用于选择性靶向活化的致病性T细胞和NK细胞的自体/同种异体免疫防御受体

本申请要求于2018年4月26日提交的美国临时专利申请62/662,817的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)和美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)给予的P50 CA126752的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开的实施方案包括至少免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。

背景技术

在接受移植物或第三方来源的治疗性细胞的患者中，T细胞和NK细胞的不需要的激活通常会促进威胁生命的同种异体免疫反应，导致对移植器官/组织的排斥或移植物抗宿主疾病(GvHD)的发展。同样，自身反应性T细胞的不需要的激活可导致破坏性的自身免疫病况，例如糖尿病、自身免疫性结肠炎和多发性硬化症。目前，由于无法选择性清除致病性T细胞，这些疾病中的大多数无法被治愈。取而代之的是，通常用免疫抑制药物治疗患者，这使得他们成为免疫缺陷性的，并因此容易感染和恶变。

本公开通过增强转移的细胞控制由于免疫系统的不需要的激活而造成的致病性病况的能力，提供了针对安全和有效的组织移植和过继性细胞转移领域中长期需求的解决方案，包括利用常备的细胞(off-the-shelf cell)。

发明内容

本公开涉及与用于过继转移以控制由于免疫活化而引起的致病性病况的细胞有关的组合物和方法。所述组合物和方法适用于自体和同种异体细胞。尽管可以采取一些措施来降低接受者个体中同种异体细胞的反应性，但是这样的细胞仍会被接受者的免疫系统(主要是T细胞和NK细胞)所靶向，这会将它们识别为外源物，导致排斥反应并限制治疗效果。

本公开通过修饰过继治疗细胞以靶向活化的致病性T、NK-T和NK细胞以预防或治疗与其存在相关的医学病况而克服了该问题。在特定的实施方案中，所述组合物和方法利用过继性T细胞转移表达选择性靶向致病性T细胞而留下静息T细胞的受体的细胞。在具体的实施方案中，用于转移的过继T细胞被工程化改造以表达靶向致病性T细胞的嵌合分子，所述致病性T细胞表达某些靶分子，所述靶分子在T细胞上的存在指示致病性T细胞。在特定的实施方案中，本公开涉及用于选择性靶向致病性T细胞的自体/同种异体免疫防御受体(ADR)。

本公开的特定实施方案包括通过向个体提供装备有ADR的细胞来保护工程化改造的同种异体T细胞使其免于在宿主个体中被清除的方法。实施方案还包括例如避免在接受组织或器官移植的个体中的同种异体免疫反应的方法。

在特定实施方案中，本公开涵盖的细胞已被修饰或可以被修饰以允许它们在接受者(包括同种异体接受者)中存活。在特定情况下，用于过继性细胞疗法的细胞(包括T细胞，NKT细胞等)适合于“常备”使用，在本文中是指细胞保存在储存库(repository)或储库(bank)中，可以被提供(有或没有进一步的修饰)给有需要的个体用于特定目的。在许多情况下，所述个体不是所述细胞原始来源的个体。以这种方式使用的细胞可以被预先制备以表达ADR，尽管在某些情况下，这些细胞是从储库中获得的，然后经过修饰以表达ADR。储库保存的细胞可以还表达或可以不表达CAR或重组TCR，或者从储库中获得的细胞可以随后被修饰以表达CAR或重组TCR。这样的实践使得易于使用第三方来源的治疗性细胞，而不会被宿主免疫排斥，并且不必每次需要时都制备患者特异性产物。

在特定的实施方案中，存在分离的多核苷酸，其包含编码以下的序列：(1)OX40特异性配体、4-1BB特异性配体、CD40L特异性配体或其功能性衍生物中的一种或多种；其操作性地连接至(2)促进T细胞活化的信号传导结构域。所述多核苷酸可包含OX40特异性配体、4-1BB特异性配体或CD40L特异性配体。所述OX40特异性配体可以是OX40L、靶向OX40的抗体、OX40L-Fc融合体或其组合，或者是任何其他能够特异性结合至OX40的工程化改造的蛋白。所述4-1BB特异性配体可以是4-1BBL、靶向4-1BB的抗体、4-1BBL-Fc融合体或其组合，或者是任何其他能够特异性结合至4-1BB的工程化改造的蛋白。所述CD40L特异性配体可以是CD40、靶向CD40L的抗体、CD40-Fc融合体或任何其他能够特异性结合至CD40L的工程化改造的蛋白或其组合。在至少某些情况下，所述多核苷酸还包含编码位于(1)和(2)之间的间隔子(例如长度在10至220个氨基酸之间)的序列。所述间隔子可具有促进用抗体进行表面检测的序列，例如所述间隔子可被抗Fc抗体检测。所述间隔子可包含IgG Fc部分。

在特定的实施方案中，本发明的多核苷酸可以进一步编码嵌合抗原受体、T细胞受体或两者。所述多核苷酸可以是任何形式，包括存在于载体上，例如病毒载体(逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体(质粒、转座子等)。在特定情况下，所述多核苷酸存在于细胞中，包括真核细胞或细菌细胞。所述细胞可以是免疫细胞，例如T细胞。所述细胞可以被工程化改造。所述细胞可包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)和/或一种或多种工程化改造的T细胞受体(TCR)。

由本公开涵盖的任何多核苷酸表达的多肽被包括作为本公开的一部分。在特定的实施方案中，存在多肽，其包含：(1)OX40特异性配体、4-1BB特异性配体和CD40的一种或多种；其操作性地连接至(2)促进T细胞活化的信号传导结构域。促进T细胞活化的信号传导结构域可以来自CD3ζ亚基、DAP12、Fc受体或其组合。

本公开涵盖的任何细胞是本公开的一部分。在特定的实施方案中，任何表达嵌合受体的细胞是本公开的一部分，包括细胞，其包含本文考虑的任何多核苷酸和/或本文考虑的任何多肽。所述细胞可以是工程化改造的细胞。所述细胞可以是免疫细胞，例如T细胞，包括CAR转导的T细胞和/或T细胞受体(TCR)转导的T细胞。在特定的实施方案中，所述细胞被工程化改造以缺乏一种或多种基因的内源表达，例如缺乏4-1BB、OX40和/或CD40L中的一种或多种。可以使用CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、TALE核酸酶或大范围核酸酶(meganuclease)对细胞进行工程化改造。备选地，可以通过例如用锚定在内质网或另一胞内区室中的特异性抗体或受体捕获ADR配体来工程化改造细胞以阻止ADR配体的表面表达。

在一个实施方案中，存在避免个体中对同种异体细胞、组织或器官排斥的方法，其包括将有效量的表达工程化改造的嵌合受体的同种异体免疫细胞递送给所述个体的步骤，所述工程化改造的嵌合受体包含胞外结构域并包含CD3ζ，所述胞外结构域靶向选择性存在于活化的T细胞上的化合物，其中所述递送步骤在所述个体中导致以下结果：(1)在所述个体中抑制内源性同种异体反应性T细胞；和/或(2)在所述个体中阻遏NK细胞活化。在特定的实施方案中，所述同种异体细胞是表达所述嵌合受体的同种异体免疫细胞。所述同种异体细胞可表达嵌合抗原受体和/或工程化改造的T细胞受体。所述同种异体免疫细胞可在所述个体中组织和/或器官移植之前、期间和/或之后被递送至所述个体。在特定情况下，所述活化的T细胞是致病性T细胞。

在一个实施方案中，存在选择性地靶向个体中活化的T细胞的方法，其包括向所述个体提供有效量的表达工程化改造的嵌合受体的细胞的步骤，所述嵌合受体包含：(1)靶向选择性存在于活化的T细胞上的化合物的胞外结构域；和(2)促进T细胞活化的信号传导结构域。所述促进T细胞活化的信号传导结构域可以衍生自CD3ζ亚基、DAP12、Fc受体、任何包含ITAM的序列或其组合。在特定情况下，所述活化的T细胞是致病性T细胞。

在某实施方案中，存在预防或治疗与个体中活化的T细胞有关的医学病况的方法，其包括将有效量的表达工程化改造的嵌合受体的免疫细胞递送给所述个体的步骤，所述工程化改造的嵌合受体选择性地靶向所述活化的T细胞，所述嵌合受体包含：(1)靶向选择性地存在于活化的T细胞上的化合物的胞外结构域；和(2)促进T细胞活化的信号传导结构域。所述医学病况可以是自身免疫病症，比如移植排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性结肠炎或其组合。

在一个实施方案中，存在避免个体中NK细胞介导的宿主排斥同种异体T细胞、组织或器官的方法，其包括向所述个体提供有效量的表达工程化改造的嵌合受体的免疫细胞的步骤，所述工程化改造的嵌合受体包含胞外结构域，并且还包含促进T细胞活化的信号传导结构域，所述胞外结构域靶向选择性存在于活化的T细胞上的化合物。在某些情况下，表达所述工程化改造的嵌合受体的所述免疫细胞是同种异体T细胞。所述免疫细胞可表达嵌合抗原受体和/或工程化改造的T细胞受体。提供给所述个体的表达所述工程化改造的嵌合受体的免疫细胞的量在每平方米10

前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解以下对本发明的详细描述。在下文中将描述构成本发明权利要求书的主题的本发明的附加特征和优点。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和特定实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本设计相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应当认识到，这种等效构造不脱离所附权利要求书中所阐述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述中将更好地理解被认为是本文公开的设计的特征的新颖特征，关于其组织和操作方法，以及进一步的目的和优点。但是，应该清楚地理解，提供每个附图仅是出于说明和描述的目的，而不旨在作为对本公开的限制的定义。

附图说明

为了更完整地理解本公开，现在结合附图给出以下描述作为参考，其中：

图1A-1E。ADR可以在免疫细胞的细胞表面表达，并促进针对相应靶标的细胞毒性。(图1A)ADR的示意图。GFP是可选的。(图1B)ADR在细胞表面的表达。(图1C)转导后ADR T细胞的扩增。(图1D)ADR T细胞对表达ADR配体的靶细胞的细胞毒性。(图1E)表达4-1BB ADR的野生型与4-1BB KO T细胞的扩增及其对4-1BB+靶标的细胞毒性，表明敲除T细胞上的ADR配体可以进一步增强扩增和细胞毒性，并证明ADR-T细胞的扩增或功能不需要ADR及其配体在T细胞上的共表达。

图2A-2E。ADR配体在活化的T细胞上的选择性表达使其能够被ADR T细胞选择性清除。(图2A-图2C)TCR刺激后，ADR配体在静息的T细胞与活化的T细胞上的表达。(图2D)ADR T细胞对静息的CD4+和CD8+T细胞无细胞毒性。(图2E)共培养48h后，ADR T细胞清除了活化的CD4+和CD8+T细胞。

图3A-3F。在MLR模型中4-1BB ADR的表达保护T细胞免受免疫排斥。(图3A)代表性点图，显示将共表达ADR的TCRKO T细胞与同种异体PBMC以1:10ADR T:PBMC的比例共培养后，共表达ADR的TCRKO T细胞免受免疫排斥。(图3B-图3C)共培养期间PBMC中供体T细胞和同种异体T细胞的绝对计数对于(图3D-图3F)病毒特异性的ADR T细胞是相同的。

图4A-4C。在体外混合淋巴细胞反应中，ADR的表达保护同种异体病毒特异性T细胞免遭免疫排斥。(图4A)代表性点图，显示ADR VST被保护免受接受者同种异体PBMC的免疫排斥。(图4B-图4C)在MLR期间各个时间点的接受者T细胞和供体VST的绝对计数。

图5。ADR VST保留抗病毒功能。ADR VST与病毒肽混合物脉冲的(pepmix-pulsed)单核细胞共培养，单核细胞计数表明，与未修饰的VST相比，它们同等良好地清除病毒感染的细胞。

图6A-6H。活化的NK细胞上调ADR配体，并可被ADR T细胞选择性靶向。(图6A-图6B)4-1BB在静息的与活化的NK细胞上的表达。(图6C)与4-1BB ADR T细胞共培养24小时后，静息的与活化的NK细胞的残留计数。(图6D)通过控制NK细胞的扩增，缺乏MHC的ADR T细胞被保护免受同种异体PBMC的免疫排斥。(图6E)在共培养期间供体T细胞和同种异体NK细胞的绝对计数。(图6F)在以1：1的E：T比例共培养48小时后，缺乏MHC的ADR T细胞抵抗NK细胞的免疫排斥。(图6G-图6H)在使用PBMC进行的MLR期间，ADR T细胞控制同种异体反应性NK细胞的扩增，NK细胞的绝对计数绘制在H中。

图7A-7E。在体内ADR表达保护同种异体T细胞免受免疫排斥。(图7A)免疫排斥的小鼠模型示意图，其中在亚致死性辐照后给予小鼠来自HLA-A2+供体的T细胞，然后4天后施用同种异体HLA-A2-T细胞。(图7B-7C)来自HLA-A2-供体的对照T细胞在第18天被排斥，而表达ADR的细胞被保护；(图7C)来自HLA-A2+和HLA-A2-供体的T细胞在各个时间点的绝对计数。(图7D)修饰的体内模型，其中不同于同种异体T细胞，小鼠接受来自供体1的全PBMC(包含T细胞和NK细胞二者)。(图7E)代表性流式图，显示ADR T细胞被保护免受免疫排斥，并保护小鼠免受致命性GvHD的快速发作。

图8A-8E。CAR和ADR的共表达保留了两种受体的功能。(图8A)共表达ADR和CAR的免疫细胞的示意图。(图8B)CAR和ADR在细胞表面上的共表达。(图8C)CAR-ADR T细胞对NALM-6(CD19+CAR靶标)的细胞毒性。(图8D)CAR-ADR T细胞对活化的T细胞(ADR靶标)的细胞毒性。(图8E)同时与两种细胞靶标共培养后，CAR-ADR T细胞对两种靶标的细胞毒性活性。

图9A-9E。CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥并发挥有效的抗肿瘤活性。(图9A)小鼠模型示意图。小鼠接受来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKO NALM6，然后接受来自供体2的单剂量CAR-ADR T细胞。(图9B)外周血中来自供体2的T细胞的动力学。(图9C)实验组中供体1T细胞的动力学。(图9D)小鼠中白血病负荷。(图9E)小鼠的整体存活率。

图10A-10C。CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥，并在实体瘤模型中发挥有效的抗肿瘤活性。(图10A)小鼠模型的示意图。小鼠接受来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKO神经母细胞瘤细胞系CHLA255，然后接受来自供体2的单剂量CAR-ADR T细胞。(图10B)供体2GD2 CAR T细胞在第18天被排斥，而CAR-ADR T细胞抵抗同种异体排斥并在外周血中持续存在。(图10C)小鼠中的肿瘤负荷，*指示在ATC+GD2 CAR T组中异种-GvHD相关的死亡。

图11A-11E。TCR敲除的CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥并发挥有效的抗肿瘤活性。(图11A)小鼠模型示意图。小鼠接受来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKO NALM6，然后接受来自供体2的单剂量TCR编辑的CAR-ADR T细胞。(图11B)外周血中来自供体2的T细胞的动力学。(图11C)实验组中供体1T细胞的动力学。(图11D)小鼠中白血病负荷。(图11E)小鼠的整体存活率。

图12A-12D。ADR T细胞保护小鼠免受致命性异种GvHD。(图12A)模型示意图。(图12B)体内FFLuc标记的ADR T细胞的扩增。(图12C)小鼠中体重增加/减少的动力学。(图12D)小鼠的整体存活率。

图13A-13G。具有CD28胞内信号传导结构域(ADR.28ζ)的第二代ADR。(图13A)ADR.28ζ的结构。(图13B-图13C)ADR.28ζ对表达靶标的细胞系的体外细胞毒性。(图13D-图13G)ADR.28ζ保护小鼠免受异种GvHD。(图13D)模型的示意图。(图13E)FFLuc标记的ADR.28ζT细胞的体内扩增。(图13F)小鼠中体重增加/损失的动力学。(图13G)小鼠的整体存活率。

图14。在癌症中表达ADR的细胞的细胞毒性。(左)表达4-1BB ADR的T细胞对HDLM-2霍奇金淋巴瘤细胞的细胞毒性，(右)表达4-1BB ADR的T细胞对K562慢性骨髓性白血病(CML)细胞的细胞毒性。显示了以1：1的效应子与靶标的比例共培养48小时后肿瘤细胞的绝对计数。

具体实施方式

如本文中所使用的，当在本说明书中(包括权利要求书中)词语“一种”和“一个”与词语“包含”一起使用时，表示“一种或多种/一个或多个”。本发明的一些实施方案可以由一个或多个本发明的元件、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。预期可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施本文描述的任何方法或组合物。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述的步骤或元件或者步骤或元件的组，但不排除任何其他步骤或元件或者步骤或元件的组。“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”之中的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，并且不存在其他元件。“基本上由……组成”是指包括在短语之中列出的任何元件，并且限于不干扰或不有助于本公开中针对所列元件所规定的活性或作用的其他元件。因此，短语“基本上由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，但是其他元件是可选的，并且其他元件是否存在取决于它们是否影响所列举的元件的活性或作用。

在整个说明书中，提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某实施方案”、“另一实施方案”或“又一实施方案”或其组合意思是结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各个地方出现的前述短语不一定都指的是同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。

如本文所用，术语“受试者”通常是指需要针对任何种类的医学病况进行治疗的个体。受试者可以是任何种类的动物。所述受试者可以是作为方法或材料的对象的任何生物或动物受试者，包括哺乳动物，例如人，实验室动物(例如灵长类、大鼠、小鼠、兔)，牲畜(例如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)，家庭宠物(例如狗、猫和啮齿动物)，马和转基因非人类动物。所述受试者可以是患者，例如患有或被怀疑患有疾病(可以称为医学病况)，比如一种或多种传染病、一种或多种遗传病症、一种或多种癌症或其任意组合。所述疾病可能是致病性的。所述受试者可能正在接受或已经接受抗生素治疗。所述受试者可能是无症状的。所述受试者可以是健康个体。在至少一些情况下，术语“个体”可以互换使用。如本文中所使用的，“受试者”或“个体”可以被接纳或可以不被接纳在医疗机构中，并且可以被作为医疗机构的门诊患者进行治疗。所述个体可能正在通过互联网接受一种或多种医疗组合物。个体可以包括任何年龄的人类或非人类动物，因此包括成年和少年(即儿童)和婴儿，并且包括子宫内个体。所述个体可以是任何种族和性别。该术语无意表示需要医学治疗，因此，个体可以自愿或不自愿地成为实验的一部分，无论是临床还是支持基础科学研究。

如本文所用，术语“工程化改造”是指自然界中不存在并且已经由人产生(例如通过本领域标准的基因重组技术)的分子。

在本公开的上下文中，“有效量”或“治疗有效量”是指当施用于个体时允许靶向活化的T细胞和/或减轻体征和/或医疗病况的征候和/或症状或预防医疗病况的细胞的量。可以基于在体外或体内进行的研究来确定实际施用的量，其中功能性免疫细胞表现出针对医学病况的药理活性。

I.自体/同种异体免疫防御受体和组合物及其用途

本公开包括合成的嵌合受体分子，其提供选择性靶向活化的T细胞，包括致病性T细胞。所述工程化改造的分子是合成的，可以通过重组技术产生。所述分子可以被称为自体/同种异体免疫防御受体，其靶向活化的T细胞，包括活化的致病性T细胞，包括具有高特异性的。

在特定实施方案中，自体/同种异体免疫防御受体(ADR)包含靶向一种或多种在活化的T细胞上上调的化合物的实体。尽管在活化的T细胞上上调的化合物可以是任何一种或其组合，但是在特定的实施方案中，OX40、4-1BB和CD40L在活化的T细胞上上调，并且是ADR靶向的对象。在特定实施方案中，所述ADR存在于同种异体免疫细胞上(相对于接受细胞的个体是同种异体的)。在其他情况下，所述ADR在自体T细胞、异种细胞和/或合成的细胞上表达。

A.自体/同种异体免疫防御受体(ADR)分子

ADR分子是合成的、非天然的并且是人为产生的，并且包含至少(1)靶向选择性存在于活化的T细胞上的化合物的胞外结构域(在特定的实施方案中，所述胞外结构域为靶向一种或多种在活化的T细胞上上调的化合物的蛋白质或其功能片段或其衍生物)；其操作性地连接至(2)促进T细胞活化的信号传导结构域，包括例如衍生自CD3ζ亚基、DAP12和Fc受体的那些，或另一种包含ITAM的序列。ADR分子可以包含元件(1)和(2)或由元件(1)和(2)组成或基本上由元件(1)和(2)组成。在至少某些情况下，所述ADR包含一种或多种I型跨膜蛋白的组分和/或一种或多种II型跨膜蛋白的组分。

在特定的实施方案中，在ADR分子中，所述胞外结构域包含选择性结合活化的T细胞上相关蛋白的蛋白。例如，所述ADR胞外结构域可以包含针对活化的T细胞上的受体的配体，或者所述ADR胞外结构域可以包含针对活化的T细胞上的配体的受体。

在特定的实施方案中，在所述ADR分子中，所述胞外结构域包含OX40的配体、4-1BB的配体和/或CD40。这些特定的例子具有在活化的T细胞上的相关蛋白，其分别是OX40、4-1BB和CD40L。在替代实施方案中，靶向活化的T细胞上的其他特定组合物。例如，可以使用相似的方法靶向在T细胞的细胞表面上上调的其他活化标志物(如CD69、CD25、CD71等)。在这种情况下，相应的ADR分子将具有各自的CD69，CD25或CD71配体，或抗体衍生的靶向部分，而不是4-1BB/OX40特异性配体。

在一些情况下，与未活化的T细胞相反，具有OX40表达上调的活化的T细胞被靶向。为了靶向这些活化的T细胞，可以在ADR中使用OX40的配体以能够靶向所述活化的T细胞。在ADR中使用OX40的配体的情况下，所述OX40的配体可以是任何合适的OX40的配体，包括至少OX40L、结合至OX40的抗体(或其功能片段)、Fc与OX40L的融合体、或其功能衍生物或其片段。OX40L也可被称为肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(tax转录激活糖蛋白1(tax-transcriptionally activated glycoprotein 1)，34kDa)、OX40L、CD252、TNFSF4、TXGP1、OX-40L或gp34。

在一些情况下，与未活化的T细胞相反，具有4-1BB表达上调的活化的T细胞被靶向。为了靶向这些活化的T细胞，可以在ADR中使用4-1BB的配体以能够靶向所述活化的T细胞。在ADR中使用4-1BB的配体的情况下，所述4-1BB的配体可以是任何合适的4-1BB的配体，包括至少4-1BBL、靶向4-1BB的抗体(或其功能片段)、Fc与4-1BBL的融合体、或其功能衍生物或片段。

在某些情况下，与未活化的T细胞相反，具有CD40L表达上调的活化的T细胞被靶向。为了靶向这些活化的T细胞，可以在ADR中使用针对CD40L的受体以能够靶向所述活化的T细胞。在ADR中使用CD40L的受体的情况下，所述ADR可以包含CD40(其也可被称为Bp50、CDW40、TNFRSF5或p50))、靶向CD40L的抗体(或其功能片段、或其功能衍生物或片段。

在一些情况下，所述ADR分子包含两个或更多个胞外结构域以促进靶向活化的T细胞。这样的组合可以总体上增强靶向活化的T细胞或可以允许特异性靶向活化的T细胞的某些子集。例如，所述ADR可以在相同ADR分子中同时包含OX40L和4-1BBL作为胞外结构域，以允许靶向表达OX40或4-1BB的活化的T细胞。这种组合的例子将选择性地靶向表达OX40或4-1BB的活化的T细胞，而不管那些活化的T细胞是否还表达CD40L。类似地，ADR可以同时包含CD40和OX40L以靶向表达CD40L或OX40的活化T细胞，而不管那些活化的T细胞是否还表达4-1BB。

在所述ADR分子中，所述胞外结构域可以操作性地连接至一种或多种组分，包括作为所述ADR分子一部分的组分。一种这样的组分可以是在T细胞活化过程中介导下游信号传导的蛋白质。在特定实施方案中，所述ADR包含CD3ζ(也称为CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、CD3Z、IMD25、T3Z或TCRZ)或其功能片段或衍生物。CD3ζ在T细胞活化过程中介导了下游ITAM衍生的信号传导。其他包含ITAM的信号传导结构域可以包括衍生自DAP12、Fc受体、其他CD3亚基等的那些。所述信号传导结构域可以通过另一个结构域非共价连接至ADR。

在特定实施方案中，所述ADR包含位于CD3ζ与胞外蛋白之间的间隔子，该胞外蛋白靶向一种或多种在活化的T细胞上上调的化合物。在其他情况下，不使用间隔子。所述间隔子可以包含相对于ADR可能具有的任何功能而言是惰性的或基本上贡献很少或没有贡献的序列，而在其他情况下，所述间隔子包含例如增强ADR的功能和/或使其可被检测和/或被靶向以抑制的序列。在特定的实施方案中，所述间隔子包含编码的蛋白质序列，其有助于检测表达ADR的细胞。例如，所述间隔子可以编码Fc区或其片段，其将允许细胞的表面检测，例如使用抗Fc抗体检测。在特定实施方案中，所述间隔子提供了配体结合结构域与膜之间的分隔，以避免潜在的空间障碍，例如由II型跨膜蛋白(4-1BBL、OX40L)与I型ADR骨架(TM、信号传导结构域)的接合引起的那些。所述间隔子可以具有任何合适的长度，例如包括约10-220个氨基酸。所述间隔子长度可以在10-220、10-200、10-150、10-100、10-50、25-200、25-150、25-100、25-75、25-50、50-200、50-150、50-125、50-100、50-75、75-200、75-150、75-100、100-200、100-175、100-150、100-125、125-200、125-175、125-150、150-200、150-175、175-200等的范围内。所述间隔子长度可以是大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220个氨基酸。在其他情况下，所述间隔子小于10个氨基酸或大于200个氨基酸。

在一些情况下，ADR包含一个、两个、三个或更多个共刺激结构域，其增强从表达ADR的细胞产生细胞因子。所述共刺激结构域可以衍生自共刺激蛋白(包括CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HVEM、CD40等)的胞内信号传导结构域，仅作为示例，当ADR包含4-1BBL时，ADR的共刺激结构域可以来自或可以不来自4-1BB。

在一些实施方案中，ADR将包含跨膜结构域，其可以是任何种类，只要其允许ADR的CD3ζ组分位于胞内并且靶向一种或多种在活化的T细胞上上调的化合物的胞外结构域位于胞外即可。在其他情况下，ADR是可结合至活化的T细胞上的各个配体并通过交联TCR促进细胞毒性的可溶性蛋白(例如，ADR-CD3 T细胞接合蛋白(engager protein))。在胞外结构域来自具有跨膜结构域的表面蛋白(例如CD40)的情况下，所述ADR可包含来自该对应内源性分子的跨膜结构域。在ADR分子包含一个或多个共刺激结构域的一些情况下，所述跨膜结构域(TM)可来自具有所述共刺激结构域的相同内源性分子。TM的例子包括来自CD3、CD8α、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD4等中的那些。

在ADR多肽的实例中，组分可以处于特定的N-末端(N)至C-末端(C)的顺序。对于一般的ADR，所述受体可以包含以下中的一种(仅作为示例)，并且其中所述胞外结构域包含与活化的T细胞上的相关蛋白选择性结合的蛋白：

N-胞外结构域-信号传导结构域-C

N-胞外结构域-CD3ζ-C

N-胞外结构域-间隔子-CD3ζ-C

N-胞外结构域-间隔子-共刺激结构域-CD3ζ-C

N-胞外结构域-间隔子-两个共刺激域-CD3ζ-C

N-两个胞外结构域-间隔子-共刺激结构域-CD3ζ-C

N-两个胞外结构域-间隔子-两个共刺激结构域-CD3ζ-C

在任何情况下，所述跨膜结构域相对于间隔子可以位于C-末端。在N末端的信号肽可用于促进II型配体(例如OX40L和4-1BBL)在I型跨膜蛋白骨架(例如跨膜结构域、信号传导结构域、CD3ζ)上的表达。

在一些情况下，所述ADR包含一种或多种可检测的标志物，例如比色(colorimetric)、荧光和/或放射性等标志物。实例包括绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。

所述ADR可以是多核苷酸或由多核苷酸表达的多肽的形式，尽管所述ADR可以被合成产生为蛋白质。产生ADR多核苷酸和多肽的重组技术是本领域已知的。

在某些情况下，ADR多核苷酸在表达构建体中或者是表达构建体的一部分，所述表达构建体存在于载体上，载体可以是病毒载体或非病毒载体。非病毒载体的实例包括质粒。病毒载体的实例包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。任何表达ADR的载体将具有适当的元件以允许在真核细胞中表达，所述真核细胞包括例如免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或NKT细胞)。这样的适当的元件包括启动子等。

4-1BB ADR(SEQ ID NO:1)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

OX40 ADR(SEQ ID NO:2)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

CD40L ADR(SEQ ID NO:3)

MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

在某些实施方案中，靶向活化的T细胞的胞外结构域包含抗体或其功能片段或衍生物。如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)

在一些情况下，ADR的胞外结构域包含抗体片段。术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')

合成的抗体可用于ADR。本文所用的术语“合成的抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码该抗体的DNA分子而产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列已通过使用合成DNA或氨基酸序列技术(本领域可用并熟知)而获得。

B.表达ADR的细胞

由于接受者个体的免疫反应，用于过继转移的同种异体细胞易于具有有限的功效。尽管在一些情况下，可以对细胞进行修饰以去除内源性TCR(例如使用CRISPR)，例如以预防移植物抗宿主病，备选地可以利用病毒特异性的T细胞(完整的或CAR/TCR修饰的)以保留抗病毒活性，这在某些致病性病况下是有用的。尽管此类VST由于其TCR更局限于病毒抗原而具有非常有限的移植物抗宿主活性，但它们仍易感于接受者的有害反应。

在本公开中包括进行修饰以表达合成的ADR分子而被改良用于同种异体用途的细胞。因此，本公开包括在细胞表面上具有ADR(作为多核苷酸和作为表达的ADR多肽)的细胞。在特定情况下，产生表达ADR的细胞，用于将其保存在储存库中以供常备使用。可以将细胞容纳在已经配置为表达ADR的储存库中，也可以将它们容纳在储库中并配置为在从储存库取出后表达ADR。某些细胞，例如细菌细胞，可用于产生ADR分子，而带有ADR的其他细胞，例如真核细胞，可用于本发明的方法，包括靶向活化的T细胞。如本文所示，表达ADR的免疫细胞选择性地清除活化的T细胞，并且表达ADR的免疫细胞被保护免受同种反应性T细胞的细胞溶解。

表达ADR分子的细胞可以是任何种类，但是在特定的实施方案中，它们是免疫细胞，例如免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞或衍生自所述谱系或经工程化改造以具有细胞毒性活性的细胞系，其已被修饰以表达ADR，并因此在自然界中不存在。考虑了非天然的表达ADR的细胞的群体，包括群体中至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是表达ADR的细胞的群体。例如，可以通过转染或转导合成的ADR多核苷酸的标准方法产生所述细胞。

在一些情况下，被修饰以表达ADR分子的ADR分子可能已经被工程化改造，或者随后被工程化改造以具有除ADR之外的另一个工程化改造的非天然分子。例如，表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化改造的T细胞受体(TCR)的细胞并在此过程中可以保护此类细胞免于宿主排斥并因此提高其治疗效力。表达一种或多种CAR和/或一种或多种TCR的细胞可以被工程化改造以表达一种或多种ADR，或者表达一种或多种ADR的细胞可以被工程化改造以表达一种或多种CAR和/或一种或多种TCR。因此，在一些情况下，ADR与CAR和/或TCR在不同的载体上表达，而在其他情况下，ADR分子与CAR和/或TCR在相同的载体上表达。在ADR与CAR在相同载体上表达的情况下(作为例子)，ADR和CAR表达可以被相同或不同的调控元件所指导。在任何情况下，ADR和CAR可被表达为单个多肽，具有位于它们之间的可切割的元件，例如2A。

在表达ADR的细胞也表达CAR或TCR的情况下，CAR或TCR可以靶向任何特定的抗原。在使用CAR的情况下，CAR可以是第一代、第二代、第三代等等。在特定情况下，CAR可以是双特异性的。

在一些情况下，表达ADR分子的细胞被工程化改造，例如被工程化改造以缺乏一种或多种内源性分子的表达。在特定情况下，所述细胞被工程化改造以缺乏一种或多种内源基因的表达(该基因否则将促进对细胞的杀伤)。在特定情况下，例如，表达ADR分子的细胞被工程化改造以缺乏4-1BB或OX40的表达。仅作为示例，可以通过CRISPR/Cas9对细胞进行工程化改造。

II.使用自体/同种异体免疫防御受体的方法

本公开的实施方案包括出于任何目的向个体提供有效量的表达ADR的细胞的方法。方法包括出于任何目的提供选择性地靶向个体中活化的T细胞。通过将活化的T细胞暴露于有效量的表达ADR的免疫细胞(例如表达ADR的T细胞)来使活化的T细胞被靶向。这种暴露可以具有例如一个或多个由此导致的应用。

在一些实施方案中，ADR用于选择性靶向除活化的T细胞以外的活化的免疫细胞，例如B细胞(这对于控制不需要的B细胞应答(例如狼疮、类风湿性关节炎等)有用)，以及靶向先天免疫的激活(例如巨噬细胞激活综合征等)。在其他实施方案中，ADR用于特异性靶向表达其相应靶标的恶性细胞，所述相应靶标包括例如4-1BB或OX40或CD40L。

向个体提供有效量的表达ADR的细胞的方案可以由递送细胞用于治疗或预防或不考虑其使用方法的个体知晓或确定。例如，在预防的情况下，可以在检测一种或多种症状之前递送细胞，或者可以在检测一种或多种症状之后但在进一步症状发展和/或恶化之前递送细胞。对于治疗情况，可以在一种、两种或更多种症状发展后和可以在临床诊断后向个体提供有效量的细胞。

在所述方法的特定方面，可以给予所述个体单剂的治疗有效量的细胞，或者可以给予所述个体多剂的治疗有效量的细胞，例如多次递送，间隔1，2、3、4、5、6、7天或1、2、3或4周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或1、2、3、4、5或更多年，或之间的任何范围。各剂之间的时间间隔在单个方案中可能有所不同。

表达ADR的细胞的施用可以通过任何合适的途径到达所述个体，包括局部(locally)或全身。在特定实施方案中，通过静脉内、口服、直肠、局部(topically)、肌肉内、输注、肠道、经鼻、吸入、舌下、经颊(bucally)、经皮、皮下等等递送表达ADR的细胞。细胞可以作为或可以不作为大丸剂(bolus)递送。在多次施用时，可以以或可以不以不同的递送途径将所述细胞提供给所述个体。当将所述细胞递送给所述个体时，它们可以用药学上可接受的载体或赋形剂递送。表达ADR的细胞的剂量的特定示例包括10

A.用于常备实施方案

本公开包括能够常备使用的用于过继转移的细胞，包括能够从储存库获得以用于在不是该细胞最初来源的个体中使用。这些细胞可能在保藏在储存库中之前已经表达了ADR，或者可以在之后对其进行修饰以表达ADR。所述细胞可以是用于过继转移的任何种类的免疫效应细胞。例如，可在细胞被保藏在储存库中之前或从储存库获得它们后将细胞进行修饰以表达肿瘤特异性受体(例如，CAR或TCR)。

如本文其他地方所示，表达ADR的细胞选择性地靶向活化的T细胞和NK细胞，而留下静息亚群。除了保护T细胞免受体内免疫排斥外，ADR还保护同种异体T细胞免受体外由T细胞和/或NK细胞介导的免疫排斥。ADR这样做不会干扰工程化改造的抗肿瘤受体(例如CAR)的功能，因为共表达ADR和CAR的T细胞在体外可以有效清除肿瘤和活化的T细胞。本公开进一步提供了在小鼠模型中使用共表达CAR和ADR的“常备”T细胞在体内的抗癌活性，而与此同时保持了对来自存在于相同小鼠中的同种异体T细胞的免疫排斥的抵抗。例如，在图14中显示4-1BB ADR对4-1BB+肿瘤细胞有效，使得ADR可用作针对表达4-1BB的恶性肿瘤的治疗方式。

在特定实施方案中，“常备”治疗细胞表达ADR以抵抗免疫排斥，并且或是保留内源TCR特异性(例如，针对病毒或肿瘤抗原)或是内源TCR被工程化改造的抗肿瘤受体替代，所述工程化改造的抗肿瘤受体比如一种或多种CAR和/或一种或多种重组TCR。

在特定实施方案中，常备的细胞容纳在储存库中，并且可以出于特定的目的在保藏在储存库中之前或之后被修饰。例如，可以将表达ADR的T细胞容纳在储存库中并准备好使用，例如在组织或器官移植之后，以防止移植排斥。表达ADR的T细胞可以被容纳在储存库中，并且可以用天然或转基因TCR选择或工程化改造，例如抵抗病毒感染或癌症。表达ADR的T细胞可以被容纳在储存库中，并且可以用针对癌症或致病性感染的CAR进行转导。表达ADR的细胞可以被容纳在储存库中，并且可以用一种或多种CAR和/或一种或多种TCR(针对由患者特定肿瘤表达的特定癌相关抗原或新抗原)进行转导。

在一些情况下，储存的同种异体细胞用于防止实体器官移植物的排斥，通过破坏排斥性宿主免疫细胞而进行，特别是在表达ADR的细胞本身没有同种异体反应性的情况下。

尽管容纳在储存库中的细胞相对于接受者个体可以是同种异体的，但是在备选实施方案中，容纳在储存库中的细胞相对于接受者个体是自体的。例如，患有癌症的个体可将表达ADR的T细胞保藏在储存库中，以备后续使用，例如在癌症缓解的情形。在其他情况下，将自体表达ADR的细胞容纳在储存库中用于治疗自身免疫性病症。

B.用于自身免疫性病症

个体中内源性自体反应性T细胞的不需要的激活会导致该个体的毁灭性自身免疫性疾病，例如糖尿病、自身免疫性结肠炎和多发性硬化症。在特定的实施方案中，在个体中使用表达ADR的免疫细胞来预防或治疗一种或多种自身免疫性病症，其通过在个体中抑制内源性自体反应性T细胞来影响自身免疫性病症(或其潜在的发展)。在特定的实施方案中，表达ADR的细胞的这种使用留下所述个体中静息的非致病性幼稚

具有不需要的特异性的T细胞的体内活化可能引起致病性，在特定的实施方案中，表达一种或多种ADR的细胞靶向活化的T细胞。在一些情况下，表达ADR的细胞靶向作为活化的T细胞子集的致病性细胞。

在特定情况下，表达ADR的T细胞可用于预防或逆转由活化的T细胞驱动的威胁生命和使人衰弱的病况(例如器官排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性结肠炎、狼疮、类风湿性关节炎)，使用过继性T细胞转移表达ADR的T细胞而进行。

在一些情况下，表达ADR的T细胞还包含一种或多种不同于ADR的组合物，所述组合物促进一种或多种自身免疫性病症的治疗或预防。

在一些情况下，给予被提供表达ADR的T细胞的个体一种或多种附加疗法，以预防或治疗一种或多种自身免疫性病症。可以给予所述个体或可以不给予所述个体一种或多种免疫抑制药物，例如糖皮质激素、细胞生长抑制剂、抗体和/或作用于免疫亲和蛋白的药物。另外或备选地，可以给予所述个体一种或多种合适的疫苗。

在一些情况下，个体处于自身免疫性病症的风险中，并被提供有效量的表达ADR的细胞以预防自身免疫性病症的发作或延迟发作和/或减轻一种或多种症状，包括例如严重程度和/或持续时间。具有自身免疫性病症风险的个体例如是具有个人或家族病史的个体，是某种族的女性等。在一些情况下，个体可能患有一种自身免疫性病症，并希望预防或降低其严重性和/或持续时间或延迟另一种自身免疫性病症的发作。

可以用表达ADR的细胞预防或治疗的自身免疫性病症的例子包括至少以下各项：失弛缓症(Achalasia)；艾迪生氏病；成人斯蒂尔氏病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经失调；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳疾病(AIED)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病(AMAN)；巴洛病(Balódisease)；贝切特氏病(Behcet’s disease)；良性粘膜类天疱疮；大疱性类天疱疮；卡斯尔门病(Castlemandisease，CD)；脂泻病；查加斯病(Chagas disease)；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)；Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)；瘢痕性类天疱疮；科根综合症(Cogan’s syndrome)；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇心肌炎；CREST综合征；克罗恩病；疱疹样皮炎；皮肌炎；迪维克病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；德勒斯勒综合征(Dressler’s syndrome)；子宫内膜异位；嗜酸性食管炎(EoE)；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑；原发性混合性冷球蛋白血症；埃文斯综合症；纤维肌痛；纤维化肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球性肾炎；古德帕斯彻氏综合征；肉芽肿性多血管炎；格雷夫斯病；格林-巴利综合征；桥本甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)；妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)；化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)；低丙球蛋白血症；IgA肾病；IgG4相关硬化疾病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)；包涵体肌炎(IBM)；间质性膀胱炎(IC)；青少年关节炎；青少年糖尿病(1型糖尿病)；青少年肌炎(JM)；川崎病；兰伯-伊顿综合征；白细胞碎裂性脉管炎；扁平苔藓；硬化性苔藓；木样结膜炎；线性IgA病(LAD)；狼疮；慢性莱姆病；梅尼埃病；显微镜下多血管炎(MPA)；混合性结缔组织病(MCTD)；角膜侵蚀性溃疡(Mooren’s ulcer)；Mucha-Habermann病；多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；嗜睡症；新生儿狼疮；视神经脊髓炎；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性天疱疮；视神经炎；复发性风湿病(PR)；PANDAS；副肿瘤性小脑变性(PCD)；阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；Parry Romberg综合征；睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)；帕森纳格-特纳综合征；天疱疮；周围神经病变；周围性脑脊髓炎；恶性贫血(PA)；POEMS综合征；结节性多动脉炎；I、II、III型多腺综合征；风湿性多肌痛；多肌炎；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；孕酮性皮炎；银屑病；银屑病性关节炎；纯红细胞再生障碍(PRCA)；坏疽性脓皮病；雷诺现象；反应性关节炎；反射交感神经营养不良；复发性多软骨炎；不安腿综合征(RLS)；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；干燥综合征(

C.用于清除NK细胞

表达ADR的免疫细胞可以在需要的情况下用于清除NK细胞。如本文所证明的，某些免疫细胞上ADR的存在提供了针对NK细胞的特异性细胞毒性活性，所述NK细胞参与介导对HLA

D.用于促进同种异体细胞/组织/器官的植入

在避免同种异体反应性T细胞的活化的特定方面，可以避免接受移植的个体中对同种异体细胞、组织或器官的排斥(其主要是由来自接受者的同种异体反应性T细胞群体介导的)。例如，如果不采取措施以避免这种排斥，接受者的同种异体反应性T细胞的活化会导致移植失败。因此，在特定实施方案中，将细胞、组织或器官移植到个体中的方法利用在细胞、组织或器官的各自移植之前、期间和/或之后递送有效量的表达ADR的细胞。在一些情况下，表达ADR的细胞本身不是移植受试者的细胞、组织或器官的一部分，而在其他情况下，表达ADR的细胞则是各自细胞、组织或器官的一部分。

用于移植的组织可以是任何种类的，例如包括至少皮肤、角膜、骨骼、肌腱、心脏瓣膜、静脉或动脉。用于移植的器官可以是任何种类的，例如包括心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠和胸腺。

在特定的实施方案中，表达ADR的细胞以双管齐下的方法增强个体中同种异体细胞的使用：(1)它们抑制个体中的内源性同种异体反应性T细胞；和(2)它们抑制个体中NK细胞介导的排斥。这样，所述ADR分子可以增强任何类型的第三方来源的治疗细胞在所述个体中的持久性和活性，所述治疗细胞包括例如同种异体治疗细胞，包括T细胞、NK细胞、NK-T细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和其他细胞毒性细胞，包括表达工程化改造的构建体(例如嵌合抗原受体(CAR)、转基因TCR等)的细胞。

E.用于在同种异体细胞/组织/器官移植期间预防或治疗移植物抗宿主病(GvHD)

在避免同种异体反应性T细胞的活化的另一个特定方面，可以避免接受同种异体细胞、组织或器官移植的个体中危及生命的同种异体免疫反应。例如，此类移植物将含有供体的同种异体反应性T细胞，如果不采取措施以避免其活化，其会引发移植物抗宿主病(GvHD)的发展。因此，在特定实施方案中，将细胞、组织或器官移植到个体中的方法利用在细胞、组织或器官的各自移植之前、期间和/或之后递送有效量的表达ADR的细胞。在一些情况下，表达ADR的细胞本身不是移植受试者的细胞、组织或器官的一部分，而在其他情况下，表达ADR的细胞则是各自细胞、组织或器官的一部分。

用于移植的组织可以是任何种类的，例如包括至少皮肤、角膜、骨骼、肌腱、心脏瓣膜、静脉或动脉。用于移植的器官可以是任何种类的，例如包括心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠和胸腺。

III.表达ADR的细胞的产生

表达ADR分子的细胞可以以多种方式产生，所有这些方式都可以是本领域中常规的。产生方法可以包括获得要被修饰以表达ADR分子的细胞，还包括产生ADR分子。

A.T细胞的来源

在对本公开的表达ADR的T细胞进行扩增和遗传修饰之前，可以从受试者获得T细胞的来源。这样的获取步骤可以是或可以不是所述方法的一部分。在一些情况下，获得要修饰的T细胞及其操作可以由不是将表达ADR的T细胞提供给个体的一方的一方执行。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如Ficoll

在另一个实施方案中，通过裂解红细胞和去除单核细胞(例如通过PERCOLL

通过阴性选择的T细胞群体的富集可与针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体相结合而实现。一种方法是细胞分选和/或选择(通过负磁免疫粘附或流式细胞术，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物进行)。例如，为了通过阴性选择富集CD4

为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，细胞和表面(例如，颗粒，比如珠子)的浓度可以变化。在某些实施方案中，可能希望显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用了20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用的细胞浓度为1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml。在又一个实施方案中，使用的细胞浓选自7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。在另一个实施方案中，可能希望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，比如珠子)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤之后冷冻。希望不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和(至某种程度上的)单核细胞而提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。许多冷冻溶液和参数是本领域已知的。在某些实施方案中，将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，如本文所述，并在使用本发明的方法来活化之前使其在室温下静置一小时。

在本公开的上下文中还考虑到在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分法产品。这样，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并将所需的细胞(例如T细胞)分离并冷冻，以用于之后的T细胞疗法(用于任何数量的疾病或病况，其将从T细胞疗法中受益，如本文所述的那些)中。在一个实施方案中，血液样本或单采血液成分是从一般健康的受试者中取得的。在某些实施方案中，血液样本或单采血液成分是从一般健康的受试者中取得的，该一般健康的受试者具有发展为疾病的风险但尚未发展为疾病，并将目标细胞分离并冷冻以备后续使用。在某些实施方案中，可以将T细胞扩增、冷冻并在之后的时间使用。在某些实施方案中，在如本文所述诊断特定疾病之后不久但在进行任何治疗之前从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在进行任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样本或单采血液成分中分离细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用以下试剂进行的治疗：诸如那他珠单抗，依法珠单抗，抗病毒剂，化学疗法，放射，免疫抑制剂，例如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体，或其他免疫消融(immunoablative)剂，例如CAMPATH，抗CD3抗体，环磷酰胺，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制p70S6激酶(其对生长因子诱导的信号传导重要)(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方案中，为患者将细胞分离出并冷冻以供之后与骨髓或干细胞移植、T细胞消融疗法(使用化学治疗剂，例如，氟达拉滨，外线束放射治疗(external-beam radiation therapy，XRT)，环磷酰胺或抗体，例如OKT3或CAMPATH)联合(例如，在其之前、同时或之后)使用。在另一个实施方案中，细胞在之前被分离并且可以被冷冻以用于之后治疗使用(在B细胞消融治疗(诸如与CD20反应的药剂，例如Rituxan)之后)。

B.T细胞的活化和扩增

无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达ADR之前还是之后，通常都可以使用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法来活化和扩增T细胞。通常，本公开的T细胞通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂的和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。这样的过程是本领域已知的。在其他情况下，可以将T细胞修饰以表达ADR而无需事先激活。

C.ADR分子的产生

整体来看编码ADR的多核苷酸，可以使用本领域已知的重组方法获得编码ADR分子的核酸序列，例如，通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含基因的载体中衍生该基因，或通过直接从包含该基因的细胞和组织中分离(使用标准技术)。备选地，目标ADR多核苷酸可以被合成产生，而不是克隆。

简要概述，编码ADR的合成多核苷酸的表达通常是通过将编码ADR多肽或其部分的核酸操作性地连接至启动子，并将构建体结合到表达载体中来实现的。所述载体可以适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体包含用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

ADR多核苷酸可以被克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定目标载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且在例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发出许多基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以使当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。

合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其操作性连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个例子是延伸生长因子-1α(EF-1alpha)。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于：猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，埃巴病毒即时早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够在需要这种表达时开启与其操作性连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估ADR多肽或其部分的表达，要引入细胞的表达载体还可以包含选择标志物基因或报告基因或两者，以促进从通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标志物可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染步骤。选择标志物和报告基因都可以侧连合适的调控序列，以使能在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调节序列的功能。通常，报告基因是在接受者生物体或组织中不存在或不表达的基因，并且编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现出来。在将DNA引入接受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBS Letters 479：79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，将具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧翼区的构建体鉴定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接，并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。

将ADR多核苷酸引入细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。

用于将ADR多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。

用于将目的ADR多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送媒介物是脂质体。考虑将脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质连接。与脂质连接的核酸可以被封装在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层中，通过与脂质体和寡核苷酸均相连接的连接分子附着于脂质体，包裹在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或与脂质相连接。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在、作为胶束存在或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或是合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.)获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(纽约Plainview)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids，Inc.(阿拉巴马州伯明翰)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可在约-20℃保存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易挥发。“脂质体”是通用术语，其包含通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可以被表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh等，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅以脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。

在一些情况下，可以将ADR分子整合到细胞的内源核酸中。可以具有用于同源重组的靶位点，其中期望在特定位点整合构建体。例如，可以使用本领域已知的用于同源重组的材料和方法，敲除内源基因并用由该构建体编码的基因替换(在相同基因座或其他位置)该内源基因。对于同源重组，可以使用OMEGA或O-载体。CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、TALE核酸酶、大范围核酸酶和其他位点定向的核酸酶可用于靶向和切割基因组中的特定位点，以促进同源重组。

已经被工程化改造以包括表达ADR的构建体的示例性T细胞可以在选择性条件下在培养物中生长，被选择为具有所述构建体的细胞可以然后被扩增和进一步分析，例如，使用用于确定构建体在宿主细胞中的存在的聚合酶链式反应。工程化改造的宿主细胞一旦被鉴定出，然后它们就可以按计划被使用，例如在培养中被扩增或被引入宿主生物。

取决于细胞的性质，可以将所述细胞以多种方式引入宿主生物，例如哺乳动物。在特定实施方案中，可将所述细胞引入肿瘤部位，尽管在备选实施方案中，所述细胞可归巢于癌症或被修饰以归巢于被感染的组织。所用细胞的数量将取决于多种情况，引入的目的，细胞的寿命，所使用的方案，例如，施用次数，细胞增殖的能力，重组构建体的稳定性等。所述细胞可以以分散体的形式施用，通常在目标部位处或其附近注射。所述细胞可以在生理可接受的培养基中。

DNA导入不必在每种情况下都导致整合。在一些情况下，短暂维持导入的DNA可能就足够了。以此方式，可以具有短期效果，其中可以将细胞引入宿主中，然后在预定时间后，例如在细胞已经能够归巢到特定位点之后启动。

实施例

呈现以下实施例以便更充分地说明本公开的特定实施方案。然而，它们绝不应被解释为限制本公开的广泛范围。

实施例1

选择性靶向致病性T细胞的自体/同种异体免疫防御受体

本文公开了使用在正常T细胞上表达的自体/同种异体免疫防御受体(ADR)特异性靶向致病性T细胞的新方法。表达ADR的T细胞仅发现并清除活化的T细胞，留下静息的非致病性幼稚和记忆T细胞(其构成了循环淋巴细胞中的大部分)。

ADR介导的靶向的概念基于以下观察：在活化的24小时内，T细胞瞬时上调其细胞表面上的共刺激基因4-1BB、OX40和/或CD40L。仅当T细胞具有活化的细胞毒性时，4-1BB、OX40和/或CD40L的表达才能保持，并且所述表达在TCR信号传导停止后的4-5天内逐渐下调。值得注意的是，活化的CD8

为了探索靶向这些活化的T细胞的可行性，将自体/同种异体免疫防御受体(ADR)设计为包含4-1BB-或OX40-特异性配体、或CD40L-特异性受体，其通过间隔子直接连接到CD3ζ链(在γ-逆转录病毒载体SFG中编码)。结合间隔子区域：a)使II型蛋白4-1BBL和OX40L能整合到ADR的I型骨架中；b)促进通过FACS染色在细胞表面检测ADR。用该构建体转导T细胞有效地迫使ADR在细胞表面表达。这些ADR T细胞对表达4-1BB、OX40和CD40L的细胞具有强大的和强健的杀伤力，在48小时内清除了90-99％的靶细胞。这些结果证明了产生功能性4-1BB、OX40和CD40L特异性ADR T细胞的可行性。

因为T细胞中的ADR信号传导导致上调了4-1BB、OX40和CD40L，从而促进杀伤并阻止效应细胞扩增，所以探索了效应T细胞中CRISPR/Cas9基因组破坏ADR靶基因的效果。发明人先前已经表明，这种CRISPR/Cas9方法可以防止对表达CD7特异性CAR的原代人T细胞的杀伤。在这种情况下，利用CRISPR/Cas9，发明人能够在～70％的ADR T细胞中敲除4-1BB表达，在与4-1BB

接下来，测试了ADR T细胞选择性清除活化的T细胞的能力。将4-1BB、OX40和CD40LADR T细胞与荧光标记的静息或CD3/CD28活化的T细胞共培养。通过流式细胞术用计数珠定量残留的活的CD4

在体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，评估了表达ADR的病毒特异性T细胞(VST)是否可以抵抗同种异体排斥。从HLA-A2阴性供体产生CMV特异性T细胞，并以1：2的细胞：细胞比例将对照非转导或ADR转导的VST与同种异体反应性HLA-A2

实施例2

自体/同种异体免疫防御受体用于选择性靶向NK细胞

ADR显示出针对NK细胞的特异性细胞毒性活性，NK细胞是介导对HLA

作为抗肿瘤和抗病毒免疫监视的一部分，NK细胞能够识别HLA不合的细胞或具有低HLA表达的细胞。因此，将同种异体细胞过继转移到免疫充足(immunoreplete)的患者体内将由此导致NK细胞活化和对HLA不合细胞的排斥。在这里，显示共培养表达4-1BB和OX40特异性自体/同种异体免疫防御受体(ADR)的T细胞导致NK细胞的清除，从而将抵消NK细胞介导的宿主对配备有ADR的同种异体T细胞的排斥。因此，ADR不仅抑制同种异体反应性T细胞应答，而且还阻遏NK细胞介导的排斥反应，进一步支持ADR的应用以增强“常备”治疗性T细胞的持久性和活性。

实施例3

表达ADR的T细胞清除靶细胞

ADR可以在免疫细胞的细胞表面上表达并促进针对相应靶标的细胞毒性。图1A示出了ADR的示意图的一个示例(诸如GFP的标记是可选的)。证实了ADR在T细胞表面上的表达(图1B)，并且细胞与对照相称地扩增(图1C)。(图1D)表达ADR的T细胞对表达相应ADR配体的靶细胞具有细胞毒性(图1D)。图1E展示了表达4-1BB ADR的野生型与4-1BB KO T细胞的扩增及其对4-1BB+靶标的细胞毒性。敲除T细胞上的ADR配体可以进一步增强扩增和细胞毒性，并且ADR-T细胞的扩增或功能不需要在T细胞上共表达ADR及其配体(图1E)。

ADR配体在活化的T细胞上的选择性表达使其能够被ADR T细胞选择性清除。确定了TCR刺激后在静息的T细胞与活化的T细胞上的ADR配体的表达(图2A-2C)。ADR T细胞对静息的CD4

作为一个实例，在MLR模型中4-1BB ADR的表达保护T细胞免受免疫排斥。代表性点图显示，与同种异体PBMC以1:10的ADR T：PBMC的比例共培养后，共表达ADR的TCR KO T细胞被保护免受排斥(图3A)。共培养期间PBMC中供体T细胞和同种异体T细胞的绝对计数(图3B-3C)对于病毒特异性的ADR T细胞(图3D-3F)是相同的。

在体外混合淋巴细胞反应中，ADR的表达保护同种异体病毒特异性T细胞免受免疫排斥。代表性的点图显示，ADR VST被保护免受接受者同种异体PBMC的免疫排斥(图4A)。在图4B和图4C中提供了在MLR期间的各个时间点的接受者T细胞和供体VST的绝对计数。

在图5中，ADR VST保留抗病毒功能。ADR VST与病毒肽混合物脉冲的单核细胞共培养，单核细胞计数表明与未修饰的VST相比，它们同等良好地清除病毒感染的细胞。

活化的NK细胞上调ADR配体，并且可以被ADR T细胞选择性地靶向。确认了4-1BB在静息的与活化的NK细胞上的表达(图6A-6B)。测定了与4-1BB ADR T细胞共培养24小时后，静息的与活化的NK细胞的残留计数(图6C)。在图6D中，通过控制NK细胞的扩增，缺乏MHC的ADR T细胞被保护免受同种异体PBMC的免疫排斥。在图6E中确定了共培养期间供体T细胞和同种异体NK细胞的绝对计数。缺乏MHC的ADR T细胞在以1：1的E：T比例共培养48小时后抵抗NK细胞的免疫排斥(图6F)。在使用PBMC进行的MLR期间，ADR T细胞控制同种异体反应性NK细胞的扩增(图6G)，其中NK细胞的绝对计数绘制在图6H中。

ADR表达保护同种异体T细胞免受体内的免疫排斥。在图7A中，示出了免疫排斥的小鼠模型的一个实例，其中在亚致死性辐射后给予小鼠来自HLA-A2+供体的T细胞，然后4天后施用同种异体HLA-A2-T细胞。来自HLA-A2-供体的对照T细胞在第18天被排斥，而表达ADR的细胞被保护(图7B)。确定了在不同时间点来自HLA-A2+和HLA-A2-供体的T细胞的绝对计数(图7C)。图7D中的修饰的体内模型描绘了不同于同种异体T细胞小鼠接受了来自供体1的全PBMC(包含T细胞和NK细胞二者)。图7E中的代表性点图显示了ADR T细胞被保护免受免疫排斥，并且还保护了小鼠免受致命性GvHD的快速发作。

CAR和ADR的共表达保留了两种受体的功能。图8A示出了共表达ADR和CAR的免疫细胞的代表的实例。证实了CAR和ADR在细胞表面上的共表达(图8B)。在图8C中，显示了CAR-ADR T细胞对作为靶标的一个实例的NALM-6(CD19+CAR靶标)的细胞毒性。在图8D中还确定了CAR-ADR T细胞对活化的T细胞(ADR靶标)的细胞毒性。在图8E中展示了在同时与两种细胞靶标共培养时，CAR-ADR T细胞对两种靶标的细胞毒性活性。

CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥并发挥有效的抗肿瘤活性。小鼠模型和方案的例子在图9A中描绘。作为方案的一个实例，小鼠接受来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKO NALM6，然后接受来自供体2的单剂量CAR-ADR T细胞。图9B提供了来自供体2的T细胞在外周血中的动力学，图9C提供了实验组中供体1T细胞的动力学。图9D显示了小鼠中的白血病负荷，并确定了小鼠的总体存活率(图9E)。

图13A-13C。在实体瘤模型中，CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥，并发挥有效的抗肿瘤活性。小鼠模型和治疗的例子的示意图在图10A中示出，其中小鼠接受来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKO神经母细胞瘤细胞系CHLA255，然后接受来自供体2的单剂量CAR-ADR T细胞。供体2GD2 CAR T细胞在第18天被排斥，而CAR-ADR T细胞抵抗同种异体排斥并在外周血中持续存在(图10B)。小鼠的肿瘤负荷示于图13C，其中*表示在ATC+GD2 CAR T组中与异种-GvHD相关的死亡。

TCR敲除的CAR-ADR T细胞被保护免受免疫排斥并发挥有效的抗肿瘤活性。提供了小鼠模型的示意图，其中小鼠接受了来自供体1的同种异体T细胞且间隔24小时接受b2mKONALM6，然后接受来自供体2的单剂量TCR编辑的CAR-ADR T细胞(图11A)。提供了来自供体2的T细胞在外周血中的动力学(图11B)。显示了实验组中的供体1T细胞的动力学(图11C)。提供了小鼠中的白血病负荷(图11D)和小鼠的整体存活率(图11E)。

ADR T细胞保护小鼠免受致命性异种GvHD。在图12A中提供了模型的示意图，并证实了FFLuc标记的ADR T细胞在体内的扩增(图12B)。确定了小鼠中体重增加/减少的动力学(图12C)。描绘了小鼠的总体存活率(图12D)。

利用具有CD28胞内信号传导结构域(“ADR.28ζ”)的第二代ADR(作为一个实例)。描绘了ADR.28ζ的结构的一个实例(图13A)。确定了ADR.28ζ对表达靶标的细胞的体外细胞毒性(图13B和图13C)。ADR.28ζ保护了小鼠免受异种-GvHD系的损害(图13B)。示出了所述模型的示意图(图13D)。证实了FFLuc标记的ADR.28ζT细胞在体内的扩增(图13E)。确定了小鼠体重增加/减少的动力学(图13F)，以及小鼠的总体存活率(图13G)。

尽管已经详细描述了本公开及其优点，但是应该理解，在不脱离所附权利要求书所限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本文进行各种改变、替换和变更。而且，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法和步骤的特定实施方案。如本领域的普通技术人员将从本公开容易地理解的是，可以根据本公开利用目前存在或以后将要开发的执行与本文所述的相应实施方案基本相同的功能或实现与本文所述的相应实施方案基本相同的结果的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤。由此，所附权利要求书旨在将这样的过程、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。