题。据推测，衣原体噬菌体侵袭其靶标的机制可能与先前已知的机制不同，并且它们的靶标可能不同，并且聚焦于脂多糖(LPS)(革兰氏阴性细菌的外膜的主要成分)以及通过溶素的渗透外膜的障碍。

研究公开的衣原体微小噬菌体的基因组，以鉴定同线基因座，即，一组遗传相关的噬菌体的基因组中相同位置的相似基因，其提示相同的功能。鉴定小的高度阳离子肽，其分子电荷概况与先前鉴定的抗微生物肽(AMP)非常相似。尽管衣原体噬菌体序列与AMP、溶素或已知的amurin蛋白(诸如蛋白A2、蛋白E等)没有蛋白序列相似性，但总体正电荷是突出的特征。使用上述生物信息技术(JPRED和iTASSAR)，进行结构预测，其揭示α螺旋(许多AMP的标志性特征)的存在。α螺旋、总体电荷、衣原体之间的保守性以及相关的革兰氏阴性细菌噬菌体基因组都表明这些蛋白可能代表先前未表征的噬菌体裂解多肽的家族，并且它们可能定义先前未描述的噬菌体裂解机制。预测它们的尺寸小且可溶(基于其电荷概况)的事实也意味着，一旦合成，它们可能通过将它们简单地添加至易感细菌培养物而容易地适合测试。

基于前述，从GenBank数据库中的微小噬菌体科基因组且特别是从衣原体微小噬菌体基因组(以及下文描述的一些其他病毒)中提取同线基因座内的12个保守序列。12个保守序列仅被注释为假设的、未表征的或非结构蛋白，并且编码预计采用α-螺旋结构的小(推定地)阳离子蛋白。这12个序列在表1中列出。表1中的肽之一，Chp5通过用带负电荷的氨基酸残基替换带正电荷的精氨酸和赖氨酸而被合成为具有不同于Chp4的分子电荷。Chp5被预测为无活性的。尽管这些肽表现出与其他裂解蛋白或抗微生物蛋白没有序列相似性，但预计它们采用类似于抗微生物剂AMP的大家族的子集的α-螺旋结构(例如，参见图1)。据推测，Chp肽对其来源的噬菌体行使宿主裂解功能。

基于前述考虑，感染革兰氏阴性细菌的其他噬菌体(相同的微小噬菌体科中，与衣原体微小噬菌体相关)的基因组以及呈现相同的同线和电荷概况的其他未表征来源的进一步研究，得到表2中列出的14种额外肽。所有39种肽(不包括Chp5)一起形成新型噬菌体裂解剂的相关家族。它们全部来自微小噬菌体科来源。

因此，所有Chp家族成员的完整列表(包括每种肽的某些特征)提供于表1和表2中。该组中包括肽Chp1-4和6-12和CPAR39，其源自11种不同的衣原体微小噬菌体且描述于表1中；肽Chp2和Chp3是来自两种不同噬菌体的两种相同的肽。如上所述，Chp5是Chp4的修饰衍生物，其通过用带负电荷的氨基酸(包括谷氨酰胺和谷氨酸)替换所有带正电荷的氨基酸(包括精氨酸和赖氨酸)而生成。通过与衣原体微小噬菌体蛋白的同源性鉴定Chp家族的额外27个成员，并且描述于表2中(“额外的Chp家族成员”)。27个额外Chp家族成员不是来自衣原体微小噬菌体来源，而是来自推定的微小噬菌体科噬菌体来源。

表1 –衣原体噬菌体(Chp)来源的裂解剂

表2 – 额外的Chp家族成员

关于几种Chp家族成员的蛋白序列同源性的额外信息提供于表3中。Chp1、Bdp1、Lvp1和Lvp2是仅有的在GenBank注释中指示预测活性的Chp家族成员。Chp1 (GenBank序列NP_044319.1)被注释为DNA结合蛋白，尽管没有提供数据支持这一点，并且该注释与宿主裂解中的假定作用不一致。总体而言，所述Chp蛋白与彼此具有39-100%同一性，并且与蛋白序列数据库中的其他肽不是同源的。在图2A和2B分别指示显示Chp家族的某些成员的有根和无根系统发生树。

表3 –Chp家族蛋白的注释和相似性

实施例2：Chp肽的合成

所有Chp肽都在有偿服务基础上由GenScript, NJ, USA合成，其具有加帽[N-末端乙酰化(Ac)和C-末端酰胺化(NH

实施例3：Chp肽的活性 – 针对革兰氏阴性细菌的最小抑制浓度(MIC)

合成39种Chp肽(不包括Chp3，其具有与Chp2相同的肽序列)并以抗微生物敏感性测试(AST)形式进行检查。首先，在补充有2.5%人血清的CAA培养基中测定针对碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌临床分离株CFS-1292的MIC值(表4)。几种肽，包括Chp1、Chp2、Chp4、Chp6、CPAR39(具有二硫苏糖醇(DTT))、Chp7、Chp8、Chp10、Chp11、Ecp1、Ecp2、Osp1、Spi1、Gkh3、Unp2、Unp5、Unp6、Ecp3、Ecp4、Lvp1、ALCES1、AVQ206、CDL907、AGT915和SBR77表现出范围为0.25-4 µg/mL的优异的MIC值。肽Chp5、CPAR39(没有DTT)、Gkh1、Unp1、Spi2和Bdp1仅有不佳的活性，并且表现出≥32µg/mL的MIC值。CPAR39在该组中是独特的，因为其含有内部半胱氨酸残基，并且对于活性需要存在0.5 mM DTT。Chp5被设计为Chp4的衍生物，其中所有带正电荷的残基都变为负电荷；基于阳离子AMP的研究预测，对于抗微生物活性需要阳离子残基，并且用阴离子残基除去阳离子残基将消除活性。因此，Chp5 (MIC>64 µg/mL)是Chp4 (MIC=0.5 µg/mL)的无活性变体。CPAR39 (没有DTT)和Chp5两者均用作阴性对照。

表4

使用肽Chp1、Chp2、Chp4、CPAR39(没有DTT)、Chp6、Ecp1和Ecp2针对一系列的革兰氏阴性生物体(包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍氏不动杆菌，其包括某些主要的ESKAPE病原体)进行额外的MIC测试(表5)。由于靶标生物体对人血清的存在的敏感性不同，在未补充有2.5%人血清的CAA(含有生理盐浓度)中进行测试。对于Chp2、Chp4、Chp6、Ecp1和Ecp2，针对测试的所有菌株，观察到1-4 µg/mL的优异MIC值，表明本发明的Chp肽在生理盐浓度范围的背景下的广谱活性。另外针对鼠伤寒沙门氏菌测试Chp2和Ecp1，并且表明其具有2 µg/mL的MIC值。

还测定对于Chp2和Chp4两者的MIC值，并且与来自文献的一系列的AMP (包括先天免疫效应子及其衍生物)在补充有50%人血浆或人血清的Mueller-Hinton培养液中针对实验室铜绿假单胞菌PAO1的MIC值进行比较(表6)。此处，使用PAO1(实验室分离株)使得能够在升高浓度的血清或血浆存在的情况下进行测试；PAO1，与大多数临床分离株不同，对人血液基质的抗细菌活性不敏感。在表6中，Chp2和Chp4的MIC值为2 µg/mL；相比之下，只有RI18和protegrin有类似活性(MIC = 1-4 µg/mL)，并且测试的18种额外肽或者无活性，或者活性不佳。

实施例4：Chp肽的活性-革兰氏阴性细菌的生物膜的根除

为了评估抗生物膜活性，在补充有2%葡萄糖的胰蛋白酶大豆培养液培养基中，对于肽Chp2和Chp4测定针对由铜绿假单胞菌ATCC 17647形成的成熟生物膜的MBEC(最小生物膜根除浓度)值。对于Chp2和Chp4两者观察到0.25 µg/mL的MBEC值(表7)，这与根除成熟生物膜的有效能力一致。相比之下，观察到RI18 (一种高活性AMP(15))的活性显著更低，为4 µg/mL，而观察到T4溶菌酶(一种活性不佳的溶素)的活性为>64 µg/mL。

表7

实施例5：Chp肽和抗生素的组合

为了评估Chp2或Chp4和一系列的11种抗生素之间的协同作用，在补充有2.5%人血清的CAA培养基中，使用铜绿假单胞菌菌株CFS-1292以标准棋盘测定形式测试Chp2与11种抗生素的每种组合以及Chp4与11种抗生素的每种组合。在棋盘测定中，计算分数抑制浓度指数(FICI)值。FICI值≤0.5与协同作用一致，值>0.5-1与强烈累加活性一致，1-2的值与累加活性一致，且>2的值被认为是拮抗作用。如下表8中所示，对于Chp2和Chp4两者，该值与Chp肽和抗生素之间的协同相互作用(即，≤0.5)或强烈累加相互作用(即，＞0.5-1)一致。

表8

实施例6：Chp肽的溶血活性的评价

适合用于治疗侵入性感染的抗微生物肽应当显示针对红细胞的低毒性(Oddo A.等人,2017. Methods Mol Biol 1548:427-435)。为了检查溶血活性的潜力，基于针对人红血细胞测定最小溶血浓度(MHC)，使用常用的方法(在上述材料和方法中描述)用于测量AMP裂解红血细胞的能力。对于测试的37种Chp肽中的33种，没有观察到溶血的证据，其中MHC值为>128 µg/mL(表9)。在2%的起始浓度下测试Triton X100对照，并且观察到MHC为0.007%。相比之下，观察到四种具有已知溶血活性的AMP，包括RI18、R12、RR12p和RR12h，其中MHC值范围为4-128 µg/mL。Triton X-100，一种通常在溶血测定中用作阳性对照的膜裂解去垢剂，在2%至0.007%的浓度范围内是溶血的。这些发现表明Chp肽不具有通常对于AMP观察到的体外毒性(即溶血活性)。对于表1和2的剩余Chp肽预期该特性，这不仅基于百分比序列同一性、3D结构相似性和电荷概况，而且还基于目前的肽作为裂解剂最有可能对于革兰氏阴性细胞包膜是非常高度特异性的预期。

表9：针对人红血细胞测定的最小溶血浓度(MHC)值

实施例7：针对革兰氏阴性细菌的裂解活性的持续时间

如材料和方法中所述，使用具有2.5%人血清的CAA，以时间-杀死形式检查Chp2和Chp4针对铜绿假单胞菌菌株CFS-1292的活性。在所有情况下，评价用1 µg/mL和10 µg/mL浓度的Chp2或Chp4处理后1、3和24小时的细菌活力，导致多个对数倍的下降，与有效杀细菌活性一致(表10)。表10列出在补充有2.5%人血清的CAA中处理后，对于铜绿假单胞菌菌株CFS-1292使用时间-杀死形式测定的菌落形成单位的对数减少(与未处理的对照相比)。

另外，在孵育如以上实施例2中所述制备的肽后，进行稳定性评价以检测MIC的倍数变化。在100%人血清中在37℃下孵育10分钟、1小时和2小时后，评价稳定性。结果显示于下表11中。

如表11中所示，Chp1、Chp2、CPAR39、Chp4、Chp5、Chp6、Chp7、Chp8、Chp9、Chp10、Chp11、Chp12、Gkh1、Gkh2、Gkh3、Ecp1、Ecp2、Ecp3、Ecp4、Osp1、Unp1、Unp2、Unp3、Unp5、Unp6、Spi1、Spi2、Bdp1、Lvp1、Lvp2、ALCES1、AVQ206、AVQ244、CDL907、AGT915、HH3930、Fen7875和SBR77在10分钟、1小时和2小时后都足够稳定。