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核糖阳离子脂质

文献发布时间：2023-06-19 09:54:18

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月16日提交的美国专利申请No.62/672,194、2018年10月2日提交的美国专利申请No.62/740,095以及2018年10月23日提交的美国专利申请No.62/749,442的权益，以上每个专利申请的全文以引用方式并入本文。

背景技术

核酸的递送已被广泛探索作为某些疾病状态的潜在治疗选择。具体地，信使RNA(mRNA)疗法已成为治疗各种疾病(包括与一种或多种蛋白质的缺乏相关的那些疾病)的日益重要的选择。

发明内容

本发明尤其提供了可用于递送mRNA的阳离子脂质。由本文所述的阳离子脂质提供的mRNA的递送可导致靶向递送，降低给药频率，改善患者耐受性，并且提供用于治疗多种疾病(包括但不限于癌症、心血管疾病、囊性纤维化、感染性疾病和神经系统疾病)的更有效和毒性更小的mRNA疗法。

在一个方面，本发明提供了式(I’)的阳离子脂质：

其中：

每个L

每个B和B’为NR

每个R

在实施方案中，本发明提供式(I)的阳离子脂质：

在实施方案中，本发明提供式(Ia)的阳离子脂质：

其中L

在实施方案中，本发明提供式(Ib)的阳离子脂质：

其中：R

在实施方案中，本发明提供式(Ic)的阳离子脂质：

其中R

在实施方案中，本发明提供式(Id)的阳离子脂质：

其中R

在实施方案中，本发明提供式(Ie)的阳离子脂质：

其中R

在实施方案中，每个L

在实施方案中，L

在实施方案中，B为NR

在另一方面，本发明提供了式(II)的阳离子脂质：

其中：

每个R

在实施方案中，R

在实施方案中，本发明提供式(IIa)的阳离子脂质：

其中每个R

在实施方案中，本发明提供式(IIb)的阳离子脂质：

其中每个R

在实施方案中，本发明提供式(IIc)的阳离子脂质：

其中每个R

在实施方案中，本发明提供式(IId)的阳离子脂质：

其中每个R

在实施方案中，本发明提供式(IIe)的阳离子脂质：

其中每个R

在实施方案中，L

在实施方案中，每个R

在实施方案中，R

在实施方案中，每个R

在另一方面，本发明提供了选自由以下项组成的组的阳离子脂质：

在实施方案中，阳离子脂质具有根据以下式中的一个的结构，

在实施方案中，阳离子脂质选自由以下项组成的组：

在实施方案中，阳离子脂质具有根据下式的结构，

在实施方案中，L

在实施方案中，B’为NR

在实施方案中，L

在实施方案中，B’为NR

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，每个R

在实施方案中，R

在实施方案中，阳离子脂质选自由阳离子脂质(22)-(462)组成的组。

在另一方面，本发明的特征在于具有以下结构的化合物，

在一些方面，本发明提供了制备本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。

在一些方面，本发明提供了一种组合物，诸如包含本发明的阳离子脂质和一种或多种多核苷酸的药物组合物。

在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA。在实施方案中，脂质体包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如式(I’),(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))，一种或多种非阳离子脂质，一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG修饰的脂质。在实施方案中，脂质体包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))，一种或多种非阳离子脂质，一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在实施方案中，mRNA编码囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)蛋白。在实施方案中，mRNA编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)蛋白。在实施方案中，mRNA编码来自感染因子的抗原。

在实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含包封在脂质体内的核酸，其中脂质体包含如本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在实施方案中，组合物还包含一种或多种选自由以下项组成的组的脂质：一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在实施方案中，组合物还包含一种或多种选自由以下项组成的组的脂质：一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在实施方案中，核酸是编码肽或多肽的mRNA。在实施方案中，mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞的肽或多肽(例如，mRNA编码囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)蛋白)。在实施方案中，mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞的肽或多肽(例如，mRNA编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)蛋白)。在实施方案中，mRNA编码来自感染因子的抗原。

在一些方面，本发明提供了治疗受试者的疾病的方法，包括向受试者施用如本文所述的组合物(例如，药物组合物)。

在实施方案中，将组合物(例如，药物组合物)配制用于静脉内(IV)施用。

在实施方案中，将组合物(例如，药物组合物)配制用于肌肉内(IM)施用。

在实施方案中，将组合物(例如，药物组合物)配制用于通过吸入而施用。在实施方案中，将组合物(例如，药物组合物)配制用于雾化。

附图说明

图1显示静脉内(IV)施用包含本文所述阳离子脂质和编码hEPO的mRNA的脂质纳米颗粒制剂后的hEPO蛋白表达。使用ELISA测定蛋白表达。

具体实施方式

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义阐述在整个本说明书中。本文所引用的用于描述本发明的背景技术并提供关于其实施的附加细节的出版物和其他参考材料以引用方式并入本文。

氨基酸如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。

大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。

生物活性的：如本文使用的，术语“生物活性的”是指在生物系统中，特别是在生物体中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物时，对该生物体具有生物效应的试剂视为生物活性的。

递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送包括其中mRNA被递送至靶组织并且编码的蛋白质被表达并保留在靶组织内的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中mRNA被递送至靶组织并且编码的蛋白质被表达并分泌至患者的循环系统(例如血清)中，并且系统地分布并被其他组织吸收的情况(也称为“系统分布”或“系统递送”)。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽，将多个多肽组装成完整蛋白质(例如酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。

功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是其表现出表征其的性质和/或活性的形式的生物分子。

半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如氨基酸或蛋白质的浓度或活性的量下降到在一个时间段开始时测量的其值的一半所需的时间。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照受试者(或多个对照受试者)的测量值的值。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与之相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初与它们相关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过99％。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”或“mRNA”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA包括修饰的RNA和未修饰的RNA。术语“修饰的mRNA”涉及包含至少一种化学修饰的核苷酸的mRNA。mRNA可以包含一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生，并且任选地纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则mRNA序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是由磷酸二酯键掺入或可以由磷酸二酯键掺入多核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。在一些实施方案中，“核酸”涵盖核糖核酸(RNA)，包括但不限于干扰RNA(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA(aRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的信使RNA(mmRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、多聚编码核酸(MCNA)、聚合编码核酸(PCNA)、引导RNA(gRNA)和CRISPR RNA(crRNA)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，“核酸”涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括但不限于单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)和互补DNA(cDNA)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA和DNA。在实施方案中，DNA可以是反义DNA、质粒DNA、质粒DNA的部分、预缩合的DNA、聚合酶链反应(PCR)的产物、载体(例如P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物的形式。在实施方案中，RNA可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信号识别颗粒RNA(7SL RNA或SRP RNA)、转移RNA(tRNA)、转移信使RNA(tmRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA、小Cajal体特异性RNA(scaRNA)、引导RNA(gRNA)、核糖核酸酶P(RNase P)、Y RNA、端粒酶RNA组分(TERC)、剪接前导RNA(SL RNA)，反义RNA(aRNA或asRNA)，顺式-天然反义转录物(cis-NAT)、CRISPR RNA(crRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、与piwi相互作用的RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)、交易siRNA(tasiRNA)、重复相关的siRNA(rasiRNA)、73K RNA、逆转录转座子、病毒基因组、类病毒、卫星RNA或这些基团的衍生物的形式。在一些实施方案中，核酸是编码蛋白质诸如酶的mRNA。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后。

药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。

药学上可接受的盐：药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸或有机酸或通过使用本领域中使用的其他方法形成的氨基基团的盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，所述本领域中使用的其他方法诸如离子交换。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸酯、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N

全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法上的等效物是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统(例如血液)完成。与“局部分布或递送”的定义形成对比。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有疾病或病症或对疾病或病症敏感，但是可以或可以不显示出该疾病或病症的症状。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。

靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。

治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、病症和/或病状或对疾病、病症和/或病状敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、病症和/或病状的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病关联的病理的风险，可以向未表现出疾病体征和/或仅表现出疾病早期体征的受试者施用治疗。

脂族：如本文所用，术语脂族是指C

烷基：如本文所用，术语“烷基”是指无环的直链和支链烃基，例如，“C

亚烷基：如本文所用，术语“亚烷基”表示饱和的二价直链或支链烃基，并且以亚甲基、亚乙基、异亚丙基等为例。同样，如本文所用，术语“亚烯基”表示具有一个或多个不饱和碳-碳双键的不饱和二价直链或支链烃基，该不饱和碳-碳双键可以存在于沿着链的任何稳定点，术语“亚炔基”在本文中表示具有一个或多个不饱和碳-碳三键的不饱和二价直链或支链烃基，该不饱和碳-碳三键可以存在于沿着链的任何稳定点。在某些实施方案中，亚烷基、亚烯基或亚炔基可以包含一个或多个环状脂族基和/或一个或多个杂原子诸如氧、氮或硫，并且可以任选地被一个或多个取代基诸如烷基、卤素、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺取代。例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基可以被卤素、-COR’、-CO

烯基：如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个不饱和碳-碳双键的任何直链或支链烃链，该不饱和碳-碳双键可以存在于沿着链的任何稳定点，例如，“C

炔基：如本文所用，“炔基”是指直链或支链构型的任何烃链，其在沿链的任何稳定点具有一个或多个碳-碳三键，例如，“C

环烷基：如本文所用，术语“环烷基”是指非芳族的饱和环状基团，例如，“C

杂环基：如本文所用，“杂环基”是指具有环碳原子和1个或更多个(例如1、2、3或4个)环杂原子的3至14元非芳族环系统的基团，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、和磷(“3-14元杂环基”)。在化合价允许的情况下，在含有一个或多个氮原子的杂环基中，连接点可以是碳原子或氮原子。杂环基可以是单环的(“单环杂环基”)或多环的(例如，稠环、桥环或螺环系统，诸如双环系统(“双环杂环基”)或三环系统(“三环杂环基”))，并且可以是饱和的或可以包含一个或多个碳-碳双键或三键。杂环多环系统可在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合的环系统，其中连接点在碳环基或杂环基环上，或其中如上定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环系统，其中连接点在杂环基环上，并且在这种情况下，环成员的数量继续表示杂环基环系统中环成员的数量。除非另有说明，否则杂环基的每个实例独立地未被取代(“未被取代的杂环基”)或被一个或多个取代基取代(“取代的杂环基”)。在某些实施方案中，杂环基是未取代的3-14元杂环基。在某些实施方案中，杂环基是取代的3-14元杂环基。

在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如1、2、3或4个)环杂原子的5-10元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5-10元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如1、2、3或4个)环杂原子的5-8元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5-8元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如1、2、3或4个)环杂原子的5-6元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5-6元杂环基”)。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1个或多个(例如1、2或3个)选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1或2个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。

含有1个杂原子的示例性3元杂环基包括但不限于氮丙啶基、环氧乙烷基、硫烯基。含有1个杂原子的示例性4元杂环基包括但不限于氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。含有1个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。含有2个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于二氧杂环戊烷基、氧杂硫戊环基和二硫戊环基。含有3个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。含有1个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二氧杂环己烷基。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于三嗪基。含有1个杂原子的示例性7元杂环基包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。含有1个杂原子的示例性8元杂环基包括但不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。示例性的双环杂环基基团包括但不限于吲哚基、异吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、四氢苯并噻吩基、四氢苯并呋喃基、四氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、八氢色烯基、八氢异色烯基、十氢萘吡啶基、十氢-1,8-萘吡啶基、十氢吡咯并[3,2-b]吡咯、吲哚基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、苯并二氢吡喃基、苯并噻吩基，1H-苯并[e][1,4]二氮杂吡啶基、1,4,5,7-四氢吡喃并[3,4-b]吡咯基、5,6-二氢-4H-呋喃并[3,2-b]吡咯基、6,7-二氢-5H-呋喃并[3,2-b]吡喃基、5,7-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡喃基、2,3-二氢-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、2,3-二氢呋喃并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-b]吡啶基、1,2,3,4-四氢-1,6-萘啶基等。

卤素：如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

阳离子脂质

基于脂质体的载体被认为是治疗剂的有吸引力的载体，并且仍需持续的开发努力。尽管包含阳离子脂质组分的基于脂质体的载体在包封、稳定性和位点定位方面已显示出令人鼓舞的结果，但是仍然非常需要改进基于脂质体的递送系统。例如，脂质体递送系统的显着缺点涉及具有足够的细胞培养物或体内稳定性以达到所需的靶细胞和/或细胞内区室的脂质体的构建，以及此类脂质体递送系统将其包封的物质有效释放至此类靶细胞的能力。

特别地，仍然需要改善的阳离子脂质，其表现出改善的药代动力学性质并且能够以提高的效率将大分子诸如核酸递送至多种细胞类型和组织。重要的是，仍然特别需要新型的阳离子脂质，其特征在于具有降低的毒性并且能够有效地将包封的核酸和多核苷酸递送至靶细胞、组织和器官。

本文描述了新型阳离子脂质，包含此类脂质的组合物及其相关使用方法。在实施方案中，本文所述的化合物可用作脂质体组合物或脂质体组合物的组分，以促进向一种或多种靶细胞的递送和随后的转染。

本文公开的阳离子脂质包含碱性、可电离的官能团(例如本文所述的胺或含氮杂芳基)，其以中性或带电形式存在。

在实施方案中，本文所述的阳离子脂质可以提供一种或多种期望的特性或性质。即，在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质的特征可以在于具有一种或多种性质，这些性质相对于其他类似分类的脂质提供了此类化合物优点。例如，本文公开的阳离子脂质可以允许控制和定制它们作为组分的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的性质。特别地，本文公开的阳离子脂质的特征可以在于增强的转染效率及其引起特定生物学结果的能力。此类结果可以包括例如增强的细胞摄取、内体/溶酶体破坏能力和/或促进细胞内包封材料(例如，多核苷酸)的释放。

在一个方面，本发明提供了式(I’)的阳离子脂质：

其中：

每个L

每个B和B’为NR

每个R

在实施方案中，R

在一些实施方案中，本发明提供式(I)的阳离子脂质：

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，-L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，B为NR

在实施方案中，L

在实施方案中，B’为NR

在实施方案中，R

在实施方案中，B为N(CH

在实施方案中，B为5至10元含氮杂芳基。在实施方案中，B为吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。在实施方案中，B为未取代的杂芳基，其为吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。在实施方案中，B为取代的杂芳基，其为吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。在实施方案中，B为咪唑基(例如，未取代的咪唑基或取代的咪唑基)。在实施方案中，B为吡啶基(例如，未取代的吡啶基或取代的吡啶基)。

在实施方案中，B为5至10元含氮杂环基。在实施方案中，B为吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢-1,3,5-三嗪基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、氮杂环壬烷基等。在实施方案中，B为哌啶基(例如，未取代的哌啶基或取代的哌啶基)。在实施方案中，B是哌嗪基(例如，未取代的哌嗪基或取代的哌嗪基)。

在实施方案中，R

在实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有根据式(Ia)的结构：

其中L

在实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有根据式(Ib)的结构：

其中R

在实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有根据式(Ic)的结构：

其中：

在实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有根据式(Id)的结构：

其中R

在实施方案中，本发明提供式(Ie)的阳离子脂质：

其中R

在实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有根据式(II)的结构：

其中：

每个R

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，R

在实施方案中，L

在实施方案中，B为NR

在实施方案中，R

在实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有根据式(IIa)的结构：

其中每个R

在实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有根据式(IIb)的结构：

其中每个R

在实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有根据式(IIc)的结构：

其中每个R

在实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有根据式(IId)的结构：

其中每个R

在实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有根据式(IIe)的结构：

其中每个R

在实施方案中，C

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中(例如，式(I’)、(I)和(II)中的任何一个以及式(IIIa)-(IIIaa)中的任何一个)，R

示例性的阳离子脂质包括阳离子脂质(1a)-(21a)(表A)。

表A。阳离子脂质(1a)-(21a)

示例性的阳离子脂质包括阳离子脂质(1b)-(21b)(表B)。

表B。阳离子脂质(1b)-(21b)

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIa)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(22)-(34)(表C)：

表C。式(IIIa)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(22)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(23)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(24)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(25)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(26)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(27)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(28)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(29)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(30)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(31)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(32)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(33)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(34)。

示例性阳离子脂质包括根据式(IIIb)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(35)-(47)(表D)：

表D。式(IIIb)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(35)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(36)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(37)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(38)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(39)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(40)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(41)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(42)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(43)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(44)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(45)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(46)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(47)。

示例性阳离子脂质包括根据式(IIIc)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(48)-(60)(表E)：

表E。式(IIIc)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(48)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(49)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(50)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(51)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(52)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(53)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(54)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(55)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(56)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(57)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(58)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(59)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(60)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIId)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(61)-(71)(表F)：

表F。式(IIId)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(61)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(62)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(63)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(64)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(65)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(66)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(67)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(68)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(69)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(70)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(71)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIe)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(72)-(82)(表F)：

表G。式(IIIe)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(72)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(73)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(74)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(75)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(76)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(77)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(78)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(79)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(80)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(81)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(82)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIf)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(83)-(93)(表H)：

表H。式(IIIf)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(83)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(84)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(85)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(86)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(87)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(88)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(89)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(90)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(91)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(92)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(93)。

示例性阳离子脂质包括根据式(IIIg)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(94)-(106)(表I)：

表I。式(IIIg)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(94)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(95)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(96)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(97)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(98)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(99)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(100)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(101)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(102)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(103)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(104)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(105)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(106)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIh)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(107)-(119)(表J)：

表J。式(IIIh)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(107)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(108)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(109)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(110)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(111)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(112)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(113)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(114)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(115)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(116)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(117)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(118)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(119)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIi)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(120)-(132)(表K)：

表K。式(IIIi)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(120)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(121)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(122)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(123)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(124)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(125)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(126)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(127)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(128)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(129)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(130)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(131)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(132)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIj)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(133)-(143)(表L)：

表L。式(IIIj)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(133)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(134)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(135)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(136)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(137)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(138)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(139)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(140)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(141)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(142)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(143)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIk)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(144)-(154)(表M)：

表M。式(IIIk)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(144)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(145)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(146)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(147)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(148)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(149)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(150)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(151)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(152)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(153)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(154)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIm)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(155)-(165)(表N)：

表N。式(IIIm)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(155)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(156)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(157)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(158)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(159)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(160)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(161)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(162)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(163)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(164)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(165)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIn)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(166)-(178)(表O)：

在实施方案中，根据式(IIIn)的阳离子脂质具有以下结构，

表O。式(IIIn)和(IIIn-1)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(166)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(167)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(168)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(169)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(170)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(171)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(172)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(173)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(174)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(175)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(176)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(177)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(178)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIo)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(179)-(191)(表P)：

表P。式(IIIo)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(179)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(180)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(181)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(182)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(183)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(184)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(185)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(186)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(187)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(188)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(189)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(190)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(191)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIp)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(192)-(204)(表Q)：

表Q。式(IIIp)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(192)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(193)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(194)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(195)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(196)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(197)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(198)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(199)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(200)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(201)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(202)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(203)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(204)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIq)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(205)-(215)(表R)：

在实施方案中，根据式(IIIq)的阳离子脂质具有以下结构，

表R。式(IIIq)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(205)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(206)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(207)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(208)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(209)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(210)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(211)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(212)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(213)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(214)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(215)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIr)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(216)-(226)(表S)：

表S。式(IIIr)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(216)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(217)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(218)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(219)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(220)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(221)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(222)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(223)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(224)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(225)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(226)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIs)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(227)-(237)(表T)：

表T。式(IIIs)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(227)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(228)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(229)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(230)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(231)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(232)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(233)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(234)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(235)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(236)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(237)。

示例性阳离子脂质包括根据式(IIIt)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(238)-(261)(表U)：

表U。式(IIIt)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(238)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(239)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(240)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(241)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(242)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(243)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(244)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(245)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(246)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(247)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(248)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(249)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(250)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(251)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(252)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(253)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(254)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(255)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(256)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(257)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(258)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(259)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(260)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(261)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIu)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(262)-(285)(表V)：

表V。式(IIIu)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(262)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(263)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(264)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(265)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(266)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(267)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(268)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(269)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(270)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(271)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(272)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(273)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(274)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(275)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(276)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(277)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(278)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(279)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(280)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(281)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(282)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(283)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(284)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(285)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIv)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(286)-(309)(表W)：

表W。式(IIIv)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(286)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(287)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(288)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(289)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(290)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(291)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(292)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(293)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(294)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(295)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(296)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(297)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(298)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(299)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(300)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(301)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(302)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(303)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(304)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(305)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(306)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(307)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(308)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(309)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIw)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(310)-(333)(表X)：

表X。式(IIIw)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(310)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(311)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(312)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(313)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(314)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(315)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(316)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(317)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(318)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(319)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(320)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(321)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(322)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(323)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(324)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(325)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(326)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(327)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(328)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(329)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(330)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(331)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(332)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(333)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIx)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(334)-(357)(表Y)：

表Y。式(IIIx)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(334)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(335)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(336)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(337)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(338)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(339)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(340)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(341)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(342)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(343)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(344)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(345)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(346)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(347)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(348)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(349)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(350)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(351)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(352)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(353)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(354)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(355)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(356)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(357)。

示例性阳离子脂质包括根据式(IIIy)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(358)-(381)(表Z)：

表Z。式(IIIy)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(358)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(359)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(360)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(361)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(362)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(363)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(364)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(365)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(366)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(367)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(368)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(369)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(370)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(371)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(372)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(373)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(374)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(375)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(376)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(377)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(378)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(379)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(380)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(381)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIz)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(382)-(405)(表AA)：

表AA。式(IIIz)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(382)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(383)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(384)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(385)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(386)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(387)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(388)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(389)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(390)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(391)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(392)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(393)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(394)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(395)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(396)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(397)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(398)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(399)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(400)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(401)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(402)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(403)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(404)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(405)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIaa)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(406)-(429)(表AB)：

表AB。式(IIIaa)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(406)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(407)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(408)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(409)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(410)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(411)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(412)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(413)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(414)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(415)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(416)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(417)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(418)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(419)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(420)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(421)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(422)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(423)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(424)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(425)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(426)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(427)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(428)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(429)。

示例性的阳离子脂质包括根据式(IIIaa)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(430)-(453)(表AC)：

表AC。式(IIIab)阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(430)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(431)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(432)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(433)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(434)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(435)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(436)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(437)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(438)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(439)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(440)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(441)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(442)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(443)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(444)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(445)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(446)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(447)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(448)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(449)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(450)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(451)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(452)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(453)。

示例性的阳离子脂质包括表AD的阳离子脂质(454)-(462)。

表AD。示例性的阳离子脂质

在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(454)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(455)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(456)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(457)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(458)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(459)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(460)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(461)。在实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质(462)。

本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可以根据本领域已知的方法制备。本文所述的实施例中提供了另外的示例性方法。

方案1提供了本文描述的阳离子脂质的示例性合成。

方案1.阳离子脂质的示例性合成

在方案1中，将碳水化合物诸如化合物A与阳离子亲电试剂(例如，化合物B，3-(二甲基氨基)丙酸或其盐)组合可以得到化合物C。可以用各种亲电试剂处理该化合物以得到如本文所述的阳离子脂质(例如式(I)和(II)的阳离子脂质)。例如，可以用诸如化合物D的脂族亲电子试剂(例如烷基卤或烯基卤)处理化合物C，以得到产物阳离子脂质E。或者，可以用诸如化合物F的酰化剂(例如酰基卤)处理化合物C以得到产物阳离子脂质G。

方案2提供了使用D-核糖和酰化剂的示例性合成。

方案2.核糖阳离子脂质的示例性合成

在方案2中，可以使用碘和三(对甲苯基)膦在二氯甲烷中将核糖(化合物A1)与3-(二甲基氨基)丙酸(化合物B)组合，以得到化合物C1。在碱性条件下用过量的酰基卤(化合物F1)处理化合物C1可得到酰化的阳离子脂质G1。

核酸

可以使用本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))制备可用于递送核酸的组合物。

可以根据任何已知方法合成根据本发明的核酸。例如，可以通过体外转录(IVT)合成根据本发明的mRNA。简而言之，通常使用线性或环状DNA模板进行IVT，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲液系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7、突变的T7或SP6 RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。确切条件将根据特定应用而变化。

在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，将DNA模板体外转录。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7、突变的T7或SP6启动子，随后是所需mRNA的所需核苷酸序列和终止信号。

可以使用标准方法测定根据本发明的所需的mRNA序列并将其掺入DNA模板中。例如，从所需的氨基酸序列(例如酶序列)开始，基于简并遗传密码进行虚拟反向翻译。然后可以使用优化算法来选择合适的密码子。通常，一方面可以优化G/C含量，以实现尽可能高的G/C含量，另一方面，尽可能根据密码子使用考虑tRNA的频率。可以例如借助合适的显示装置建立和显示优化的RNA序列，并将其与原始(野生型)序列进行比较。还可以分析二级结构以分别计算稳定和去稳定特性或RNA的区域。

如上所述，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。DNA可以是反义DNA、质粒DNA、质粒DNA的一部分、预缩合的DNA、聚合酶链反应(PCR)产物、载体(例如P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物的形式。RNA可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、信号识别颗粒RNA(7SLRNA或SRP RNA)、转移RNA(tRNA)、转移信使RNA(tmRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA、小Cajal体特异性RNA(scaRNA)、引导RNA(gRNA)、核糖核酸酶P(RNaseP)、Y RNA、端粒酶RNA组分(TERC)、剪接前导RNA(SL RNA)、反义RNA(aRNA或asRNA)、顺式-天然反义转录物(cis-NAT)、CRISPR RNA(crRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、与piwi相互作用的RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)、交易siRNA(tasiRNA)、重复相关的siRNA(rasiRNA)、73K RNA、逆转录转座子、病毒基因组、类病毒、卫星RNA或这些基团的衍生物的形式。在一些实施方案中，核酸是编码蛋白质的mRNA。

可以根据多种已知方法中的任一种合成根据本发明的mRNA。例如，可以通过体外转录(IVT)合成根据本发明的mRNA。简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。确切条件将根据特定应用而变化。确切条件将根据特定应用而变化。根据若干实施方案，这些试剂的存在在最终产品中是不希望的，因此可以被称为杂质，并且含有一种或多种这些杂质的制剂可以被称为不纯的制剂。在一些实施方案中，体外转录以单批次发生。

在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，将DNA模板体外转录。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，随后是所需mRNA的所需核苷酸序列和终止信号。

修饰的mRNA

在一些实施方案中，根据本发明的mRNA可以合成为未修饰的mRNA或修饰的mRNA。修饰的mRNA在RNA中包含核苷酸修饰。因此，根据本发明的修饰的mRNA可以包括核苷酸修饰，例如，骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(修饰的核苷酸)合成，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的修饰的核苷酸类似物或衍生物，诸如1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶，2,6-二氨基嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基辫苷、怀丁氧苷和焦磷酰胺、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如来自美国专利No.4,373,071、美国专利No.4,401,796、美国专利No.4,415,732、美国专利No.4,458,066、美国专利No.4,500,707、美国专利No.4,668,777、美国专利No.4,973,679、美国专利No.5,047,524、美国专利No.5,132,418、美国专利No.5,153,319、美国专利No.5,262,530和No.5,700,642，这些专利的公开内容以引用方式整体并入。

在一些实施方案中，mRNA可以包含RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是其中RNA中所含核苷酸骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。示例性的骨架修饰通常包括但不限于选自由以下项组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基膦酰胺、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼酸磷酸酯、带正电荷的胍鎓基团等，这意味着用其他阴离子、阳离子或中性基团代替磷酸二酯键。

在一些实施方案中，mRNA可以包含糖修饰。典型的糖修饰是其包含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自由以下项组成的组的糖修饰：4'-硫代核糖核苷酸(参见例如，美国专利申请公开No.US 2016/0031928，以引用方式并入本文)，2'-脱氧-2'-氟寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)，2'-脱氧2'-脱胺寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)，2'-O-烷基寡核糖核苷酸，2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)，2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)或叠氮基三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。

在一些实施方案中，mRNA可以包含核苷酸的碱基的修饰(碱基修饰)。包含碱基修饰的修饰核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的实例包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷、5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷5'-三磷酸、7-脱氮杂腺苷5'-三磷酸、7-脱氮杂鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄嘌呤核苷5'-三磷酸。

通常，mRNA合成包括在N(5')末端添加一个“帽”，在C(3')末端添加一个“尾巴”。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。

因此，在一些实施方案中，mRNA包括5’帽结构。通常按如下方式添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)加入末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

在一些实施方案中，mRNA包括3’聚(A)尾结构。mRNA 3'末端的聚A尾通常包括约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸，约10至150个腺苷核苷酸，约10至100个腺苷核苷酸，约20至70个腺苷核苷酸，或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施方案中，mRNA包括3’聚(C)尾结构。mRNA 3'末端上的合适的聚C尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸，约10至100个胞嘧啶核苷酸，约20至70个胞嘧啶核苷酸，约20至60个胞嘧啶核苷酸，或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。可以将聚C尾添加至聚A尾，或者可以替代聚A尾。

在一些实施方案中，mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。

在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mRNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。

帽结构

在一些实施方案中，mRNA包括5’帽结构。通常按如下方式添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)加入末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

天然存在的帽结构包含7-甲基鸟苷，其通过三磷酸桥连接至第一个转录核苷酸的5'-末端，从而得到m

通过体外转录产生的mRNA的常见帽是m

迄今为止，体外翻译实验中使用的合成二核苷酸帽的通常形式是抗-反向帽类似物(“ARCA”)或修饰的ARCA，其通常是其中2’或3’OH基团被-OCH

其他帽类似物包括但不限于选自由以下项组成的组的化学结构：m

在一些实施方案中，合适的帽是经由三磷酸桥连接至第一个转录核苷酸的5'-末端的7-甲基鸟苷酸(“m

在一些实施方案中，帽是Cap0结构。Cap0结构缺少连接至碱基1和2的核糖的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是Cap1结构。Cap1结构在碱基2处具有2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是Cap2结构。Cap2结构的2'-O-甲基残基同时连接至碱基2和3。

多种m

尾巴结构

通常，“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。人们认为聚A尾可以稳定天然信使和合成有义RNA。因此，在某些实施方案中，可以将长的聚A尾添加至mRNA分子，从而使RNA更稳定。可以使用多种本领域公认的技术添加聚A尾。例如，可以使用聚A聚合酶将长的聚A尾添加至合成的或体外转录的RNA(Yokoe等人，Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体还可以编码长聚A尾。另外，可以通过从PCR产物直接转录来添加聚A尾。聚A也可以用RNA连接酶连接至正义RNA的3'末端(参见例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring HarborLaboratory Press：1991年版))。

在一些实施方案中，mRNA包括3’聚(A)尾结构。通常，聚A尾的长度可以是至少约10、50、100、200、300、400、至少500个核苷酸。在一些实施方案中，mRNA的3'末端上的聚A尾通常包含约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸，约10至150个腺苷核苷酸，约10至100个腺苷核苷酸，约20至70个腺苷核苷酸，或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施方案中，mRNA包括3’聚(C)尾结构。mRNA 3'末端上的合适的聚C尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸，约10至100个胞嘧啶核苷酸，约20至70个胞嘧啶核苷酸，约20至60个胞嘧啶核苷酸，或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。可以将聚C尾添加至聚A尾，或者可以替代聚A尾。

在一些实施方案中，调节聚A尾或聚C尾的长度以控制本发明的修饰的有义mRNA分子的稳定性，从而控制蛋白质的转录。例如，由于聚A尾的长度可以影响有义mRNA分子的半衰期，因此可以调节聚A尾的长度以改变mRNA对核酸酶的抗性水平，从而控制靶细胞中多核苷酸表达和/或多肽产生的时间进程。

5’和3’未翻译区域

示例性的3'和/或5'UTR序列可以衍生自稳定的mRNA分子(例如，球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可以包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以提高核酸酶抗性和/或提高多核苷酸的半衰期。还考虑了在多核苷酸(例如，mRNA)的3’末端或非翻译区包含编码人生长激素(hGH)或其片段的序列，以进一步稳定该多核苷酸。通常，这些修饰相对于其未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性而进行的修饰。

阳离子脂质和核酸的药物制剂

在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))以及包含此类脂质的药物和脂质体组合物可用于制剂中，以促进包封材料(例如一种或多种多核苷酸，诸如mRNA)向一种或多种靶细胞的递送以及随后的转染。例如，在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(和包含此类脂质的组合物，诸如脂质体组合物)的特征在于导致受体介导的胞吞作用、网格蛋白介导的和小窝介导的胞吞作用、吞噬作用和大胞饮作用、促融合性、内体或溶酶体破坏和/或可释放性质中的一种或多种，所述性质提供此类化合物相对于其他类似分类的脂质的优势。

根据本发明，核酸，例如编码如本文所述的蛋白质(例如，蛋白质的全长、片段或部分)的mRNA可以经由包含如本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))的递送载体来递送。

如本文中所用，术语“递送载体”、“转运载体”、“纳米颗粒”或语法等同物可互换使用。

例如，本发明提供了包含本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))和一种或多种多核苷酸的组合物(例如药物组合物)。组合物(例如药物组合物)还可以包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG修饰的脂质。

在某些实施方案中，组合物表现出增强的(例如提高的)转染一个或多个靶细胞的能力。因此，本文还提供了转染一种或多种靶细胞的方法。此类方法通常包括使一种或多种靶细胞与本文公开的阳离子脂质和/或药物组合物(例如，包含包封一种或多种多核苷酸的式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的脂质体制剂)，使得包封在其中的材料(例如一种或多种多核苷酸)转染一种或多种靶细胞。如本文所用，术语“转染”或“转染”是指将一种或多种包封材料(例如，核酸和/或多核苷酸)细胞内引入细胞，或优选地引入靶细胞。引入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地保持在靶细胞中。术语“转染效率”是指由经受转染的靶细胞摄取、引入和/或表达的此类包封材料(例如，多核苷酸)的相对量。实际上，转染效率可以通过转染后靶细胞产生的报告多核苷酸产物的量来估计。在某些实施方案中，本文所述的化合物和药物组合物表现出高转染效率，从而提高了将适当剂量的包封材料(例如一种或多种多核苷酸)递送至病理部位并随后表达的可能性，同时尽量减少与该化合物或其包封内容物相关的潜在全身性不良反应或毒性。

在通过例如包封在包含本文所公开的药物组合物或脂质体组合物的一种或多种脂质纳米颗粒中的多核苷酸转染一种或多种靶细胞之后，可以优选地刺激由此类多核苷酸编码的产物(例如多肽或蛋白质)的产生，并且增强此类靶细胞表达多核苷酸以及产生例如感兴趣的多肽或蛋白质的能力。例如，通过包封mRNA的一种或多种化合物或药物组合物对靶细胞的转染将增强(即增加)由此类mRNA编码的蛋白质或酶的产生。

此外，本文所述的递送载体(例如脂质体递送载体)可以被制备成优先分布至其他靶组织、细胞或器官，诸如心脏、肺、肾、脾。在实施方案中，可以制备本发明的脂质纳米颗粒以实现对靶细胞和组织的增强的递送。例如，包封在本文所述的一种或多种化合物或药物组合物和脂质体组合物中的多核苷酸(例如，mRNA)可以被递送至和/或转染靶细胞或组织。在一些实施方案中，包封的多核苷酸(例如，mRNA)能够被靶细胞表达并且由靶细胞产生(并且在某些情况下分泌)功能性多肽产物，从而赋予例如靶细胞或组织有益的特性。此类包封的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码例如激素、酶、受体、多肽、肽或其他感兴趣的蛋白质。

在一些实施方案中，组合物是合适的递送载体。在实施方案中，组合物是脂质体递送载体，例如脂质纳米颗粒。

术语“脂质体递送载体”和“脂质体组合物”可互换使用。

用本文所公开的一种或多种阳离子脂质富集脂质体组合物可以用作改善(例如降低)毒性或以其他方式赋予此类富集脂质体组合物一种或多种所需特性(例如，改善包封的多核苷酸对一种或多种靶细胞的递送和/或降低脂质体组合物的体内毒性)的方法。因此，还考虑了包含一种或多种本文公开的阳离子脂质的药物组合物，特别是脂质体组合物。

因此，在某些实施方案中，本文所述的化合物(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))是阳离子脂质，其可以用作脂质体组合物的组分，以促进或增强包封材料(例如一种或多种治疗剂)向一种或多种靶细胞的递送和释放(例如，通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。

如本文所用，脂质体递送载体，例如脂质纳米颗粒，通常被表征为具有内部水空间的微观囊泡，该内部水空间通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，诸如包含空间上分开的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送载体通常用于将所需的mRNA转运至靶细胞或组织。

在某些实施方案中，此类组合物(例如脂质体组合物)装载或以其他方式包封材料，诸如一种或多种生物活性多核苷酸(例如mRNA)。

在实施方案中，组合物(例如药物组合物)包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA。在实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG修饰的脂质，并且至少一种阳离子脂质是如本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在实施方案中，组合物包含编码蛋白质(例如，本文所述的任何蛋白质)的mRNA。在实施方案中，组合物包含编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的mRNA。在实施方案中，组合物包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白的mRNA。在实施方案中，mRNA编码来自感染因子的抗原。

在实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含包封在脂质体内的核酸，其中脂质体包含如本文所述的任何阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。

在实施方案中，核酸是编码肽或多肽的mRNA。在实施方案中，mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞的肽或多肽(例如，mRNA编码囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)蛋白)。在实施方案中，mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞的肽或多肽(例如，mRNA编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)蛋白)。在实施方案中，mRNA编码来自感染因子的抗原。本文还描述了其他示例性mRNA。

在实施方案中，脂质体递送载体(例如脂质纳米颗粒)可具有净正电荷。

在实施方案中，脂质体递送载体(例如脂质纳米颗粒)可具有净负电荷。

在实施方案中，脂质体递送载体(例如脂质纳米颗粒)可具有净中性电荷。

在实施方案中，包封核酸(例如，编码肽或多肽的mRNA)的脂质纳米颗粒包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。

例如，组合物中如本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))的量可描述为组合物的所有脂质的总干重(例如，存在于脂质体组合物中的所有脂质的总干重)。

在本文所述的药物组合物的实施方案中，如本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))以组合物(例如脂质体组合物)中存在的所有脂质的总干重的约0.5重量％至约30重量％(例如约0.5重量％至约20重量％)的量存在。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)以组合物(例如脂质体组合物)中存在的所有脂质的总干重的约1重量％至约30重量％、约1重量％至约20重量％、约1重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％或约5重量％至约25重量％的量存在。在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)以组合物诸如脂质体递送载体中存在的所有脂质的总摩尔量的约0.5重量％至约5重量％、约1重量％至约10重量％、约5重量％至约20重量％或约10重量％至约20重量％的量存在。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的量以组合物(例如脂质体组合物)中的总脂质的总干重的至少约5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％、约70重量％、约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％或约99重量％的量存在。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的量以不超过组合物(例如脂质体组合物)中的总脂质的总干重的约5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％、约70重量％、约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％或约99重量％的量存在。

在实施方案中，组合物(例如脂质体递送载体，诸如脂质纳米颗粒)包含约0.1重量％至约20重量％(例如，约0.1重量％至约15重量％)的本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在实施方案中，递送载体(例如脂质体递送载体，诸如脂质纳米颗粒)包含约0.5重量％、约1重量％、约3重量％、约5重量％或约10重量％的本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在实施方案中，递送载体(例如脂质体递送载体，诸如脂质纳米颗粒)包含至多约0.5重量％、约1重量％、约3重量％、约5重量％、约10重量％、约15重量％或约20重量％的本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在实施方案中，该百分比导致改善的有益效果(例如，改善了对靶向组织诸如肝或肺的递送)。

组合物中式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的量也可以描述为组合物中总脂质的总摩尔量(例如，存在于脂质体递送载体中的所有脂质的总摩尔量)的百分比(“摩尔％”)。

在本文所述的药物组合物的实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)以组合物诸如脂质体递送载体中存在的所有脂质的总摩尔量的约0.5摩尔％至约30摩尔％(例如约0.5摩尔％至约20摩尔％)的量存在。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)以组合物诸如脂质体递送载体中存在的所有脂质的总摩尔量的约0.5摩尔％至约5摩尔％、约1摩尔％至约10摩尔％、约5摩尔％至约20摩尔％或约10摩尔％至约20摩尔％的量存在。在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)以组合物诸如脂质体递送载体中存在的所有脂质的总摩尔量的约1摩尔％至约30摩尔％、约1摩尔％至约20摩尔％、约1摩尔％至约15摩尔％、约1摩尔％至约10摩尔％或约5摩尔％至约25摩尔％的量存在。

在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可占组合物(例如脂质体递送载体)中脂质总量的约0.1摩尔％至约50摩尔％、或0.5摩尔％至约50摩尔％、或约1摩尔％至约25摩尔％、或约1摩尔％至约10摩尔％。

在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可占脂质纳脂米颗粒中脂质总量的大于约0.1摩尔％、或大于约0.5摩尔％、或大于约1摩尔％、或大于约5摩尔％。

在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可占组合物(例如脂质体递送载体)中脂质总量的小于约25摩尔％、或小于约10摩尔％、或小于约5摩尔％、或小于约1摩尔％。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的量以组合物(例如脂质体组合物)中总脂质的总干重的至少约5摩尔％、约10摩尔％、约15摩尔％、约20摩尔％、约25摩尔％、约30摩尔％、约35摩尔％、约40摩尔％、约45摩尔％、约50摩尔％、约55摩尔％、约60摩尔％、约65摩尔％、约70摩尔％、约75摩尔％、约80摩尔％、约85摩尔％、约90摩尔％、约95摩尔％、约96摩尔％、约97摩尔％、约98摩尔％或约99摩尔％的量存在。

在实施方案中，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462)中的任何一种)的量以不超过组合物(例如脂质体组合物)中总脂质的总干重的约5摩尔％、约10摩尔％、约15摩尔％、约20摩尔％、约25摩尔％、约30摩尔％、约35摩尔％、约40摩尔％、约45摩尔％、约50摩尔％、约55摩尔％、约60摩尔％、约65摩尔％、约70摩尔％、约75摩尔％、约组合物中总脂质的总干重的80摩尔％、约85摩尔％、约90摩尔％、约95摩尔％、约96摩尔％、约97摩尔％、约98摩尔％或约99摩尔％的量存在。

在实施方案中，该百分比导致改善的有益效果(例如，改善了对靶向组织诸如肝或肺的递送)。

在实施方案中，组合物还包含一种或多种脂质(例如，一种或多种选自由以下项组成的组的脂质：一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质)。

在某些实施方案中，此类药物(例如脂质体)组合物包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质和胆固醇脂质中的一种或多种。在实施方案中，此类药物(例如脂质体)组合物包含：一种或多种PEG修饰的脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种胆固醇脂质。在实施方案中，此类药物(例如脂质体)组合物包含：一种或多种PEG修饰的脂质和一种或多种胆固醇脂质。

在实施方案中，包封核酸(例如，编码肽或多肽的mRNA)的组合物(例如，脂质纳米颗粒)包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))以及一种或多种选自由阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇化脂质组成的组的脂质。

在实施方案中，包封核酸(例如，编码肽或多肽的mRNA)的组合物(例如，脂质纳米颗粒)包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))；一种或多种选自由阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇化脂质组成的组的脂质；并且还包含基于胆固醇的脂质。

在实施方案中，包封核酸(例如，编码肽或多肽的mRNA)的脂质纳米颗粒包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))，以及一种或多种选自由阳离子脂质、非阳离子脂质、聚乙二醇化脂质和基于胆固醇的脂质组成的组的脂质。

在本文所述的脂质纳米颗粒的实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))，非阳离子脂质(例如DOPE)，聚乙二醇化脂质(例如DMG-PEG2000)和基于胆固醇的脂质(例如胆固醇)。

根据各种实施方案，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质的选择以及此类脂质彼此的相对摩尔比基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、要递送的mRNA的特征。其他考虑因素包括例如，烷基链的饱和度以及所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可以相应地调节摩尔比。

其他阳离子脂质

除了本文所述的任何阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))，组合物可以包含一种或多种其他阳离子脂质。

在一些实施方案中，脂质体可以包含一种或多种其他阳离子脂质。如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH诸如生理pH下具有净正电荷的多种脂质物质中的任何一种。文献中已经描述了若干阳离子脂质，其中许多是可商购获得的。

用于本发明的组合物和方法中的特别合适的其他阳离子脂质包括国际专利公布WO 2010/053572(特别是段落[00225]中所述的C12-200)和WO2012/170930中所述的那些，这两个专利公布以引用方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法采用包含另外的阳离子脂质的脂质纳米颗粒，所述另外的阳离子脂质描述2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468中(以引用方式并入本文)，诸如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-l-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。

在一些实施方案中，组合物(例如脂质体组合物)包含2012年10月26日提交的WO2013/063468和2014年3月14日提交的美国临时申请61/953,516中描述的另外的阳离子脂质，这两个文献均以引用方式并入本文。

在特定实施方案中，组合物(例如脂质体组合物)包含另外的阳离子脂质cKK-E12或(3,6-双(4-(双(2-羟基月桂基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)。cKK-E12的结构如下所示：

在一些实施方案中，另外的阳离子脂质可以是N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”(Feigner等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利No.4,897,355)。DOTMA可以单独配制，也可以与中性脂质(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺或“DOPE”)或其他阳离子或非阳离子脂质组合到脂质体转移载体或脂质纳米颗粒中，此类脂质体可用于增强核酸向靶细胞的递送。其他合适的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精丙基甘氨酸二十八烷基酰胺或“DOGS”；2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”(Behr等人，Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利No.5,171,678；美国专利No.5,334,761)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”；或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷或“DOTAP”。

另外的示例性的其他阳离子脂质还包括1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油醇基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚麻醇基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化溴或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾醇-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾醇5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油烯氧基氧基苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N’-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油醇基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷或“DLin--DMA”、2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷或“DLin-K-XTC2-DMA”，以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l 2-二烯-1-基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙醇胺(DLin-KC2-DMA)(参见WO 2010/042877；Semple等人，Nature Biotech.28:172-176(2010))或它们的混合物。(Heyes,J.等人，J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人，Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。在一些实施方案中，一种或多种其他阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一个。

在一些实施方案中，一种或多种其他阳离子脂质可以选自XTC(2,2-二亚油醇基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷)，MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯)，ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊烷[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺)，NC98-5(4,7,13-三(3-氧-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)，DODAP(1,2-二油烯基-3-二甲基铵丙烷)，HGT4003(WO 2012/170889，其教导内容以引用方式整体并入本文)，ICE(WO 2011/068810，其教导内容以引用方式整体并入本文)，HGT5000(美国临时专利申请No.61/617,468，其教导内容以引用方式整体并入本文)或HGT5001(顺式或反式)(临时专利申请No.61/617,468)，氨基醇类脂质，诸如WO2010/053572中公开的那些，DOTAP(1,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷)，DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)，DLinDMA(Heyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationiclipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleicacids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)，DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人，“RationalDesign of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)，C12-200(Love,K.T.等人，“Lipid-like materials for low-dose in vivo genesilencing”PNAS 2010,107,1864-1869)。

在一些实施方案中，如按摩尔比(摩尔％)或按重量(重量％)测量，组合物(例如脂质体组合物)中总阳离子脂质的百分比可以不超过总脂质的10％、不超过20％、不超过30％、不超过40％、不超过50％、不超过60％、不超过70％、不超过80％、不超过90％或不超过95％。

在一些实施方案中，如按摩尔比(摩尔％)或按重量(重量％)测量，组合物(例如脂质体组合物)中总阳离子脂质的百分比可大于总脂质的10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或大于95％。

在一些实施方案中，按重量计总阳离子脂质构成脂质体的约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，按摩尔比计阳离子脂质构成组合物(例如脂质体组合物)的约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在一些实施方案中，按重量计总阳离子脂质构成脂质体的约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，按重量计阳离子脂质构成组合物(例如脂质体组合物)的约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。

非阳离子/辅助脂质

组合物(例如脂质体组合物)也可以包含一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH诸如生理pH下携带净负电荷的多种脂质物质中的任何一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)或它们的混合物。

在实施方案中，非阳离子或辅助脂质是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即在配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。

在一些实施方案中，非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的摩尔比(摩尔％)存在。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的摩尔比(摩尔％)存在。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。

在一些实施方案中，非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的重量比(重量％)存在。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％的重量比(重量％)存在。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施方案中，组合物(例如脂质体组合物)包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的脂质包括胆固醇和例如DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基羧酰胺胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人，BioTechniques 23,139(1997)；美国专利No.5,744,335)或咪唑胆固醇酯(ICE)，其具有以下结构，

在实施方案中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以以脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％或约5％至约20％的摩尔比(摩尔％)存在。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于约5摩尔％、大于约10摩尔％、大于约20摩尔％、大于约30摩尔％或大于约40摩尔％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以不超过约5摩尔％、不超过约10摩尔％、不超过约20摩尔％、不超过约30摩尔％或不超过约40摩尔％。

在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以以脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％或约5％至约20％的重量比(重量％)存在。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于约5重量％、大于约10重量％、大于约20重量％、大于约30重量％或大于约40重量％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以不超过约5重量％、不超过约10重量％、不超过约20重量％、不超过约30重量％或不超过约40重量％。

聚乙二醇化脂质

在一些实施方案中，组合物(例如脂质体组合物)包含一种或多种聚乙二醇化脂质。

例如，本发明还考虑了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质诸如衍生神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)与一种或多种阳离子脂质和在一些实施方案中与其他脂质一起构成脂质体的组合的用途。在一些实施方案中，特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链的PEG-神经酰胺(例如，C

预期的PEG修饰的脂质(在本文中也称为聚乙二醇化脂质，该术语可与PEG修饰的脂质互换)包括但不限于与具有C

在实施方案中，PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2000)。

本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可以以组合物(例如脂质体组合物)中存在的总脂质的约0％至约15％、约0.5％至约15％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％的摩尔比(摩尔％)存在。

本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可以以组合物(例如脂质体组合物)中存在的总脂质的约0％至约15％、约0.5％至约15％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％的重量比(重量％)存在。

药物制剂和治疗用途

本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，例如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可用于制备组合物(例如，用于构建脂质体组合物)，该组合物促进或增强包封材料(例如一种或多种治疗性多核苷酸)向一种或多种靶细胞的递送和释放(例如，通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。

例如，当脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包含或以其他方式富集本文所公开的化合物中的一种或多种时，一种或多种靶细胞的脂质双层中的相变可以促进包封材料(例如，包封在脂质纳米颗粒中的一种或多种治疗性多核苷酸)递送至一种或多种靶细胞中。

类似地，在某些实施方案中，本文所述的阳离子脂质(例如，式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))可用于制备脂质体载体，所述脂质体载体的特征在于它们的体内毒性降低。在某些实施方案中，降低的毒性是与本文所公开的组合物相关的高转染效率的函数，使得可以将减少量的此类组合物施用于受试者以实现期望的治疗反应或结果。

因此，包含本文所述的阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))以及本发明提供的核酸的药物制剂可用于各种治疗目的。为了促进核酸的体内递送，阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))和核酸可以与一种或多种其他药物载体、靶向配体或稳定剂组合配制。在一些实施方案中，可通过预混合脂质溶液配制阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。在其他实施方案中，包含阳离子脂质(例如式(I’)、(I)、(II)或(IIIa)-(IIIab)的阳离子脂质，诸如阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))的组合物可以使用后插入技术配制到纳米颗粒的脂质膜中。用于配制和施用药物的技术可见于“Remington’s PharmaceuticalSciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版。

合适的施用途径包括例如口腔、直肠、阴道、透粘膜、肺，包括气管内或吸入，或肠内施用；肠胃外递送，包括真皮内、透皮(局部)、肌肉内、皮下、髓内注射；以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在特定的实施方案中，肌内施用是对选自由骨骼肌、平滑肌和心肌组成的组的肌肉。在一些实施方案中，施用导致核酸递送至肌肉细胞。在一些实施方案中，施用导致核酸递送至肝细胞(即，肝脏细胞)。在实施方案中，施用是肌内的。在实施方案中，施用是静脉内的。

另选地或除此之外，本发明的药物制剂可以以局部而非全身的方式施用，例如，通过优选地以缓释制剂的形式，将药物制剂直接注射到靶向组织中。根据待靶向组织，可以各种方式影响局部递送。可以在其中递送和/或表达递送的mRNA的示例性组织包括但不限于肝、肾、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液。在实施方案中，待靶向组织在肝中。例如，可以吸入含有本发明组合物的气溶胶(用于鼻腔、气管或支气管递送)；例如，可以将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现或疼痛的部位；可以以锭剂形式提供组合物，用于口腔、气管或食道应用；可以以液体、片剂或胶囊剂形式供应给胃或肠，也可以以栓剂形式供应给直肠或阴道应用；或者甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂递送至眼睛。

在实施方案中，施用是经由肺部递送。如本文所用，肺部递送是指经由例如鼻腔、气管、支气管、细支气管和/或其他肺系统递送至肺部。在实施方案中，本文所述的组合物被配制用于雾化。在实施方案中，递送载体可以是可吸入的雾化组合物。在实施方案中，肺部递送涉及吸入(例如，用于鼻、气管或支气管递送)。在实施方案中，在吸入之前将组合物雾化。

本发明提供了用于递送具有编码感兴趣的肽或多肽的全长mRNA分子的组合物的方法，所述组合物用于治疗受试者，例如人类受试者或人类受试者的细胞或经处理并递送至人类受试者的细胞。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族A成员3蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码动力蛋白轴突中间链1蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码动力蛋白轴突重链5(DNAH5)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码α-1-抗胰蛋白酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码叉头盒P3(FOXP3)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种表面活性蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述表面活性蛋白蛋白例如表面活性A蛋白、表面活性B蛋白、表面活性C蛋白和表面活性D蛋白中的一种或多种。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，以富集的全长mRNA递送至或治疗肝脏或肝细胞提供治疗有益效果。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与尿素循环障碍相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨琥珀酸合成酶1蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码氨基甲酰磷酸合成酶I蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨琥珀酸裂合酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与溶酶体贮积症相关的蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码α半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码葡萄糖脑苷脂酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码异氰酸酯-2-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码艾杜糖苷酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码N-乙酰基-α-D-葡糖胺苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码β-半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码溶酶体脂肪酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码转录因子EB(TFEB)的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与糖原贮积症相关的蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码酸性α-葡糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肝糖原磷酸化酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肌肉磷酸甘油酸突变酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码糖原解支化酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与氨基酸代谢相关的蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码苯丙氨酸羟化酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码戊二酰-CoA脱氢酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码丙酰基-CoA羧化酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与脂质代谢或纤维化疾病相关的蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码mTOR抑制剂的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATPase磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种NF-κB抑制剂的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述抑制剂诸如I-κBα、干扰素相关的发育调节剂1(IFRD1)和Sirtuin 1(SIRT1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码PPAR-γ蛋白或活性变体的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码甲基丙二酰辅酶A突变酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码甲基丙二酰辅酶A差向异构酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，对于该治疗组合物，递送至或治疗肝脏可以提供治疗有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP7B蛋白(也被称为Wilson病蛋白)的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码胆色素原脱氨酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种凝结酶的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人血色素沉着病(HFE)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心血管系统或心血管细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码血管内皮生长因子A蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码松弛素蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码骨形态发生蛋白9蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码骨形态发生蛋白2受体蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肌肉或肌肉细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肌营养不良蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人源线粒体蛋白(frataxin)的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心肌或心肌细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Kv7.1通道的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Nav1.5通道的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的神经系统或神经系统细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码存活运动神经元1蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码存活运动神经元2蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人源线粒体蛋白(frataxin)的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码CLN3蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码β球蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码布鲁顿酪氨酸激酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种凝结酶的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肾脏或肾脏细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码IV型胶原α5链(COL4A5)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的眼或眼细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码视黄醛壳素蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码视网膜色素上皮特异性65kDa(RPE65)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码290kDa的中心体蛋白(CEP290)的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在实施方案中，mRNA编码来自感染因子的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于向受试者或受试者的细胞递送疫苗或用疫苗治疗。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自诸如病毒之类的传染源的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自流感病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自呼吸道合胞病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自狂犬病病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自巨细胞病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自轮状病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自肝炎病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述肝炎病毒诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人乳头瘤病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自单纯疱疹病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述单纯疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人免疫缺陷病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述人免疫缺陷病毒诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人间质肺炎病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人副流感病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自疟疾病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自寨卡病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自基孔肯雅病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码从突变KRAS基因表达的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对OX40的抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对VEGF的抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对组织坏死因子α的抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对CD3的抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对CD19的抗体的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码免疫调节剂的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素12的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素23的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素36γ的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码一种或多种干扰素基因(STING)蛋白刺激物的组成型活性变体。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码核酸内切酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白，诸如Cas 9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码大范围核酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码转录激活因子样效应子核酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种制备具有编码锌指核酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在实施方案中，示例性治疗用途是由编码分泌蛋白的mRNA的递送产生的。因此，在实施方案中，本发明的组合物和方法提供了编码分泌蛋白的mRNA的递送。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了编码表1中列出的一种或多种分泌蛋白的mRNA的递送；因此，本发明的组合物可以包含编码表1中列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA以及本文列出的其他组分，并且本发明的方法可以包括制备和/或施用包含编码表1中列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA以及本文列出的其他成分的组合物。

表1.分泌蛋白质

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了一种或多种编码表2中列出的一种或多种其他示例性蛋白质的mRNA的递送；因此，本发明的组合物可以包含编码表2中列出的蛋白质的mRNA(或其同源物)以及本文列出的其他组分，并且本发明的方法可以包括制备和/或施用包含编码选自表2中列出的蛋白质的蛋白质(或其同源物)的mRNA以及本文列出的其他组分的组合物。

表2.其他示例性蛋白质

表1和表2中列出的Uniprot ID是指人类版本，列出的蛋白质及各自的序列可从Uniprot数据库获得。列出的蛋白质的序列通常也可用于多种动物，包括各种哺乳动物和兽医学或工业上感兴趣的动物。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了一种或多种mRNA的递送，所述mRNA编码一种或多种选自哺乳动物同源物或来自表1和表2中列出的分泌蛋白质的兽医学或工业上感兴趣的动物的同源物的蛋白质；因此，本发明的组合物可以包含mRNA以及本文列出的其他组分，该mRNA编码选自哺乳动物同源物或来自表1和表2中列出的蛋白质的具有兽医学或工业上感兴趣的动物的同源物的蛋白质；并且本发明的方法可以包括制备和/或施用包含mRNA以及本文列出的其他组分的组合物，该mRNA编码哺乳动物同源物或来自表1和表2中列出的蛋白质的兽医学或工业上感兴趣的动物的同源物的蛋白质。在一些实施方案中，哺乳动物同源物选自小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、马、猪、牛、美洲驼、羊驼、貂、狗、猫、雪貂、绵羊、山羊或骆驼同源物。在一些实施方案中，兽医学或工业上感兴趣的动物选自上文列出的哺乳动物和/或鸡、鸭、火鸡、鲑鱼、鲶鱼或罗非鱼。

在实施方案中，本发明的组合物和方法提供了编码选自表3的溶酶体蛋白的mRNA的递送。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了一种或多种编码表3中列出的一种或多种溶酶体和/或相关蛋白质的mRNA的递送；因此，本发明的组合物可以包含编码表3中列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA以及本文列出的其他组分，并且本发明的方法可以包括制备和/或施用包含编码选自表3中列出的蛋白质的蛋白质(或其同源物)的mRNA以及本文列出的其他组分的组合物。

表3.溶酶体及相关蛋白质

关于溶酶体蛋白的信息可从Lubke等人，“Proteomics of the Lysosome,”Biochim Biophys Acta.(2009)1793:625-635中获得。在一些实施方案中，表3中列出的并且在本发明的组合物和方法中由mRNA编码的蛋白质是人蛋白质。列出的蛋白质的序列也可用于多种动物，包括多种哺乳动物和如上所述的兽医或工业关注的动物。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了编码诸如表4中列出的那些治疗性蛋白质(例如，胞液、跨膜或分泌的)的mRNA的递送。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了编码治疗性蛋白质的mRNA的递送，所述治疗性蛋白质可用于治疗表4中列出的疾病或病症(即适应症)；因此，本发明的组合物可以包含编码表4中列出或未列出的治疗性蛋白质(或其同源物，如下所述)的mRNA以及本文所述的用于治疗表4中列出的疾病或病症(即适应症)的其他成分，并且本发明的方法可以包括制备和/或施用包含编码此类蛋白(或其同源物，如下所述)的mRNA以及本文所述的用于治疗表4中列出的疾病或病症的其他组分的组合物。

表4.示例性适应症和相关蛋白

在一些实施方案中，本发明用于预防、治疗和/或治愈受表1、2、3或4中列出的或与其列出的蛋白质相关的疾病或病症影响的受试者。在一些实施方案中，mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、因子IX、存活运动神经元1(SMN1)或苯丙氨酸羟化酶(PAH)中的一种或多种。

尽管已经根据某些实施方案具体描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明的化合物，而不旨在对其进行限制。

实施例

可以根据如本文所述的方案1或方案2制备阳离子脂质(例如，阳离子脂质(1a)-(21a)、(1b)-(21b)和(22)-(462))。

方案3提供了普通合成中间体的示例性合成。

方案3.((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧)四氢呋喃-2-基)3-(二甲基氨基)丙酸甲酯的合成

(2R,3R,4S,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇(A3)的合成：

向D-核糖A1(100g，0.66摩尔)在300mL吡啶中的溶液中添加三苯甲基氯A2(180g，0.65摩尔)，并将所得混合物在室温下搅拌过夜。在蒸发溶剂后，将残余物溶解于二氯甲烷(1.5L)，用盐水洗涤(500mL×3)，然后用无水Na

(2S,3R,4R,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三(叔丁基二甲基硅烷)(A4)的合成：

向(2R,3R,4S,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇A3(40g，0.102摩尔)和咪唑(34.8g，0.51摩尔)在400mL DMF中的溶液中在0℃下添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(76.8g，0.51mol)，并将所得的混合物在室温下搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯(500mL)，用盐水洗涤(300mL×3)，并用无水Na

((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇(A5)的合成：

向(((2S,3R,4R,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三(叔丁基二甲基硅烷)A4(65g，88mmol)在600mL二氯甲烷中的溶液中添加三乙基硅烷(60mL，0.352摩尔)，然后在0℃下添加三氟乙酸(13.8mL，0.176摩尔)。将所得混合物在该温度下搅拌4小时。用饱和NaHCO

((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基3-(二甲氨基)丙酸酯(A7)的合成：

向((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇A5(71g，88mmol)和3-(二甲氨基)丙酸B1(13.6g，88mmol)在500mL二氯甲烷中的溶液中，添加DMAP(10.7g，88mmol)和EDCI(16.8g，88mmol)，并将所得的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用盐水(200mL×3)洗涤，并用无水Na

(2S,3R,4R,5R)-5-(((3-(二甲氨基)丙酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三癸酸酯(2b)的合成：

向((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基3-(二甲基氨基)丙酸酯A7(0.8g，1.35mmol)在1mL THF中的溶液中添加HF-吡啶(0.72mL，40.5mmol)，并将混合物在室温下搅拌。在3小时后，随后添加2mL二氯甲烷、4mL吡啶和癸酰氯(2.3g，12.15mmol)，并将所得到的混合物在室温下搅拌四天。在真空下蒸发挥发物，然后将残余物溶解于二氯甲烷(50mL)，用盐水(50mL×3)洗涤，并用无水Na

该方法适用于制备本文所述的其他脂质，其可以通过该代表性方法以相似的收率获得。

方案4.具有可生物降解脂质基团的脂质的合成

(2S,3R,4R,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三油酸酯(A9)的合成

在0℃下，向(2R,3R,4S,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇A3(5.0g，1.67mmol)的二氯甲烷/吡啶溶液中(1/1v/v，100mL)，添加油酰氯A8(23g，9.4mmol)，并将混合物温热至室温，并在室温下搅拌5天。在浓缩后，将残余物溶解于二氯甲烷，用水和盐水洗涤。在用硫酸钠干燥并浓缩后，通过快速色谱法(SiO

(2S,3R,4R,5R)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三油酸酯(A10)的合成

在0℃下，向(2S,3R,4R,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三油酸酯A9(0.8g，0.67mmol)和三乙基硅烷(0.62mL，3.9mmol)在50mL二氯甲烷中的溶液中，添加三氟乙酸(0.12mL，1.06mmol)。在该温度下搅拌90分钟后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠淬灭，然后用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，用MgSO

(2S,3R,4R,5R)-5-(((4-(二甲氨基二甲氨基)丁酰基)氧)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三油酸酯(211)的合成

将(2S,3R,4R,5R)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基三油酸酯A9(0.8g，0.67mmol)、EDCI(130g，0.67mmol)、3-(二甲氨基)丙酸盐酸盐(108mg，0.7mmol)和DMAP(82mg，0.67mmol)在50mL二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，然后用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

如方案4中所示，可以使用不同的酰化剂代替3-(二甲氨基)丙酸盐酸盐，以提供如本文所述的其他阳离子脂质。根据代表性程序制备并以相似的收率获得其他脂质。

方案5.氢化钠途径制备具有脂族脂质基团的脂质

(2S,3R,4R,5R)-2,3,4-三(辛氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃(A12)的合成

在0℃下，向(2R,3R,4S,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇A3(3.0g，7.6mmol)在90mL DMF中的溶液中添加氢化钠(60％分散于油中，2.7g，67.5mmol)。在30分钟后，添加1-溴辛烷A11(8.1mL，47mmol)和碘化四丁基铵(600mg，1.6mmol)，并将所得溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物用冰/水淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速柱色谱法(SiO

((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三(辛氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇(A13)的合成

在0℃下，向(2S,3R,4R,5R)-2,3,4-三(辛氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃A12(290mg，0.4mmol)和三乙基硅烷(0.25mL，1.6mmol)在2mL二氯甲烷中的溶液中添加三氟乙酸(0.06mL，0.8mmol)。在该温度下搅拌1小时后，将反应混合物用饱和NaHCO

((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三(辛氧基)四氢呋喃-2-基)甲基3-(二甲氨基)丙酸酯的合成(11b)

将((2R,3R,4R,5S)-3,4,5-三(辛氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇A13(325mg，0.4mmol)、EDCI(76mg，0.4mmol)、3-(二甲氨基)丙酸盐酸盐B1(61mg，0.4mmol)和DMAP(48mg，0.4mmol)在6mL二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，然后用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速柱色谱法(SiO

方案6.具有脂族臂的脂质的钛介导合成

(2R,3R,4S,5R)-2-(癸氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(A15)的合成

向(2R,3R,4S,5R)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三醇A3(3.0g，7.65mmol)、溴化锂(0.66g，7.65mmol)和扁桃酸(0.58g，3.82mmol)在15mL 1-癸醇A14中的悬浮液中添加叔丁醇钛(IV)(0.26g，0.76mmol)。将混合物在室温下搅拌2天。在除去THF后，通过柱色谱法(SiO

(2R,3R,4R,5R)-2,3,4-三(癸氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃(A16)的合成

在0℃下，向(2R,3R,4S,5R)-2-(癸氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇A15(1.7g，3mmol)在DMF/THF(100mL/100mL)中的溶液中添加氢化钠(60％分散于油中，0.72g，18.2mmol)。在5分钟后，添加1-溴代癸烷(3.78g，15.2mmol)，并将所得溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物用冰/水淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速柱色谱法(SiO

((2R,3R,4R,5R)-3,4,5-三(癸氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇(A17)的合成

在0℃下，向(2R,3R,4R,5R)-2,3,4-三(癸氧基)-5-((三苯甲氧基)甲基)四氢呋喃A16(1.5g，1.67mmol)和三乙基硅烷(1.5mL，9.4mmol)在35mL二氯甲烷中的溶液中添加三氟乙酸(0.3mL，3.89mmol)。在该温度下搅拌90分钟后，将反应混合物用饱和NaHCO

((2R,3R,4R,5R)-3,4,5-三(癸氧基)四氢呋喃-2-基)甲基3-(二甲氨基)丙酸酯(12b)的合成

将((2R,3R,4R,5R)-3,4,5-三(癸氧基)四氢呋喃-2-基)甲醇17(1.7g，1.67mmol)、EDCI(320mg，1.67mmol)、3-(二甲氨基)丙酸盐酸盐6(260mg，1.9mmol)和DMAP(200mg，1.67mmol)在100mL二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，然后用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速柱色谱法(SiO

根据代表性程序以相似的收率制备其他脂质。

(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(癸-9-烯-1-基氧)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯(A21)的合成

在0℃下，向1,2,3,5-四邻乙酰基-β-l-呋喃核糖A19(6.36g，20mmol)和癸-9-烯-1-醇A20(4.3mL，24mmol)在100mL二氯甲烷中的溶液中添加BF

(2R,3R,4S,5R)-2-(癸-9-烯-1-基氧)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(A22)的合成

将(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(癸-9-烯-1-基氧)四氢呋喃-3,4-二基乙酸酯A21和癸-9-烯-1-醇A20(3.12g)的混合物溶解于THF/MeOH(40mL/40mL)，并且添加氢氧化锂水合物(3.16g，75mmol)在5mL水中的溶液。将所得的混合物在室温下搅拌过夜。在浓缩至干燥后，将残余物溶解于二氯甲烷，用盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

(2R,3R,4S,5R)-2-(癸-9-烯-1-基氧)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(A23)的合成

向(2R,3R,4S,5R)-2-(癸-9-烯-1-基氧)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇A22(1.63g，5.55mmol)和咪唑(755mg，11.1mmol)在DMF(60mL)中的溶液中添加三异丙基甲硅烷基氯(1.3mL，6.1mmol)，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干燥。将残余物用水和乙醚分配。在分离后，将有机层干燥并浓缩。通过快速色谱法(SiO

三异丙基(((2R,3R,4R,5R)-3,4,5-三(癸-9-烯-1-基氧)四氢呋喃-2-基)甲氧基)硅烷(A25)的合成

在0℃下，向(2R,3R,4S,5R)-2-(癸-9-烯-1-基氧)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇A23(1.76g，3.96mmol)在DMF/THF(40mL/40mL)中的溶液中添加氢化钠(0.95g，23.7mmol)。在10分钟后，添加10-溴代癸-1-烯A24(4.33g，19.8mmol)，将所得溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物用冰/水淬灭，然后用醚萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬醛(A26)的合成

向三异丙基(((2R,3R,4R,5R)-3,4,5-三((9-(苄氧基)壬基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲氧基)硅烷A25(2.20g，3.05mmol)和2,6-卢剔啶(4.3mL，36.6mmol)在80mL二氧杂环己烷中的溶液中，添加氧化锇的水溶液(4重量％，0.84mL，0.137mmol)，然后添加高碘酸钠的水溶液(7.83g，溶于10mL水中)。将反应混合物在室温下搅拌4小时后，添加饱和亚硫酸钠。将所得混合物搅拌10分钟，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，并用2N HCl洗涤。用硫酸钠干燥后，在真空下除去溶剂，得到2.30g期望产物A26，为黄色半固体，其无需纯化即可用于下一步。

9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬酸(A27)的合成

向9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基)三壬醛A26(1.0g，1.3mmol)在tBuOH/水(15mL/1mL)中的溶液中，添加亚氯酸钠(0.54g，5.9mmol)和磷酸二氢钠(0.95g，7.9mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。TLC显示反应完全。将反应混合物用饱和磷酸二氢钠稀释并用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤。在浓缩后，获得1.13g期望产物A27，为无色油状物，其无需纯化即可用于下一步。

三(3-戊基辛基)9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬酸酯(A29)的合成

将9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基)三壬酸A27(1.13g，1.46mmol)、3-戊基辛-1-醇A28(3.5g，17.5mmol)、EDCI(3.35g，17.5mmol)和DMAP(215mg，1.75mmol)在100mL二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用1N HCl稀释并用二氯甲烷萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

三(3-戊基辛基)9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬酸酯(A30)的合成

向三(3-戊基辛基)9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬酸酯A29(0.64g，0.48mmol)在8mL THF中的溶液中，添加HF·吡啶(70％，1mL)，并将所得溶液搅拌3小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释，添加饱和碳酸氢钠以调节至pH7。分离有机层，并用硫酸钠干燥。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

三(3-戊基辛基)9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基)三壬酸酯(21b)

将三(3-戊基辛基)9,9',9”-(((2R,3R,4R,5R)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2,3,4-三基)三(氧基))三壬酸酯A30(0.51g，0.437mmol)、3-(二甲氨基)丙酸盐酸盐B1(67mg，0.437mmol)、EDCI(84mg，0.437mmol)和DMAP(53mg，0.437mmol)在30mL二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌过夜。将该反应混合物用水稀释并用二氯甲烷萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤。在浓缩后，通过快速色谱法(SiO

根据相同的程序，以相似的产率制备化合物19b和20b。

根据本领域已知的方法，本文所述的阳离子脂质可用于制备脂质纳米颗粒。例如，合适的方法包括在国际公开No.WO 2018/089801中描述的方法，该文献全文以引用方式并入本文。

脂质纳米颗粒制剂的一种示例性方法是WO 2018/089801的方法A(参见例如，WO2018/089801的实施例1和图1)。方法A(“A”)涉及通过将mRNA与脂质混合物混合而无需首先将脂质预形成为脂质纳米颗粒来包封mRNA的常规方法。在示例性方法中，分别制备了乙醇脂质溶液和mRNA的缓冲水溶液。通过将脂质溶解于乙醇中来制备脂质混合物(阳离子脂质、辅助脂质、两性离子脂质、PEG脂质等)的溶液。通过将mRNA溶解于柠檬酸盐缓冲液中来制备mRNA溶液，从而在pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液中产生0.0833mg/ml浓度的mRNA。然后在混合之前将混合物都加热至65℃。然后，使用泵系统将两种溶液混合。在某些情况下，使用齿轮泵系统将两种溶液混合。在某些实施方案中，使用“T”汇流(或“Y”汇流)将两种溶液混合。然后通过TFF方法渗滤纯化混合物。将所得制剂浓缩并在2-8℃下储存，直至进一步使用。

用于脂质纳米颗粒制剂的第二示例性方法是WO 2018/089801的方法B(参见例如，WO 2018/089801的实施例2和图2)。方法B(“B”)是指通过将预成形的脂质纳米颗粒与mRNA混合来包封信使RNA(mRNA)的过程。在方法B中可以使用一系列不同的条件，诸如变化的温度(即加热或不加热混合物)、缓冲剂和浓度。在示例性方法中，使用泵系统将溶解于乙醇和柠檬酸盐缓冲液中的脂质混合。两股流的瞬时混合导致空脂质纳米颗粒的形成，这是一个自组装过程。所得制剂混合物为含有醇的柠檬酸盐缓冲液中的空脂质纳米颗粒。然后使制剂经历TFF纯化过程，其中发生了缓冲液交换。然后使用泵系统将所得的预成形空脂质纳米颗粒的悬浮液与mRNA混合。对于某些阳离子脂质，混合后加热溶液导致更高百分比的含有mRNA的脂质纳米颗粒和更高的mRNA总产量。

如WO 2018/089801中所述，通过使用方法A或方法B制备表5的脂质纳米颗粒制剂。所有脂质纳米颗粒制剂均包含hEPO mRNA和以下摩尔％比例的不同脂质：阳离子脂质：DMG-PEG2000；胆固醇：DOPE＝40:5:25:30。

表5.示例性脂质纳米颗粒制剂

静脉内(IV)施用包含核糖阳离子脂质和编码hEPO的mRNA的脂质纳米颗粒制剂(表5)，以研究mRNA递送和所得的hEPO表达。给6-8周龄的雄性CD1小鼠以1mg/kg的剂量水平单次静脉内注射LNP制剂。在给药后6小时和24小时通过尾剪收集血液样品。通过ELISA在血清样品中测量的hEPO蛋白表达水平(图1)。这些研究显示，本文所述的核糖阳离子脂质在体内递送mRNA时高度有效，导致由所递送的mRNA编码的蛋白质或多肽的高表达。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：F·德罗莎;S·卡夫;Y·张;M·哈特莱因;
专利申请人：川斯勒佰尔公司;